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CN106987550A - 一种产β‑胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种产β‑胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用 Download PDF

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CN106987550A CN201710352395.5A CN201710352395A CN106987550A CN 106987550 A CN106987550 A CN 106987550A CN 201710352395 A CN201710352395 A CN 201710352395A CN 106987550 A CN106987550 A CN 106987550A
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Abstract

本发明公开了一种产β‑胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用，分别构建经密码子优化的β‑胡萝卜素合成基因编码的蛋白质八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶、八氢番茄红素脱氢酶以及MVA途径基因编码的蛋白质牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶的超强基因表达模块；将所述基因表达模块体外组装后获得含4个基因表达模块的质粒，然后将该质粒整合至不产β‑胡萝卜素的宿主菌基因组中，筛选橘红色的单菌落，即得到产β‑胡萝卜素的重组菌。采用本发明的重组菌进行发酵培养生产β‑胡萝卜素，β‑胡萝卜素的产量可达到26.03mg/g DCW，具有高的产β‑胡萝卜素性能。

Description

一种产β-胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于代谢工程和组合生物学技术领域，具体涉及一种生产β-胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用。
背景技术
β-胡萝卜素是存在于胡萝卜、木瓜、绿色蔬菜等诸多食物中的一种天然类胡萝卜素。在自然界中，β-胡萝卜素主要以全反式结构存在，具有11个共轭碳碳双键，具有良好的淬灭自由基、抗氧化、抑制单线态氧等作用，并具有防癌、抗癌、延缓衰老等功能。β-胡萝卜素作为维生素A的前体，是WHO和FAO食品添加剂联合专家委员会认定的A类营养食品强化剂。作为药物，β-胡萝卜素已被美国药典(USP)1990版、1995版，欧洲药典1997版，英国药典(BP)1998版正式收载，中国卫生部颁布的标准和中国国家药品监督管理局公布的第一批非处方药目录也已收录本产品(S.J.Chem.β-胡萝卜素国内市场分析,精细与专用化学品,2003,8:8-9)。
微生物发酵法是指以三孢布拉霉、酵母等微生物发酵生产β-胡萝卜素。其中，以三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素最具工业应用前景。但是三孢布拉霉由于霉菌的生殖方式等原因，其性状易发生衰退，这些不足限制了其发展，所以寻求优良菌株变得尤为重要。
CN 105316246A公开了一种β-胡萝卜素高产菌种及其应用，借助基因组装技术，将来自于卷枝毛霉的β-胡萝卜素合成途径的基因carB、carRP，及来自于解脂耶氏酵母的tHMG1、GGS1基因引入解脂耶氏酵母，构建成为产β-胡萝卜素的工程菌。所述的解脂耶氏酵母能够利用普通碳源和氮源，经发酵培养后，β-胡萝卜素产量可达到4.5g/L。
CN104805167A公开了一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌，主要包括以下步骤：大肠杆菌基因工程菌中包括4个外源的β-胡萝卜素合成基因(crtE、crtI、crtY和crtB)表达载体和4个MEP途径基因(dxs、idi、ispD和ispF)表达载体，过表达MEP途径中的4个酶，构建不同强度启动子的MEP途径，从而提高β-胡萝卜素产量。
CN102168096A公开了一种基于杜氏盐藻代谢途径的β-胡萝卜素工程菌及构建方法，包括如下步骤：获取杜氏盐藻中相关基因的cDNA，获取巴氏杜氏八氢番茄红素合成酶Psy启动子，构建质粒pDscrtB转化大肠杆菌后获得β-胡萝卜素工程菌。在2YT培养基下37℃摇瓶培养24h，β-胡萝卜素产率为2.6～3.2mg/g DCW。
CN103865817A公开了一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，主要步骤如下：利用来自红发夫酵母中crtE、crtYB、crtI构建基因表达模块，并且所述的表达模块包括基因上游的启动子和下游的终止子。将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中，经发酵培养，β-胡萝卜素产量约6mg/g DCW。
CN105087408A公开了一种生产β-胡萝卜素的酵母菌株，该发明酵母菌株基因组上的GAL1、GAL7、GAL10基因被ERG12、tHMG1、ERG8基因替换掉；GAL80基因被MVD1、ERG10、IDI1基因替换；ERG9基因的启动子被替换；三孢布拉霉中carG、carB和carRA基因被表达。
尽管目前已经有很多利用大肠杆菌和酿酒酵母合成β-胡萝卜素的报道，但是仍然没有相关的菌株被应用于工业化生产，究其原因，可能有以下几点：
(1)β-胡萝卜素合成关键酶(八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶)自身活性较低，异源表达后胡萝卜素合成量不高；(2)大肠杆菌会产生细胞毒素，用它做表达宿主生产胡萝卜素时存在食品安全风险；(3)β-胡萝卜素是一种脂溶性色素，它存储于脂质体中，而酿酒酵母是一种非产油酵母，积累的油脂量小于细胞干重的3％，这也限制了酿酒酵母作为表达宿主的应用。因此，寻找一种更具有优势的微生物势在必行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的生产β-胡萝卜素的方法存在的稳定性较低、产量低的问题，提供一种高产β-胡萝卜素的重组菌，以及该重组菌的构建方法和应用。
解决上述技术问题所采用的技术方案是该产β-胡萝卜素的重组菌由下述方法构建而成：
1、构建基因表达模块，所述基因表达模块包括a和b：
a、经密码子优化的β-胡萝卜素合成基因以及该基因上游的启动子和下游的终止子，其中所述经密码子优化的β-胡萝卜素合成基因编码的蛋白质分别为八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶和八氢番茄红素脱氢酶。
b、MVA途径基因以及该基因上游的启动子和下游的终止子，其中所述MVA途径基因编码的蛋白质分别为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶。
2、将步骤1的基因表达模块进行体外组装，获得含4个基因表达模块的质粒。
3、将步骤2的质粒整合至不产β-胡萝卜素的宿主菌的基因组中，筛选橘红色的单菌落，即得到产β-胡萝卜素的重组菌。
上述经密码子优化的β-胡萝卜素合成基因编码的蛋白质来源于三孢布拉霉菌、成团泛菌、菠萝泛菌、法夫酵母、卷枝毛霉中的任意一种，MVA途径基因编码的蛋白质来源于解脂亚罗酵母、酿酒酵母、假丝酵母中的任意一种，不产β-胡萝卜素的宿主菌为解脂亚罗酵母、酿酒酵母、假丝酵母、大肠杆菌中的任意一种。
上述经密码子优化的八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，经密码子优化的八氢番茄红素脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
上述启动子为PTEF1、PHXT7、PGAL1-PGAL10、PTPI1、PTDH3、PPGK1、PPYK1、PEXP1、PFBA、PPYK1、PXPR2、PUAS、PGPAT、PYAT1、PLeum、PTPS1中的任意一种，终止子为TCYC1、TADH1、Txpr2、Tmig1、Tlip2、TTKL1、TTDH2、TENO2中的任意一种。
本发明重组菌在制备β-胡萝卜素中的应用，具体方法如下：
1、一级种子培养：将重组菌菌株单克隆接种于种子培养液中，在28℃、200rpm/min下培养24h，获得一级种子液；其中种子培养液是按每100mL去离子水中加入2g葡萄糖、2g蛋白胨、1g酵母粉，灭菌后得到。
2、发酵培养：将一级种子液按1％的接种量接种于发酵培养基中，在28℃、200rpm/min下培养144h，收集发酵液；其中发酵培养基的是按每100mL去离子水中加入4g葡萄糖、0.251g硫酸铵、0.2g缺少亮氨酸的酵母氮源(Drop-out mix synthetic minus leucine w/o yeast nitrogen base)、0.17g酵母氮源，灭菌后得到。
3、以丙酮为提取溶剂，从发酵液中提取β-胡萝卜素。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过分别构建经密码子优化的β-胡萝卜素合成基因编码的蛋白质八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶、八氢番茄红素脱氢酶以及MVA途径基因编码的蛋白质牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的超强基因表达模块；将所述基因表达模块体外组装后获得含4个基因表达模块的质粒，然后将该质粒整合至不产β-胡萝卜素的宿主菌基因组中，筛选橘红色的单菌落，即得到产β-胡萝卜素的重组菌。采用本发明的重组菌进行发酵培养生产β-胡萝卜素，β-胡萝卜素的产量可达到26.03mg/g DCW，具有高的产β-胡萝卜素性能。
附图说明
图1是解脂亚罗酵母中β-胡萝卜素生物合成途径示意图，其中Carbon source表示碳源，Acetyl-CoA表示乙酰-CoA，HMG-CoA表示3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶，Mevalonate acid表示甲羟戊酸，GPP表示牻牛儿基焦磷酸，FPP表示法尼基焦磷酸，GGPP表示牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸，Phytoene表示八氢番茄红素，Lycopene表示番茄红素，Beta-carotene表示β-胡萝卜素。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
根据图1所示的解脂亚罗酵母中β-胡萝卜素生物合成途径，构建产β-胡萝卜素重组菌，具体构建方法如下：
1、构建基因表达模块
将经密码子优化的八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶基因(opt carRA，碱基序列如SEQ ID No.1所示，登录号为KY971027，由南京金斯瑞生物技术有限公司合成)和表达载体pJN44(含启动子PTEF和终止子Txpr2)分别用限制性内切酶SmaI在37℃下处理2h，纯化并胶回收目的基因和载体的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到含optcarRA表达模块的质粒optpJN44-carRA。
将经密码子优化的八氢番茄红素脱氢酶基因(optcarB，碱基序列如SEQ ID No.2所示，登录号为KY971026，由南京金斯瑞生物技术有限公司合成)和表达载体pJN44分别用限制性内切酶HindIII/SmaI在37℃下处理2h，纯化并胶回收目的基因和载体(约7500bp)的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到含optcarB表达模块的质粒optpJN44-carB。
将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GGS1，碱基序列如SEQ ID No.3所示，登录号为YALI0D17050g)和表达载体pJN44分别用限制性内切酶HindIII/SmaI在37℃下处理2h，纯化并胶回收目的基因和载体(约7500bp)的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到含GGS1表达模块的质粒pJN44-GGS1。
将3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tHMG，碱基序列如SEQ ID No.4所示，登录号为YALI0E04807g)和表达载体pJN44分别用限制性内切酶SmaI在37℃下处理2h，纯化并胶回收目的基因和载体的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到含tHMG表达模块的质粒pJN44-tHMG。
2、基因表达模块体外组装
将含optcarB表达模块的质粒opt pJN44-carB和含opt carRA表达模块的质粒optpJN44-carRA分别用限制性内切酶XbaI/SpeI、SpeI在37℃下处理2h，纯化并胶回收optcarB表达模块(约2700bp)和质粒opt pJN44-carRA的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEBDNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到质粒opt pJN44-carRA/carB。
将含GGS1表达模块的质粒pJN44-GGS1和质粒opt pJN44-carRA/carB分别用限制性内切酶XbaI/SpeI、SpeI在37℃下处理2h，纯化并胶回收pJN44-GGS1表达模块(约1900bp)和质粒opt pJN44-carRA/carB的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1。
将含tHMG表达模块的质粒pJN44-tHMG和质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1分别用限制性内切酶XbaI/SpeI、SpeI在37℃下处理2h，纯化并胶回收pJN44-tHMG表达模块(约2500bp)和质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1/tHMG。
3、质粒整合至宿主菌的基因组
按照酵母转化试剂盒说明书(Zymo Research corporation，USA)操作，将活化的解脂亚罗酵母单菌落接种于2mL YPD培养基中，于30℃、180rpm过夜培养至菌液OD600在1.8左右；取1mL菌液于1.5mL干净的离心管中，离心(4000×g，4min)，弃培养基，加入500μLsolution 1，涡旋混匀，离心(4000×g，4min)，弃上清液，加入50μL solution 2，涡旋混匀，加入5μL质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1/tHMG，震荡混匀，再加入500μLsolution 3，涡旋混匀，于30℃、180rpm培养4h后，涂布于相应的营养缺陷型SD筛选平板上；待菌落长出后，筛选橘红色的单菌落，即得到产β-胡萝卜素的重组菌。
对比例1
1、构建基因表达模块
将八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶基因(carRA，碱基序列如SEQ ID No.5所示，登录号为37729028)和表达载体pJN44分别用限制性内切酶SmaI在37℃下处理2h，纯化并胶回收目的基因和载体的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到含carRA表达模块的质粒pJN44-carRA。
将八氢番茄红素脱氢酶基因(carB，碱基序列如SEQ ID No.6所示，登录号为37729027)和表达载体pJN44分别用限制性内切酶HindIII/SmaI在37℃下处理2h，纯化并胶回收目的基因和载体(约7500bp)的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到含carB表达模块的质粒pJN44-carB。
2、基因表达模块体外组装
将含carB表达模块的质粒pJN44-carB和含carRA表达模块的质粒pJN44-carRA分别用限制性内切酶XbaI/SpeI、SpeI在37℃下处理2h，纯化并胶回收carB表达模块(约2700bp)和质粒pJN44-carRA的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到质粒pJN44-carRA/carB。
3、质粒整合至宿主菌的基因组
该步骤中，用等体积的质粒pJN44-carRA/carB替换实施例1步骤3中的质粒optpJN44-carRA/carB/GGS1/tHMG，其他步骤与实施例1的步骤3相同，得到重组菌。
对比例2
1、构建基因表达模块
按照实施例1步骤1的方法构建含optcarRA表达模块的质粒opt pJN44-carRA和含optcarB表达模块的质粒optpJN44-carB。
2、基因表达模块体外组装
将含opt carB表达模块的质粒opt pJN44-carB和含opt carRA表达模块的质粒opt pJN44-carRA分别用限制性内切酶XbaI/SpeI、SpeI在37℃下处理2h，纯化并胶回收optcarB表达模块(约2700bp)和质粒opt pJN44-carRA的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEBDNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到质粒opt pJN44-carRA/carB。
3、质粒整合至宿主菌的基因组
该步骤中，用等体积的质粒opt pJN44-carRA/carB替换实施例1步骤3中的质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1/tHMG，其他步骤与实施例1的步骤3相同，得到重组菌。
对比例3
1、构建基因表达模块
按照实施例1步骤1的方法构建含opt carRA表达模块的质粒opt pJN44-carRA、含opt carB表达模块的质粒opt pJN44-carB及含GGS1表达模块的质粒pJN44-GGS1。
2、基因表达模块体外组装
将含opt carB表达模块的质粒opt pJN44-carB和含opt carRA表达模块的质粒opt pJN44-carRA分别用限制性内切酶XbaI/SpeI、SpeI在37℃下处理2h，纯化并胶回收optcarB表达模块(约2700bp)和质粒optpJN44-carRA的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEBDNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到质粒opt pJN44-carRA/carB。
将含GGS1表达模块的质粒pJN44-GGS1和质粒opt pJN44-carRA/carB分别用限制性内切酶XbaI/SpeI、SpeI在37℃下处理2h，纯化并胶回收pJN44-GGS1表达模块(约1900bp)和质粒opt pJN44-carRA/carB的DNA片段；将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶(NEB公司，产品编号：M0367S)作用下进行连接反应，得到质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1。
3、质粒整合至宿主菌的基因组
该步骤中，用等体积的质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1替换实施例1步骤3中的质粒optpJN44-carRA/carB/GGS1/tHMG，其他步骤与实施例1的步骤3相同，得到重组菌。
实施例2
实施例1的重组菌在制备β-胡萝卜素中的应用，具体方法如下：
1、一级种子培养：将实施例1的重组菌菌株单克隆接种于含5mL种子培养液的试管中，在28℃、200rpm/min下培养24h，获得一级种子液；其中种子培养液是按每100mL去离子水中加入2g葡萄糖、2g蛋白胨、酵母粉1g，灭菌后得到。
2、发酵培养：将一级种子液按1％的接种量转接至含50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在28℃、200rpm/min下培养144h，收集菌液；其中发酵培养基的是按每100mL去离子水中加入4g葡萄糖、0.251g硫酸铵、0.2g缺少亮氨酸的酵母氮源(Drop-out mix syntheticminus leucine w/o yeast nitrogenbase)、0.17g酵母氮源，灭菌后得到。
同时以对比例1、2、3得到的重组菌做对比试验。利用HPLC检测菌液中β-胡萝卜素含量，结果见表1。
表1
重组菌 β-胡萝卜素产量
对比例1 0
对比例2 0.045mg/g DCW
对比例3 6.16mg/g DCW
实施例1 26.03mg/g DCW
由表1可见，当在不产β-胡萝卜素的宿主菌中导入原生carRA和carB基因时(对比例1)，不能合成β-胡萝卜素，即使将经密码子优化的carRA和carB基因导入宿主菌中(对比例2)，提取的β-胡萝卜素含量也仅为0.045mg/g DCW，在此基础上进一步在经密码子优化的carRA和carB基因中引入GGS1基因(对比例3)，所得β-胡萝卜素含量虽然有所提高(6.16mg/gDCW)，但β-胡萝卜素产量仍较低，本发明通过在经密码子优化的carRA和carB基因中引入MVA途径中的GGS1和tHMG基因(实施例1重组菌)，所得β-胡萝卜素含量可达到26.03mg/g DCW，β-胡萝卜素的产量明显提高，说明本发明重组菌具有高的产β-胡萝卜素性能。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120> 一种产β-胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用
<160> 6
<210> 1
<211> 1827
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
1 ATGTCTATCC TGACCTACCT GGAGTTCCAC CTGTACTACA CCCTGCCTGT CCTGGCTGCT
61 CTGTGTTGGC TGCTGAAGCC CTTCCACTCC CAGCAGGACA ACCTGAAGTA CAAGTTCCTG
121 ATGCTGATGG CCGCTTCTAC CGCCTCCATC TGGGACAACT ACATTGTGTA CCACCGAGCT
181 TGGTGGTACT GTCCCACCTG CGTGGTCGCC GTCATCGGTT ACGTGCCCCT GGAGGAGTAC
241 ATGTTCTTCA TCATTATGAC CCTGATGACC GTCGCTTTCT CTAACTTCGT GATGCGATGG
301 CACCTGCACA CCTTCTTCAT TCGACCCAAC ACCTCTTGGA AGCAGACCCT GCTGGTCCGA
361 CTGGTGCCCG TCTCCGCTCT GCTGGCTATC ACCTACCACG CCTGGCACCT GACCCTGCCC
421 AACAAGCCCT CTTTCTACGG CTCCTGTATT CTGTGGTACG CTTGCCCTGT GCTGGCTATC
481 CTGTGGCTGG GTGCTGGCGA GTACATTCTG CGACGACCCG TGGCCGTCCT GCTGTCTATC
541 GTCATTCCCT CCGTGTACCT GTGTTGGGCC GACATCGTCG CCATTTCCGC TGGAACCTGG
601 CACATCTCTC TGCGAACCTC CACCGGCAAG ATGGTGGTCC CTGACCTGCC TGTGGAGGAG
661 TGTCTGTTCT TCACCCTGAT TAACACCGTG CTGGTCTTCG CTACCTGCGC TATCGACCGA
721 GCTCAGGCTA TTCTGCACCT GTACAAGTCT TCCGTCCAGA ACCAGAACCC CAAGCAGGCT
781 ATCTCTCTGT TCCAGCACGT GAAGGAGCTG GCCTGGGCTT TCTGCCTGCC CGACCAGATG
841 CTGAACAACG AGCTGTTCGA CGACCTGACC ATCTCCTGGG ACATTCTGCG AAAGGCCTCT
901 AAGTCCTTCT ACACCGCCTC TGCTGTCTTC CCCTCCTACG TGCGACAGGA CCTGGGAGTC
961 CTGTACGCTT TCTGTCGAGC CACCGACGAC CTGTGCGACG ACGAGTCTAA GTCCGTGCAG
1021 GAGCGACGAG ACCAGCTGGA CCTGACCCGA CAGTTCGTCC GAGACCTGTT CTCTCAGAAG
1081 ACCTCCGCTC CCATCGTGAT TGACTGGGAG CTGTACCAGA ACCAGCTGCC CGCCTCTTGT
1141 ATTTCCGCCT TCCGAGCTTT CACCCGACTG CGACACGTGC TGGAGGTCGA CCCTGTGGAG
1201 GAGCTGCTGG ACGGCTACAA GTGGGACCTG GAGCGACGAC CCATCCTGGA CGAGCAGGAC
1261 CTGGAGGCCT ACTCTGCTTG TGTCGCCTCT TCCGTGGGAG AGATGTGCAC CCGAGTCATT
1321 CTGGCTCAGG ACCAGAAGGA GAACGACGCT TGGATCATTG ACCGAGCCCG AGAGATGGGA
1381 CTGGTCCTGC AGTACGTGAA CATCGCCCGA GACATTGTGA CCGACTCCGA GACCCTGGGT
1441 CGATGCTACC TGCCCCAGCA GTGGCTGCGA AAGGAGGAGA CCGAGCAGAT CCAGCAGGGA
1501 AACGCCCGAT CTCTGGGTGA CCAGCGACTG CTGGGCCTGT CCCTGAAGCT GGTCGGCAAG
1561 GCCGACGCTA TCATGGTGCG AGCTAAGAAG GGAATTGACA AGCTGCCTGC TAACTGTCAG
1621 GGTGGAGTCC GAGCTGCTTG CCAGGTGTAC GCCGCTATTG GTTCTGTGCT GAAGCAGCAG
1681 AAGACCACCT ACCCTACCCG AGCTCACCTG AAGGGTTCCG AGCGAGCTAA GATCGCCCTG
1741 CTGTCTGTCT ACAACCTGTA CCAGTCCGAG GACAAGCCTG TGGCTCTGCG ACAGGCTCGA
1801 AAGATTAAGT CTTTCTTCGT GGACTAG
<210> 2
<211> 1749
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
1 ATGTCCGACC AGAAGAAGCA CATCGTGGTC ATTGGTGCTG GAATCGGTGG AACCGCTACC
61 GCTGCTCGAC TGGCTCGAGA GGGCTTCCGA GTGACCGTGG TCGAGAAGAA CGACTTCTCC
121 GGTGGCCGAT GTTCTTTCAT CCACCACGAC GGTCACCGAT TCGACCAGGG CCCCTCTCTG
181 TACCTGATGC CCAAGCTGTT CGAGGACGCC TTCGCTGACC TGGACGAGCG AATTGGCGAC
241 CACCTGGACC TGCTGCGATG CGACAACAAC TACAAGGTGC ACTTCGACGA CGGAGACGCT
301 GTCCAGCTGT CTTCCGACCT GACCAAGATG AAGGGCGAGC TGGACCGAAT TGAGGGACCC
361 CTGGGTTTCG GCCGATTCCT GGACTTCATG AAGGAGACCC ACGTGCACTA CGAGCAGGGA
421 ACCTTCATCG CCATTAAGCG AAACTTCGAG ACCATCTGGG ACCTGATTCG ACTGCAGTAC
481 GTCCCCGAGA TCTTCCGACT GCACCTGTTC GGCAAGATCT ACGACCGAGC TTCCAAGTAC
541 TTCCAGACCA AGAAGATGCG AATGGCCTTC ACCTTCCAGA CCATGTACAT GGGAATGTCC
601 CCCTACGACG CCCCCGCTGT GTACTCTCTG CTGCAGTACA CCGAGTTCGC TGAGGGCATC
661 TGGTACCCCC GAGGAGGTTT CAACATGGTG GTCCAGAAGC TGGAGTCCAT TGCTTCTAAG
721 AAGTACGGCG CCGAGTTCCG ATACCAGTCC CCCGTGGCCA AGATCAACAC CGTCGACAAG
781 GACAAGCGAG TGACCGGAGT CACCCTGGAG TCTGGAGAGG TCATCGAGGC CGACGCTGTG
841 GTCTGTAACG CCGACCTGGT CTACGCTTAC CACCACCTGC TGCCCCCCTG CAACTGGACC
901 AAGAAGACCC TGGCTTCCAA GAAGCTGACC TCTTCCTCTA TCTCTTTCTA CTGGTCCATG
961 TCTACCAAGG TGCCCCAGCT GGACGTCCAC AACATCTTCC TGGCCGAGGC TTACAAGGAG
1021 TCCTTCGACG AGATTTTCAA CGACTTCGGA CTGCCCTCCG AGGCCTCTTT CTACGTGAAC
1081 GTCCCCTCCC GAATCGACGA GTCTGCCGCT CCCCCCAACA AGGACTCTAT CATTGTGCTG
1141 GTCCCCATTG GTCACATGAA GTCCAAGACC GGCAACTCTG CTGAGGAGAA CTACCCCGAG
1201 CTGGTGAACC GAGCCCGAAA GATGGTGCTG GAGGTCATCG AGCGACGACT GGGCGTCAAC
1261 AACTTCGCCA ACCTGATTGA GCACGAGGAG GTGAACGACC CCTCCGTCTG GCAGTCTAAG
1321 TTCAACCTGT GGCGAGGCTC CATCCTGGGA CTGTCTCACG ACGTGTTCCA GGTCCTGTGG
1381 TTCCGACCCT CCACCAAGGA CTCTACCAAC CGATACGACA ACCTGTTCTT CGTGGGAGCT
1441 TCTACCCACC CCGGAACCGG TGTGCCCATT GTCCTGGCCG GATCCAAGCT GACCTCTGAC
1501 CAGGTCTGTA AGTCCTTCGG TCAGAACCCC CTGCCCCGAA AGCTGCAGGA CTCTCAGAAG
1561 AAGTACGCTC CCGAGCAGAC CTCCAAGACC GAGTCTCACT GGATCTACTA CTGTCTGGCC
1621 TGCTACTTCG TGACCTTCCT GTTCTTCTAC TTCTTCCCTC GAGACGACAC CACCACCCCT
1681 GCTTCCTTCA TTAACCAGCT GCTGCCCAAC GTGTTCCAGG TCCAGAACTC TAACGACATC
1741 CGAATCTAG
<210> 3
<211> 984
<212> DNA
<213>解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 3
1 ATGGATTATA ACAGCGCGGA TTTCAAGGAG ATATGGGGCA AGGCCGCCGA CACCGCGCTG
61 CTGGGACCGT ACAACTACCT CGCCAACAAC CGGGGCCACA ACATCAGAGA ACACTTGATC
121 GCAGCGTTCG GAGCGGTTAT CAAGGTGGAC AAGAGCGATC TCGAGACCAT TTCGCACATC
181 ACCAAGATTT TGCATAACTC GTCGCTGCTT GTTGATGACG TGGAAGACAA CTCGATGCTC
241 CGACGAGGCC TGCCGGCAGC CCATTGTCTG TTTGGAGTCC CCCAAACCAT CAACTCCGCC
301 AACTACATGT ACTTTGTGGC TCTGCAGGAG GTGCTCAAGC TCAAGTCTTA TGATGCCGTC
361 TCCATTTTCA CCGAGGAAAT GATCAACTTG CATAGAGGTC AGGGTATGGA TCTCTACTGG
421 AGAGAAACAC TCACTTGCCC CTCGGAAGAC GAGTATCTGG AGATGGTGGT GCACAAGACC
481 GGTGGACTGT TTCGGCTGGC TCTGAGACTT ATGCTGTCGG TGGCATCGAA ACAGGAGGAC
541 CATGAAAAGA TCAACTTTGA TCTCACACAC CTTACCGACA CACTGGGAGT CATTTACCAG
601 ATTCTGGATG ATTACCTCAA CCTGCAGTCC ACGGAATTGA CCGAGAACAA GGGATTCTGC
661 GAAGATATCA GCGAAGGAAA GTTTTCGTTT CCGCTGATTC ACAGCATACG CACCAACCCG
721 GATAACCACG AGATTCTCAA CATTCTCAAA CAGCGAACAA GCGACGCTTC ACTCAAAAAG
781 TACGCCGTGG ACTACATGAG AACAGAAACC AAGAGTTTCG ACTACTGCCT CAAGAGGATA
841 CAGGCCATGT CACTCAAGGC AAGTTCGTAC ATTGATGATC TAGCAGCAGC TGGCCACGAT
901 GTCTCCAAGC TACGAGCCAT TTTGCATTAT TTTGTGTCCA CCTCTGACTG TGAGGAGAGA
961 AAGTACTTTG AGGATGCGCA GTGA
<210> 4
<211> 1521
<212> DNA
<213>解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 4
1 GCCACCCGAG AAGTTGTGCG AACCCAGTCT GTGAAGGTGG TTGAGAAGCA CGTTCCTATC
61 GTCATTGAGA AGCCCAGCGA GAAGGAGGAG GACACCTCTT CTGAAGACTC CATTGAGCTG
121 ACTGTCGGAA AGCAGCCCAA GCCCGTGACC GAGACCCGTT CTCTGGACGA CCTAGAGGCT
181 ATCATGAAGG CAGGTAAGAC CAAGCTTCTG GAGGACCACG AGGTTGTCAA GCTCTCTCTC
241 GAGGGCAAGC TTCCTTTGTA TGCTCTTGAG AAGCAGCTTG GTGACAACAC CCGAGCTGTT
301 GGCATCCGAC GATCTATCAT CTCCCAGCAG TCTAATACCA AGACTTTAGA GACCTCAAAG
361 CTTCCTTACC TGCACTACGA CTACGACCGT GTTTTTGGAG CCTGTTGCGA GAACGTTATT
421 GGTTACATGC CTCTCCCCGT TGGTGTTGCT GGCCCCATGA ACATTGATGG CAAGAACTAC
481 CACATTCCTA TGGCCACCAC TGAGGGTTGT CTTGTTGCCT CAACCATGCG AGGTTGCAAG
541 GCCATCAACG CCGGTGGCGG TGTTACCACT GTGCTTACTC AGGACGGTAT GACACGAGGT
601 CCTTGTGTTT CCTTCCCCTC TCTCAAGCGG GCTGGAGCCG CTAAGATCTG GCTTGATTCC
661 GAGGAGGGTC TCAAGTCCAT GCGAAAGGCC TTCAACTCCA CCTCTCGATT TGCTCGTCTC
721 CAGTCTCTTC ACTCTACCCT TGCTGGTAAC CTGCTGTTTA TTCGATTCCG AACCACCACT
781 GGTGATGCCA TGGGCATGAA CATGATCTCC AAGGGCGTCG AACACTCTCT GGCCGTCATG
841 GTCAAGGAGT ACGGCTTCCC TGATATGGAC ATTGTGTCTG TCTCGGGTAA CTACTGCACT
901 GACAAGAAGC CCGCAGCGAT CAACTGGATC GAAGGCCGAG GCAAGAGTGT TGTTGCCGAA
961 GCCACCATCC CTGCTCACAT TGTCAAGTCT GTTCTCAAAA GTGAGGTTGA CGCTCTTGTT
1021 GAGCTCAACA TCAGCAAGAA TCTGATCGGT AGTGCCATGG CTGGCTCTGT GGGAGGTTTC
1081 AATGCACACG CCGCAAACCT GGTGACCGCC ATCTACCTTG CCACTGGCCA GGATCCTGCT
1141 CAGAATGTCG AGTCTTCCAA CTGCATCACG CTGATGAGCA ACGTCGACGG TAACCTGCTC
1201 ATCTCCGTTT CCATGCCTTC TATCGAGGTC GGTACCATTG GTGGAGGTAC TATTTTGGAG
1261 CCCCAGGGGG CTATGCTGGA GATGCTTGGC GTGCGAGGTC CTCACATCGA GACCCCCGGT
1321 GCCAACGCCC AACAGCTTGC TCGCATCATT GCTTCTGGAG TTCTTGCAGC GGAGCTTTCG
1381 CTGTGTTCTG CTCTTGCTGC CGGCCATCTT GTGCAAAGTC ATATGACCCA CAACCGGTCC
1441 CAGGCTCCTA CTCCGGCCAA GCAGTCTCAG GCCGATCTGC AGCGTCTACA AAACGGTTCG
1501 AATATTTGCA TACGGTCATA G
<210> 5
<211> 1827
<212> DNA
<213>三孢不拉霉（Blakeslea trispora）
<400> 5
1 ATGTCAATAC TCACTTATCT GGAATTTCAT CTCTACTATA CACTACCTGT CCTTGCGGCA
61 TTGTGTTGGC TGCTAAAGCC GTTTCACTCA CAGCAAGACA ATCTCAAGTA TAAATTTTTA
121 ATGTTGATGG CCGCCTCTAC CGCATCGATT TGGGACAATT ATATCGTTTA TCATCGCGCT
181 TGGTGGTACT GTCCTACTTG TGTTGTGGCT GTCATTGGCT ATGTACCTCT AGAAGAATAC
241 ATGTTCTTTA TCATCATGAC TTTAATGACT GTCGCGTTCT CAAACTTTGT TATGCGTTGG
301 CACTTGCATA CTTTCTTTAT TAGACCCAAC ACTTCTTGGA AGCAAACACT ATTAGTACGC
361 CTTGTGCCTG TTTCAGCTTT ATTGGCAATC ACTTATCATG CTTGGCACTT GACACTGCCA
421 AATAAACCTT CATTTTATGG TTCATGCATC CTTTGGTATG CTTGTCCTGT GTTGGCTATT
481 CTTTGGCTGG GTGCTGGCGA ATATATCTTG CGTCGACCTG TGGCTGTCCT TTTGTCTATT
541 GTTATCCCTA GTGTATACCT ATGTTGGGCT GATATCGTCG CTATTAGTGC TGGCACATGG
601 CATATTTCTC TTAGAACAAG CACTGGCAAA ATGGTAGTAC CCGATTTACC TGTAGAAGAA
661 TGCCTGTTTT TTACTTTGAT CAACACAGTC TTGGTTTTTG CTACCTGTGC TATAGACCGC
721 GCTCAGGCCA TCCTCCATCT GTACAAATCA TCTGTTCAAA ATCAAAACCC TAAACAAGCC
781 ATTTCCCTTT TCCAGCATGT CAAAGAGCTA GCATGGGCCT TCTGTCTTCC TGACCAAATG
841 CTCAACAATG AATTGTTTGA TGATCTTACT ATCAGCTGGG ATATTTTACG TAAAGCCTCA
901 AAGTCATTCT ATACTGCATC TGCCGTTTTT CCAAGTTATG TACGTCAAGA CTTGGGTGTT
961 CTCTATGCTT TCTGCAGAGC TACCGATGAC CTGTGCGATG ATGAATCCAA ATCTGTTCAA
1021 GAAAGAAGAG ACCAATTAGA TCTTACTCGA CAATTTGTTC GTGATCTCTT TAGCCAAAAG
1081 ACCAGTGCGC CTATTGTGAT TGATTGGGAA TTGTATCAAA ACCAACTTCC TGCTTCTTGT
1141 ATATCAGCCT TTAGAGCCTT TACTCGCCTT CGCCATGTCC TTGAAGTAGA CCCTGTAGAA
1201 GAACTATTAG ATGGTTACAA ATGGGATCTT GAGCGTCGTC CTATCCTTGA TGAACAAGAC
1261 TTGGAGGCAT ACTCTGCTTG TGTGGCCAGT AGTGTGGGTG AAATGTGCAC ACGTGTGATT
1321 CTTGCTCAAG ACCAAAAGGA AAATGATGCT TGGATAATTG ACCGTGCACG TGAGATGGGG
1381 CTGGTGCTAC AATACGTTAA CATTGCTCGA GACATTGTGA CTGATAGCGA GACTCTGGGT
1441 CGATGTTATC TGCCTCAACA ATGGCTTAGA AAAGAAGAAA CAGAACAAAT ACAGCAAGGC
1501 AACGCCCGTA GCCTAGGTGA TCAAAGACTG TTGGGCTTGT CTCTGAAGCT TGTAGGAAAG
1561 GCAGACGCTA TCATGGTGAG AGCTAAGAAG GGCATTGACA AGTTGCCGGC AAACTGTCAA
1621 GGCGGTGTAC GAGCTGCTTG CCAAGTATAT GCTGCAATTG GATCTGTACT CAAGCAGCAG
1681 AAGACAACAT ATCCTACAAG AGCTCATCTA AAAGGAAGCG AACGTGCCAA GATTGCTCTG
1741 TTGAGTGTAT ACAACCTCTA TCAATCTGAA GACAAGCCTG TGGCTCTCCG TCAAGCTAGA
1801 AAGATTAAGA GTTTTTTTGT TGATTAG
<210> 6
<211> 1749
<212> DNA
<213>三孢不拉霉（Blakeslea trispora）
<400> 6
1 ATGTCTGATC AAAAGAAGCA TATTGTTGTC ATTGGTGCCG GTATTGGCGG AACTGCTACT
61 GCTGCTCGTC TTGCTCGTGA AGGTTTTCGA GTTACTGTTG TTGAAAAGAA CGACTTTTCC
121 GGTGGCCGTT GTTCATTCAT TCATCACGAT GGTCATCGCT TTGATCAGGG TCCCTCACTC
181 TATTTGATGC CTAAGCTTTT TGAAGATGCA TTTGCTGATT TGGATGAACG TATTGGTGAT
241 CATTTGGATT TGCTTCGCTG TGACAATAAC TATAAGGTTC ATTTTGACGA CGGTGATGCC
301 GTACAACTCT CTTCCGATTT AACCAAGATG AAGGGCGAAT TGGACCGTAT TGAGGGTCCC
361 CTTGGATTTG GTAGATTCTT GGATTTCATG AAGGAAACAC ATGTCCATTA TGAACAAGGT
421 ACATTTATTG CTATCAAGCG CAACTTTGAA ACCATTTGGG ATTTGATTCG TCTTCAGTAT
481 GTGCCTGAAA TCTTTCGCTT GCACTTGTTT GGTAAGATCT ATGACCGAGC CAGTAAATAT
541 TTCCAAACCA AGAAAATGCG TATGGCTTTT ACTTTTCAAA CAATGTATAT GGGTATGTCG
601 CCTTATGATG CTCCAGCAGT TTACAGTTTG TTACAATACA CCGAGTTTGC TGAAGGTATC
661 TGGTATCCTC GTGGTGGTTT CAACATGGTT GTTCAGAAGC TTGAGTCTAT CGCCTCCAAA
721 AAGTACGGTG CTGAATTCAG ATATCAATCG CCTGTTGCTA AAATTAACAC TGTCGATAAA
781 GACAAGCGTG TAACCGGTGT CACTTTGGAA AGCGGAGAAG TCATTGAAGC CGATGCAGTC
841 GTATGTAATG CGGATCTTGT TTATGCTTAT CACCATCTGT TACCTCCTTG CAATTGGACA
901 AAGAAGACAT TAGCCTCAAA GAAACTCACT TCATCATCTA TTTCGTTTTA TTGGTCCATG
961 TCAACAAAGG TGCCTCAATT AGACGTACAC AATATCTTCT TGGCTGAAGC CTACAAGGAA
1021 AGTTTTGATG AGATTTTCAA CGACTTCGGT TTGCCCTCTG AAGCTTCATT CTATGTCAAC
1081 GTTCCATCTC GAATTGATGA ATCTGCCGCA CCTCCCAACA AGGACTCCAT TATTGTGTTG
1141 GTTCCAATTG GCCATATGAA GAGTAAGACA GGAAACAGTG CTGAAGAAAA TTATCCTGAG
1201 TTGGTAAACC GTGCACGCAA GATGGTTCTG GAAGTTATCG AACGTCGTTT GGGAGTAAAC
1261 AACTTTGCTA ATTTGATTGA ACATGAAGAA GTGAATGATC CTAGTGTTTG GCAAAGCAAG
1321 TTTAACCTTT GGAGAGGTTC TATTCTTGGT CTTTCTCATG ATGTGTTCCA AGTTCTCTGG
1381 TTCAGACCTA GTACCAAGGA TTCCACAAAC CGTTATGATA ATCTTTTCTT TGTCGGAGCT
1441 AGTACACATC CAGGTACTGG TGTTCCTATC GTTCTTGCTG GAAGTAAGCT TACTTCCGAC
1501 CAAGTCTGTA AAAGCTTTGG CCAGAATCCC TTACCAAGAA AGTTACAAGA TAGCCAAAAG
1561 AAGTATGCTC CTGAACAAAC TAGTAAGACC GAAAGCCATT GGATCTATTA TTGTCTTGCT
1621 TGTTACTTTG TTACTTTCCT CTTTTTCTAT TTCTTCCCAA GAGATGATAC TACAACTCCT
1681 GCTTCTTTCA TTAACCAACT TTTACCTAAC GTTTTCCAAG TACAAAACAG CAACGATATT
1741 CGCATTTAA

Claims (9)

1.一种产β-胡萝卜素的重组菌的构建方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括a和b：
a、经密码子优化的β-胡萝卜素合成基因以及该基因上游的启动子和下游的终止子，其中所述经密码子优化的β-胡萝卜素合成基因编码的蛋白质分别为八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶和八氢番茄红素脱氢酶；
b、MVA途径基因以及该基因上游的启动子和下游的终止子，其中所述MVA途径基因编码的蛋白质分别为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶；
(2)将步骤(1)的基因表达模块进行体外组装，获得含4个基因表达模块的质粒；
(3)将步骤(2)的质粒整合至不产β-胡萝卜素的宿主菌的基因组中，筛选橘红色的单菌落，即得到产β-胡萝卜素的重组菌。
2.权利要求1所述的产β-胡萝卜素的重组菌的构建方法，其特征在于：所述经密码子优化的β-胡萝卜素合成基因编码的蛋白质来源于三孢布拉霉菌、成团泛菌、菠萝泛菌、法夫酵母、卷枝毛霉中的任意一种。
3.权利要求1所述的产β-胡萝卜素的重组菌的构建方法，其特征在于：所述经密码子优化的八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，经密码子优化的八氢番茄红素脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
4.权利要求1所述的产β-胡萝卜素的重组菌的构建方法，其特征在于：所述MVA途径基因编码的蛋白质来源于解脂亚罗酵母、酿酒酵母、假丝酵母中的任意一种。
5.权利要求1所述的产β-胡萝卜素的重组菌的构建方法，其特征在于：所述启动子为PTEF1、PHXT7、PGAL1-PGAL10、PTPI1、PTDH3、PPGK1、PPYK1、PEXP1、PFBA、PPYK1、PXPR2、PUAS、PGPAT、PYAT1、PLeum、PTPS1中的任意一种。
6.权利要求1所述的产β-胡萝卜素的重组菌的构建方法，其特征在于：所述终止子为TCYC1、TADH1、Txpr2、Tmig1、Tlip2、TTKL1、TTDH2、TENO2中的任意一种。
7.权利要求1所述的产β-胡萝卜素的重组菌的构建方法，其特征在于：所述的不产β-胡萝卜素的宿主菌为解脂亚罗酵母、酿酒酵母、假丝酵母、大肠杆菌中的任意一种。
8.权利要求1～7任意一项构建方法得到的产β-胡萝卜素的重组菌。
9.权利要求8所述的重组菌在制备β-胡萝卜素中的应用。
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