CN106866796A

CN106866796A - 草鱼呼肠孤病毒ⅱ型s9基因编码的重组蛋白及其应用

Info

Publication number: CN106866796A
Application number: CN201710067886.5A
Authority: CN
Inventors: 曾伟伟; 王庆; 王英英; 李莹莹; 石存斌; 任燕
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2017-02-07
Filing date: 2017-02-07
Publication date: 2017-06-20

Abstract

本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S9基因编码的重组蛋白及其应用。所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明获得的重组蛋白具有较好的免疫原性，与GCRV其它结构蛋白相比，其诱导免疫动物产生的特异性抗体效价更高。进一步试验表明，用VP6蛋白免疫草鱼，可使草鱼诱导产生较高的特异性抗体，并能对草鱼呼肠孤病毒强毒株的攻击起到一定的免疫保护作用。因此，对GCRV Ⅱ型VP6蛋白的研究和应用，对开发草鱼出血病新型疫苗及免疫学检测试剂盒具有极其重要的意义，为草鱼出血病提供新的有效解决途径。

Description

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S9基因编码的重组蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及由草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S9基因编码的重组VP6抗原蛋白及其应用。

背景技术

由草鱼呼肠孤病毒(Grass Crap Reovirus，GCRV)引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖业造成巨大经济损失，严重制约着我国草鱼养殖的健康发展。GCRV具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60nm～70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成，根据其基因节段的大小，将其基因组按分子量大小分为3个组，分别命名为L1-L3、M4-M6和S7-S11。这11个RNA节段可以编码12种多肽蛋白，但具体哪些基因编码结构蛋白，哪些编码非结构蛋白以及各编码蛋白的功能如果还没有证实。由于病毒的基因组的分节段特性，不同毒株之间可发生重配而产生高度变异，使得草鱼呼肠孤病毒的毒株较为复杂，目前已报道有30多个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV096、GCRV829、H962、ZV-8802、ZV-8909、GCHV-854、GCRV-HZ08、JX09-01、GCRV-104、GD108、106、109、HuNan1307等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。根据现有的分离株基因序列信息，进行核苷酸序列与氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析，所有毒株总体上可以分为3大类，分为3个基因型，即GCRVⅠ型(代表株为GCRV-873与GCRV-JX09-01)、GCRVⅡ型(代表株为GCRV-HZ08)和GCRVⅢ型(代表株为GCRV-104为)。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有单独感染，也有混合感染,以HZ08株为代表的GCRVⅡ型是目前导致草鱼出血病流行和爆发的主要株型。

目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是免疫预防，草鱼出血病细胞灭活疫苗与细胞弱毒疫苗的应用，对减少草鱼出血病的发生起到了一定的效果。但灭活疫苗的免疫原性比较差，需要足够大的量才能引起免疫应答，而大剂量又可引起局部或全身反应，并且所获得的免疫应答比较短暂，需要多次注射来增强免疫应答，而灭活疫苗的生产成本又比较高；细胞弱毒疫苗存在毒力返强的危险，有散毒的风险。和传统疫苗相比，基因工程疫苗存在较多有点，其抗原成分单一、免疫原性强，能够刺激机体产生较强的体液和细胞免疫应答，持续时间长；可规模化生产，成本相对低廉。此外，一种疫苗的免疫效果如何，需要合适的方法来检测和评价。通过免疫学方法来检测免疫动物特异性抗体的有无及抗体效价的高低是目前最为简便和有效的方法。由于草鱼呼肠孤病毒免疫原性比较差，至今还没有一种有效的免疫学诊断方法，尤其是缺乏评价疫苗免疫效果的血清学检测方法。

发明内容

经研究表明：GCRVⅡ型S9基因节段能够编码一个长达418个氨基酸的蛋白质(VP6)，分子量预测为42.86KDa，BLASTp的结果显示该VP6蛋白与水生呼肠孤病毒VP6蛋白(S8编码)、哺乳动物(MRV)σ2(S2编码)、禽呼肠孤病毒(ARV)σA(S2编码)具有较高的同源性，与美国草鱼呼肠孤病毒(AGCRV)、草鱼呼肠孤病毒873株(GCRV873)、水生呼肠孤病毒A(AquA)、美洲金体鳊呼肠孤病毒(GSV)、MRV血清型2、MRV血清型3和MRV血清型1的同源性分别为：25％、26％、25％、26％、20％、20％和20％，相似性分别为：37％、39％、37％、40％、36％、36％和37％，与ARV的同源性和相似性大约为24％和38％。初步认为HZ08S9的编码蛋白VP6与MRV的σ2和ARV的σA蛋白有很近的亲缘关系。GCRVⅡ为近几年新分离和研究的病毒，对病毒基因组各节段编码的蛋白功能还不清楚，哪些是结构蛋白，哪些是非结构蛋白也没有定论，S9基因编码的蛋白是否为结构蛋白一直还没有实验证实，也不清楚该蛋白的具体功能和免疫原性如何。

我们经实验证实，GCRVⅡ型S9基因编码的VP6蛋白为结构蛋白，能诱导免疫动物产生较高效价的特异性抗体，具有良好的免疫原性；针对VP6蛋白的抗体可以特异性识别GCRVⅡ型毒株，并对该类型毒株具有很强的中和能力；进一步试验表明，用VP6重组蛋白免疫草鱼，可使草鱼诱导产生较高的特异性抗体，并能对草鱼呼肠孤病毒强毒株的攻击起到一定的免疫保护作用。因此，对GCRVⅡ型VP6蛋白的研究和应用，对开发草鱼出血病新型疫苗及免疫学检测试剂盒具有极其重要的意义。

由此，本发明的一个目的在于提供一种VP6抗原蛋白，及由其制备得到的多克隆抗体。

本发明的另一个目的在于提供上述VP6抗原蛋白和抗VP6抗原蛋白的多克隆抗体在制备草鱼出血病基因工程疫苗或制备草鱼呼肠孤病毒检测试剂盒上中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种编码权利要求1所述蛋白的核酸，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

上述VP6蛋白作为鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的应用。

一种多克隆抗体，是以氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白为抗原，免疫动物制备所得。

上述VP6蛋白和/或上述的抗VP6蛋白的多克隆抗体在制备草鱼出血病基因工程疫苗中的应用。

上述VP6蛋白和/或上述的抗VP6蛋白的多克隆抗体在制备草鱼呼肠孤病毒检测试剂盒上的应用。

一种基因工程疫苗，含有上述的VP6蛋白或抗VP6蛋白的多克隆抗体。

一种检测草鱼呼肠孤病毒的试剂盒，含有上述的VP6蛋白和/或上述的抗VP6蛋白的多克隆抗体。

本发明的有益效果是：

本发明获得的重组蛋白具有较好的免疫原性，与GCRV其它结构蛋白相比，其诱导免疫动物产生的特异性抗体效价较高，其抗体效价可以达到1：:,2048，而其它结构蛋白诱导的特异性抗体效价一般在1:1024以下，。因此，S9基因编码的VP6蛋白是研制草鱼出血病基因工程疫苗较好的候选抗原。以VP6蛋白作为检测草鱼呼肠孤病毒抗体效价的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的包被抗原，能很好的识别GCRV感染或疫苗免疫草鱼产生的特异性抗体；并且，通过该方法获取的包被抗原，具有快速、特异、敏感、简便和安全的优点，克服了组织和细胞培养方法产生完整病毒作为间接ELISA包被抗原而造成的操作过程繁琐、不稳定、产量低、成本高的缺点。因此，本发明的GCRVⅡ型S9基因及其编码蛋白，对开发草鱼出血病新型疫苗、免疫学检测试剂盒及治疗产品具有重要的意义，为草鱼出血病提供新的有效解决途径。

附图说明

图1为GCRVⅡ型毒株S9基因PCR扩增产物电泳图，图1中M为DL marker 1000；1为阴性对照；2为以GCRV HZ08株病毒cDNA为模板的PCR扩增产物；

图2为重组质粒pET-32a-S9双酶切鉴定结果，图2中M为DL marker 15000；1为重组质粒pET-32a-0双酶切产物；

图3为SDS-PAGE分析重组质粒pET-32a-S9表达产物及其可溶性，图3中M为低分子质量蛋白质marker；1为IPTG诱导的pET-32a(+)的菌体；2为未经IPTG诱导的pET-32a-S9菌体；3为菌体超声波破碎后的上清；4为经IPTG诱导的pET-32a-S9菌体；5为菌体超声波破碎后的沉淀；

图4为S9基因编码重组蛋白经Ni柱纯化后SDS-PAGE分析结果，图4中M低分子质量蛋白质marker；1为未纯化的菌体总蛋白；2为纯化的VP6重组蛋白；3为通过Ni柱的流穿液；

图5为western blot分析VP6蛋白抗血清特性，图5中M低分子质量蛋白质marker；1为VP6重组蛋白；2为纯化的HZ08毒株；

图6为间接免疫荧光分析VP6蛋白抗血清特性，图6中A为接种HZ08株的GSB细胞；B为未接种病毒的正常GSB细胞对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

一、草鱼呼肠孤病毒HZ08株RNA的提取和S9基因片段扩增

按照Qiagen RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司，货号：74104)的说明书步骤，从感染GCRV HZ08株病毒的CIK细胞内中提取RNA，用TAKARA(购自大连宝生物工程有限公司，货号：)反转录试剂盒将病毒RNA反转录成cDNA。GCRV HZ08病毒株由珠江水产研究所鱼病室保藏。

根据GenBank(GenBank:GU350746.1)中GCRV-HZ08株S9基因序列设计1对引物，上游引物：5’-GAT GGA TCC ATA GTC TCG GAA GCC TAC CAA-3’(SEQ ID NO:3)；下游引物：5’-ATA CTC GAG AGC ACG CGT CCA GTT ATT-3’(SEQ ID NO:4)，在上下游引物序列中分别插入BanHⅠ和XhoⅠ酶切位点(带下划线的基因)，以上述制备的cDNA为模版，对S9基因进行PCR扩增。每25μL反应体系中加入2.5μL 10×PCR reaction buffer，0.5μL dNTP(10mMeach)，上、下游引物分别为0.5μL，2μL cDNA作为模版，LA Taq酶0.25μL，ddH₂O 18.75μL；反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，共35个循环，72℃延伸8min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现在约750bp处出现一条预期大小一致的特异性扩增条带(见图1)，用胶回收试剂盒回收纯化目的条带，经测序验证与预期相符。

二、pET-32a-S9重组表达载体构建

将PCR回收产物和原核表达载体pET-32a(+)分别双酶切处理(BanHⅠ1μl，XhoⅠ1μl，10×H buffer 2μl，质粒16μl)后，经1％琼脂糖电泳分析，胶回收S9目的片段和处理好的pET-32a(+)载体，用T4DNA连接酶连接S9目的片段和pET-32a(+)(T4Liqase 1.5μl，T4Liqase buffer 1.5μl，pET-32a(+)3μl，S9目的片段9μl，共15μl),，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，菌液PCR鉴定为阳性的提取质粒，质粒经双酶切和测序鉴定正确后，命名为pET-32a-S9，保存用于后续试验。

PCR和双酶切鉴定结果(见图2)均显示重组表达质粒pET-32a-S9构建正确，测序结果证实目的片段及阅读框均正确，且目的基因S9和pET-32a(+)的His-Tag标签蛋白在同一开放阅读框下。

三、诱导表达和可溶性分析

诱导表达：将鉴定正确的重组质粒pET-32a-S9转化到大肠杆菌BL21(DE3)，挑取LB/Amp平板筛选的阳性克隆，于LB/Amp培养基中，37℃，200rpm/min恒温摇床培养至光密度(OD600＝0.6)时，加入终浓度为1mmol/L的TPTG诱导，诱导10h后取200μl菌液离心收集菌体和上清备用，同时设立空载体pET-32a(+)作为阴性对照。

可溶性分析：将pET-32a-S9诱导表达20ml，离心收集菌体，用PBS重悬离心洗涤2次后，加入5ml PBS重悬菌体，在冰上超声波破碎(工作5s，间歇10s，功率250w)约2h至溶液澄清，吸取200μL破碎液，6000rpm/min离心5min，将上清吸到另一EP管记为溶液A，沉淀用200μl 6M的尿素溶解，记为溶液B，分别将A、B溶液进行SDS-PAGE，对该重组蛋白进行可溶性分析，若目的蛋白主要在A溶液中，则该蛋白为可溶性蛋白；若目的蛋白主要在B溶液中，则目的蛋白以包涵体形式存在。

经SDS-PAGE分析诱导表达的重组蛋白显示，重组质粒pET-32a-S9菌株在42ku处出现一条目的条带(见图3)，pET-32a(+)载体的的His-标签蛋白与目的蛋白一起融合表达。取超声波破碎液离心后的上清溶液A和6M尿素溶解沉淀的溶液B，经SDS-PAGE分析表明，融合标签蛋白的目的蛋白主要存在B溶液中，即目的蛋白主要以包涵体形式存在(见图3)。

四、诱导表达条件的优化

采用棋盘法优化诱导条件，把pET-32a-S9转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，LB/Amp平板筛选阳性菌落，挑取单菌落于3ml LB/Amp培养基中，在37℃，200rpm/min恒温摇床培养12h，然后将菌液接种20μL到2mL LB/Amp培养基中，在37℃，200rpm/min恒温摇床培养至光密度(OD600设0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，已实际测定为准)时，加入TPTG诱导(IPTG终浓度设0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mmol/L)，培养10h后取200μl菌液离心，收集菌体，经SDS-PAGE分析后用BandScan 5.0软件分析重组蛋白的相对表达量。

最后得出当诱导表达条件是：OD600为1.0左右，IPTG终浓度为1.6mmol/L时，其表达条件最佳，目的蛋白的含量可达70％以上。

五、目的蛋白的大量表达和纯化

挑取LB/Amp平板筛选得阳性单菌落到1mL LB/Amp培养基培养10～12h，然后将其接种到1L LB/Amp培养基，37℃，200rpm/min恒温摇床培养，在优化的表达条件下诱导表达。将诱导表达的菌液在10000rpm/min离心5min，收集菌体，用400ml PBS重悬离心洗涤2次，再加入100ml PBS重悬，在冰上超声波破碎至溶液澄清。将破碎液离心收集包涵体(该蛋白可溶性检验为包涵体蛋白)，然后参照Ni-凝胶纯化试剂盒(包涵体蛋白纯化)说明书纯化目的蛋白。用50ml Binding Buffer溶解包涵体过夜，将溶解液10000rpm/min离心20min收集上清，再0.45μm的滤膜过滤，将上清负载上已平衡好的Ni柱流速10倍柱体积/小时，收集流穿液；用15倍柱体积的Binding Buffer洗去未结合蛋白和杂蛋白，然后用20ml ElutionBuffer洗脱目的蛋白，收集洗脱峰(整个纯化过程在4℃冰箱中进行)。将Ni柱上洗脱下的蛋白装入透析袋，依次放入含6M，4M，2M，1M，0.5M，0M尿素的PBS溶液中透析，每个浓度透析12h(全部过程在4℃冰箱中进行)。透析完成后加入PEG-6000，4℃冰箱静置浓缩，浓缩50％后分装成1mL/管，用紫外吸光光度法测浓度后－20℃保存备用。

六、多克隆抗体的制备

将纯化的目的蛋白用无菌PBS稀释至200μg/ml后注射昆明小白鼠。第一次免疫用弗氏完全佐剂1:1乳化，注射量为200μL/只，共免疫10只。第二次免疫和第三次免疫用弗氏不完全佐剂1:1乳化，注射同样的量。每次免疫时间间隔14d。第三次免疫10d后天断尾取血，制备血清，用ELISA检测血清抗体的效价。如抗体效价不够，可以加强免疫一次，如足够高，则第14d摘眼球取血。采取的血样37℃静置1h后4℃冰箱静置过夜，第二天3000rpm/min离心8min，收集血清，－20℃保存备用。对照组注射无菌PBS制备阴性血清。

七、血清抗体效价测定

根据本实验室建立的草鱼呼肠孤病毒间接ELISA检测方法来测定血清抗体效价，即用纯化的VP6蛋白作为抗原包被聚苯乙烯反应板来建立的间接ELISA方法。其简要过程如下：将纯化的重组蛋白用pH9.6的碳酸盐缓冲液按1:10000倍稀释(50ng/ml)包被100μL于96孔酶标板，4℃过夜；用200μL 1％BSA于37℃封闭2h；将制备的血清按1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸、1:10⁹、1:10¹⁰等梯度稀释加入100μL，37℃孵育2h，以相应稀释倍数的阴性血清做对照；加入1：5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG100μL，37℃孵育1h；以上每步反应后都用200μL PBST洗板3—5次，每次5min；最后用TMB显色试剂盒显色20min，加入0.5M的H2SO4终止显色，在酶标仪(Infinite M200PRO)上读OD450值。当OD450≥0.277，且P/N≥2.1判定为阳性。

用间接ELISA法对VP6重组蛋白鼠抗血清进行效价测定，结果表明该抗体效价约为1:10⁵。

八、多克隆抗体特性分析

Western blot分析：将纯化的GCRV HZ08病毒、IPTG诱导的pET-32a(+)空载体和纯化的VP6重组蛋白经SDS-PAGE电泳，电泳结束后用半干转膜法将蛋白转移到NC膜上，用含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液4℃封闭过夜；加入1:1000稀释的血清，37℃孵育2h；加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；每次反应后用TBST洗3～5次，每次5min，最后用DAB显色剂显色并观察结果。

制备的多克隆抗体经western blot分析，加入纯化的GCRV HZ08毒株的孔道中，在约42ku处出现一条特异性条带，与病毒VP6自身编码的蛋白大小一致；在加入纯化的重组蛋白的孔道中，在约40ku处出现一条特异条带，与预期大小一直；而加入空载体菌体的孔道中没有任何条带。

间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescent assay，IFA)：将GSB细胞传代至96孔细胞培养板中，待细胞长至单层铺满80％左右后，感染HZ08病毒；感染病毒5d后，将细胞培养板中的培养基吸尽，用0.01mol/L的PBS洗涤3次，加入80％的丙酮溶液室温孵育30min，吸去丙酮，室温干燥1h；每孔加100μl 1：1000稀释的鼠抗VP6蛋白多克隆抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，加入1:50稀释的羊抗鼠IgG-FITC标记的荧光二抗100μl，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，荧光倒置显微镜(Nikon，Eclipse Ti-S)下观察结果。阴性对照为未感染病毒的正常GSB细胞。

间接免疫荧光实验的结果显示，制备的多克隆抗体能使感染HuNan1307毒株的GSB细胞能产生特异性的荧光(见图6中A)，而在未感染病毒的正常GSB细胞中观察不到荧光信号。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S9基因编码的重组蛋白及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1257

<212> DNA

<213> Grass Crap Reovirus

<400> 1

atggagcgat ccacttacaa tatctgcacc ccaggctttt tcggcgcgaa tgttccgcct 60

tttaaaacaa tagacataca acgatctacg acgggtggta atacgctttg gaatgcgcgc 120

ggtcacgatg ctttcaggac tcaccctaaa gtggtatctc atgagaagga tttccctcta 180

atttatacag agcagttcac attcaacttg cttattggcg cctgcctcca gcaaccccta 240

ctgcagaact cgattgaccg acagtggagg ggtatgattt ggacatctga tcggctcagc 300

tcgttgcgta tagcgccgcc gaactcacgt gctgctgatc tgccttgtgc atatcgtacg 360

ttggaccttg cgaattaccc actatgggga actgcacctg ctgccctaca gacactatgg 420

atggacagtt gtctgatgac attagagagt ttatctgcga gaggaccttt tctttacctc 480

cggcatcctc aagctcgacc agacgggaat gttttacgag ccttacagca gcatatttcc 540

aagccaatgg aggccatagt ctcggaagcc taccaatcaa tagctatggg acctttgaca 600

ttgcaagacg ggtattatcg cgctctgtca gtgatcaccc tcatctatct agcctctctg 660

accggtcgtc tgggccctga ccgtacatac tatggcttct acgtccaatt ccctaagaaa 720

aggaaattcg aggatctcgg atactttgcg tacaatgctg atggacgtaa cgtcgctgtc 780

ctgcaatcca ttaacgccta catctactgt gcctcacctg attggcagta cagctgtgcc 840

ctctactact tgcatgtcct ttcggcccta tcgctcccct ggactgatcc agttggaatg 900

ataaatggct tctcgtgtgt caatcaattc acggacgttc ctggttggtc aaccacaaac 960

cgtgctttgc acacgcatag cttcaactgg ttcaccctac tggaggacgc tattgacaca 1020

ctagttgcgc gtagatactg gaccaatgcc gagggacagg ccatacggca ggaatggacg 1080

gcggcgcgag acaggtggcg agtgatcatg gacgcaaccc gtgatgaaga tgacttggta 1140

gttttccgta cgccagacga ttgtcgtaga aggctcaaac cttatgggga caataactgg 1200

acgcgtgctt acgatactgc cgatgtggtg cgggtgttgg atcgcttatt cccttag 1257

<210> 2

<211> 418

<212> PRT

<213> Grass Crap Reovirus

<400> 2

Met Glu Arg Ser Thr Tyr Asn Ile Cys Thr Pro Gly Phe Phe Gly Ala

1 5 10 15

Asn Val Pro Pro Phe Lys Thr Ile Asp Ile Gln Arg Ser Thr Thr Gly

20 25 30

Gly Asn Thr Leu Trp Asn Ala Arg Gly His Asp Ala Phe Arg Thr His

35 40 45

Pro Lys Val Val Ser His Glu Lys Asp Phe Pro Leu Ile Tyr Thr Glu

50 55 60

Gln Phe Thr Phe Asn Leu Leu Ile Gly Ala Phe Leu Gln Gln Pro Leu

65 70 75 80

Leu Gln Asn Ser Ile Asp Arg Gln Trp Arg Gly Met Ile Trp Thr Ser

85 90 95

Asp Arg Leu Ser Ser Leu Arg Ile Val Pro Pro Asn Ser Arg Ala Ala

100 105 110

Asp Leu Pro Arg Ala Tyr Arg Thr Leu Asp Leu Ala Asn Tyr Pro Leu

115 120 125

Trp Gly Thr Ala Pro Ala Ala Leu Gln Thr Leu Trp Met Asp Ser Cys

130 135 140

Leu Met Thr Leu Glu Ser Leu Ser Ala Arg Gly Pro Phe Leu Tyr Leu

145 150 155 160

Arg His Pro Gln Ala Arg Pro Asp Glu Asn Val Leu Arg Ala Leu Gln

165 170 175

Gln His Ile Ser Lys Pro Met Glu Ala Ile Val Ser Glu Ala Tyr Gln

180 185 190

Ser Ile Ala Met Gly Pro Leu Thr Leu Gln Asp Gly Tyr Tyr Arg Ala

195 200 205

Leu Ser Val Ile Thr Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Leu Thr Gly Arg Leu

210 215 220

Gly Pro Asp Arg Thr Tyr Tyr Gly Phe Tyr Val Gln Phe Pro Lys Lys

225 230 235 240

Arg Lys Phe Glu Asp Leu Gly Tyr Phe Ala Tyr Asn Ala Asp Gly Arg

245 250 255

Asn Val Ala Val Leu Gln Ser Ile Asn Ala Tyr Ile Tyr Cys Ala Ser

260 265 270

Pro Asp Trp Gln Tyr Ser Cys Ala Leu Tyr Tyr Leu His Val Leu Ser

275 280 285

Ala Leu Ser Leu Ser Trp Thr Asp Pro Val Gly Met Ile Asn Gly Phe

290 295 300

Ser Cys Val Asn Gln Phe Thr Asp Val Pro Gly Trp Ser Thr Thr Asn

305 310 315 320

Arg Ala Leu His Thr His Ser Phe Asn Trp Phe Asn Leu Leu Glu Asp

325 330 335

Ala Ile Asp Thr Leu Val Ala Arg Arg Tyr Trp Thr Asn Ala Glu Gly

340 345 350

Gln Ala Ile Arg Gln Glu Trp Thr Ala Ala Arg Asp Arg Trp Arg Met

355 360 365

Ile Met Asp Ala Thr Arg Asp Glu Asp Asp Leu Val Val Phe Arg Thr

370 375 380

Pro Asp Asp Cys Arg Arg Arg Leu Lys Pro Tyr Gly Asp Asn Asn Trp

385 390 395 400

Thr Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Asp Val Val Arg Val Leu Asp Arg Leu

405 410 415

Phe Pro

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatggatcca tagtctcgga agcctaccaa 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atactcgaga gcacgcgtcc agttatt 27

Claims

1.一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S9基因编码的VP6蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1所述的VP6蛋白作为草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的应用。

4.一种多克隆抗体，其特征在于，是以氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白为抗原，免疫动物制备所得。

5.权利要求1所述的VP6蛋白和/或权利要求4所述的多克隆抗体在制备草鱼出血病基因工程疫苗中的应用。

6.权利要求1所述的VP6蛋白和/或权利要求4所述的多克隆抗体在制备草鱼呼肠孤病毒检测试剂盒上的应用。

7.一种基因工程疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的VP6蛋白或含有权利要求4所述的多克隆抗体。

8.一种检测草鱼呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的VP6蛋白和/或权利要求4所述的多克隆抗体。