CN106811417A - 一种用于微小亚历山大藻的培养基及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用于微小亚历山大藻的培养基及其培养方法。培养基具体包括以下摩尔浓度的各组分：硝酸钠为1766μmol/L，磷酸二氢钠为18.15μmol/L，氯化铁为5μmol/L，Na2EDTA为5μmol/L，硫酸铜为0.02μmol/L，钼酸钠为0.015μmol/L，硫酸锌为0.04μmol/L，氯化钴为0.025μmol/L，氯化锰为0.45μmol/L，天然海水。采用该培养基培养的微小亚历山大藻，能够及大地提高产毒量，并且其中的培养方法为连续培养方法，省时省力。

Description

一种用于微小亚历山大藻的培养基及其培养方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用于微小亚历山大藻的培养基及其培养方法。

背景技术

微小亚历山大藻（Alexandrium minutum）隶属原生生物界（Protoctista）、甲藻门（Dinoflagellata）、亚历山大属（Alexandrium），是一种有甲片的海洋浮游甲藻，细胞大小在13-30μm，分布广泛并且与产麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish toxins PSTs）赤潮有关。其体内产生的膝沟藻毒素(gonyautoxin)GTX1、GTX2、GTX3、GTX4，经软体动物富集，最终通过食物链传递给贝类、鱼类和人类，可引起人严重的麻痹性贝类毒素中毒（paralyticshellfish poisoning PSP），国内已发生多起因食用含麻痹性贝类毒素的织纹螺而导致死亡的事故。

麻痹性贝类毒素是一类具有神经毒害作用的生物碱，其中毒机理是毒素结合了钠离子通道结构，阻碍了钠离子的流动。中毒后没有解药，唯一的解救方法是人工呼吸和输液。PSTs因其毒性强烈、无色无味且具有麻痹作用，在军事上有应用于生化武器的可能性，在医疗上则作为探索新型麻醉剂的前体物质，而在环境和食品检测方面，国外已有部分PSTs毒素标准品出售，但售价昂贵。

制备膝沟藻毒素需要大量的原材料，通常通过培养产毒微藻来获得。微小亚历山大藻产毒量不仅受到光强、温度、盐度等环境因素影响，还受到氮磷等营养配方、培养方式的影响。现已知微小亚历山大藻通常培养在f/2海水培养基和K海水培养基中，但是它们并非产毒最佳的营养配方，如果用其大规模培养海藻，会造成资源的浪费和成本提高。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述存在的微小亚历山大藻所问题，提供一种用于微小亚历山大藻的培养基及其培养方法。

另外，由于亚历山大藻的生长对扰动较为敏感，本案采用半连续的培养方式，培养周期较短，省时省力。是一种非常适合微小亚历山大藻产毒的培养基，其方法是一种高效的培养方法。

这里，公布了一种用于培养微小亚历山大藻的培养基和半连续培养方法，能够显著提高产毒含量。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于微小亚历山大藻的培养基，具体包括以下摩尔浓度的各组分：硝酸钠为1766μmol/L，磷酸二氢钠为18.15μmol/L，氯化铁为5μmol/L，Na₂EDTA为5μmol/L，硫酸铜为0.02μmol/L，钼酸钠为0.015μmol/L，硫酸锌为0.04μmol/L，氯化钴为0.025μmol/L，氯化锰为0.45μmol/L，天然海水。

作为进一步优选，所述培养基还包括硝酸钐0.01μmol/L。

作为进一步优选，该培养基的配置方法具体如下：

（1）天然海水静置，取上清海水经0.22μm滤膜过滤，装在透明培养容器中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟；

（2）将各组分首先配制成储备液，硝酸钠储备液浓度为1766mmol/L，磷酸二氢钠储备液浓度为18.15mmol/L，微量金属元素储备液配制成组合储备液，含氯化铁5mmol/L，Na₂EDTA5mmol/L，硫酸铜0.02mmol/L，钼酸钠0.015mmol/L，硫酸锌0.04mmol/L，氯化钴0.025mmol/L，氯化锰0.45mmol/L，将储备液也在121℃高压蒸汽灭菌20分钟；

（3）在紫外灭菌30分钟后的超净工作台或培养室中，将1毫升氮储备液、1毫升磷储备液、1毫升微量金属元素储备液加入到灭菌海水中，定容至1L，使其配制成配方中规定的浓度，培养基即完成配制。

作为进一步优选，天然海水盐度通过添加氯化钠或纯水将盐度调节至24‰。

一种采用上述培养基培养微小亚历山大藻的培养方法，具体包括以下步骤：

（1）将处于对数生长期藻种接种于上述培养基中，调节初始密度为5000±200cell/ml，温度为25℃，光照为125±12.5µmol/(m²·s)，昼夜光照时间比为12h∶12h条件下静置培养8-9天；

（2）在其中加入等体积上述新制的培养基，进行扩大培养，培养4-5天；

（3）重复步骤（2）的培养过程，使培养液的体积不断增加；

（4）在一个步骤（2）的重复过程完成后，将培养器中的藻液取出部分，置于温度20℃，光照125±12.5µmol/(m²·s)，昼夜光照时间比为12h∶12h条件下静置培养，在3~5天后即可收获藻细胞，同时，向培养器中补充剩余藻液的等体积新制的培养基，与培养器中剩余的藻液混合，重复步骤（2）的培养过程；

（5）不断重复步骤（2）及步骤（4），获取到高毒素含量的微小亚历山大藻。

作为进一步优选，步骤（4）中，向取出来的藻液中添加硝酸钠，添加量为每升藻液1766umol。

本发明与现有技术相比，有益效果是：

1、提高了产毒量，比现有的产毒量（5.31μmol/L）提高了48.6%，可高达7.89μmol/L膝沟藻毒素；

2、为半连续培养方式，可以不断获取藻细胞，缩短培养周期，提高生产效率。培养时间从现有的22~30天缩短为7~10天。

3、减少了营养素种类，简化了操作，节约了开支，例如，本发明与现有培养基相比略去了维生素的添加。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。

如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。

实施例1：

一种用于微小亚历山大藻的培养基，具体包括以下摩尔浓度的各组分：硝酸钠为1766μmol/L，磷酸二氢钠为18.15μmol/L，氯化铁为5μmol/L，Na₂EDTA为5μmol/L，硫酸铜为0.02μmol/L，钼酸钠为0.015μmol/L，硫酸锌为0.04μmol/L，氯化钴为0.025μmol/L，氯化锰为0.45μmol/L，天然海水。

该培养基的配置方法具体如下：

（1）天然海水静置，取上清海水经0.22μm滤膜过滤，装在透明培养容器中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟；天然海水盐度通过添加氯化钠或纯水将盐度调节至24‰；

（2）将各组分首先配制成储备液，硝酸钠储备液浓度为1766mmol/L，磷酸二氢钠储备液浓度为18.15mmol/L，微量金属元素储备液配制成组合储备液，含氯化铁5mmol/L，Na₂EDTA5mmol/L，硫酸铜0.02mmol/L，钼酸钠0.015mmol/L，硫酸锌0.04mmol/L，氯化钴0.025mmol/L，氯化锰0.45mmol/L，将储备液也在121℃高压蒸汽灭菌20分钟；

（3）在紫外灭菌30分钟后的超净工作台或培养室中，将1毫升氮储备液、1毫升磷储备液、1毫升微量金属元素储备液加入到灭菌海水中，定容至1L，使其配制成配方中规定的浓度，培养基即完成配制。

一种采用上述培养基培养微小亚历山大藻的培养方法，具体包括以下步骤：

（1）将处于对数生长期藻种接种于上述培养基中，调节初始密度为5000±200cell/ml，温度为25℃，光照为125±12.5µmol/(m²·s)，昼夜光照时间比为12h∶12h条件下静置培养8-9天；

（2）在其中加入等体积上述新制的培养基，进行扩大培养，培养4-5天；

（3）重复步骤（2）的培养过程，使培养液的体积不断增加；

（4）在一个步骤（2）的重复过程完成后，将培养器中的藻液取出部分，并向其中添加硝酸钠，添加量为每升藻液1766umol；然后置于温度20℃，光照125±12.5µmol/(m²·s)，昼夜光照时间比为12h∶12h条件下静置培养，在3~5天后即可收获藻细胞，同时，向培养器中补充剩余藻液的等体积新制的培养基，与培养器中剩余的藻液混合，重复步骤（2）的培养过程；

（5）不断重复步骤（2）及步骤（4），获取到高毒素含量的微小亚历山大藻。

向取出来的藻液中添加硝酸钠，添加量为每升藻液1766umol。

实施例2：

一种用于微小亚历山大藻的培养基，具体包括以下摩尔浓度的各组分：硝酸钠为1766μmol/L，磷酸二氢钠为18.15μmol/L，氯化铁为5μmol/L，Na₂EDTA为5μmol/L，硫酸铜为0.02μmol/L，钼酸钠为0.015μmol/L，硫酸锌为0.04μmol/L，氯化钴为0.025μmol/L，氯化锰为0.45μmol/L，硝酸钐0.01μmol/L，天然海水。

该培养基的配置方法具体如下：

（1）天然海水静置，取上清海水经0.22μm滤膜过滤，装在透明培养容器中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟；天然海水盐度通过添加氯化钠或纯水将盐度调节至24‰；

（2）将各组分首先配制成储备液，硝酸钠储备液浓度为1766mmol/L，磷酸二氢钠储备液浓度为18.15mmol/L，微量金属元素储备液配制成组合储备液，含氯化铁5mmol/L，Na₂EDTA5mmol/L，硫酸铜0.02mmol/L，钼酸钠0.015mmol/L，硫酸锌0.04mmol/L，氯化钴0.025mmol/L，氯化锰0.45mmol/L，硝酸钐0.01mmol/L，将储备液也在121℃高压蒸汽灭菌20分钟；

（3）在紫外灭菌30分钟后的超净工作台或培养室中，将1毫升氮储备液、1毫升磷储备液、1毫升微量金属元素储备液加入到灭菌海水中，定容至1L，使其配制成配方中规定的浓度，培养基即完成配制。

一种采用上述培养基培养微小亚历山大藻的培养方法，具体包括以下步骤：

（1）将处于对数生长期藻种接种于上述培养基中，调节初始密度为5000±200cell/ml，温度为25℃，光照为125±12.5µmol/(m²·s)，昼夜光照时间比为12h∶12h条件下静置培养8-9天；

（2）在其中加入等体积上述新制的培养基，进行扩大培养，培养4-5天；

（3）重复步骤（2）的培养过程，使培养液的体积不断增加；

（4）在一个步骤（2）的重复过程完成后，将培养器中的藻液取出部分，并向其中添加硝酸钠，添加量为每升藻液1766umol；然后置于温度20℃，光照125±12.5µmol/(m²·s)，昼夜光照时间比为12h∶12h条件下静置培养，在3~5天后即可收获藻细胞，同时，向培养器中补充剩余藻液的等体积新制的培养基，与培养器中剩余的藻液混合，重复步骤（2）的培养过程；

（5）不断重复步骤（2）及步骤（4），获取到高毒素含量的微小亚历山大藻。

对实施例1和实施例2所培养的微小亚历山大藻进行测定，具体结果为：

实施例1中收获的藻细胞产毒量为6.63umol膝沟藻毒素每升藻液。实施例2中收获的藻细胞产毒量为7.89umol膝沟藻毒素每升藻液。硝酸钐的加入，对于后续的影响是积极的，相比未添加，有明显的提高。

Claims (6)

1.一种用于微小亚历山大藻的培养基，其特征在于，具体包括以下摩尔浓度的各组分：硝酸钠为1766μmol/L，磷酸二氢钠为18.15μmol/L，氯化铁为5μmol/L，Na₂EDTA为5μmol/L，硫酸铜为0.02μmol/L，钼酸钠为0.015μmol/L，硫酸锌为0.04μmol/L，氯化钴为0.025μmol/L，氯化锰为0.45μmol/L，天然海水。

2.根据权利要求1所述的一种用于微小亚历山大藻的培养基，其特征在于，所述培养基还包括硝酸钐0.01μmol/L。

3.根据权利要求1所述的一种用于微小亚历山大藻的培养基，其特征在于，该培养基的配置方法具体如下：

（1）天然海水静置，取上清海水经0.22μm滤膜过滤，装在透明培养容器中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟；

（2）将各组分首先配制成储备液，硝酸钠储备液浓度为1766mmol/L，磷酸二氢钠储备液浓度为18.15mmol/L，微量金属元素储备液配制成组合储备液，含氯化铁5mmol/L，Na₂EDTA5mmol/L，硫酸铜0.02mmol/L，钼酸钠0.015mmol/L，硫酸锌0.04mmol/L，氯化钴0.025mmol/L，氯化锰0.45mmol/L，将储备液也在121℃高压蒸汽灭菌20分钟；

（3）在紫外灭菌30分钟后的超净工作台或培养室中，将1毫升氮储备液、1毫升磷储备液、1毫升微量金属元素储备液加入到灭菌海水中，定容至1L，使其配制成配方中规定的浓度，培养基即完成配制。

4.根据权利要求1或3所述一种用于微小亚历山大藻的培养基，其特征在于，天然海水盐度通过添加氯化钠或纯水将盐度调节至24‰。

5.一种采用上述培养基培养微小亚历山大藻的培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）将处于对数生长期藻种接种于上述培养基中，调节初始密度为5000±200cell/ml，温度为25℃，光照为125±12.5µmol/(m²·s)，昼夜光照时间比为12h∶12h条件下静置培养8-9天；

（2）在其中加入等体积上述新制的培养基，进行扩大培养，培养4-5天；

（3）重复步骤（2）的培养过程，使培养液的体积不断增加；

（4）在一个步骤（2）的重复过程完成后，将培养器中的藻液取出部分，置于温度20℃，光照125±12.5µmol/(m²·s)，昼夜光照时间比为12h∶12h条件下静置培养，在3~5天后即可收获藻细胞，同时，向培养器中补充剩余藻液的等体积新制的培养基，与培养器中剩余的藻液混合，重复步骤（2）的培养过程；

（5）不断重复步骤（2）及步骤（4），获取到高毒素含量的微小亚历山大藻。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤（4）中，向取出来的藻液中添加硝酸钠，添加量为每升藻液1766umol。