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CN106795512B - 抗Orai1抗体 - Google Patents

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CN106795512B CN201580054267.1A CN201580054267A CN106795512B CN 106795512 B CN106795512 B CN 106795512B CN 201580054267 A CN201580054267 A CN 201580054267A CN 106795512 B CN106795512 B CN 106795512B
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Abstract

本发明的目的是提供用于移植排斥、免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓、癌症等的治疗和/或预防剂，所述药剂靶向人Orai1。提供包含具有特异性识别人Orai1并抑制人T细胞活化的活性的抗体的药物组合物等。

Description

抗Orai1抗体
技术领域
本发明涉及提供用于治疗病症或疾病的更高度活性的抗Orai1抗体。
背景技术
钙释放活化的钙（CRAC）通道是钙库操纵性钙通道(store-operated channels,SOC)的子集，所述钙库操纵性钙通道响应于胞内内质网中储存的钙的消耗而打开，且响应于胞外钙进入特定的非可兴奋性细胞，具体而言，免疫系统的细胞包括T细胞和肥大细胞，和细胞因此的活化。CRAC通道活性的抑制剂是本领域已知的，且其鉴定和治疗潜能已由Feske等人描述（非专利文献1和2）。
Orail（CRACM1：钙释放活化的钙调节子1，跨膜蛋白142A：TMEM142A），是由301个氨基酸残基构成的4次跨膜蛋白，已经被鉴定为通过形成同四聚体而构成CARC通道的孔形成亚基的组分（专利文献1和非专利文献3-5）。Orai基因家族包括人Orai1基因以及人Orai2和人Orai3基因，其各自与人Orai1基因具有90%或更高的同源性（非专利文献6）。在一些情况下，形成包含Orai2和/或Orai3蛋白和Orai1的异四聚体或异六聚体的可能性也已经被报道（非专利文献7和8）。Orai1由以下构成：偶联STIM-1（基质相互作用分子1）或STIM-2（其为感受胞内内质网中储存的钙的消耗的蛋白）的N末端和C末端胞质区、和4个跨膜结构域、由大约20个氨基酸残基构成的第一胞外环结构域、和由大约40个氨基酸残基构成的第二胞外环结构域（非专利文献9）。Orai1的DNA序列和氨基酸序列可获自公共数据库并且可以指定在例如登录号NM_032790和NP_116179 (NCBI)下。
已经发现人Orai1基因功能的先天性缺陷消除了CRAC通道活性并取消了机体对免疫原的应答，导致严重的免疫缺陷病况。因此，Orai1的分子功能已证实对于活化CRAC通道是必需的（非专利文献10和11）。因此，靶向Orai1分子的功能阻断性抗体可以用作CRAC通道活性的抑制剂。
在暗示CRAC通道活性抑制剂可以用于治疗患有免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、细胞或器官的移植排斥、血栓形成、癌症等的患者这一信息（非专利文献12）的教导下，已经尝试获得目标在于抑制Orai1的分子功能的抗Orai1抗体，并且已经研究了它们的作用（专利文献2和3以及非专利文献13和14）。尽管该文献表明每一抗体单独抑制T细胞的活化，但抑制活性仍不是足够强。这些抗体作为靶向Orai1的生物制剂的临床应用可能无法满足在需要高剂量或频繁施用、受限的施用方法等方面的临床需要。
引用列表
专利文献
专利文献1：国际申请号WO07/081804
专利文献2：国际申请号WO11/063277
专利文献3：国际申请号WO13/091903
非专利文献
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非专利文献2：Derler I, 等人, Expert Opin.Drug Discovery 3 (7), 第 787-800页 (2008)
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非专利文献4：Vig M, 等人, Science 312, 第1220-1223页 (2006)
非专利文献5：Park CY, 等人, Cell 136, 第876-890页 (2008)
非专利文献6：Mercer JC, 等人, J. Biol.Chem.281, 第24979-24990页 (2006)
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非专利文献9：Vig M, 等人, Curr.Biol.16, 第2073-2079页 (2006)
非专利文献10：Feske S, Nature 441, 第179-185页 (2006)
非专利文献11：McCarl CA, 等人, J. Allergy Clin.Immunol.124, 第1311-1318页 (2009)
非专利文献12：McCarl CA, 等人, J. Immunol.185, 第5845-5858页 (2010)
非专利文献13：Lin F, 等人, J. Pharmacol.Exp.Ther.345, 第225-238页(2013)
非专利文献14：Cox JH, 等人, PLOS ONE 8 (12), e82944 (2013)。
发明概述
技术问题
本发明的目标是提供用于移植排斥、免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成、癌症等的治疗和/或预防剂。
问题的解决方案
本发明人出于搜寻对移植排斥、免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成或癌症具有治疗和/或预防作用的物质的目的，已经获得大鼠抗Orai1抗体。所获得的大鼠抗Orai1抗体已经人源化，并且已经工程化该人源化抗体的CDR、框架和可变区。以这种方式，完成了本发明。
具体而言，本发明包括以下方面：
（1）抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，其中CDRH1由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成，CDRH2由SEQ ID NO: 104、106、107和108中任一种代表的氨基酸序列组成，和CDRH3由SEQ ID NO: 109或110代表的氨基酸序列组成；和
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，其中CDRL1由SEQ ID NO: 93、94和95中任一种代表的氨基酸序列组成，CDRL2由SEQ ID NO: 96、97和98中任一种代表的氨基酸序列组成，和CDRL3由SEQ ID NO: 101代表的氨基酸序列组成。
（2）根据（1）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，其中CDRH1由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成，CDRH2由SEQ IDNO: 106代表的氨基酸序列组成，和CDRH3由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成；和
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，其中CDRL1由SEQ ID NO: 93代表的氨基酸序列组成，CDRL2由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成，和CDRL3由SEQ IDNO: 101代表的氨基酸序列组成。
（3）根据（1）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，其中CDRH1由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成，CDRH2由SEQ IDNO: 106代表的氨基酸序列组成，和CDRH3由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成；和
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，其中CDRL1由SEQ ID NO: 94代表的氨基酸序列组成，CDRL2由SEQ ID NO: 97代表的氨基酸序列组成，和CDRL3由SEQ IDNO: 101代表的氨基酸序列组成。
（4）根据（1）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，其中CDRH1由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成，CDRH2由SEQ IDNO: 106代表的氨基酸序列组成，和CDRH3由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成；和
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，其中CDRL1由SEQ ID NO: 95代表的氨基酸序列组成，CDRL2由SEQ ID NO: 98代表的氨基酸序列组成，和CDRL3由SEQ IDNO: 101代表的氨基酸序列组成。
（5）根据（1）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，其中CDRH1由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成，CDRH2由SEQ IDNO: 107代表的氨基酸序列组成，和CDRH3由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成；和
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，其中CDRL1由SEQ ID NO: 93代表的氨基酸序列组成，CDRL2由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成，和CDRL3由SEQ IDNO: 101代表的氨基酸序列组成。
（6）根据（1）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，其中CDRH1由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成，CDRH2由SEQ IDNO: 108代表的氨基酸序列组成，和CDRH3由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成；和
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，其中CDRL1由SEQ ID NO: 93代表的氨基酸序列组成，CDRL2由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成，和CDRL3由SEQ IDNO: 101代表的氨基酸序列组成。
（7）根据（1）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，其中CDRH1由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成，CDRH2由SEQ IDNO: 104代表的氨基酸序列组成，和CDRH3由SEQ ID NO: 109代表的氨基酸序列组成；和
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，其中CDRL1由SEQ ID NO: 93代表的氨基酸序列组成，CDRL2由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成，和CDRL3由SEQ IDNO: 101代表的氨基酸序列组成。
(8)根据（1）或（2）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含由来自SEQID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
(9)根据（8）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
(10)根据（8）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 70代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
(11)根据（1）或（3）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含由来自SEQID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 58代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
(12)根据（11）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 58代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
(13)根据（1）或（4）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含由来自SEQID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 60代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
(14)根据（13）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 60代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
(15)根据（1）或（5）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含由来自SEQID NO: 64代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
(16)根据（15）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 64代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
(17)根据（1）或（6）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含由来自SEQID NO: 66代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
(18)根据（17）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 66代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
(19)根据（1）或（7）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体包含由来自SEQID NO: 43代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
(20)根据（19）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 43代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-235的氨基酸残基组成。
（21）根据（1）-（20）中任一项的抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab')2、Fab'和Fv。
（22）根据（1）-（8）、（11）、（13）、（15）、（17）和（19）中任一项的抗体，其中所述抗体是scFv。
（23）药物组合物，其包含根据（1）-（22）的至少一种抗体或抗体的抗原结合片段。
（24）根据（23）的药物组合物，其中所述药物组合物是用于移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病或癌症的治疗和/或预防剂、抗血小板或抗血栓活化剂或Orai1表达细胞活化的抑制剂。
（25）根据（24）的药物组合物，其中所述移植排斥是针对移植器官或组织诸如心、肾、肝、骨髓、或皮肤的排斥反应和宿主抗移植物反应、和由移植造血细胞（骨髓、外周血、脐带血等）引起的移植物抗宿主病。
（26）根据（24）的药物组合物，其中所述免疫相关疾病是结缔组织或肌肉骨骼疾病（类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎等）、血液病（再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等）、胃肠道疾病（克罗恩病、溃疡性结肠炎等）、神经系统疾病（多发性硬化、重症肌无力等）、眼疾病（葡萄膜炎等）、血管疾病（白塞病、韦格纳肉芽肿等）、表皮疾病（银屑病、天疱疮、白斑病等）、内分泌疾病（1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯氏病、桥本氏病等）等，变应性性疾病是特应性皮炎、哮喘、过敏反应、类过敏反应、食物过敏、鼻炎、中耳炎、药物反应、昆虫咬伤反应、对植物的反应、乳胶过敏、结膜炎、荨麻疹等，炎性疾病是炎症性肾病（肾小球肾炎、肾病等）、炎性肺部疾病（慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、间质性肺炎等）、炎症性肠疾病（溃疡性结肠炎、回肠炎等）、炎症性肝病（自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等）、炎性心脏病（心肌炎、缺血性心脏病、动脉粥样硬化等）、炎症性皮肤疾病（接触性皮炎、湿疹等）、炎症性眼病（沙眼、眼内炎等）、炎症性中枢神经疾病（脑膜炎、脑脊髓炎、自身免疫性脑炎等）、炎症性关节疾病（关节炎、骨关节炎等）、全身炎症（败血症、出血、超敏反应、由癌症化疗等引起的休克症状等），等等。
（27）根据（24）的药物组合物，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、皮肤癌、白血病等，和抗血小板或抗血栓活性可用于治疗和/或预防的病例是心肌梗死、中风、缺血性心脏病、血栓形成等，和抑制Orai1表达细胞活化可用于治疗和/或预防的病例是肥大细胞白血病、肥大细胞增多症、嗜碱细胞性白血病、子宫内膜异位症、管状聚集性肌病、Stormorken综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、特应性皮炎等等。
（28）多核苷酸，其编码根据（1）-（22）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。
（29）载体，其包含根据（28）的多核苷酸。
（30）转化的宿主细胞，其包含根据（28）的多核苷酸。
（31）转化的宿主细胞，其包含根据（29）的载体。
（32）用于产生根据（1）-（22）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其包括培养根据（30）或（31）的宿主细胞和从培养产物纯化抗体的步骤。
（33）抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为80 ng/mL或更低。
（34）根据（33）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为10 ng/mL或更低。
（35）抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中从用PMA和A23187处理的人外周血单核细胞（PBMC）释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为100 ng/mL或更低。
（36）根据（35）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为20 ng/mL或更低。
（37）抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为800 ng/mL或更低。
（38）根据（37）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为40 ng/mL或更低。
本发明的有利效果
根据本发明，可以获得基于抑制CRAC通道活性作为作用机制的用于移植排斥、免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成或癌症的治疗和/或预防剂。
附图简述
[图1] 图1是显示R118和R198各自以浓度依赖性方式结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。
[图2] 图2是显示R118和R198各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。
[图3] 图3是显示cR118和cR198各自以浓度依赖性方式结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。
[图4] 图4是显示cR118和cR198各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。
[图5] 图5是显示人源化抗人Orai1抗体hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3和hR198_H4/L4如同亲本抗体cR118或cR198各自以浓度依赖性方式结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。
[图6] 图6是显示人源化抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。
[图7] 图7是显示通过核糖体展示获得的突变的Fab克隆LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057、HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124和HEP237相比于亲本抗体Fab hR198_H4/L4-Fab各自更强地结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。
[图8] 图8是显示亲和力突变抗体hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1和hR198_HG3/LG1以与亲本抗体hR198_H3/L3或hR198_H4/L4相当的或比起更强的水平各自结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。
[图9] 图9是显示亲和力突变抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。
[图10] 图10是显示10F8、14F74和17F6抗体各自结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。
[图11] 图11是显示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1和5H3.1抗体各自结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞的图。
[图12] 图12是显示抗Orai1单克隆抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放的图。
[图13] 图13是显示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74和17F6针对从Jurkat细胞的IL-2释放的半最大抑制浓度(IC50)和80%抑制浓度(IC80)的图。
[图14] 图14是显示编码R118轻链可变区的核苷酸序列和可变区的氨基酸序列的图。
[图15] 图15是显示编码R118重链可变区的核苷酸序列和可变区的氨基酸序列的图。
[图16] 图16是显示编码R198轻链可变区的核苷酸序列和可变区的氨基酸序列的图。
[图17] 图17是显示编码R198重链可变区的核苷酸序列和可变区的氨基酸序列的图。
[图18] 图18是显示编码人嵌合cR118轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图19] 图19是显示编码人嵌合cR198轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图20] 图20是显示编码人嵌合cR118重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图21] 图21是显示编码人嵌合cR198重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图22] 图22是显示编码hR198_L1型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图23] 图23是显示编码hR198_L2型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图24] 图24是显示编码hR198_L3型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图25] 图25是显示编码hR198_L4型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图26] 图26是显示编码hR198_H1型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图27] 图27是显示编码hR198_H2型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图28] 图28是显示编码hR198_H3型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图29] 图29是显示编码hR198_H4型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图30] 图30是显示编码hR198_LG1型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图31] 图31是显示编码hR198_LG2型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图32] 图32是显示编码hR198_LG3型轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图33] 图33是显示编码hR198_HG1型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图34] 图34是显示编码hR198_HG2型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图35] 图35是显示编码hR198_HG3型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图36] 图36是显示编码hR198_H4-LALA型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图37] 图37是显示编码hR198_HG1-LALA型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图38] 图38为显示对应于cR118、cR198、hR198_L1至hR198_L4和hR198_LG1至hR198_LG3轻链的每一个和cR118、cR198、hR198_H1至hR198_H4、hR198_HG1至hR198_HG3、hR198_H4-LALA和hR198_HG1-LALA重链的每一个中包含的CDR序列的SEQ ID NO的图。
[图39] 图39是显示编码2C1.1抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图40] 图40是显示编码2C1.1抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图41] 图41是显示编码5H3.1抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图42] 图42是显示编码5H3.1抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图43] 图43是显示编码10F8抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图44] 图44是显示编码10F8抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图45] 图45是显示编码14F74抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图46] 图46是显示编码14F74抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图47] 图47是显示编码17F6抗体重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图48] 图48是显示编码17F6抗体轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列的图。
[图49] 图49是显示编码hR198_H0型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图50] 图50是显示编码hR198_H5型重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列的图。
[图51] 图51是显示抗Orai1单克隆抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的人PBMC的IL-2释放的图。
[图52] 图52是显示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74和17F6针对从人PBMC的IL-2释放的半最大抑制浓度(IC50)和80%抑制浓度(IC80)的图。
[图53] 图53是显示抗Orai1单克隆抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的人PBMC的IFN-γ释放的图。
[图54] 图54是显示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74和17F6针对从人PBMC的IFN-γ释放的半最大抑制浓度(IC50)和80%抑制浓度(IC80)的图。
[图55] 图55是显示hR198_HG1/LG1抑制与由移植人PBMC至严重联合免疫缺陷小鼠发生的移植物抗宿主病相关的体重减轻的图。
[图56] 图56是显示hR198_HG1/LG1抑制人Orai1敲入小鼠中诱导的被动皮肤过敏反应的图。
[图57] 图57是显示hR198_HG1/LG1在抗原施用后的6小时（A）、24小时（B）和48小时（C）的各个时间点抑制人Orai1敲入小鼠中诱导的迟发性超敏反应的图。
[图58] 图58是显示hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1和2C1.1抗体以90 mg/mL、120 mg/mL和150 mg/mL的浓度测量的粘度。
实施方案描述
在本说明书中，术语“基因”不仅包括DNA，还包括mRNA、cDNA和cRNA。
在本说明书中，术语“多核苷酸”用如核酸的相同含义使用且还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
在本说明书中，术语“多核苷酸”和术语“蛋白”可彼此互换使用。
在本说明书中，术语“RNA级分”指含有RNA的级分。
在本说明书中，术语“细胞”包括个体动物和培养细胞中的细胞。
在本说明书中，术语“Orai1”用与Orai1蛋白的相同含义使用。
在本说明书中，术语“抗体的抗原结合片段”意指具有针对抗原的结合活性的抗体的部分片段且包括从抗体片段形成的Fab、F(ab')2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体和多特异性抗体等等。抗体的抗原结合片段也包括Fab'，其为通过在还原性条件下处理F(ab')2获得的抗体可变区的单价片段。然而，抗体的抗原结合片段不限于这些分子，只要抗原结合片段具有结合抗原的能力。此类抗原结合片段不仅包括通过用合适的酶处理抗体蛋白的全长分子获得的片段，还包括使用基因工程化的抗体基因在合适的宿主细胞中产生的蛋白。
抗体分子的重链和轻链已知各自具有三个互补性决定区域（CDR）。互补性决定区域也称为高变域。这些区域位于抗体重链和轻链的可变区中。这些位点具有尤其高度变化的一级结构且在重链和轻链多肽链的各一级结构上分布在三个位置。在本说明书中，抗体的互补性决定区域对于重链的互补性决定区域而言自重链氨基酸序列的氨基末端称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，且对于轻链的互补性决定区域而言自轻链氨基酸序列的氨基末端称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。这些位点在三维结构上彼此靠近且决定针对待结合抗原的特异性。
在本发明中，短语“在严格条件下杂交”意指在涉及在68℃下杂交的条件下在可商购杂交溶液ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech Laboratories, Inc.)中的杂交，或者在0.7-1.0 M NaCl存在的情况下在68℃下使用DNA固定化滤器杂交，随后在68℃下使用具有0.1-2 × 浓度的SSC溶液(具有1 × 浓度的SSC由150 mM NaCl和15 mM柠檬酸钠组成)洗涤，其允许在与其等同的条件下鉴定或杂交。
在本发明中，术语“宿主抗移植物反应”指器官移植后观察到的受体的超免疫状态和由其产生的对移植器官的损伤。
在本发明中，术语“移植物抗宿主病”指表现为在造血细胞移植后由移植的细胞对受体的免疫攻击的症状。
1.Orai1
本发明中使用的Orai1可以直接从人、非人哺乳动物（例如，豚鼠、大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、牛或猴）、或鸡的T细胞或肥大细胞中纯化，或者可以用于从细胞制备的细胞膜级分中。可选地，Orai1可以体外合成或者通过基因操作从宿主细胞中产生来获得。在此类基因操作中，具体而言，将Orai1 cDNA插入允许表达的载体中，并随后在含有转录和翻译所必需的酶、底物和能量物质的溶液中合成Orai1，或者通过转化不同的原核或真核生物的宿主细胞进行表达来获得蛋白。
人Orai1 cDNA的核苷酸序列登记在GenBank中登录号: NM_032790下。小鼠Orai1cDNA的核苷酸序列登记在GenBank中登录号: NM_175423下。编码人Orai1的核苷酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO: 1中，并且人Orai1的氨基酸序列显示于序列表中的SEQ IDNO: 2中。Orai1也称为钙释放活化钙调节子1（CRACM1）或跨膜蛋白142A (TMEM142A)，其均表示相同分子。
Orai1 cDNA可以通过所谓的PCR方法获得，所述方法涉及进行聚合酶链反应（下文中称为“PCR”）(Saiki, R.K., 等人, Science, (1988) 239, 487-49)，例如，用表达Orai1mRNA的器官的cDNA文库作为模板使用特异性扩增Orai1 cDNA的引物。
术语“Orai1 cDNA”还包括这样的多核苷酸，其在严格条件下与由与编码人或小鼠Orai1的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的的多核苷酸杂交并且编码具有与Orai1等同的生物活性的蛋白。术语“Orai1 cDNA”进一步包括已由人或小鼠Orai1基因座转录的剪接变体的cDNA或在严格条件下与由与所述剪接变体互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交且编码具有与Orai1等同的生物活性的蛋白的多核苷酸。
术语“Orai1”还包括这样的蛋白，所述蛋白由来源于人或小鼠Orai1的氨基酸序列的氨基酸序列或者其通过取代、缺失或添加1、2或3、或4或5个氨基酸而不含信号序列的氨基酸序列组成并且具有与Orai1等同的生物活性。术语“Orai1”还包括这样的蛋白，所述蛋白由从人或小鼠Orai1基因座转录的剪接变体编码的氨基酸序列或者来源于该氨基酸序列并取代、缺失或添加1、2或3、或4或5个氨基酸的氨基酸序列组成并且具有与Orai1等同的生物活性。
2.抗Orai1抗体的产生
本发明的针对Orai1的抗体可以根据常规方法通过用Orai1或选自Orai1的氨基酸序列的任意多肽免疫动物并收集和纯化体内产生的抗体来获得。用作抗原的Orai1的物种不限于人，并且可以用来源于非人动物诸如小鼠或大鼠的Orai1免疫动物。在这种情况下，所获得的结合异源Orai1的抗体可以用人Orai1测试其交叉反应性以选择可应用于人疾病的抗体。抗原Orai1可以通过基因操作通过允许宿主细胞产生Orai1基因来获得。具体而言，制备允许表达Orai1基因的载体并转染至宿主细胞以表达该基因。可以纯化表达的Orai1。
本发明针对Orai1的抗体还可以通过使用DNA免疫方法来获得。DNA免疫方法是涉及用抗原表达质粒转染动物（例如小鼠或大鼠）并在动物中表达抗原以诱导针对该抗原的免疫的方法。转染方法包括直接注射质粒入肌肉中的方法、注射质粒和脂质体、聚乙烯亚胺等的复合物入血管中的方法、使用病毒载体的方法、使用基因枪注射附有质粒的金颗粒、以大量快速注射质粒溶液入血管的水动力学法，等等。称为体内电穿孔的技术涉及应用电穿孔至给予肌内注射的质粒的位点，其已知是用于提高注射表达质粒至肌肉的转染方法的表达水平的方法(Aihara H, Miyazaki J., Nat Biotechnol.1998 Sep；16 (9):867-70或Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P,Branellec D, Schwartz B, Scherman D., Proc Natl Acad Sci USA.1999 Apr 13；96(8):4262-7)。该方法通过用透明质酸酶处理肌肉随后肌内注射质粒来进一步提高表达水平(McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther.2001 Aug；8 (16):1264-70)。
单克隆抗体还可以根据本领域已知的方法(例如, Kohler和Milstein, Nature(1975) 256, p. 495-497；和Kennet, R. 编辑, Monoclonal Antibodies, p. 365-367,Plenum Press, N.Y. (1980))通过融合产生针对Orai1的抗体的产抗体细胞与骨髓瘤细胞以建立杂交瘤来获得。此类方法的具体实例描述于国际公开号WO09/48072 (公开于2009年4月16日)和WO10/117011 (公开于2010年10月14日)。
因此建立的大鼠抗人Orai1抗体的实际实例可以包括R118和R198抗体。R118抗体的轻链可变区的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 11中并且R118抗体的重链可变区的序列显示于序列表的SEQ ID NO: 13中。R198抗体的轻链可变区的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO: 15中并且R198抗体的重链可变区的序列显示于序列表的SEQ ID NO:17中。
本发明的抗体包括上文所述的针对Orai1的单克隆抗体以及对于例如减少针对人的异种抗原性的目的而人工工程化的重组抗体，例如，嵌合抗体和人源化抗体、人抗体，等等。这些抗体可以通过使用已知方法来产生。
嵌合抗体的实例可以包括含有来源于不同物种的抗体的可变区和恒定区，例如，连接人来源的恒定区的小鼠或大鼠来源的抗体的可变区的嵌合抗体（参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)）。
来源于大鼠抗人Orai1抗体R118的嵌合抗体的实例可以包括由包含由SEQ ID NO:23的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 27的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体。此类R118来源的嵌合抗体的一个实例可以包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO: 23的位置21-234处的氨基酸残基组成且所述重链由SEQ ID NO: 27的位置20-466处的氨基酸残基组成。在本说明书中，这种抗体称为“cR118”或“cR118抗体”。
来源于大鼠抗人Orai1抗体R198的嵌合抗体的实例可以包括由包含由SEQ ID NO:25的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 29的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体。此类R198来源的嵌合抗体的一个实例可以包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO: 25的位置21-234处的氨基酸残基组成且所述重链由SEQ ID NO: 29的位置20-466处的氨基酸残基组成。在本说明书中，这种抗体称为“cR198”或“cR198抗体”。
上述针对Orai1的嵌合抗体的序列可以人工工程化以制备作为基因重组抗体的人源化抗体，用于例如降低针对人的异种抗原性的目的。本发明的抗体包括其CDR为人源化抗体的工程化的CDR的抗体。这些抗体可以通过使用已知方法来产生。
人源化抗体的实例可以包括含有单独嫁接入人来源的抗体中的互补性决定区域（CDR）的抗体(参见Nature (1986) 321, 第522-525页)，和包含CDR序列以及嫁接入人抗体的框架部分的氨基酸残基的抗体（国际公开号WO90/07861）。
来源于cR118或cR198的人源化抗体保留来源于cR118或cR198的所有6个CDR序列并具有抑制T细胞活化的活性。人源化抗体的轻链可变区保留由SEQ ID NO: 92(RASQSIGNSLS)代表的氨基酸序列组成的CDRL1和由SEQ ID NO: 116 (RASQSISNSLS)代表的氨基酸序列组成的CDRL1中任一者、由SEQ ID NO: 96 (STSTLES)代表的氨基酸序列组成的CDRL2、和由SEQ ID NO: 99 (LQFATFPDT)代表的氨基酸序列组成的CDRL3和SEQ ID NO:100 (LQFATYPDT)中显示的CDRL3中任一者。而且，人源化抗体的重链可变区保留由SEQ IDNO: 102 (AYYIS)代表的氨基酸序列组成的CDRH1和SEQ ID NO: 103 (SYYIS)中显示的CDRH1中任一者、由SEQ ID NO: 104 (YIDMGNGRTNYNARFKG)代表的氨基酸序列组成的CDRH2和SEQ ID NO: 105 (YVDMGNGRTNYNEKFKG)中显示的CDRH2中任一者、和由SEQ ID NO: 109(DSNWGVDY)代表的氨基酸序列组成的CDRH3。CDR的这些氨基酸序列还显示于图38中。
具有优选组合的CDR的抗体的实例可以包括含有由SEQ ID NO: 92代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQ ID NO: 100代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQ ID NO: 103代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQID NO: 105代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 109代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体，和含有由SEQ ID NO: 92代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQ ID NO: 99代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQID NO: 102代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO: 104代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 109代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体。
人源化抗体的优选实例可以包括由包含由SEQ ID NO: 31的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 39的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQ ID NO: 33的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 41的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQ ID NO: 35的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 43的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、和由包含由SEQ ID NO: 37的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 45的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体。
其更优选的实例可以包括由由SEQ ID NO: 31的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 39的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQID NO: 33的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 41的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQ ID NO: 35的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 43的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、和由由SEQ ID NO: 37的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 45的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体。
本发明的抗体可以是通过进一步突变上述人源化抗体获得的具有结合Orai1的增强能力的抗体。此类方法称为亲和力成熟。该方法的具体实例可以包括核糖体展示方法。核糖体展示方法是涉及使用经核糖体结合到具有其遗传信息的mRNA的蛋白的三重复合物(tripartite complex)并分离编码结合靶分子的蛋白的基因序列的方法(Stafford RL.等人, Protein Eng. Des.Sel.2014 (4):97-109)。
通过上述方法基因工程化的抗体的轻链可变区保留由SEQ ID NO: 93(RASQSIGGSLS)代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO: 94 (HASQNIGGSLS)代表的氨基酸序列组成的CDRL1和由SEQ ID NO: 95 (HASRNIGGSLS)代表的氨基酸序列组成的CDRL1中任一种，由SEQ ID NO: 96 (STSTLES)代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQ IDNO: 97 (LTSTLDW)代表的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO: 98 (LTSSLDW)代表的氨基酸序列组成的CDRL2中任一种，和由SEQ ID NO: 101 (LQFAIFPDS)代表的氨基酸序列组成的CDRL3。而且，基因工程化的抗体的重链可变区保留由SEQ ID NO: 102 (AYYIS)代表的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO: 104 (YIDMGNGRTNYNARFKG)代表的氨基酸序列组成的CDRH2、由SEQ ID NO: 106 (YIDMGNGRTDYNARFKG)代表的氨基酸序列组成的CDRH2、由SEQ ID NO: 107 (YIDMGNGRTDYNGRFKG)代表的氨基酸序列组成的CDRH2和显示于SEQ IDNO: 108 (YIDMGNGRTDYNMRFKG)中的CDRH2中任一种，和由SEQ ID NO: 109 (DSNWGVDY)代表的氨基酸序列组成的CDRH3或由SEQ ID NO: 110 (DSNWGADY)代表的氨基酸序列组成的CDRH3。CDR的这些氨基酸序列还显示于图38中。
具有优选组合的CDR的抗体的实例可以包括含有由SEQ ID NO: 93代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQ ID NO: 101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQID NO: 106代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体，含有由SEQ ID NO: 94代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO: 97代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQ ID NO: 101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQID NO: 102代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO: 106代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体，含有由SEQ ID NO: 95代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO: 98代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQID NO: 101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO: 106代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体，含有由SEQ ID NO: 93代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQID NO: 96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQ ID NO: 101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO: 107代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 110代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体，含有由SEQ ID NO: 93代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQ ID NO: 101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO: 108代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO:110代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体，和含有由SEQ ID NO: 93代表的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO: 96代表的氨基酸序列组成的CDRL2、由SEQ ID NO: 101代表的氨基酸序列组成的CDRL3、由SEQ ID NO: 102代表的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO:104代表的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO: 109代表的氨基酸序列组成的CDRH3的抗体。
遗传工程化的CDR抗体的优选实例可以包括由包含由SEQ ID NO: 56的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 62的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQ ID NO: 58的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 62的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQ ID NO: 60的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 62的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQ ID NO: 56的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 64的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、由包含由SEQ ID NO: 56的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 66的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体、和由包含由SEQ ID NO: 56的位置21-126处的氨基酸残基组成的轻链可变区的轻链和包含由SEQ ID NO: 43的位置20-136处的氨基酸残基组成的重链可变区的重链组成的抗体。
包含上述轻链可变区和重链可变区的抗体的优选实例可以包括由由SEQ ID NO:56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 62的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQ ID NO: 58的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 62的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQ IDNO: 60的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 62的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQ ID NO: 56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 64的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQID NO: 56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 66的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、和由由SEQ ID NO: 56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 43的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体。
为了规避针对表达人Orai1的正常细胞的细胞毒性，期望抗体应具有低效应子活性。效应子活性已知在抗体亚类中是不同的。观察到以下特征，例如，IgG4具有低ADCC和CDC活性，且IgG2具有CDC活性，但具有低ADCC活性。在这些特征的基础上，可以通过用IgG2或IgG4的恒定区置换IgG1的恒定区来制备具有降低的ADCC和CDC活性的抗体。而且，可以通过参考IgG2或IgG4部分取代IgG1的恒定区序列来制备具有降低的ADCC和CDC活性的IgG1抗体。作为一个实例，Marjan Hezareh 等人, Journal of Virology, 75 (24):12161-12168(2001)显示IgG1的ADCC和CDC活性通过用丙氨酸残基置换IgG1的位置234和235（位置通过Kabat等人的EU索引来表示）处的每一亮氨酸残基来降低。
通过上述方法制备的抗Orai1抗体的重链的实例可以包括SEQ ID NO: 68或70中显示的重链序列。SEQ ID NO: 68或70中显示的重链可以与本说明书中描述的每一轻链序列组合并用作治疗性抗体。待组合的轻链的具体实例可以包括SEQ ID NO: 31、33、35、37、56、58或60中描述的轻链。具有优选组合的轻链和重链的抗体的实例可以包括由由SEQ IDNO: 56的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 70的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、由由SEQ ID NO: 58的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 70的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体、和由由SEQ ID NO: 60的位置21-234处的氨基酸残基组成的轻链和由SEQ ID NO: 70的位置20-466处的氨基酸残基组成的重链组成的抗体。
已知羧基末端赖氨酸残基在培养的哺乳动物细胞中产生的抗体的重链中被缺失(Journal of Chromatography A, 705:129-134 (1995))。还已知两个羧基末端氨基酸残基（甘氨酸和赖氨酸）在重链中缺失，且新位于羧基末端的一个脯氨酸残基被酰胺化(Analytical Biochemistry, 360:75-83 (2007))。然而，重链序列的此类缺失和修饰对于抗体结合抗原的能力和抗体的效应子功能（补体活化和抗体依赖性细胞毒性作用等）并无影响。因此，本发明的抗体还包括因此修饰的抗体。其实例可以包括通过缺失重链羧基末端处的1个2个氨基酸获得缺失突变体和该缺失突变体的酰胺化形式（例如，在羧基末端位点处的脯氨酸残基处酰胺化的重链）。然而，根据本发明的抗体的重链羧基末端缺失突变体不限于上述类型，只要缺失突变体保留结合抗原的能力和效应子功能。构成根据本发明的抗体的两个重链可以是选自全长重链和上述的缺失突变体的重链的任一种类型的重链，或者可以是由其所选的任两种类型的组合。每一缺失突变体的定量比率可以受产生根据本发明的抗体的培养哺乳动物细胞的类型和培养条件所影响。根据本发明的抗体的主要组分的实例可以包括两个重链，其两者均缺少一个羧基末端氨基酸残基。具体而言，由显示于序列表的SEQ ID NOs: 27、29、39、41、43、45、62、64、66、68和70的每一个中的重链序列中位置20-465处的氨基酸残基组成的重链或由其中位置20-464处的氨基酸残基组成的重链也可以用于本发明的抗体中。
通过这些方法获得的抗体可评价其针对抗原的结合活性以选择合适的抗体。另一个比较抗体特性的指标的一个实例可以包括抗体稳定性。差示扫描量热法（DSC）是能够快速且准确测量热变性中点（Tm）的方法，所述热变性中点（Tm）用作蛋白的相对结构稳定性的良好指标。Tm值可以使用DSC测量比进行比较以确定不同的热稳定性。抗体的储存稳定性已知在一些程度上与抗体的热稳定性相关(Lori Burton, 等人, PharmaceuticalDevelopment and Technology (2007) 12, p. 265-273)。合适的抗体可以用热稳定性作为指标进行选择。其他选择抗体的指标实例可以包括在合适宿主细胞中的高产量和水溶液中的低聚集。例如，由于具有最高产量的抗体并不总是展示出最高的热稳定性，最适合施用于人的抗体必须基于上述指标通过综合判断来选择。
通过经合适接头连接抗体的全长重链和轻链序列获得单链免疫球蛋白的方法也是已知的(Lee, H-S, 等人, Molecular Immunology (1999) 36, p. 61-71；andSchirrmann, T. 等人, mAbs (2010), 2 (1), p. 73-76)。此类单链免疫球蛋白可以二聚化以由此保持与原始为四聚体的抗体相似的结构和活性。而且，本发明的抗体可以是具有单个重链可变区且没有轻链序列的抗体。此类抗体称为单域抗体（sdAb）或纳米抗体，已实际在骆驼和美洲驼中观察到并报道为保持结合抗原的能力(Muyldemans S. 等人,Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35；和Hamers-Casterman C. 等人, Nature (1993)363 (6428), 446-8)。这些抗体可以解释为根据本发明的抗体的一类抗原结合片段。
本发明的抗体的抗体依赖性细胞细胞毒性活性可以通过调整结合到抗体的糖链的修饰来增强。例如，WO99/54342、WO00/61739和WO02/31140中描述的方法已知作为调整抗体的糖链修饰的此类技术的实例，尽管该技术并不限于此。
在通过暂时分离抗体基因并随后转移基因至合适宿主中制备抗体的情况下，合适宿主可以与表达载体组合使用。抗体基因的具体实例可以包括编码本说明书中描述的抗体的重链序列的基因和编码其轻链序列的基因的组合。对于转化宿主细胞，重链序列基因和轻链序列基因可以插入到相同表达载体中或可以插入不同的表达载体中。在使用宿主真核细胞的情况下，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。动物细胞的实例可以包括哺乳动物细胞，例如，猴COS细胞(Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞，ATCCCCL-61）的二氢叶酸还原酶缺乏细胞系(Urlaub, G.和Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220)。在使用原核细胞的情况下，其实例可以包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。目标抗体基因通过转换转移入这些细胞，并且经转化的细胞体外培养以获得抗体。此类培养方法可以根据抗体序列而在产量上有所不同。可以选择容易作为药物产生的抗体，这通过使用其产量作为指标从具有等同的结合活性的抗体中来选择。
本发明的抗体的同种型的实例可以包括但不限于IgG (IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA (IgA1和IgA2)、IgD和IgE。同种型可以优选为IgG或IgM，更优选为IgG1或IgG2。
本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合位点的抗体的抗原结合片段或其修饰形式。抗体片段可以通过用蛋白水解酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体或者通过在合适培养细胞中表达基因工程化的抗体基因来获得。在此类抗体片段中，保持抗体的全长分子所具有的全部或部分功能的片段可以称为抗体的抗原结合片段。
抗体的功能的实例可以通常包括抗原结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性细胞细胞毒性活性、补体依赖性细胞毒性活性和补体依赖性细胞细胞毒性活性。根据本发明的抗体的抗原结合片段所具有的功能为针对Orai1的结合活性且优选为抑制T细胞活化的活性，更优选为抑制由T细胞产生IL-2和/或干扰素γ的活性。
抗体片段实例可以包括Fab、F(ab')2、Fv、包含经合适接头连接的重链和轻链Fv单链Fv（scFv）、双抗体、线性抗体和从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的片段还包括Fab'，其是在还原性条件下通过处理F(ab')2获得抗体可变区的单价片段。
本发明的抗体可以是具有对至少两种不同类型的抗原的特异性的多特异性抗体。此类分子通常结合两种类型的抗原（即，双特异性抗体）。根据本发明的“多特异性抗体”包括具有多于多种类型（例如3种类型）抗原的特异性的抗体。
本发明的多特异性抗体可以是由全长抗体组成的抗体或者可以是此类抗体的片段（例如，F(ab')2双特异性抗体）。双特异性抗体可以通过连接两种类型抗体的重链和轻链（HL对）来制备，或者通过融合产生不同单克隆抗体的杂交瘤以制备产生双特异性抗体的融合细胞来制备(Millstein 等人, Nature (1983) 305, p. 537-539)。
本发明的抗体可以是单链抗体（单链Fv；也称为“scFv”）。通过经多肽接头连接抗体的重链可变区和轻链可变区获得scFv (Pluckthun, The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, 113 (Rosenberg和Moore 编辑, Springer Verlag, New York, p. 269-315(1994)；和Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136)。此外，通过经多肽接头连接两个scFv制备的双scFv片段也可以用作双特异性抗体。
制备scFv的方法是本领域所熟知的（参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030）。在该scFv中，重链可变区和轻链可变区经接头连接，优选为多肽接头，其阻止其形成缀合物(Huston, J.S. 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85, p. 5879-5883)。scFv中的重链可变区和轻链可变区可以来源于相同抗体或可以来源于不同抗体。例如，由12-19个残基组成的任意单链肽用作连接这些可变区的多肽接头。
为了获得编码scFv的DNA，编码抗体的重链或重链可变区的DNA和编码其轻链或轻链可变区的DNA的序列中编码全部或期望的氨基酸序列的每一DNA部分用作模板并通过PCR使用侧接模板的两个末端的引物对来扩增。随后，编码多肽接头部分的DNA进一步组合侧接DNA的两个末端的引物对进行扩增，从而获得片段可以在其末端分别连接重链DNA和轻链DNA。
一旦制备编码scFv的DNA，可以根据常规方法获得包含DNA的表达载体和转化有表达载体的宿主。此外，宿主可以用于获得根据常规方法的scFv。这些抗体片段可以以如上相同方式通过获得和表达该基因由宿主产生。
本发明的抗体可以多聚化以由此增强其对于抗原的亲和力。相同类型的抗体可以多聚化或者分别识别相同抗原的多个表位的多种抗体可以多聚化。用于多聚化这些抗体的方法的实例可以包括结合两个scFv至IgG CH3结构域，其结合至链霉抗生物素和引入螺旋-转角-螺旋基序。
本发明的抗体可以是作为氨基酸序列不同的多种类型的抗Orai1抗体的混合物的多克隆抗体。多克隆抗体的一个实例可以包括CDR不同的多种类型抗体的混合物。通过培养产生不同抗体的细胞的混合物随后从培养物中纯化而获得的抗体可以用作此类多克隆抗体（参见WO2004/061104）。
缀合有多种分子的任一种诸如聚乙二醇（PEG）的抗体也可以用作抗体的修饰形式。
本发明的抗体可以进一步是由这些抗体与其他药物形成的缀合物（免疫缀合物）的任一种。此类抗体的实例可以包括缀合有放射性材料或具有药理作用的化合物的抗体(Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146)。
所获得的抗体可以纯化直至均质。常用的蛋白分离和纯化方法可以用于分离和纯化抗体。抗体可以通过合适选择的或组合的方法分离和纯化，例如，柱层析、经滤器过滤、超滤、盐析、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或等电聚焦(Strategies for ProteinPurification and Characterization:A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak 等人 编辑, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)；和Antibodies:ALaboratory Manual.Ed Harlow和David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，尽管分离和纯化方法并不限于此。
此类层析的实例可以包括亲和层析、离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤层析、反向层析和吸附层析。这些层析方法可以使用液相层析诸如HPLC或FPLC进行。用于亲和层析的柱的实例可以包括蛋白A柱和蛋白G柱。蛋白A柱的实例可以包括Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia Corp.)。此外，抗体可以通过使用其针对抗原的结合活性使用抗原固定的载体来纯化。
3.含有抗Orai1抗体的药物
中和Orai1的生物活性的抗体可以获自通过前面段落“2.抗Orai1抗体的产生”中所述的方法而获得的抗Orai1抗体中。此类中和Orai1的生物活性的抗体可以抑制Orai1的体内活性，即以T细胞和肥大细胞为代表的表达Orai1细胞的钙释放活化的钙通道（CRAC通道）的活化并且因此，可以药学上用作用于由这些细胞的CRAC通道活化引起的疾病的治疗和/或预防剂。
由CRAC通道活化引起的疾病或病况包括移植排斥、免疫相关的疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成和癌症等。
移植排斥的治疗和/或预防的实例包括治疗和/或预防针对移植器官或组织诸如心、肾、肝、骨髓、或皮肤的排斥反应和宿主抗移植物反应、和由移植造血细胞（骨髓、外周血、脐带血等）引起的移植物抗宿主病。
免疫相关疾病的实例包括结缔组织或肌肉骨骼疾病（类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎等）、血液病（再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等）、胃肠道疾病（克罗恩病、溃疡性结肠炎等）、神经系统疾病（多发性硬化、重症肌无力等）、眼科疾病（葡萄膜炎等）、血管疾病（贝切特氏病、韦格纳肉芽肿等）、表皮疾病（银屑病、天疱疮、白斑病等）、和内分泌疾病（1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本氏病等）。
变应性疾病的实例包括特应性皮炎、哮喘、过敏反应、类过敏反应、食物过敏、鼻炎、中耳炎、药物反应、昆虫叮咬反应、对植物的反应、乳胶过敏、结膜炎和荨麻疹。
炎性疾病的实例包括炎症性肾疾病（肾小球性肾炎、肾病等）、炎症性肺疾病（慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、间质性肺炎等）、炎症性肠疾病（溃疡性结肠炎、回肠炎等）、炎性肝病（自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等）、炎性心脏病（心肌炎、缺血性心脏病、动脉粥样硬化等）、炎性皮肤疾病（接触性皮炎、湿疹等）、炎性眼病（沙眼、眼内炎等）、炎性中枢神经疾病（脑膜炎、脑脊髓炎、自身免疫性脑炎等）、炎症性关节疾病（关节炎、骨关节炎等）和全身炎症（败血症、出血、超敏反应、癌症化疗引起的休克症状等，等等）。
其中抗血小板或抗血栓形成活性可用于治疗和/或预防的病例的实例是心肌梗塞、中风、缺血性心脏病和血栓形成。
癌症治疗的实例包括乳腺癌、肺癌、皮肤癌和白血病。
可以由本发明的抗体治疗的疾病的其他实例包括：涉及肥大细胞和嗜碱粒细胞的病理状况，诸如肥大细胞白血病、肥大细胞增多症、嗜碱粒细胞白血病和子宫内膜异位；和管状聚集性肌病、Stormorken综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和特应性皮炎，所述疾病由于CRAC通道的遗传机能亢进发生或者其发生风险由于CRAC通道的遗传机能亢进而增加。
作为药物的抗Orai1抗体的实例可以包括从R118抗体和/或R198抗体制备的人源化抗体及其CDR工程化形式。
抗Orai1抗体针对Orai1的生物活性的体外中和活性可以在例如针对表达Orai1的T细胞的活化的抑制活性基础上进行测量。例如，将抗Orai1抗体以不同浓度添加至人T细胞来源的细胞系Jurkat细胞，并且可以测量针对从用PMA和A23187刺激的Jurkat细胞的IL-2释放的抑制活性。此外，将抗Orai1抗体以不同浓度添加至人外周血单核细胞（PBMC），并且可以测量针对从用PMA和A23187刺激的PBMC的IL-2和干扰素γ释放的抑制活性。
负责发生移植物抗宿主病的细胞是T细胞是经实验证实的事实且广为承认。当移植的T细胞识别受体为外来物质时，基于由其自身产生的白细胞介素2（IL-2）的自繁殖和通过活化的炎性细胞因子诸如干扰素γ(IFN-γ)释放引起全身性免疫炎症反应，导致发生移植物抗宿主病。因此，抑制这些细胞因子的产生可以预防或治疗移植物抗宿主病，而抗Orai1抗体作为治疗药物的使用可以通过使用其抑制活性作为指标来确定。
根据本发明的抗体的优选实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为80 ng/mL或更低。该抗体更优选的实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为10 ng/mL或更低。本发明的抗体还包括这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制80%的浓度为60000 ng/mL或更低，以及这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞释放的IL-2的量被抑制80%的浓度为200 ng/mL或更低。
根据本发明的抗体的可选的优选实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为100 ng/mL或更低。该抗体更优选的实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制50%的浓度为20ng/mL或更低。本发明的抗体还包括这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制80%的浓度为17000 ng/mL或更低，以及这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IL-2的量被抑制80%的浓度为400 ng/mL或更低。
根据本发明的抗体的进一步的优选实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为800 ng/mL或更低。该抗体更优选的实例可以包括抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制50%的浓度为40 ng/mL或更低。本发明的抗体还包括这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制80%的浓度为300000 ng/mL或更低，以及这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其中从用PMA和A23187处理的人PBMC释放的IFN-γ的量被抑制80%的浓度为2000 ng/mL或更低。
抗Orai1抗体在实验室动物中对移植物抗宿主病的体内治疗或预防作用可以例如通过测量人PBMC移植的小鼠移植物抗宿主病模型中的体重减轻来证实。具体而言，NOG或NSG小鼠，其为严重联合免疫缺陷小鼠，用2.0 Gy的X射线照射。在第二天，将200 μL含有15,000,000-50,000,000个细胞的人PBMC/mL的PBS溶液经尾静脉移植入每只小鼠中。未接受人PBMC的X射线照射的小鼠组用作非移植物抗宿主病组，和仅给予抗体的媒介物溶液的人PBMC移植的组用作移植物抗宿主病组。在人PBMC移植之前或之后，将抗Orai1抗体静脉内施用至尾部或腹膜内施用以测量对移植物抗宿主病组中体重减轻的抑制作用。
此外，抗Orai1抗体对各种疾病的治疗或预防作用还可以通过以下体内评价系统使用人Orai1敲入小鼠来验证。
对于对皮炎的作用，将蛋白抗原溶液腹膜内或静脉内施用给小鼠，并在2周后，对其注射抗原作为加强剂。随后，将如上的相同蛋白抗原溶液以3天至2周的时间间隔重复应用至耳部或背部3-6次，以引起皮炎。对皮炎的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间的耳廓厚度、背部皮炎的宏观评分，血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度和获自皮肤、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的生长活性、细胞因子产生能力或表面抗原来评价。
对于对瘙痒的作用，将螨抗原霜剂(cream)以3天至2周的时间间隔重复应用至耳廓或背部，或者将半抗原每天至每周一次应用至耳廓、腹部或背部，或将瘙痒诱导物质皮内施用至耳廓，皮下施用至背部或通过鞘内途径施用。由此类方法诱导的瘙痒动作通过使用连接至小鼠两只脚背的磁铁和瘙痒动作测量仪器来测量瘙痒事件的数目来量化，或者通过检查皮肤、外周血或脊髓组织中的病理体征来量化。对瘙痒的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间获得的结果来评价。
对于对银屑病的作用，将咪喹莫特应用至耳廓和剃毛的背部的两侧或一侧，或者将酵母聚糖悬浮液腹膜内施用，或将细胞因子诸如IL-23皮内施用至小鼠耳廓的一侧。由此类方法诱导的银屑病性皮炎通过检查炎症部位的重量和厚度、浸润入部位的中性粒细胞的髓过氧物酶活性、浸润细胞的流式细胞术分析、基因分析、细胞因子浓度测量等来量化。对银屑病的作用通过比较在抗Orai1抗体组和非施用组之间所获得的结果来评价。
对于对多发性硬化的作用，通过与等量的弗氏完全佐剂的水溶液混合，将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白或其部分肽抗原的溶液乳化。将该乳状液皮内施用至小鼠的侧腹或腹部。随后，将百日咳毒素水溶液施用至尾静脉。几日后，将百日咳毒素溶液进一步再次施用至尾静脉以诱导实验性脑脊髓炎。实验1周或2周后发生且从尾部扩展至后肢和前肢的麻痹症状通过肉眼观察来评分。对多发性硬化的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间获得的结果来评价。
对于对关节炎的作用，将通过混合牛II型胶原和弗氏完全佐剂获得的乳状液皮内施用至小鼠尾根部。2-3周后，进行如上相同施用。随后，对关节炎的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间的关节肿胀评分，血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度，获自皮肤、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓等的细胞的生长活性、细胞因子产生能力或表面抗原来评价。
对于对结肠炎的作用，将三硝基苯磺酸施用入禁食24小时的小鼠的肠道内，或者允许小鼠从喂水瓶中自由饮用含有1-10%硫酸葡聚糖钠的水溶液持续4天至2周，或将从人Orai1敲入小鼠的淋巴结和脾中收集并纯化的CD4+CD25-CD45RBhi T细胞腹膜内移植入Rag2-/-小鼠。通过此类方法诱导的对结肠炎的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间在观察期过程中的体重、肠道的增厚程度、息肉的数目和大小、和测试完成后通过尸体解剖检查的病理体征，血液或组织中抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度，获自肠道、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓等的细胞的生长活性、细胞因子产生能力或表面抗原来评价。
对于对系统性红斑狼疮的作用，将卵白蛋白或另一非刺激性抗原以5-10天的时间间隔最大15次腹膜内或皮下施用以诱导系统性红斑狼疮样症状。对系统性红斑狼疮的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间在观察期过程中随时间收集的血液或组织中抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度，尿液中的抗体效价或生物标志物浓度、通过移植从测试完成后收集的器官诸如脾或淋巴结制备的细胞在未处理小鼠中诱导的症状等等来评价。
对于对肝炎的作用，将D-半乳糖胺单独或与脂多糖组合腹膜内施用至小鼠，或者将伴刀豆球蛋白A单独静脉内施用至尾部。通过此类方法诱导的对肝炎的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间在施用致病物质后1小时至1周收集的血液中的GOT和GPT浓度和肝损伤的组织病理学状况来评价。
对于对骨髓细胞移植中的移植物存活率的作用或者对移植物抗宿主病的预防作用，将从人Orai1敲入小鼠的股骨或胫骨收集的骨髓中的细胞单独或与收集自人Orai1敲入小鼠的脾的脾细胞组合移植至X射线照射的受体小鼠中。对移植物存活率的作用或者预防作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间4-16周的体重改变或存活率，测试完成时血液或组织中抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度，获自肠道、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的表面抗原、生长活性或细胞因子产生能力来评价。
对于对移植器官的移植物存活率的作用，将从宿主小鼠的尾根部收集的皮肤固定到通过切割人Orai1敲入小鼠的背部皮肤暴露的肉膜。移植物的大小及其移植状态在移植后4-16周进行评分。对移植物存活率的作用通过比较抗Orai1抗体组和非施用组之间获得的结果来评价。
因此获得的中和Orai1生物活性的抗体可用作药物，具体而言，用作用于预防或治疗移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成或癌症等的抗体。
作为一个实例，抗Orai1抗体可以单独或与用于治疗或预防移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成或癌症的至少一种另外的治疗剂组合施用。可以与抗Orai1抗体组合施用的另外的治疗剂的实例可以包括但不限于抗叶酸剂、钙依赖磷酸酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂和靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂。
这些治疗剂的具体实例可以包括：作为抗叶酸剂的甲氨蝶呤；作为钙依赖磷酸酶抑制剂的环孢霉素和他克莫司；作为肾上腺皮质类固醇的甲泼尼龙；作为核酸合成抑制剂的环磷酰胺；作为抗胸腺细胞球蛋白的Zetbulin、淋巴球蛋白和胸腺球蛋白；作为核酸抗代谢物的吗替麦考酚酯；作为靶向细胞表面抗原的生物制剂的阿仑单抗和利妥昔单抗；和作为靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂的英利昔单抗、依那西普和利妥昔单抗。
取决于移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病、血栓形成、或癌症的病况或其治疗和/或预防的目标，可以施用2、3或更多种类型的另外的治疗剂，并且这些另外的治疗剂可以包封在相同制剂中并同时施用。另外的治疗剂和抗Orai1抗体可以包封在相同制剂中并同时施用。可选地，抗Orai1抗体和另外的治疗剂可以包封在不同制剂中并同时施用。此外，另外的治疗剂和抗Orai1抗体可以以交替方式分开施用。具体而言，包含抗Orai1抗体或抗体的抗原结合片段作为活性成分的治疗剂可以在施用另外的治疗剂之后施用，或者另外的治疗剂可以在施用包含抗Orai1抗体或抗体的抗原结合片段作为活性成分的治疗剂之后施用。在施用基因疗法的情况下，蛋白治疗剂的基因和抗Orai1抗体的基因可以插入不同启动子区或相同启动子区的下游并引入不同载体或相同载体中。
抗Orai1抗体或其片段可以与治疗剂缀合以产生以下中描述的靶向药物缀合物：M.C.Garnet, "Targeted drug conjugates: principles and progress", AdvancedDrug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216。为此目的，抗体分子以及任何抗体片段可以应用，只要抗体片段不完全丧失识别T细胞的特性。片段的实例可以包括Fab、F(ab')2和Fv片段。因此，抗体和片段可以用于本发明中。抗Orai1抗体或抗体的片段和治疗剂之间的缀合模式可以是以下中描述的多种方式的任一种：M.C.Garnet, "Targeted drugconjugates: principles and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001)53, 171-216, G.T.Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press,California (1996), Putnam和J. Kopecek, "Polymer Conjugates with AnticancerActivity", Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123，等。其具体实例可以包括其中抗Orai1抗体和治疗剂以化学方式直接或经间隔基诸如寡核苷酸缀合的模式，和其中抗Orai1抗体和治疗剂经合适的药物载体缀合的模式。药物载体的实例可以包括脂质体和水溶性聚合物。由这些药物载体介导的此类模式的实例可以更具体而言包括其中抗体和治疗剂通过缀合脂质体和抗体而包封在脂质体中的模式，和其中治疗剂以化学方式直接或经间隔基诸如寡核苷酸缀合水溶性聚合物（具有1000-100,000数量级的分子量的化合物）同时抗体也缀合水溶性聚合物的模式。抗体（或片段）与治疗剂或药物载体（例如脂质体和水溶性聚合物）的缀合可以通过本领域技术人员熟知的方法来进行，例如以下中描述的方法：G.T.Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, California(1996)和Putnam和J. Kopecek, "Polymer Conjugates with Anticancer Activity",Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123。治疗剂在脂质体中的包封可以通过本领域技术人员熟知的方法来进行，例如以下中描述的方法：D.D. Lasic, "Liposomes:From Physics to Applications", Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam(1993)，等。治疗剂与水溶性聚合物的缀合可以通过本领域技术人员熟知的方法来进行，例如以下中描述的方法：D. Putnam和J Kopecek, "Polymer Conjugates with AnticancerActivity", Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123。抗体（或片段）和蛋白治疗剂（或片段）的缀合物可以通过上述任一种方法以及本领域技术人员熟知的遗传工程方法来制备。
本发明还提供药物组合物，其包含治疗和/或预防有效量的抗Orai1抗体和药学上可接受的稀释剂、媒介物、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或添加剂。
本发明还提供药物组合物，其包含治疗和/或预防有效量的抗Orai1抗体、治疗和/或预防有效量的至少一种治疗剂和药学上可接受的稀释剂、媒介物、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或添加剂。治疗剂的实例可以包括但不限于上述的抗叶酸剂、钙依赖磷酸酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂和靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂。
优选本发明的药物组合物中使用的药学上可接受的物质应该对于药物组合物的受体是无毒的，优选在剂量或施用浓度方面。
本发明的药物组合物可以包含用于改变或维持pH、渗透压、粘度、透明性、颜色、等渗性、无菌性、稳定性、溶解性、持续释放、可吸收性或透性的药物材料。药物材料的实例可以包括但不限于以下：氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸；抗微生物剂；抗氧化剂诸如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠；缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐、或硼酸盐缓冲液、碳酸氢钠和Tris-HCl溶液；填充物诸如甘露醇和甘氨酸；螯合剂诸如乙二胺四乙酸（EDTA）；络合剂如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；填充剂如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它碳水化合物如单糖和二糖；着色剂；矫正剂；稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；低分子量多肽；成盐抗衡离子；防腐剂如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢；溶剂如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇如甘露醇和山梨醇；悬浮剂；表面活性剂如脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20和聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇；稳定性增强剂如蔗糖和山梨醇；弹性增强剂(elasticity enhancers)如氯化钠、氯化钾、甘露醇和山梨醇；转运剂；赋形剂；和/或药物添加剂。添加的这些药物材料的量优选为抗Orai1抗体重量的0.01-100倍，尤其是0.1-10倍。制剂中药物组合物的合适处方可以由本领域技术人员根据可应用的疾病、可应用的施用途径等合适地确定。
药物组合物中的赋形剂或媒介物可以是液体或固体。合适的赋形剂或媒介物可以是通常用于可注射水、生理盐水、人工脑脊液和肠胃外施用中的其他材料。中性生理盐水或含有血清白蛋白的生理盐水可用作媒介物。药物组合物可以包含pH 7.0-8.5的Tris缓冲液、pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液或pH 3.0-6.2的柠檬酸盐缓冲液。这些缓冲液还包含山梨醇或其他化合物。本发明的药物组合物的实例可以包括含有抗Orai1抗体的药物组合物和含有抗Orai1抗体和至少一种治疗剂的药物组合物。本发明的药物组合物以冻干产物或液体的形式作为具有所选处方和所需纯度的药物来制备。含有抗Orai1抗体的药物组合物或含有抗Orai1抗体和至少一种治疗剂的药物组合物也可以使用合适的赋形剂诸如蔗糖作为冻干产物来形成。
本发明的药物组合物可以制备用于肠胃外施用或可以制备用于经口服途径在消化道中吸收。制剂的处方和浓度可以根据施用方法来决定。本发明的药物组合物中包含的抗Orai1抗体对于Orai1的亲和力越高，即对Orai1的更低的解离常数（Kd值），在人中可能显示效力的抗Orai1抗体的剂量越低。因此，本发明的药物组合物对于人的剂量也可以基于该结果来确定。施用人类型抗Orai1抗体至人的剂量为约0.1-100 mg/kg，其可以每1-180天施用一次。
本发明的药物组合物的实例可以包括包括静脉点滴的注射剂、栓剂、经鼻制剂、舌下制剂和经皮吸收制剂。
尽管大部分批准的抗体制剂静脉内施用，但皮下施用经常在医疗实践中是更优选的。在这种情况下，体积限于1.0-1.5 mL。因此，具有高浓度的抗体溶液根据剂量而需要。然而，由于更高浓度增加药物溶液的粘度，因此可能存在这样的情况，即药物溶液因为其高粘度而无法通过具有通常使用的粗细(thickness)的注射针来进行注射。简言之，在选择注射剂作为药物组合物的形式的情况下，低粘度是应该给予最高优先级的重要特性。因此，合适的抗体可以用粘度作为指标进行选择。
实施例
下文中，本发明将参考实施例来具体描述。然而，本发明不旨在受其所限。关于以下实施例中基因操作的每一程序根据"Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch,E.F.和Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的方法或使用可商购的试剂或试剂盒根据市售产品的说明手册来进行，除非另有说明。
[实施例1] 制备大鼠抗人Orai1抗体
1)-1 免疫
1)-1-1 构建人Orai1表达载体(pcDNA3.1-hOrai1)
购买克隆于pDONR221 (Life Technologies Corp.)中的Ultimate ORF克隆(克隆编号IOH40869, Life Technologies Corp.)并用作人Orai1的基因序列。基因序列显示于序列表中的SEQ ID NO: 1中，并且氨基酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO: 2中。此外，用Gateway Vector Conversion System (Life Technologies Corp.)将pcDNA3.1(+)修饰入目的载体中以制备pcDNA3.1-DEST。将基因序列与pcDNA3.1-DEST在att序列内使用GatewayLR Clonase Enzyme mix (Life Technologies Corp.)重组以制备人Orai1表达载体pcDNA3.1-hOrai1。在人Orai1表达载体的大规模制备中使用EndoFree Plasmid Giga Kit(Qiagen N.V.)。
1)-1-2 大鼠免疫
将雌性WKY/Izm大鼠(Japan SLC, Inc.)用于免疫。首先，将每只大鼠的两个后肢用透明质酸酶(Sigma-Aldrich Corp.)进行预处理，并随后，肌内注射pcDNA3.1-hOrai1至这些部位。随后，使用ECM830 (BTX)和两针电极在所述部位进行体内电穿孔。每两周一次重复类似的体内电穿孔之后，将大鼠的淋巴结收集并用于杂交瘤制备中。
1)-2 杂交瘤制备
使用Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences Inc.)将淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞电融合。将融合细胞用ClonaCell-HYSelection Medium D (StemCell Technologies Inc.)稀释并培养。出现的杂交瘤集落回收以制备单克隆杂交瘤。将回收的每一杂交瘤集落培养，并将所获的杂交瘤培养上清液用于筛选产生抗人Orai1抗体的杂交瘤。
1)-3 通过细胞-ELISA的一级筛选
1)-3-1 制备用于细胞-ELISA的表达抗原基因的细胞
将HEK293细胞以7.5 × 105细胞/mL在含有10% FBS的DMEM培养基中制备。用pcDNA3.1-hOrai1或pcDNA3.1-DEST作为对照根据转染程序使用Lipofectamine 2000进行转染，以50 μl/孔分配至96孔板(Corning Inc.)，并在37℃下在5% CO2条件下在含有10%FBS的DMEM培养基中培养两夜。将所获的转染细胞以贴壁状态用于细胞-ELISA中。
1)-3-2 细胞-ELISA
从实施例1)-1-1中制备的转染有表达载体的HEK293细胞中去除培养上清液后，将每一杂交瘤培养上清液添加至pcDNA3.1-hOrai1或pcDNA3.1-DEST转染的HEK293细胞中，并将板在4℃下孵育1小时。将孔中的细胞用含有5% FBS的PBS洗涤一次。随后，用含有5% FBS的PBS稀释500倍的兔中产生的抗大鼠IgG-过氧化物酶抗体(Sigma-Aldrich Corp.)加入其中，并将板在4℃下孵育1小时。将孔中的细胞用含有5% FBS的PBS洗涤6次。随后，将OPD发色溶液(在0.05 M柠檬酸三钠和0.1 M磷酸氢二钠十二水合物中分别以0.4 mg/mL和0.6% (v/v)的浓度溶解的OPD 溶液(邻苯二胺二盐酸盐(Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.)和H2O2, pH 4.5))以25 μL/孔向其添加。用偶尔搅拌并通过以25 μL/孔添加1 M HCl来终止来进行颜色反应。随后，在490 nm处使用板读数器(ENVISION；PerkinElmer, Inc.)测量吸光度。为了选择产生特异性结合表达于细胞膜表面上的人Orai1的抗体的杂交瘤，选择相比于对照pcDNA3.1-DEST转染的HEK293细胞产生对于pcDNA3.1-hOrai1表达载体转染的HEK293细胞展示更高吸光度的培养上清液的杂交瘤作为抗人Orai1抗体阳性杂交瘤。
1)-4 通过流式细胞术的二级筛选
1)-4-1 制备用于流式细胞术分析的表达抗原基因的细胞
将HKE293细胞以5 × 104细胞/cm2接种到225 cm2烧瓶中并在37℃和5% CO2条件下在含有10% FBS的DMEM培养基中培养。第二天，将HEK293细胞用作为对照的pcDNA3.1-hOrai1或pcDNA3.1-DEST使用Lipofectamine 2000转染并在37℃和5% CO2条件下再培养两夜。第二天，将转染表达载体的HEK293细胞用TrypLE Express (Life TechnologiesCorp.)处理，用含有10% FBS的DMEM洗涤，并随后悬浮于含5% FBS的PBS中。将所获的细胞悬液用于流式细胞术分析。
1)-4-2 流式细胞术分析
通过实施例1)-3中的细胞-ELISA证实为阳性的每一杂交瘤产生的抗体的人Orai1结合特异性进一步通过流式细胞术来验证。实施例1)-4-1中制备的每一HEK293细胞悬液离心以去除上清液。随后，将pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞或pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞通过添加杂交瘤培养上清液来悬浮并在4℃下孵育1小时。将细胞用含有5%FBS的PBS洗涤一次，随后通过添加用含有5% FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgG FITC缀合物(Sigma-Aldrich Corp.) 悬浮，并置于4℃下静置1小时。将细胞用含5% FBS的PBS洗涤3次并随后重悬于含5% FBS和2 μg/mL 7-氨基放线菌素Ｄ(Molecular Probes, Inc.)的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500；Beckman Coulter Inc.)进行检测。使用Flowjo (TreeStar Inc.)分析数据。通过门控排除7-氨基放线菌素Ｄ阳性的死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图。产生展示出相比于对照pcDNA3.1-DEST转染的HEK293细胞的荧光强度直方图在pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293细胞的直方图中更强荧光强度偏移的样品的杂交瘤获得作为产生抗人Orai1抗体的杂交瘤。结果是，获得225个展示显著偏移的杂交瘤。
1)-5 抗体分型
将抗体R118和R198（其表明强烈结合人Orai1）从由1)-4中获得的杂交瘤产生的大鼠抗人Orai1抗体中选择出来，并进行分型。它们的同种型使用大鼠单克隆分型测试试剂盒(AbD Serotec)来确定。结果是，大鼠抗人Orai1单克隆抗体R118和R198的同种型均发现为IgG2a和κ链。
1)-6 制备大鼠抗人Orai1抗体
将每一大鼠抗人Orai1单克隆抗体从杂交瘤培养上清液中纯化。
首先，将产生R118或R198的杂交瘤用ClonaCell-HY Selection Medium E生长至足够量。随后，将培养基用补充有20%的Ultra Low IgG FBS (Life Technologies Corp.)的Hybridoma SFM (Life Technologies Corp.)替换，随后培养5天。收集该培养上清液并经0.45 μm滤器灭菌。
通过蛋白G亲和层析(在4-6℃)在一步中从杂交瘤上清液中纯化抗体。通过蛋白G亲和层析纯化后的缓冲液置换步骤在4-6℃下进行。首先，将杂交瘤培养上清液应用至用PBS平衡的填充有蛋白G (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)的柱。整个培养上清液进入柱后，将柱用2倍或更多倍柱体积的PBS洗涤。随后，通过用0.1 M的甘氨酸盐酸盐水溶液（pH 2.7）洗脱收集含抗体的级分。收集的级分通过添加1 M Tris-HCl (pH 9.0)在pH 7.0-7.5制备，并随后使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (分子量截止:UF30K, Sartorius Japan K.K., 4-6℃)用PBS进行缓冲液置换，同时浓缩至0.2 mg/mL或更高的抗体浓度。最后，将抗体溶液经Minisart-Plus滤器(Sartorius Japan K.K.)过滤并用作经纯化的样品。
[实施例2] 体外评价大鼠抗人Orai1抗体
2)-1 通过流式细胞术评价大鼠抗人Orai1抗体结合的能力
为了评价Orai1结合特异性，将通过1)-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后，通过添加在1)-6中制备的大鼠抗人Orai1单克隆抗体R118或R198或大鼠IgG对照抗体(Beckman Coulter Inc.)悬浮HEK293细胞，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，随后通过添加用含有5% FBS的PBS稀释320倍的抗大鼠IgG FITC缀合物悬浮，并置于4℃下孵育30分钟。将细胞用含5% FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5% FBS和1 μg/mL 碘化丙啶(Life Technologies Corp.)的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500)进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度（MFI）。R118和R198不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞，并且如图1中所示，各自以浓度依赖性方式仅结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞，表明这些抗体各自特异性结合人Orai1。另一方面，此类结合在大鼠IgG对照抗体中未观察到。
2)-2 大鼠抗人Orai1抗体的T细胞活化抑制作用
人T细胞系Jurkat细胞以1.5 x 106细胞/mL的浓度在含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素(Life Technologies Corp.)的RPMI1640 (Life TechnologiesCorp.)制备，并以80 μL/孔接种至96孔细胞培养板，并用以10 μL/孔添加的大鼠抗人Orai1单克隆抗体R118或R198或大鼠IgG对照抗体在37℃和5% CO2条件下预处理60分钟。随后，将100 ng/mL PMA (Sigma-Aldrich Corp.)和1 μg/mL A23187 (Sigma-Aldrich Corp.)以10μL/孔(终浓度：10 ng/mL PMA和100 ng/mL A23187)添加并充分搅拌，随后在37℃和5% CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600 g离心3分钟。上清液中包含的白细胞介素-2（IL-2）浓度通过ELISA (R&D systems, Inc.)测量。图2显示获得的大鼠抗人Orai1单克隆抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。R118和R198各自以浓度依赖性方式抑制从Jurkat细胞的IL-2释放。另一方面，此类抑制在大鼠IgG对照抗体中未观察到。
[实施例3] 测定编码大鼠抗人Orai1抗体的可变区的cDNA的核苷酸序列
3)-1 cDNA合成
产生各抗体R118或R198的杂交瘤的细胞裂解物(50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、250mM LiCl、5 mM EDTA (pH 8)、0.5%十二烷基硫酸锂(LiDS)、2.5 mM二硫苏糖醇(DTT))与结合有寡dT25的磁珠(Dynabeads mRNA DIRECT Kit, Invitrogen Corp.)混合，使得mRNA结合到磁珠上。随后，将磁珠用mRNA洗涤溶液A(10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.15 M LiCl、1mM EDTA、0.1% LiDS、0.1% Triton X-100)和cDNA合成的溶液(50 mM Tris-HCl (pH 8.3)、75 mM KCl、3 mM MgCl2、5 mM DTT、0.5 mM dNTP、0.2% Triton X-100、1.2单位的RNA酶抑制剂(Life Technologies Corp.))各洗涤一次，随后使用添加有12单位的SuperScriptIII Reverse Transcriptase (Life Technologies Corp.)的cDNA合成溶液进行cDNA合成。随后，将磁珠用3'加尾反应溶液(50 mM磷酸钾、4 mM MgCl2、0.5 mM dGTP、0.2% TritonX-100、1.2单位的RNA酶抑制剂(Life Technologies Corp.))洗涤，随后使用添加有48单位的重组末端转移酶(F. Hoffmann-La Roche, Ltd.)的反应溶液进行3'加尾反应。
3)-2 扩增和测序大鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区基因片段
将磁珠用TE溶液(10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、0.1% Triton X-100)洗涤，并随后通过5'-RACE PCR扩增大鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。具体而言，将磁珠转移至PCR反应溶液(0.2 μM引物、0.2 mM dNTP、0.25单位的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara Bio Inc.))并进行35个循环的反应，每一循环涉及94℃持续30秒-68℃持续90秒。所用的引物组如下：
PCR引物组（对于重链）
Figure 858547DEST_PATH_IMAGE001
Figure 775688DEST_PATH_IMAGE002
Figure 555425DEST_PATH_IMAGE003
。
PCR引物组（对于轻链）
Figure 888317DEST_PATH_IMAGE004
(SEQ ID NO:6) (与重链的相同)
Figure 702690DEST_PATH_IMAGE005
。
通过PCR反应扩增的片段进行测序以分析其核苷酸序列。将具有核苷酸序列5'-CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3' (rIgγ-seq) (SEQ ID NO: 8)的寡核苷酸用作重链的测序引物，并将具有核苷酸序列5'-TCCAGTTGCTAACTGTTCC-3' (rIgκ-seq) (SEQ ID NO: 9)的寡核苷酸用作轻链的测序引物。
使用基因序列分析仪器("ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems,Inc."或"Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems, Inc.")进行测序分析。将具有AmpliTaq DNA聚合酶的Dye Terminator Cycle Sequencing System (LifeTechnologies Corp.)和GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.)用于测序反应中。
编码R118和R198的重链和轻链可变区的测定的核苷酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NOs: 10 (R118轻链)和12 (R118重链) 以及SEQ ID NOs: 14 (R198轻链)和16(R198重链)中。可变区的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NOs: 11 (R118轻链)和13 (R118重链) 以及SEQ ID NOs: 15 (R198轻链)和17 (R198重链)中。SEQ ID NO: 10和11显示于图14中。SEQ ID NO: 12和13显示于图15中。SEQ ID NO: 14和15显示于图16中。SEQ ID NO: 16和17显示于图17中。
[实施例4] 制备人嵌合抗人Orai1抗体
4)-1 构建嵌合和人源化轻链表达载体pCMA-LK
将通过用限制酶 XbaI和PmeI 消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ (LifeTechnologies Corp.)获得的大约5.4 kb的片段与包含编码人κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列的DNA片段(显示于序列表的SEQ ID NO: 18中)使用In-Fusion Advantage PCR 克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)连接以制备pcDNA3.3/LK。
将pcDNA3.3/LK用作使用下文给出的引物组的PCR中的模板。将所获的大约3.8 kb的片段磷酸化并随后自连接以构建具有信号序列、克隆位点和CMV启动子下游的人κ链恒定区编码序列的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK。
引物组
Figure 525152DEST_PATH_IMAGE006
引物3.3-F1)
Figure 726939DEST_PATH_IMAGE007
引物3.3-R1)。
4)-2 构建嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1
使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒将通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK以去除编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列获得的DNA片段与包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的序列的DNA片段（显示于序列表的SEQ ID NO: 21中）连接以构建具有信号序列、克隆位点和CMV启动子下游的人IgG1重链恒定区编码序列的嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1。
4)-3 构建人嵌合抗人Orai1抗体轻链表达载体
4)-3-1 构建人嵌合R118轻链cR118_L表达载体
合成实施例3)-2中获得的包含R118轻链可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificial Gene Synthesis service)。使用Ligation High 版本 2 (Toyobo Co.,Ltd.)将通过用限制酶XbaI和PmeI切割包含R118轻链可变区编码序列的DNA片段获得的大约0.7 kb的DNA片段插入通过用如上相同的限制酶切割用于嵌合和人源化抗体轻链表达的一般目的载体pCMA-LK获得的大约3.4 kb的DNA片段以构建人嵌合R118轻链(cR118_L)表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-LK/cR118_L"。编码人嵌合cR118轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO: 22和23（图18）中。
4)-3-2 构建人嵌合R198轻链cR198_L表达载体
合成实施例3)-2中获得的包含R198轻链可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificial Gene Synthesis service)。使用Ligation High 版本 2 (Toyobo Co.,Ltd.)将通过用限制酶XbaI和PmeI切割包含R198轻链可变区编码序列的DNA片段获得的大约0.7 kb的DNA片段插入通过用如上相同的限制酶切割用于嵌合和人源化抗体轻链表达的一般目的载体pCMA-LK获得的大约3.4 kb的DNA片段以构建人嵌合R198轻链(cR198_L)表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-LK/cR198_L"。编码人嵌合cR198轻链的核苷酸序列和轻链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO: 24和25（图19）中。
4)-4 构建人嵌合抗人Orai1抗体重链表达载体
4)-4-1 构建人嵌合R118重链cR118_H表达载体
合成实施例3)-2中获得的包含R118重链可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificial Gene Synthesis service)。使用Ligation High 版本 2将通过用限制酶BlpI切割包含R118重链可变区编码序列的DNA片段获得的大约0.3 kb的DNA片段插入通过用如上相同的限制酶切割嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1获得的大约4.5 kb的DNA片段以构建人嵌合R118重链(cR118_H)表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-G1/cR118_H"。编码人嵌合cR118重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO: 26和27（图20）中。
4)-4-2 构建人嵌合R198重链cR198_H表达载体
合成实施例3)-2中获得的包含R198重链可变区编码序列的DNA片段(GeneArtArtificial Gene Synthesis service)。使用Ligation High 版本 2将通过用限制酶BlpI切割包含R198重链可变区编码序列的DNA片段获得的大约0.3 kb的DNA片段插入通过用如上相同的限制酶切割嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1获得的大约4.5 kb的DNA片段以构建人嵌合R198重链(cR198_H)表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-G1/cR198_H"。编码人嵌合cR198重链的核苷酸序列和重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO: 28和29（图21）中。
4)-5 制备人嵌合抗人Orai1抗体
4)-5-1 产生人嵌合抗人Orai1抗体
根据手册继代培养和培养FreeStyle 293F细胞(Life Technologies Corp.)。
将处于对数生长期的107个FreeStyle 293F细胞(Life Technologies Corp.)接种到30 mL瓶(Thermo Fisher Scientific Inc.)，用FreeStyle 293表达培养基(LifeTechnologies Corp.)通过稀释以9 mL制备，并随后在37℃下在8% CO2培养箱中以135 rpm摇动1小时。将30 μg的聚乙烯亚胺(Polysciences #24765)溶解在500 μL 的Opti-Pro SFM(Life Technologies Corp.)中。随后，将使用QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen N.V.)制备的每一人嵌合抗人Orai1抗体重链表达载体(4 μg)和每一人嵌合抗人Orai1抗体轻链表达载体(6 μg)悬浮在500 μL的Opti-Pro SFM中。将500 μL的表达载体/Opti-Pro SFM混合的溶液加入500 μL的聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合的溶液中，并将混合物轻柔搅拌，进一步放置5分钟，并随后加入到FreeStyle 293F细胞中。将细胞以95 rpm在37℃下在8% CO2培养箱中摇动培养5-7天，并将所获的培养上清液经0.22 μm Millex Filter (MilliporeCorp.)进行过滤。
将通过组合pCMA-G1/cR118_H和pCMA-LK/cR118_L获得的人嵌合R118称为"cR118"。类似地，将通过组合pCMA-G1/cR198_H和pCMA-LK/cR198_L获得的人嵌合R198称为"cR198"。
4)-5-2 纯化人嵌合抗人Orai1抗体
在4)-5-1中获得的每一培养上清液通过rProtein A亲和层析在一步中纯化。首先，将10 mL用PBS平衡的培养上清液应用到MabSelectSuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)。在所有培养溶液进入柱后，将柱用7 mL的PBS洗涤。随后，用5 mL的2 M精氨酸-HCl，pH 4.0进行洗脱，并将洗脱液用4 mL的组氨酸缓冲液(25 mM组氨酸、5%山梨醇，pH 6.0)使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)进行缓冲液置换。最后，使用Amicon Ultracel 30K (分子量截止值: 30 K, Millipore Corp.)将溶液浓缩至大约100 μL并用作纯化样品。
[实施例5] 人嵌合抗人Orai1抗体的体外活性
5)-1 通过流式细胞术的人嵌合抗人Orai1抗体的抗原结合活性
为了评价人Orai1结合特异性，将通过1)-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后，通过添加在4)-5中制备的人嵌合抗人Orai1抗体cR118或cR198或人IgG对照抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)悬浮HEK293T细胞，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，随后通过添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的抗人IgG FITC缀合物(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)悬浮，并置于4℃下孵育30分钟。将细胞用含5% FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5% FBS和1 μg/mL 碘化丙啶(Invitrogen Corp.)的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500)进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度（MFI）。cR118和cR198不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞，并且如图3中所示，各自以浓度依赖性方式仅结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞，表明这些抗体各自特异性结合人Orai1。另一方面，此类结合在人IgG对照抗体中未观察到。
5)-2 人嵌合抗人Orai1抗体的人T细胞系活化抑制作用
人T细胞系Jurkat细胞以1.5 x 106细胞/mL的浓度在含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640中制备，并以80 μL/孔接种至96孔细胞培养板，并用以10μL/孔添加的人嵌合抗人Orai1抗体cR198或cR118、亲本抗体R198、或人IgG对照抗体在37℃和5% CO2条件下预处理60分钟。随后，将100 ng/mL PMA和1 μg/mL A23187以10 μL/孔添加并充分搅拌，随后在37℃和5% CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600 g离心3分钟。上清液中包含的IL-2浓度通过ELISA测量。图4显示制备的人嵌合抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。cR118和cR198各自以浓度依赖性方式抑制从Jurkat细胞的IL-2释放，且其抑制强度等于亲本抗体R198的抑制强度。另一方面，此类抑制在人IgG对照抗体中未观察到。
[实施例6] 设计人嵌合抗人Orai1抗体cR198的人源化形式hR198
6)-1 R198的可变区的分子建模
cR198的可变区的分子建模通过一般已知为同源性建模的方法来进行(Methodsin Enzymology, 203, 121-153, (1991))。上面测定的R198的可变区与蛋白数据库中登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列（衍生于X射线晶体结构的三维结构可获得）进行比较(Nuc.Acid Res.28, 235-242 (2000))。结果是，选择1AJ7作为与cR198的轻链可变区具有最高序列同源性的那个。而且，选择1XGY作为与cR198的重链可变区具有最高序列同源性的那个。将框架区的三维结构制备为“框架模型”，这通过组合对应于cR198的轻链和重链的1AJ7和1XGY的坐标。将cR198的CDR对于CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2分别指定为簇11A、7A、9A、10A和10A，这根据Thornton等人的分类(J. Mol.Biol., 263, 800-815,(1996))。其CDRH3根据H3规则分类为k(6)- (FEBS letter, 399, 1-8 (1996))。随后，将每一CDR的典型构象并入框架模型中。
最后，进行能量计算用于排除不利的原子间接触以在能量方面获得cR198可变区的可能的分子模型。使用可商购的蛋白三维结构预测程序Prime和构象搜索程序MacroModel (Schrodinger, LLC)进行这些程序。
6)-2 设计人源化R198的氨基酸序列
将人源化的R198抗体通过通常已知为CDR移植的方法来构建(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033 (1989))。基于框架区中氨基酸的同源性选择受体抗体。
将cR198框架区的序列与在抗体氨基酸序列的Kabat数据库(Nuc. Acid Res.,29, 205-206 (2001))中登记的所有人框架序列进行比较。结果是，选择1C10'CL抗体作为受体，这是由于其与框架区的71%序列同源性。将1C10'CL中框架区的氨基酸残基与cR198框架区的氨基酸残基进行比对以鉴定它们之间不匹配的氨基酸位置。这些残基的位置使用上面构建的cR198的三维模型来分析。随后，根据由Queen等人提供的标准选择供体残基嫁接至受体上(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033 (1989))。
因此选择的一些供体残基转移至受体抗体以构建如以下实施例中所述的人源化R198序列。
此外，将cR198的各CDR或FR中的1-5个氨基酸残基用cR118的氨基酸残基替换以构建如以下实施例中所述的CDR工程化的人源化R198序列。
6)-3 设计人源化R198轻链hR198_L
6)-3-1 hR198_L1型轻链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 25所示的cR198轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_L1型轻链”：用丝氨酸残基替换氨基酸位置30处的苏氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置32处的脯氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置35处的亮氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置37处的谷氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置42处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置61处的天冬氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置62处的甘氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置63处的丝氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置64处的缬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置92处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置94处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置96处的苏氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置99处的谷氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置100处的丝氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置120处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置124处的亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置126处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置127处的精氨酸残基、和用苏氨酸残基替换氨基酸位置129处的丙氨酸残基。
编码hR198_L1型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:30中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_L1型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:31中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQ ID NOs: 30和31的序列两者也显示于图22中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
6)-3-2 hR198_L2型轻链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 25所示的cR198轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_L2型轻链”：用丝氨酸残基替换氨基酸位置30处的苏氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置32处的脯氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置35处的亮氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置37处的谷氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置42处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置61处的天冬氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置62处的甘氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置63处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置92处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置94处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置96处的苏氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置99处的谷氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置100处的丝氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置120处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置124处的亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置126处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置127处的精氨酸残基、和用苏氨酸残基替换氨基酸位置129处的丙氨酸残基。
编码hR198_L2型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:32中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_L2型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:33中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQ ID NOs: 32和33的序列两者也显示于图23中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
6)-3-3 hR198_L3型轻链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 25所示的cR198轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_L3型轻链”：用丝氨酸残基替换氨基酸位置30处的苏氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置32处的脯氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置35处的亮氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置37处的谷氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置42处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置61处的天冬氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置62处的甘氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置63处的丝氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置64处的缬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置92处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置94处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置96处的苏氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置99处的谷氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置100处的丝氨酸残基、用苯丙氨酸残基替换氨基酸位置114处的酪氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置120处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置124处的亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置126处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置127处的精氨酸残基、和用苏氨酸残基替换氨基酸位置129处的丙氨酸残基。
编码hR198_L3型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:34中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_L3型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:35中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQ ID NOs: 34和35的序列两者也显示于图24中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
6)-3-4 hR198_L4型轻链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 25所示的cR198轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_L4型轻链”：用丝氨酸残基替换氨基酸位置30处的苏氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置32处的脯氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置35处的亮氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置37处的谷氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置42处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置61处的天冬氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置62处的甘氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置63处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置92处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置94处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置96处的苏氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置99处的谷氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置100处的丝氨酸残基、用苯丙氨酸残基替换氨基酸位置114处的酪氨酸残基、用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置120处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置124处的亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置126处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置127处的精氨酸残基、和用苏氨酸残基替换氨基酸位置129处的丙氨酸残基。
编码hR198_L4型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:36中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_L4型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:37中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQ ID NOs: 36和37的序列两者也显示于图25中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
6)-4 设计人源化R198重链hR198_H
6)-4-1 hR198_H1型重链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 29所示的cR198重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_H1型重链”：用缬氨酸残基替换氨基酸位置24处的谷氨酰胺残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置30处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置31处的丙氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置35处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置37处的甲硫氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置39处的异亮氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置56处的异亮氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置57处的赖氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置59处的苏氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置60处的苏氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置86处的赖氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置95处的丝氨酸残基、用酪氨酸残基替换氨基酸位置99处的苯丙氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置101处的谷氨酰胺残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置106处的苏氨酸残基、用丝氨酰胺残基替换氨基酸位置107处的脯氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置108处的天冬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置110处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置130处的缬氨酸残基、和用亮氨酸残基替换氨基酸位置131处的甲硫氨酸残基。
编码hR198_H1型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:38中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_H1型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:39中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-136代表可变区。SEQ ID NOs: 38和39的序列两者也显示于图26中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
6)-4-2 hR198_H2型重链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 29所示的cR198重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_H2型重链”：用缬氨酸残基替换氨基酸位置24处的谷氨酰胺残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置30处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置31处的丙氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置35处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置37处的甲硫氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置39处的异亮氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置57处的赖氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置59处的苏氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置60处的苏氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置86处的赖氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置95处的丝氨酸残基、用酪氨酸残基替换氨基酸位置99处的苯丙氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置101处的谷氨酰胺残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置106处的苏氨酸残基、用丝氨酰胺残基替换氨基酸位置107处的脯氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置108处的天冬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置110处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置130处的缬氨酸残基、和用亮氨酸残基替换氨基酸位置131处的甲硫氨酸残基。
编码hR198_H2型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:40中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_H2型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:41中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-136代表可变区。SEQ ID NOs: 40和41的序列两者也显示于图27中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
6)-4-3 hR198_H3型重链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 29所示的cR198重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_H3型重链”：用缬氨酸残基替换氨基酸位置24处的谷氨酰胺残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置30处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置31处的丙氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置35处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置37处的甲硫氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置39处的异亮氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置50处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置56处的异亮氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置57处的赖氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置59处的苏氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置60处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置67处的异亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置70处的缬氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置81处的谷氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置82处的赖氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置86处的赖氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置95处的丝氨酸残基、用酪氨酸残基替换氨基酸位置99处的苯丙氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置101处的谷氨酰胺残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置106处的苏氨酸残基、用丝氨酰胺残基替换氨基酸位置107处的脯氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置108处的天冬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置110处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置130处的缬氨酸残基、和用亮氨酸残基替换氨基酸位置131处的甲硫氨酸残基。
编码hR198_H3型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:42中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_H3型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:43中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-136代表可变区。SEQ ID NOs: 42和43的序列两者也显示于图28中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
6)-4-4 hR198_H4型重链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 29所示的cR198重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_H4型重链”：用缬氨酸残基替换氨基酸位置24处的谷氨酰胺残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置30处的亮氨酸残基、用赖氨酸残基替换氨基酸位置31处的丙氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置35处的丝氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置37处的甲硫氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置39处的异亮氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置50处的丝氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置57处的赖氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置59处的苏氨酸残基、用脯氨酸残基替换氨基酸位置60处的苏氨酸残基、用缬氨酸残基替换氨基酸位置67处的异亮氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置70处的缬氨酸残基、用丙氨酸残基替换氨基酸位置81处的谷氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置82处的赖氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置86处的赖氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置95处的丝氨酸残基、用酪氨酸残基替换氨基酸位置99处的苯丙氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置101处的谷氨酰胺残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置106处的苏氨酸残基、用丝氨酰胺残基替换氨基酸位置107处的脯氨酸残基、用谷氨酸残基替换氨基酸位置108处的天冬氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置110处的丝氨酸残基、用苏氨酸残基替换氨基酸位置130处的缬氨酸残基、和用亮氨酸残基替换氨基酸位置131处的甲硫氨酸残基。
编码hR198_H4型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:44中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_H4型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:45中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-136代表可变区。SEQ ID NOs: 44和45的序列两者也显示于图29中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
[实施例7] 制备人源化抗人Orai1抗体
7)-1 构建人源化抗人Orai1抗体轻链hR198_L表达载体
7)-1-1 构建hR198_L1表达载体
合成包含显示于序列表的SEQ ID NO: 30代表的hR198_L1的核苷酸序列中核苷酸位置38-402中的hR198_L1可变区编码序列的DNA片段(GeneArt Artificial GeneSynthesis service)。将合成的DNA片段用限制酶AvaI和EcoRV切割并插入用如上同样的限制酶切割的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的对应位点中以构建hR198_L1表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-LK/hR198_L1"。
7)-1-2 构建hR198_L2表达载体
合成包含显示于序列表的SEQ ID NO: 32代表的hR198_L2的核苷酸序列中核苷酸位置38-402中的hR198_L2可变区编码序列的DNA片段(GeneArt Artificial GeneSynthesis service)。将包含hR198_L2可变区编码序列的DNA片段用合成的DNA片段作为模板使用KOD -Plus- (Toyobo Co., Ltd.)进行扩增，用限制酶BsiWI切割，并插入用限制酶BsiWI切割的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的对应位点中以构建hR198_L2表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-LK/hR198_L2"。
7)-1-3 构建hR198_L3和hR198_L4表达载体
合成包含显示于序列表的SEQ ID NO: 36代表的hR198_L4的核苷酸序列中核苷酸位置38-402中的hR198_L4可变区编码序列的DNA片段(GeneArt Artificial GeneSynthesis service)。通过实施例7)-1-2中相同的方法构建hR198_L4表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-LK/hR198_L4"。
使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corp.)用pCMA-LK/hR198_L4作为模板引入用脯氨酸残基替换氨基酸位置64处的缬氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ ID NO: 34所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-LK/hR198_L3"。
7)-2 构建人源化抗人Orai1抗体重链hR198_H表达载体
7)-2-1 构建hR198_H1和hR198_H2表达载体
合成包含编码序列表的SEQ ID NO: 111代表的hR198_H0核苷酸序列中核苷酸位置36-425中显示的序列的hR198_H0可变区的DNA片段作为人源化抗Orai1抗体重链hR198的候选(GeneArt Artificial Gene Synthesis service)。将包含hR198_H0可变区编码序列的DNA片段用合成的DNA片段作为模板使用KOD -Plus-扩增并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)插入用限制酶BlpI切割的嵌合和人源化抗体IgG1型重链表达载体pCMA-G1的对应位点以构建hR198_H0表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_H0"。hR198_H0的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:112。
随后，使用KOD -Plus-诱变试剂盒(Toyobo Co., Ltd.)用pCMA-G1/hR198_H0作为模板引入用酪氨酸残基替换氨基酸位置66处的色氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ IDNO: 40所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_H2"。
随后，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corp.)和下文给出的引物组用pCMA-G1/hR198_H2作为模板引入用缬氨酸残基替换氨基酸位置56处的异亮氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ ID NO: 38所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_H1"。
7)-2-2 构建hR198_H3、hR198_H4和hR198_H5表达载体
合成包含编码序列表的SEQ ID NO: 113代表的hR198_H5核苷酸序列中核苷酸位置36-425中显示的序列的hR198_H5可变区的DNA片段作为人源化抗Orai1抗体重链hR198的候选(GeneArt Artificial Gene Synthesis service)。通过实施例7-2-1)中相同的方法构建hR198_H5表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_H5"。hR198_H5的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:114。
随后，使用KOD -Plus-诱变试剂盒用pCMA-G1/H5作为模板引入分别用酪氨酸残基和缬氨酸残基替换氨基酸位置66处的色氨酸残基和氨基酸位置67处的异亮氨酸残基的突变。将包含SEQ ID NO: 44所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_H4"。
随后，通过实施例7)-2-1中相同的方法用pCMA-G1/hR198_H4作为模板引入用缬氨酸残基替换氨基酸位置56处的异亮氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ ID NO: 44所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_H3"。
7)-3 制备人源化抗人Orai1抗体hR198
通过如4)-5-1中的相同方法用每一人源化抗人Orai1抗体重链表达载体和每一人源化抗人Orai1抗体轻链表达载体转染FreeStyle 293F细胞以获得含有抗体的培养上清液。
通过组合pCMA-G1/hR198_H1和pCMA-LK/hR198_L1、组合pCMA-G1/hR198_H2和pCMA-LK/hR198_L2、组合pCMA-G1/hR198_H3和pCMA-LK/hR198_L3和组合pCMA-G1/hR198_H4和pCMA-LK/hR198_L4获得人源化抗人Orai1抗体分别命名为"hR198_H1/L1"、"hR198_H2/L2"、"hR198_H3/L3"和"hR198_H4/L4"。
通过rProtein A亲和层析通过如4)-5-2中的相同方法纯化各自获得的培养上清液以获得纯化的抗体样品。
[实施例8] 人源化抗人Orai1抗体的体外活性
8)-1 通过流式细胞术的人源化抗人Orai1抗体的抗原结合活性
为了评价人Orai1结合特异性，将通过1)-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后，通过添加在7)-5中制备的人源化抗Orai1抗体hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3或hR198_H4/L4或亲本抗体cR118或cR198悬浮HEK293T细胞，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，随后通过添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的抗人IgGFITC缀合物悬浮，并置于4℃下孵育30分钟。将细胞用含5% FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5% FBS和1 μg/mL 碘化丙啶的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500)进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度（MFI）。人源化的抗人Orai1抗体hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3和hR198_H4/L4不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞，并且如图5中所示，各自以浓度依赖性方式仅结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞，如同亲本抗体cR118或cR198，表明这些抗体各自特异性结合人Orai1。
8)-2 人源化抗人Orai1抗体的人T细胞系活化抑制作用
人T细胞系Jurkat细胞以1.5 x 106细胞/mL的浓度在含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640中制备，并以80 μL/孔接种至96孔细胞培养板，并用以10μL/孔添加的人源化抗人Orai1抗体hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3或hR198_H4/L4或人嵌合抗人Orail抗体cR118或cR198在37℃和5% CO2条件下预处理60分钟。随后，将100 ng/mL PMA和1 μg/mL A23187以10 μL/孔添加并充分搅拌，随后在37℃和5% CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600 g离心3分钟。上清液中包含的IL-2浓度通过ELISA测量。图6显示人源化抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。人源化抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从Jurkat细胞的IL-2释放，并且hR198_H1/L1和hR198_H2/L2的抑制活性等于人嵌合抗人Orai1抗体cR118和cR198的抑制活性。另一方面，hR198_H3/L3和hR198_H4/L4展示出比cR118和cR198的更低的浓度下的抑制活性。
[实施例9] 通过核糖体展示鉴定增强活性的突变
9)-1 制备H链和L链文库
用人源化抗人Orai1抗体hR198_H4/L4作为模板构建含有突变的H链或L链的文库并进行通过核糖体展示鉴定增强活性的突变。
9)-1-1 制备H链文库
用hR198_H4基因作为模板使用下文给出的引物组和rTaq DNA 聚合酶(ToyoboCo., Ltd.)进行80个循环的PCR以随机突变基因区。
引物组
Figure 925839DEST_PATH_IMAGE008
引物Orai1 HF)
Figure 594718DEST_PATH_IMAGE009
引物Orai1 CH FR)。
随后，用随机突变的H链基因、包含T7启动子的5'UTR位点、包含5'添加的c-Myc和3'添加的SecM序列的TolA基因片段作为模板使用下文给出的引物组进行重叠PCR以制备H链文库。
引物组
Figure 525765DEST_PATH_IMAGE010
引物M13 rev 长)
Figure 280094DEST_PATH_IMAGE011
引物SecM 终止 R)。
9)-1-2 制备L链文库
用hR198_L4基因作为模板使用下文给出的引物组和rTaq DNA 聚合酶进行80个循环的PCR以随机突变基因区。
引物组
Figure 17106DEST_PATH_IMAGE012
引物Orai1 LcF)
Figure 478174DEST_PATH_IMAGE013
引物Orai1 CL-FR)。
以如9)-1-1的描述中相同的方式，使用各随机突变的L链基因和上文描述的两个基因片段作为模板进行重叠PCR以制备L链文库。
9)-1-3 制备H链基因片段
通过PCR用hR198_H4基因作为模板使用下文给出的引物组和KOD -Plus-扩增H链基因区。
引物组
Figure 908018DEST_PATH_IMAGE014
引物 Orai1 HF)
Figure 149644DEST_PATH_IMAGE015
Figure 362451DEST_PATH_IMAGE016
引物 Orai1 HR-FLAG R)。
随后，用基因片段和包含T7启动子的5'UTR作为模板使用下文给出的引物组进行重叠PCR以制备H链基因片段。
引物组
Figure 5922DEST_PATH_IMAGE017
引物 M13 rev 长)
Figure 341088DEST_PATH_IMAGE018
Figure 7693DEST_PATH_IMAGE019
引物 Orai1 HR-FLAG R)。
9)-1-4 制备L链基因片段
通过PCR用hR198_L4基因作为模板使用下文给出的引物组和KOD -Plus-扩增L链基因区。
引物组
Figure 86507DEST_PATH_IMAGE020
引物 Orai1 LcF)
Figure 584485DEST_PATH_IMAGE021
Figure 356131DEST_PATH_IMAGE022
引物 Orai1 CL-FLAG R)。
随后，以如9)-1-3中描述的相同方式，进行重叠PCR以制备L链基因片段。
引物组
Figure 244453DEST_PATH_IMAGE023
引物 M13 rev 长)
Figure 126958DEST_PATH_IMAGE024
Figure 479442DEST_PATH_IMAGE025
引物 Orai1 CL-FLAG R)。
9)-1-5 制备mRNA
用实施例9)-1-1至9)-1-4制备的文库和基因片段作为模板使用T7 RiboMaxExpress Large Scale RNA Production System (Promega Corp.)合成各mRNA。
9)-2 通过核糖体展示筛选
通过组合H链文库和L链基因片段制备H链核糖体展示Fab，并且通过组合L链文库和H链基因片段制备L链核糖体展示Fab。将20 pmol的H链（或L链）文库mRNA和100 pmol的核糖体添加至PUREfrex反应溶液(GeneFrontier Corp.)，并将混合物在30℃下孵育45分钟。类似地，将40 pmol的L链（或H链）mRNA和200 pmol的核糖体添加至PUREfrex反应溶液，并将混合物在30℃下孵育45分钟。随后，将H链（或L链）文库和L链（或H链）的翻译后反应溶液混合并进一步在30℃下孵育90分钟以制备H链（或L链）核糖体展示Fab。随后，通过冷却至4℃终止反应。随后，将抗原添加至反应溶液，并将混合物在4℃下轻柔搅拌1小时使得每一Fab结合至抗原。所用抗原为通过使用1)-1-1中制备的pcDNA3.1-hOrai1或下文显示的生物素-PEG化的人Orai1环区肽(Sigma-Aldrich Corp.)建立的组成型表达人Orai1的CHO细胞的福尔马林固定样品。
生物素-PEG化的人Orai1环区肽
生物素-PEG-
Figure 359674DEST_PATH_IMAGE026
Figure 797608DEST_PATH_IMAGE027
。
使用Nonolink Streptavidin磁珠(SoluLink, Inc.)回收结合有抗原的核糖体展示Fab。随后，将抗原用50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、15 mM Mg(OAc)2、0.05%Tween 20和1 mg/mL酵母RNA和用50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、15 mM Mg(OAc)2和0.05% Tween 20洗涤。随后，将50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、15 mMMg(OAc)2和50 mM EDTA添加至抗原，并将混合物在室温下保持静置10分钟，随后通过离心回收含有mRNA的上清液。使用Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (F.Hoffmann-La Roche, Ltd.)从回收的mRNA中形成cDNA，并随后通过PCR使用下文给出的引物组和KOD -Plus-扩增为DNA。用DNA作为模板合成mRNA并以如上相同方式进一步筛选。将筛选循环进行多次以选择强烈结合抗原的抗体的基因。
引物组
Figure 218225DEST_PATH_IMAGE028
引物 Orai1-LcF)
Figure 628478DEST_PATH_IMAGE029
引物Myc-R)。
9)-3 制备Fab蛋白
将所选的基因亚克隆至载体中用于在大肠杆菌中表达，并通过细胞ELISA筛选具有针对组成型表达人Orai1的CHO细胞改善的结合活性的克隆。首先，用限制酶EcoRV和XhoI切割每一所选的DNA并插入用如上相同的酶切割的用于Fab表达的载体(GeneFrontierCorp.)，将所述载体随后转化入大肠杆菌BL21（DE3）中。将因此获得的转化子在37℃下在圆底96孔板的150 μL羧苄青霉素/0.1%葡萄糖/2 x YT/孔中孵育4-5小时。随后，将板冷却至4℃，并随后，以终浓度0.5 mM向其加入IPTG，随后在30℃下过夜摇动培养。随后，通过离心回收细菌细胞，并随后向其加入裂解缓冲液(2.5 mg/mL溶菌酶, 100 U DNase I)，随后在室温下摇动60分钟。随后，通过离心回收上清液以制备Fab样品。
9)-4 通过细胞ELISA筛选
将表达人Orai1的细胞在384孔板中培养直至成为汇合片(confluent sheet)。随后，将板用洗涤缓冲液(PBS(-)、20 mM MgSO4、2.5% FBS)洗涤。随后，将Fab样品加入到板中，并将板在4℃下摇动1小时。用洗涤缓冲液洗涤四次后，向其加入过氧化物酶标记的抗人F(ab')2山羊抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)，并将板在4℃下摇动30分钟。用洗涤缓冲液将板洗涤三次，并随后用PBS(-)和20 mM MgSO4洗涤三次。随后，向其添加生色试剂(0.4 mg/mL四甲基联苯胺、200 mM 乙酸钠(pH 3.4)、0.01%过氧化氢水溶液)，并将板在室温下摇动15分钟。随后，向其加入2 N HCl，随后测量OD450。选择相比于对照CHO细胞针对组成型表达人Orai1的CHO细胞展示出更高的OD450的Fab样品。
9)-5 通过流式细胞术的抗人Orai1抗体Fab的抗原结合活性
为了评价人Orai1结合特异性，将通过1)-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后，通过添加在9)-4中选择的轻链突变的克隆LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151或PE057或者重链突变的克隆HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124或HEP237或者亲本抗体Fab hR198_H4/L4-Fab悬浮HEK293T细胞，并在4℃下保持静置30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，随后通过添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的抗人IgG FITC缀合物悬浮，并置于4℃下保持静置30分钟。将细胞用含5% FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5% FBS和1 μg/mL 碘化丙啶的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500)进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控去除碘化丙啶阳性的死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度（MFI）。轻链突变的克隆LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151和PE057和重链突变的克隆HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124和HEP237不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞，如同亲本抗体Fab hR198_H4/L4-Fab，并且，如图7中所示，各自倾向于以与亲本抗体Fab的等同的或比其更强的水平结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞中的人Orai1。
[实施例10] 制备人源化抗人Orai1抗体的亲和力成熟抗体
通过转移实施例9)中所选的轻链突变的克隆LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151和PE057和重链突变的克隆HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124和HEP237中发现的增强活性的突变中的一些至hR198_H3/L3来制备100种或更多种类型的工程化的hR198_H3/L3抗体，并且从结合亲和力、体外活性、生产力和针对人的异质抗原性的观点来评估。结果是，选择下文显示的抗体。
10)-1 设计人源化抗人Orai1抗体的亲和力成熟抗体
10)-1-1 hR198_LG1型轻链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 35所示的hR198_L3轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_LG1型轻链”：用甘氨酸残基替换氨基酸位置51处的天冬酰胺残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置113处的苏氨酸残基、和用丝氨酸残基替换氨基酸位置117处的苏氨酸残基。
编码hR198_LG1型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:55中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_LG1型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:56中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQ ID NOs: 55和56的序列两者也显示于图30中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
10)-1-2 hR198_LG2型轻链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 35所示的hR198_L3轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_LG2型轻链”：用组氨酸残基替换氨基酸位置44处的精氨酸残基、用天冬酰胺残基替换氨基酸位置48处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置51处的天冬酰胺残基、用亮氨酸残基替换氨基酸位置70处的丝氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置75处的谷氨酸残基、用色氨酸残基替换氨基酸位置76处的丝氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置113处的苏氨酸残基和用丝氨酸残基替换氨基酸位置117处的苏氨酸残基。
编码hR198_LG2型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:57中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_LG2型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:58中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQ ID NOs: 57和58的序列两者也显示于图31中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
10)-1-3 hR198_LG3型轻链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 35所示的hR198_L3轻链通过以下设计的人源化R198轻链命名为“hR198_LG3型轻链”：用组氨酸残基替换氨基酸位置44处的精氨酸残基、用精氨酸残基替换氨基酸位置47处的谷氨酰胺残基、用天冬酰胺残基替换氨基酸位置48处的丝氨酸残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置51处的天冬酰胺残基、用亮氨酸残基替换氨基酸位置70处的丝氨酸残基、用丝氨酸残基替换氨基酸位置73处的苏氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置75处的谷氨酸残基、用色氨酸残基替换氨基酸位置76处的丝氨酸残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置113处的苏氨酸残基和用丝氨酸残基替换氨基酸位置117处的苏氨酸残基。
编码hR198_LG3型轻链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:59中。核苷酸位置61-702编码通过切割信号序列形成的成熟轻链。核苷酸位置61-378编码可变区。hR198_LG3型轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:60中。氨基酸位置21-234代表通过切割信号序列形成的成熟轻链。氨基酸位置21-126代表可变区。SEQ ID NOs: 59和60的序列两者也显示于图32中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
10)-1-4 hR198_HG1型重链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 43所示的hR198_H3重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_HG1型重链”：用天冬氨酸残基替换氨基酸位置78处的天冬酰胺残基和用丙氨酸残基替换氨基酸位置123处的缬氨酸残基。
编码hR198_HG1型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:61中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_HG1型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:62中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-135代表可变区。SEQ ID NOs: 61和62的序列两者也显示于图33中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
10)-1-5 hR198_HG2型重链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 43所示的hR198_H3重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_HG2型重链”：用异亮氨酸残基替换氨基酸位置48处的缬氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置78处的天冬酰胺残基、用甘氨酸残基替换氨基酸位置81处的丙氨酸残基和用丙氨酸残基替换氨基酸位置123处的缬氨酸残基。
编码hR198_HG2型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:63中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_HG2型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:64中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-135代表可变区。SEQ ID NOs: 63和64的序列两者也显示于图34中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
10)-1-6 hR198_HG3型重链:
将关于序列表中SEQ ID NO: 43所示的hR198_H3重链通过以下设计的人源化R198重链命名为“hR198_HG3型重链”：用异亮氨酸残基替换氨基酸位置48处的缬氨酸残基、用天冬氨酸残基替换氨基酸位置78处的天冬酰胺残基、用甲硫氨酸残基替换氨基酸位置81处的丙氨酸残基和用丙氨酸残基替换氨基酸位置123处的缬氨酸残基。
编码hR198_HG3型重链的核苷酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:65中。核苷酸位置58-1398编码通过切割信号序列形成的成熟重链。核苷酸位置58-408编码可变区。hR198_HG3型重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:66中。氨基酸位置20-466代表通过切割信号序列形成的成熟重链。氨基酸位置20-135代表可变区。SEQ ID NOs: 65和66的序列两者也显示于图35中。每一CDR序列及其对应的SEQ ID NO显示于图38中。
10)-2 制备人源化抗人Orai1抗体的亲和力成熟抗体表达载体
10)-2-1 构建hR198_LG1型轻链表达载体
使用KOD -Plus-诱变用pCMA-LK/hR198_L3作为模板引入用甘氨酸残基替换氨基酸位置51处的天冬酰胺残基、用异亮氨酸残基替换氨基酸位置113处的苏氨酸残基和用丝氨酸残基替换氨基酸位置117处的苏氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ ID NO: 55所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-LK/hR198_LG1"。
10)-2-2 构建hR198_LG2和LG3型轻链表达载体
合成包含显示于序列表的SEQ ID NO: 59代表的hR198_LG3的核苷酸序列中核苷酸位置38-402中的hR198_LG3可变区编码序列的DNA片段(GeneArt Artificial GeneSynthesis service)。用限制酶EcoRV和AvaI切割合成的DNA片段并插入到用如上同样的限制酶切割的pCMA-LK/hR198_LG1中以构建hR198_LG3表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-LK/hR198_LG3"。
使用KOD -Plus-诱变用pCMA-LK/hR198_LG3作为模板引入用谷氨酰胺残基替换氨基酸位置47处的精氨酸残基和用苏氨酸残基替换氨基酸位置73处的丝氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ ID NO: 57所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-LK/hR198_LG2"。
10)-2-3 构建hR198_HG1型重链表达载体
使用KOD -Plus-诱变用pCMA-G1/hR198_H3作为模板引入用天冬氨酸胺残基替换氨基酸位置78处的天冬酰胺残基和用丙氨酸残基替换氨基酸位置123处的缬氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ ID NO: 61所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_HG1"。
10)-2-4 构建hR198_HG2型重链表达载体
使用KOD -Plus-诱变用pCMA-G1/hR198_HG1作为模板引入用异亮氨酸胺残基替换氨基酸位置48处的缬氨酸残基和用甘氨酸残基替换氨基酸位置81处的丙氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ ID NO: 63所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_HG2"。
10)-2-5 构建hR198_HG3型重链表达载体
使用KOD -Plus-诱变用pCMA-G1/hR198_HG2作为模板引入用甲硫氨酸残基替换氨基酸位置81处的甘氨酸残基的突变。将包含序列表的SEQ ID NO: 65所代表的核苷酸序列的所获的表达载体命名为"pCMA-G1/hR198_HG3"。
10)-3 制备人源化抗人Orai1抗体的亲和力成熟抗体
通过如4)-5-1中的相同方法用10)-2中制备的每一人源化抗人Orai1抗体重链表达载体和每一人源化抗人Orai1抗体轻链表达载体转染FreeStyle 293F细胞以获得含有抗体的培养上清液。
将通过组合含有突变的作为模板的pCMA-G1/hR198_H3或pCMA-G1/hR198_HG1、pCMA-G1/hR198_HG2或pCMA-G1/hR198_HG3与pCMA-LK/hR198_LG1、pCMA-LK/hR198_LG2或pCMA-LK/hR198_LG3获得的人源化抗人Orai1抗体分别命名为"hR198_H3/LG1"、"hR198_HG1/LG1"、"hR198_HG1/LG2"、"hR198_HG1/LG3"、"hR198_HG2/LG1"和"hR198_HG3/LG1"。
通过rProtein A亲和层析通过如4)-5-2中的相同方法纯化各自获得的培养上清液以获得纯化的抗体样品。
[实施例11] 亲和力成熟抗体的体外活性
11)-1 通过流式细胞术评价亲和力成熟抗体结合的能力
为了评价人Orai1结合特异性，将通过1)-4-1中所示的方法制备的pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞悬液或pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞悬液离心以去除上清液。随后，通过添加在10)-3中制备的亲和力成熟抗体hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1或hR198_HG3/LG1或亲本抗体hR198_H3/L3或hR198_H4/L4悬浮HEK293T细胞，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，随后通过添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的抗人IgG FITC缀合物悬浮，并置于4℃下孵育30分钟。将细胞用含5% FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5% FBS和1 μg/mL 碘化丙啶的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500)进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度（MFI）。亲和力成熟抗体hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1和hR198_HG3/LG1不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞，如同亲本抗体hR198_H3/L3或hR198_H4/L4，并且，如图8中所示，各自倾向于以与亲本抗体的等同的或比其更强的水平结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞中的人Orai1。
11)-2 亲和力成熟抗体的T细胞活化抑制作用
人T细胞系Jurkat细胞以1.5 x 106细胞/mL的浓度在含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640中制备，并以80 μL/孔接种至96孔细胞培养板，并用以10μL/孔添加的亲和力成熟抗体hR198_H3/LG1, hR198_HG1/LG1, hR198_HG1/LG2, hR198_HG1/LG3, hR198_HG2/LG1或hR198_HG3/LG1或人源化抗人Orai1抗体hR198_H3/L3或hR198_H4/L4在37℃和5% CO2条件下预处理60分钟。随后，将100 ng/mL PMA和1 μg/mL A23187以10 μL/孔添加并充分搅拌，随后在37℃和5% CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600 g离心3分钟。上清液中包含的IL-2浓度通过ELISA测量。图9显示亲和力成熟抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。亲和力成熟抗体各自以浓度依赖性方式抑制从Jurkat细胞的IL-2释放并且在抑制活性上均优于人源化抗人Orai1抗体hH3/L3和hH4/L4（其为亲本抗体）。
[实施例12] 制备亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式
如下文实施例中所述通过取代恒定区中的两个氨基酸残基构建来源于hR198_HG1的恒定区工程化的hR198_HG1-LALA序列。
12)-1 设计LALA型重链表达载体
为了规避针对表达人Orai1的正常细胞的细胞毒性，期望抗体应具有低效应子活性。效应子活性已知在抗体亚类中是不同的。观察到以下特征，例如，IgG4具有低ADCC和CDC活性，且IgG2具有CDC活性，但具有低ADCC活性。在这些特征的基础上，可以通过参考IgG2或IgG4部分取代IgG1的恒定区序列来制备具有降低的ADCC和CDC活性的IgG1抗体。作为一个实例，Marjan Hezareh 等人, Journal of Virology, 75 (24):12161-12168 (2001)显示IgG1的ADCC和CDC活性通过用丙氨酸残基置换IgG1的位置234和235（位置通过Kabat等人的EU索引来表示）处的每一亮氨酸残基来降低。因此，将关于10)-1中制备的hR198_HG1型重链通过用丙氨酸残基替代氨基酸位置253处的亮氨酸残基和用丙氨酸残基替代氨基酸位置254处的亮氨酸残基设计的人源化抗人Orai1抗体重链命名为“hR198_HG1-LALA型重链”。
12)-2 构建LALA型重链表达载体
12)-2-1 构建hR198_HG1-LALA型重链表达载体
使用KOD -Plus- 诱变试剂盒用7)-2中制备的hR198_H4型重链pCMA-G1/hR198_H4作为模板引入突变，以构建hR198_H4-LALA型重链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-G1-LALA/hR198_H4"。编码hR198_H4-LALA型重链的核苷酸序列和所述重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQ ID NO: 67和68（图36）中。
通过用限制酶PstI和XbaI消化10)-2中制备的pCMA-G1/hR198_HG1获得包含抗体可变区编码序列的约0.6 kb的DNA片段，并使用Ligation High版本2将其插入到通过用如上同样的限制酶消化pCMA-G1-LALA/hR198_H4获得的约4.2 kb的DNA片段中，以构建hR198_HG1-LALA型重链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-G1-LALA/hR198_HG1"。编码hR198_HG1-LALA型重链的核苷酸序列和所述重链的氨基酸序列分别显示于序列表的SEQID NO: 69和70（图37）中。
12)-3 制备亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式
12)-3-1 产生亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式
根据手册继代培养和培养FreeStyle 293F细胞(Life Technologies Corp.)。将处于对数生长期的1.2 × 109个FreeStyle 293F细胞(Life Technologies Corp.)接种到3 L Fernbach Erlenmeyer Flask (Corning Inc.)，用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)通过稀释以1.0 × 106细胞/mL制备，并随后在37℃下在8% CO2培养箱中以90 rpm摇动培养1小时。将3.6 mg的聚乙烯亚胺(Polysciences #24765)溶解在20 mL的Opti-Pro SFM (Life Technologies Corp.)中。随后，将使用PureLink HiPure Plasmid试剂盒(Life Technologies Corp.)制备的每一轻链表达载体（0.8 mg）和每一重链表达载体（0.4 mg）加入到20 mL的Opti-Pro SFM (Life Technologies Corp.)中。将20 mL的表达载体/Opti-Pro SFM混合的溶液加入20 ml的聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合的溶液中，并将混合物轻柔搅拌，进一步放置5分钟，并随后加入到FreeStyle 293F细胞中。将细胞以90rpm在37℃下在8% CO2培养箱中摇动培养7天，并将所获的培养上清液经DisposableCapsule Filter (ADVANTEC #CCS-045-E1H)进行过滤。通过组合pCMA-G1/hR198_HG1和pCMA-LK/hR198_LG1产生hR198_HG1/LG1，并且通过组合pCMA-G1-LALA/hR198_HG1和pCMA-LK/hR198_LG1产生hR198_HG1-LALA/LG1。
12)-3-2 亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式的两步纯化
使用rProtein A亲和层析(在4-6℃)和陶瓷羟磷灰石(在室温)以两步从实施例12)-3-1中获得的培养上清液中纯化每一抗体。通过rProtein A亲和层析纯化后和通过陶瓷羟磷灰石纯化后的缓冲液置换步骤在4-6℃下进行。将培养上清液应用到用PBS平衡的MabSelectSuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., HiTrap柱)。整个培养上清液进入柱后，将柱用2倍或更多倍柱体积的PBS洗涤。随后，通过用2 M的精氨酸盐酸盐溶液（pH4.0）洗脱收集含抗体的级分。将级分的缓冲液用PBS通过透析(Thermo Fisher ScientificInc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)置换并随后用5 mM磷酸钠/50 mM MES (pH7.0)的缓冲液稀释5倍。将所得的抗体溶液应用至用5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl(pH 7.0)的缓冲液平衡的陶瓷羟磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-ScaleCHT Type-1 Hydroxyapatite Column)。通过用氯化钠线性浓度梯度洗脱收集含抗体的级分。通过透析(Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)用HBSor (25 mM组氨酸/5%山梨糖醇, pH 6.0)置换级分的缓冲液。使用Centrifugal UFFilter Device VIVASPIN 20 (分子量截止: UF10K, Sartorius Japan K.K., 4℃)将溶液浓缩至5 mg/mL或更高的IgG浓度。最后，将抗体溶液经Minisart-Plus滤器(SartoriusJapan K.K.)过滤并用作经纯化的样品。
[实施例13] 制备人抗人Orai1抗体2C1.1和5H3.1表达载体
在WO2011063277A1中描述的轻链和重链的氨基酸序列的基础上制备2C1.1和5H3.1抗体。
13)-1 构建嵌合和人源化IgG2型重链表达载体pCMA-G2
使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒将通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK以去除编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列获得的DNA片段与包含编码人重链分泌信号和人IgG2恒定区的氨基酸的序列的DNA片段（显示于序列表的SEQ ID NO: 71中）连接以构建具有信号序列、克隆位点和CMV启动子下游的人IgG2重链恒定区编码序列的嵌合和人源化抗体IgG2型重链表达载体pCMA-G2。
13)-2 构建2C1.1抗体重链表达载体
合成包含显示于序列表的SEQ ID NO: 72代表的2C1.1抗体重链编码核苷酸序列中核苷酸位置36-434中的2C1.1抗体重链可变区编码序列的DNA片段(GeneArt ArtificialGene Synthesis service)。将包含2C1.1抗体重链可变区编码序列的DNA片段用合成的DNA片段作为模板使用KOD -Plus-扩增并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒插入用限制酶BlpI切割的嵌合和人源化抗体IgG2型重链表达载体pCMA-G2的对应位点以构建2C1.1抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-G2/2C1.1"。
2C1.1抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:73中。
13)-3 构建2C1.1抗体轻链表达载体
合成包含显示于序列表的SEQ ID NO: 74代表的2C1.1抗体轻链编码核苷酸序列中核苷酸位置38-739中的2C1.1抗体轻链可变区和恒定区(λ链)编码序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis service)。将包含2C1.1抗体轻链可变区和恒定区编码序列的DNA片段用合成的DNA片段作为模板使用KOD -Plus-扩增并使用In-Fusion HDPCR克隆试剂盒插入用限制酶BsiWI和PmeI切割的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK的对应位点以构建2C1.1抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-L/2C1.1"。
2C1.1抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:75中。
13)-4 构建5H3.1抗体重链表达载体
合成包含显示于序列表的SEQ ID NO: 76代表的5H3.1抗体重链编码核苷酸序列中核苷酸位置36-434中的5H3.1抗体重链可变区编码序列的DNA片段(GeneArt ArtificialGene Synthesis service)。通过实施例13)-2中相同的方法构建5H3.1抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-G2/5H3.1"。
5H3.1抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:77中。
13)-5 构建5H3.1抗体轻链表达载体
合成包含显示于序列表的SEQ ID NO: 78代表的5H3.1抗体轻链编码核苷酸序列中核苷酸位置38-742中显示的5H3.1抗体轻链可变区和恒定区编码序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis service)。通过实施例13)-3中相同的方法构建5H3.1抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA-L/5H3.1"。
5H3.1抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:79中。
13)-6 制备2C1.1和5H3.1抗体
13)-6-1 产生2C1.1和5H3.1抗体
通过实施例12-3-1)中相同的方法产生每一抗体。通过组合pCMA-G2/2C1.1和pCMA-L/2C1.1产生2C1.1抗体，和通过组合pCMA-G2/5H3.1和pCMA-L/5H3.1产生5H3.1抗体。
13)-6-2 2C1.1和5H3.1抗体的两步纯化
通过如实施例12)-3-2的相同方法从实施例13)-6-1中产生的培养上清液两步纯化每一抗体。
[实施例14] 制备小鼠抗人Orai1抗体10F8、14F74和17F6
在WO2013091903A1中描述的轻链和重链的氨基酸序列的基础上制备10F8、14F74和17F6抗体。
14)-1 构建10F8抗体重链表达载体
合成包含序列表的SEQ ID NO: 80代表的10F8抗体重链编码核苷酸序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis service)。用合成的DNA片段作为模板使用KOD-Plus-扩增包含10F8抗体重链编码序列的DNA片段，并使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒插入到其中通过用限制酶XbaI和PmeI消化嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK去除编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列的位点，以构建10F8抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA/10F8H"。
10F8抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:81中。
14)-2 构建10F8抗体轻链表达载体
合成包含序列表的SEQ ID NO: 82代表的10F8抗体轻链编码核苷酸序列的DNA片段(GeneArt Strings DNA Fragments)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒将合成的DNA片段插入到其中通过用限制酶XbaI和PmeI消化嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK去除编码κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列的位点，以构建10F8抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA/10F8L"。
10F8抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:83中。
14)-3 构建14F74抗体重链表达载体
合成包含序列表的SEQ ID NO: 84代表的14F74抗体重链编码核苷酸序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis service)。通过实施例14)-1中相同的方法构建14F74抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA/14F74H"。
14F74抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:85中。
14)-4 构建14F74抗体轻链表达载体
合成包含序列表的SEQ ID NO: 86代表的14F74抗体轻链编码核苷酸序列的DNA片段(GeneArt Strings DNA Fragments)。通过实施例14)-2中相同的方法构建14F74抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA/14F74L"。
14F74抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:87中。
14)-5 构建17F6抗体重链表达载体
合成包含序列表的SEQ ID NO: 88代表的17F6抗体重链编码核苷酸序列的DNA片段(GeneArt Artificial Gene Synthesis service)。通过实施例14)-1中相同的方法构建17F6抗体重链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA/17F6H"。
17F6抗体重链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:89中。
14)-6 构建17F6抗体轻链表达载体
合成包含序列表的SEQ ID NO: 90代表的17F6抗体轻链编码核苷酸序列的DNA片段(GeneArt Strings DNA Fragments)。通过实施例14)-2中相同的方法构建17F6抗体轻链表达载体。所获得的表达载体命名为"pCMA/17F6L"。
17F6抗体轻链的氨基酸序列显示在序列表的SEQ ID NO:91中。
14)-7 制备10F8、14F74和17F6抗体
14)-7-1 产生10F8、14F74和17F6抗体
通过实施例12-3-1)中相同的方法产生每一抗体。通过组合pCMA/10F8H和pCMA/10F8L产生10F8抗体。通过组合pCMA/14F74H和pCMA/14F74L产生14F74抗体。通过组合pCMA/17F6H和pCMA/17F6L产生17F6抗体。
14)-7-2 10F8、14F74和17F6抗体的两步纯化
通过如实施例12)-3-2的相同方法从实施例14)-7-1中获得的培养上清液两步纯化每一抗体。
[实施例15] 亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式与其他抗人Orai1抗体的体外活性比较
15)-1 通过流式细胞术的抗人Orai1抗体的抗原结合活性
将通过1)-4-2中显示的方法用1)-1-1中构建的每一人Orai1表达载体转染的HEK293T细胞的细胞悬浮液离心以去除上清液。随后，通过添加12)-3中制备的hR198_HG1/LG1或hR198_HG1/LG1-LALA、13)-6中制备的2C1.1或5H3.1、14)-7中制备的10F8、14F74或17F6、或人IgG对照抗体或小鼠IgG对照抗体（作为对照）悬浮pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞或pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞，并且在4℃下孵育30分钟。将细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，随后通过添加用含有5% FBS的PBS稀释100倍的抗人IgG FITC缀合物（对于人抗体）或抗小鼠IgG FITC缀合物(Cappel Laboratories, Inc.)（对于小鼠抗体）悬浮，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用含5% FBS的PBS洗涤2次并随后重悬于含5% FBS和1 μg/mL 碘化丙啶的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500)进行检测。使用Flowjo分析数据。通过门控排除碘化丙啶阳性的死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度作图为直方图以计算平均荧光强度（MFI）。hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74和17F6不结合pcDNA3.1-DEST转染的HEK293T细胞，并且，如图10（小鼠抗体）和图11（人抗体）中所示，各自结合pcDNA3.1-hOrai1转染的HEK293T细胞，表明所有这些抗体特异性结合人Orai1。另一方面，此类结合在小鼠IgG对照抗体中未观察到。
15)-2 抗人Orai1抗体的人T细胞系活化抑制作用
人T细胞系Jurkat细胞以1.5 x 106细胞/mL的浓度在RPMI1640（含有10% FBS、100U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中制备，并以80 μL/孔接种至96孔细胞培养板，并用以10μL/孔添加的hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74或17F6在37℃和5% CO2条件下预处理60分钟。随后，将100 ng/mL PMA和1 μg/mL A23187以10 μL/孔(终浓度：10 ng/mL PMA和100 ng/mL A23187)添加并充分搅拌，随后在37℃和5% CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600 g离心3分钟。上清液中包含的IL-2浓度通过ELISA测量。图12显示抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的Jurkat细胞的IL-2释放。图13显示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74和17F6的半最大抑制浓度(IC50)和80%抑制浓度(IC80)，且不存在抗体的情况下的IL-2浓度定义为100%。现有技术的抗体的IC50为80 ng/mL或更高，而本发明的典型抗体的IC50为10 ng/mL或更低。现有技术的抗体的IC80为60000 ng/mL或更高，而本发明的典型抗体的IC80为200 ng/mL或更低。
15)-3 亲和力成熟抗体的效应子活性降低的工程化形式和其他抗人Orai1抗体的人外周血单核细胞活化抑制作用
人外周血单核细胞（PBMC）作为冷冻产品购自Cellular Technology Ltd.并在根据说明书手册融化后使用。将在含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640中以2.0 x 106细胞/mL的浓度制备的PBMC以80 μL/孔接种在96孔细胞培养板上，并用以10 μL/孔添加的各抗人Orai1抗体在37℃下培养箱中预处理60分钟。随后，将100ng/mL PMA和1 μg/mL A23187以10 μL/孔添加并充分搅拌，随后在37℃和5% CO2条件下培养大约16小时。将板充分搅拌并随后以600 g离心3分钟。上清液中含有的IL-2浓度和干扰素γ(IFN-γ)浓度(Mabtech AB)通过ELISA测量。图51显示抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的人PBMC的IL-2释放。图52显示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74和17F6的半最大抑制浓度(IC50)和80%抑制浓度(IC80)，且不存在抗体的情况下的IL-2浓度定义为100%。现有技术的抗体的IC50为100 ng/mL或更高，而本发明的典型抗体的IC50为20 ng/mL或更低。现有技术的抗体的IC80为17000ng/mL或更高，而本发明的典型抗体的IC80为400 ng/mL或更低。图53显示抗人Orai1抗体各自以浓度依赖性方式抑制从用PMA和A23187处理的人PBMC的IFN-γ释放。图54显示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74和17F6的半最大抑制浓度(IC50)和80%抑制浓度(IC80)，且不存在抗体的情况下的IFN-γ浓度定义为100%。现有技术的抗体的IC50为800 ng/mL或更高，而本发明的典型抗体的IC50为40 ng/mL或更低。现有技术的抗体的IC80为300000 ng/mL或更高，而本发明的典型抗体的IC80为2000 ng/mL或更低。
[实施例16] hR198_HG1/LG1的体内活性
16)-1 施用hR198_HG1/LG1对人PBMC移植的小鼠移植物抗宿主病模型的作用
已知人移植物抗宿主病样反应可以通过移植人PBMC至NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ)来诱导，所述NSG小鼠为严重的联合免疫缺陷小鼠(Clinical andExperimental Immunology, 157: 104-118 (2009))。购自Charles River LaboratoriesJapan, Inc的17只六周龄雄性NSG小鼠用2.0 Gy的X射线照射 (Hitachi X-rayirradiation apparatus MBR-1520R-4)。随后，将小鼠分入两只小鼠的一个组和各5只小鼠的3个组。用HBSor (25 mM组氨酸/5%山梨醇, pH 6.0)以3 mg/mL和6 mg/mL制备的hR198_HG1/LG1以10 mL/kg（即30 mg/kg和60 mg/kg）静脉内施用至2组(n = 5)小鼠的尾部。仅HBSor施用至另一组(n = 5)作为媒介物组。第二天，使用CTL-抗聚集物(CellularTechnology Ltd.)根据方案融解冷冻的人PBMC (Cellular Technology Ltd.)，并将3,000,000个细胞的人PBMC悬浮在200 μL的PBS中并移植入3组(n = 5)的小鼠中，同时人PBMC不移植至1组(n = 2)，其作为X射线照射对照组随时间进行观察。X射线照射后0、7、14和21天，将hR198_HG1/LG1或HBSor以如上相同剂量施用至施用组。在第0、1、4、7、9、10、11和13天和随后每天测量每只小鼠的体重。体重变化以百分比方式计算，且第0天的体重定义为100%。每组的平均体重的变化显示于图55中。媒介物施用组中平均体重的降低从约第16天开始被观察到。当媒介物施用组的平均体重降到80%以下时，在第21天终止实验。在该时间点，没有接受人PBMC的X射线照射的对照组没有展示出体重降低。以30 mg/kg和60 mg/kg给予hR198_HG1/LG1的小鼠没有降低其体重，并且平均体重等于人PBMC未移植小鼠的平均体重。预期在该系统中显著抑制由活化人PBMC引起的移植物抗宿主病的症状的hR198_HG1/LG1（抗Orai1抗体）对人移植物抗宿主病具有治疗和/或预防作用。
16)-2 使用人Orai1敲入小鼠的hR198_HG1/LG1体内活性评价
16)-2-1 制备人Orai1敲入小鼠
其中小鼠Orai1的胞外环结构域的氨基酸序列用人Orai1序列替换的人Orai1敲入小鼠由Institute of Immunology Co., Ltd.根据遗传工程化小鼠制备的标准方法来制备。简言之，通过用人Orai1基因座替换包含小鼠Orai1基因座的BAC克隆编码区的DNA序列构建人Orai1基因敲入靶向载体，同时向其引入侧翼为loxP序列的新霉素抗性基因。用该靶向载体转染小鼠ES细胞以建立G418抗性系。具有特异性重组的靶基因座的ES细胞系通过Southern杂交筛选。通过用Cre表达载体转染去除选择标记物，并将所得的ES细胞系用于制备嵌合F1小鼠。通过Southern杂交进行基因分型以从F1小鼠中选择杂合突变体个体。将所选的F1杂合突变体个体交配以制备作为F2纯合突变体的人Orai1敲入小鼠。
16)-2-2 hR198_HG1/LG1的被动皮肤过敏（PCA）反应抑制作用
根据标准方法进行小鼠PCA反应。将由Institute of Immunology Co., Ltd.产生的八周龄人Orai1敲入小鼠或野生型仔鼠保持在定位器中。随后，将用HBSor以 6 mg/mL制备的hR198_HG1/LG1以10 mL/kg即60 mg/kg静脉内施用至小鼠的尾部。将仅HBSor施用给媒介物组。第二天，将用生理盐水调节至10 μg/mL的10 μL单克隆抗OVA IgE (Chondrex,Inc.)皮内施用于异氟烷(Pfizer Japan Inc.)吸入麻醉下的每只小鼠的耳廓。24小时后，将含有2 mg/mL OVA (来自鸡蛋清的白蛋白, Sigma-Aldrich Corp.)和20 mg/mL伊文思蓝(Merck KGaA)的生理盐水以5 mg/kg OVA和100 mg/kg伊文思蓝静脉内施用至尾部。30分钟后，通过在异氟烷深度麻醉下放血处死每只小鼠，并且切除其耳廓并浸在0.5 mL的DMSO中，随后为提取伊文思蓝（37℃, 72小时）。含有提取的伊文思蓝的DMSO溶液以200 μL/孔转移至96孔微量板，并且使用微量板读数器(Molecular Devices Corp., SpectraMax M5e)测量O.D. 650 nm。渗出的伊文思蓝的吸光度根据下文给出的计算方法测定，并且用定义为100%的媒介物施用组的平均值来表示。DMSO溶液的吸光度测定为空白。% = (OD650样品 -OD650空白) / (OD650媒介物 - OD650 空白)。图56显示hR198_HG1/LG1抑制人Orai1敲入小鼠中诱导的PCA反应。小鼠PCA反应是再现过敏反应的速发型过敏的基础模型系统，其为人中的I型变态反应，并且已知该系统可用于评价抗过敏药(Archives internationalesde pharmacodynamie et de therapie, 165:92-102 (1967)；和International archivesof allergy and applied immunology, 78:113-117 (1985))。hR198_HG1/LG1（抗Orai1抗体）在该系统中确认具有针对IgE依赖性肥大细胞脱颗粒的抑制活性，预期具有针对在现存的肥大细胞脱颗粒抑制剂中发现的支气管哮喘、过敏性鼻咽和过敏性皮肤炎以及在人中的相似的I型变应性疾病例如变应性哮喘的治疗和/或预防作用。
16)-2-3 hR198_HG1/LG1的迟发型超敏反应（DTH）反应抑制作用
根据标准方法进行小鼠DTH反应。将由Institute of Immunology Co., Ltd.产生的八周龄人Orai1敲入小鼠或野生型仔鼠保持在定位器中。随后，将用HBSor以 6 mg/mL制备的hR198_HG1/LG1以10 mL/kg即60 mg/kg静脉内施用至小鼠的尾部。将仅HBSor施用给媒介物组。第二天，将通过等量混合用生理盐水稀释至5 mg/mL的mBSA (Albumin BovineMethylated, Sigma-Aldrich Corp.)和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories)制备的50 μL的乳状液皮下施用至每只小鼠的两个腋窝的每一个用于免疫。6天后，将hR198_HG1/LG1以60 mg/kg再次静脉内施用至尾部。第二天，在用异氟烷吸入麻醉下将用生理盐水以0.5 mg/mL制备的mBSA和生理盐水各自皮内施用至后肢。施用后6、24和48小时，使用刻度盘(dialgauge)测量腿上的肿胀。腿上肿胀厚度的时间依赖性变化用在0小时作为0 (10-2 mm)的肿胀计算并且用定义为100%的媒介物施用组的平均值测定。图57显示hR198_HG1/LG1在抗原施用后的6小时（A）、24小时（B）和48小时（C）的各个时间点抑制人Orai1敲入小鼠中诱导的DTH反应。小鼠DTH反应是用于观察T细胞依赖性免疫的建立和应答的系统，并且众所周知在该系统中展示活性的药物作为强免疫抑制剂进行开发(Clinical and ExperimentalImmunology, 52: 599-606 (1983))。hR198_HG1/LG1（抗Orai1抗体）在该系统中证实具有针对T细胞免疫的抑制活性，预期针对人中由T细胞活性引起的机体应答或疾病例如移植物排斥、免疫疾病和炎性疾病具有治疗和/或预防作用。
16)-2-4 对抗Orai1抗体针对皮炎的抑制活性的研究
通过任何以下方法诱导皮炎：将0.5 mL白蛋白抗原溶液腹膜内施用于小鼠，并且在2周后，将相同量的以上抗原向其注射作为加强剂。随后，将白蛋白抗原溶液以3天至2周间隔重复应用于耳(20 μL)或背部(100 μL)3-6次。可选地，将螨抗原霜以3天至2周间隔重复应用于耳(20 μL)或背部(100 μL)3-6次。根据方案制备半抗原苦基氯或二硝基氟苯并一周一次或两次应用于耳(20 μL)或背部(100 μL)持续最大8周。可选地，将皮肤反应诱导物质组胺、化合物40/80、5- (和6-)羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸荧光素或蛙皮素样肽施用至耳(20 μL)、背部(100 μL)或脊髓(5 μL)。将抗Orai1抗体在皮炎诱导前一天或在皮炎诱导前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后，施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。皮炎诱导后，使用刻度盘式测厚仪测量耳廓厚度或皮炎的肉眼评分随时间进行。测试期完成后，进行血液或组织中抗体、细胞因子或血清生物标记物浓度的定量，获自皮肤、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的生长活性、细胞因子产生能力、表面抗原等的检查，组织病理学分析等以确定抗Orai1抗体针对皮炎的抑制活性。
16)-2-5 对抗Orai1抗体针对银屑病的抑制活性的研究
在使用咪喹莫特的情况下，通过向耳廓的两侧或一侧(5-30 mg)和剃毛的背部(50-100 mg)应用来诱导银屑病性皮炎。可选地，通过腹膜内施用200 μL的磷酸缓冲溶液中的10 mg/mL酵母聚糖悬浮液来诱导皮炎。在使用细胞因子（IL-23等）作为亲炎性物质(prophlogistic substance)的情况下，通过皮内施用20-50 μL的含有0.1-2 μg细胞因子的溶液至在用1-5%异氟烷深度麻醉下的小鼠耳廓的一侧诱导银屑病性皮炎。将抗Orai1抗体在皮炎诱导前一天或在皮炎诱导前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后，施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。皮炎诱导后，使用刻度盘式测厚仪测量耳廓厚度或皮炎的肉眼评分随时间进行。测试期完成后，进行炎症部位重量的检查、浸润入所述部位的中性粒细胞的髓过氧物酶活性、浸润细胞的流式细胞术分析、基因分析、细胞因子浓度测量等，以确定抗Orai1抗体针对银屑病的抑制活性。
16)-2-6 对抗Orai1抗体针对多发性硬化的抑制活性的研究
将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白或其肽抗原用生理盐水调整至4 mg/mL并通过与用生理盐水调整至8 mg/mL的弗氏完全佐剂等量混合来乳化。将200 μL的该混合溶液皮内施用至小鼠的侧腹或腹部。之后立即将100 μL的2 μg/mL百日咳毒素水溶液从尾静脉施用至该小鼠。2天后，将上述百日咳毒素溶液进一步再次从尾静脉施用以诱导实验性脑脊髓炎。进入实验1周至2周后，发生脑脊髓炎，并且麻痹从尾部扩展至后肢和前肢。通过肉眼观察肢和尾部运动来对这种麻痹程度进行评分。将抗Orai1抗体在脑脊髓炎诱导前一天或在脑脊髓炎诱导前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后，施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。确定施用抗Orai1抗体对多发性硬化的作用。
16)-2-7 对抗Orai1抗体针对关节炎的抑制活性的研究
将通过以1:1.3的体积比率混合2 mg/mL牛II型胶原和弗氏完全佐剂获得的100 μL乳状液使用1 mL注射器和结核菌素针(tuberculin needle)皮内施用至小鼠的尾基部。2-3周后，进行如上相同处理。随后，肉眼观察或使用刻度盘式测厚仪评分肢中的关节肿胀。测试期完成后，测量血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度，获自皮肤、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓等的细胞的生长活性、细胞因子产生能力或表面抗原等。将抗Orai1抗体在关节炎诱导前一天或在关节炎诱导前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后，施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。确定施用抗Orai1抗体对关节炎的作用。
16)-2-8 对抗Orai1抗体针对结肠炎的抑制活性的研究
使用抗CD4抗体GK1.5、抗CD25抗体PC61.5和抗CD45R抗体C363.16A（均来自eBioscience）用细胞分选器分离从人Orai1敲入小鼠的淋巴结和脾收集和纯化的淋巴细胞。通过该方法获得的细胞在流式细胞仪中证实为具有95%或更高纯度的CD4+CD25-CD45RBhi T细胞。随后，将500,000个细胞腹膜内移植入12至16周龄的Rag2-/- 小鼠。随后，进行体重测量和观察症状诸如腹泻持续12周。观察期完成后，通过尸体解剖检查肠道增厚程度、息肉数目和大小以及病理体征存在与否。此外，定量血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度，分析获自肠道、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的生长活性、细胞因子产生能力、表面抗原等。将抗Orai1抗体在细胞移植前一天或在细胞移植前1小时至4小时静脉内或皮下施用。随后，施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。确定施用抗Orai1抗体对结肠炎的作用。
16)-2-9 对抗Orai1抗体对骨髓细胞移植系统的作用的研究
从人Orai1敲入小鼠切除股骨和胫骨，并且通过使用具有针头的注射器从骨骺注射1-5 mL含有10% FBS的RPMI1640培养基将骨髓中的细胞推出。用细胞过滤器处理后，通过离心回收骨髓细胞并调节使得10,000,000个骨髓细胞包含在200 μL的含有10 mM HEPES、0.5 mM EDTA和0.5%青霉素/链霉素的注射缓冲液中。与此同时，根据标准方法从人Orai1敲入小鼠的脾中收集脾细胞。将作为受体的10至13周龄BALB/c小鼠用2.0-8.0 Gy的X射线照射。随后，将0-4,000,000个供体脾细胞加入至200 μL的供体骨髓细胞中，并且将该细胞混合溶液注射至受体的尾静脉。随后，检查体重变化和存活率持续4-16周。测试完成后，测量受体小鼠的血液或组织中的抗体、细胞因子或血清生物标志物的浓度和获自肠道、外周血、胸腺、脾、淋巴结或骨髓的细胞的表面抗原、生长活性、或细胞因子产生能力。将抗Orai1抗体在骨髓移植前一天或在骨髓移植前1小时至4小时静脉内或皮下施用至受体小鼠。随后，施用频率设定至7天至28天间隔以继续抗体施用。确定抗Orai1抗体对移植细胞的植入或移植物抗宿主病的发病率的作用。
[实施例17] 比较亲和力成熟的抗体和其他抗人Orai1抗体之间的生理化学特性
使用m-VROC的粘度测量
将在10)-3中制备的hR198_HG1/LG1或hR198_H3/LG1、在12)-3中制备的hR198_HG1-LALA/LG1或13)-6中制备的2C1.1用VIVAPORE 5 (Sartorius Japan K.K.)浓缩至150mg/mL或更高并随后用HBSor以90、120和150 mg/mL制备。使用m-VROC (RheoSense, Inc.)对于每一浓度测量三次25℃下的粘度以计算平均粘度(mPa·s)。结果显示于图58和表1中。hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1和hR198_HG1-LALA/LG1在所有浓度下的粘度低于2C1.1的粘度。具体而言，在150 mg/mL，hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1和hR198_HG1-LALA/LG1的粘度分别为11.4、10.0和10.8 mPa·s，而2C1.1的粘度为21.0 mPa·s，表明亲和力成熟的抗体相比于2C1.1即使在高浓度下仍然具有低粘度。
[表1]
Figure 741928DEST_PATH_IMAGE030
产业实用性
本发明的人源化抗Orai1抗体比本领域已知的抗体具有更强的T细胞活性抑制作用，并且可以用作用于移植排斥等的治疗或预防剂。
序列表的自由文本
SEQ ID NO:1:人Orai1的基因序列
SEQ ID NO:2:人Orai1的氨基酸序列
SEQ ID NO:3:PCR引物Nhe-polyC-S
SEQ ID NO:4:PCR引物rIgγ-AS1
SEQ ID NO:5:PCR引物rIgγ-AS2
SEQ ID NO:6:PCR引物Nhe-polyC-S
SEQ ID NO:7:PCR引物rIgκ-AS
SEQ ID NO:8:测序引物rIgγ-seq
SEQ ID NO:9:测序引物rIgκ-seq
SEQ ID NO:10:编码R118轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:11:R118轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:12:编码R118重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:13:R118重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:14:编码R198轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:15:R198轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:16:编码R198重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:17:R198重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:18:包含编码人κ链分泌信号和人κ链恒定区的序列的DNA片段
SEQ ID NO:19:PCR引物3.3-F1
SEQ ID NO:20:PCR引物3.3-R1
SEQ ID NO:21:包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸的序列的DNA片段
SEQ ID NO:22:编码人嵌合cR118轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:23:人嵌合cR118轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:24:编码人嵌合cR198轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:25:人嵌合cR198轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:26:编码人嵌合cR118重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:27:人嵌合cR118重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:28:编码人嵌合cR198重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:29:人嵌合cR198重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:30:编码hR198_L1型轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:31:hR198_L1型轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:32:编码hR198_L2型轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:33:hR198_L2型轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:34:编码hR198_L3型轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:35:hR198_L3型轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:36:编码hR198_L4型轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:37:hR198_L4型轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:38:编码hR198_H1型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:39:hR198_H1型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:40:编码hR198_H2型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:41:hR198_H2型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:42:编码hR198_H3型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:43:hR198_H3型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:44:编码hR198_H4型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:45:hR198_H4型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:46:PCR引物Orai1 HF
SEQ ID NO:47:PCR引物Orai1 CH FR
SEQ ID NO:48:PCR引物M13 rev 长
SEQ ID NO:49:PCR引物SecM 终止 R
SEQ ID NO:50:PCR引物Orai1 Lc F
SEQ ID NO:51:PCR引物Orai1 CL-FR
SEQ ID NO:52:PCR 引物 Orai1 HR-FLAG R
SEQ ID NO:53:PCR 引物 Orai1 CL-FLAG R
SEQ ID NO:54:PCR 引物 Myc-R
SEQ ID NO:55:编码hR198_LG1型轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:56:hR198_LG1型轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:57:编码hR198_LG2型轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:58:hR198_LG2型轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:59:编码hR198_LG3型轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:60:hR198_LG3型轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:61:编码hR198_HG1型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:62:hR198_HG1型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:63:编码hR198_HG2型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:64:hR198_HG2型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:65:编码hR198_HG3型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:66:hR198_HG3型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:67:编码hR198_H4-LALA型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:68:hR198_H4-LALA型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:69:编码hR198_HG1-LALA型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:70:hR198_HG1-LALA型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:71:包含编码人重链分泌信号和人IgG2恒定区的氨基酸的序列的DNA片段
SEQ ID NO:72:编码2C1.1抗体重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:73:2C1.1抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:74:编码2C1.1抗体轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:75:2C1.1抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:76:编码5H3.1抗体重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:77:5H3.1抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:78:编码5H3.1抗体轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:79:5H3.1抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:80:编码10F8抗体重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:81:10F8抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:82:编码10F8抗体轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:83:10F8抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:84:编码14F74抗体重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:85:14F74抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:86:编码14F74抗体轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:87:14F74抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:88:编码17F6抗体重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:89:17F6抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:90:编码17F6抗体轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO:91:17F6抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:92:大鼠CDRL1（其来源于R198并用于hR198_L1至hR198_L4型轻链）
SEQ ID NO:93:工程化的CDRL1（其用于hR198_LG1型轻链）
SEQ ID NO:94:工程化的CDRL1（其用于hR198_LG2型轻链）
SEQ ID NO:95:工程化的CDRL1（其用于hR198_LG3型轻链）
SEQ ID NO:96:大鼠CDRL2（其对于R118和R198是共有的并用于hR198_L1至hR198_L4和hR198_LG1型轻链）
SEQ ID NO:97:工程化的CDRL2（其用于hR198_LG2型轻链）
SEQ ID NO:98:工程化的CDRL2（其用于hR198_LG3型轻链）
SEQ ID NO:99:大鼠CDRL3（其来源于R118并用于hR198_L3和hR198_L4型轻链）
SEQ ID NO:100:大鼠CDRL3（其来源于R198并用于hR198_L1和hR198_L2型轻链）
SEQ ID NO:101:工程化的CDRL3（其用于hR198_LG1至hR198_LG3型轻链）
SEQ ID NO:102:大鼠CDRH1（其来源于R118并用于hR198_H3、hR198_H4和hR198_HG1至hR198_HG3型重链）
SEQ ID NO:103:大鼠CDRH1（其来源于R198并用于hR198_H1和hR198_H2型重链）
SEQ ID NO:104:大鼠CDRH2（其来源于R118并用于hR198_H3和hR198_H4型重链）
SEQ ID NO:105:大鼠CDRH2（其来源于R198并用于hR198_H1和hR198_H2型重链）
SEQ ID NO:106:工程化的CDRH2（其用于hR198_HG1型重链）
SEQ ID NO:107:工程化的CDRH2（其用于hR198_HG2型重链）
SEQ ID NO:108:工程化的CDRH2（其用于hR198_HG3型重链）
SEQ ID NO:109:大鼠CDRH3（其对于R118和R198是共有的并用于hR198_H1至hR198_H4型重链）
SEQ ID NO:110:工程化的CDRH3（其用于hR198_HG1至hR198_HG3型重链）
SEQ ID NO:111:编码hR198_H0型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:112:hR198_H0型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:113:编码hR198_H5型重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:114:hR198_H5型重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:115:生物素-PEG化的人Orai1环区肽序列
SEQ ID NO:116:大鼠CDRL1 (其来源于R118，但不用于人源化的抗体)。
序列表
<110> Daiichi Sankyo Co., Ltd.
<120> 抗Orai1抗体
<130> FP1522
<160> 116
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 906
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
atgcatccgg agcccgcccc gcccccgagc cgtagcagtc ccgagcttcc cccaagcggc 60
ggcagcacca ccagcggcag ccgccggagc cgccgccgca gcggggacgg ggagcccccg 120
ggggccccgc caccgccgcc gtccgccgtc acctacccgg actggatcgg ccagagttac 180
tccgaggtga tgagcctcaa cgagcactcc atgcaggcgc tgtcctggcg caagctctac 240
ttgagccgcg ccaagcttaa agcctccagc cggacctcgg ctctgctctc cggcttcgcc 300
atggtggcaa tggtggaggt gcagctggac gctgaccacg actacccacc ggggctgctc 360
atcgccttca gtgcctgcac cacagtgctg gtggctgtgc acctgtttgc gctcatgatc 420
agcacctgca tcctgcccaa catcgaggcg gtgagcaacg tgcacaatct caactcggtc 480
aaggagtccc cccatgagcg catgcaccgc cacatcgagc tggcctgggc cttctccacc 540
gtcattggca cgctgctctt cctagctgag gtggtgctgc tctgctgggt caagttcttg 600
cccctcaaga agcagccagg ccagccaagg cccaccagca agccccccgc cagtggcgca 660
gcagccaacg tcagcaccag cggcatcacc ccgggccagg cagctgccat cgcctcgacc 720
accatcatgg tgcccttcgg cctgatcttt atcgtcttcg ccgtccactt ctaccgctca 780
ctggttagcc ataagaccga ccgacagttc caggagctca acgagctggc ggagtttgcc 840
cgcttacagg accagctgga ccacagaggg gaccaccccc tgacgcccgg cagccactat 900
gcctag 906
<210> 2
<211> 301
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met His Pro Glu Pro Ala Pro Pro Pro Ser Arg Ser Ser Pro Glu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Ser Gly Gly Ser Thr Thr Ser Gly Ser Arg Arg Ser Arg Arg
20 25 30
Arg Ser Gly Asp Gly Glu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ser
35 40 45
Ala Val Thr Tyr Pro Asp Trp Ile Gly Gln Ser Tyr Ser Glu Val Met
50 55 60
Ser Leu Asn Glu His Ser Met Gln Ala Leu Ser Trp Arg Lys Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Ser Arg Ala Lys Leu Lys Ala Ser Ser Arg Thr Ser Ala Leu Leu
85 90 95
Ser Gly Phe Ala Met Val Ala Met Val Glu Val Gln Leu Asp Ala Asp
100 105 110
His Asp Tyr Pro Pro Gly Leu Leu Ile Ala Phe Ser Ala Cys Thr Thr
115 120 125
Val Leu Val Ala Val His Leu Phe Ala Leu Met Ile Ser Thr Cys Ile
130 135 140
Leu Pro Asn Ile Glu Ala Val Ser Asn Val His Asn Leu Asn Ser Val
145 150 155 160
Lys Glu Ser Pro His Glu Arg Met His Arg His Ile Glu Leu Ala Trp
165 170 175
Ala Phe Ser Thr Val Ile Gly Thr Leu Leu Phe Leu Ala Glu Val Val
180 185 190
Leu Leu Cys Trp Val Lys Phe Leu Pro Leu Lys Lys Gln Pro Gly Gln
195 200 205
Pro Arg Pro Thr Ser Lys Pro Pro Ala Ser Gly Ala Ala Ala Asn Val
210 215 220
Ser Thr Ser Gly Ile Thr Pro Gly Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ser Thr
225 230 235 240
Thr Ile Met Val Pro Phe Gly Leu Ile Phe Ile Val Phe Ala Val His
245 250 255
Phe Tyr Arg Ser Leu Val Ser His Lys Thr Asp Arg Gln Phe Gln Glu
260 265 270
Leu Asn Glu Leu Ala Glu Phe Ala Arg Leu Gln Asp Gln Leu Asp His
275 280 285
Arg Gly Asp His Pro Leu Thr Pro Gly Ser His Tyr Ala
290 295 300
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物Nhe-多聚C-S
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> n为a、c、g或t
<400> 3
gctagcgcta ccggactcag atcccccccc cccccdn 37
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物rIg γ-AS1
<400> 4
tcactgagct ggtgagagtg tagagccc 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物rIG γ-AS2
<400> 5
tcaccgagct gctgagggtg tagagccc 28
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物Nhe-多聚C-S
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> n为a、c、g或t
<400> 6
gctagcgcta ccggactcag atcccccccc cccccdn 37
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> rIg κ-AS
<400> 7
tcagtaacac tgtccaggac accatctc 28
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> rIG γ-seq
<400> 8
ctggctcagg gaaatagcc 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> rIG κ-seq
<400> 9
tccagttgct aactgttcc 19
<210> 10
<211> 405
<212> DNA
<213> 黑鼠
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (382)..(382)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (403)..(403)
<223> n为a、c、g或t
<400> 10
atgaaaatga cgacacctgc tcagttcctt gggcttctgt tgctctggtt tccaggtgcc 60
aggtgtgaca tccagttgac ccagtctcca tccacattgc ctgcatccct gggagagaga 120
gtcaccatca gttgcagagc aagtcagagt attagcaata gtttaagctg gtttcaacag 180
aaaccagatg gaactgttaa acgcctgatc tattctacat ccactttaga atctggtgtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctctccat caccagtctt 300
gagtctgaag attttgcaat gtattactgt ctacagtttg ctacttttcc ggacacgttt 360
ggaactggga ccaaactgga antgagacgg gctgatgctg canca 405
<210> 11
<211> 135
<212> PRT
<213> 黑鼠
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (128)..(128)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (135)..(135)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 11
Met Lys Met Thr Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr
20 25 30
Leu Pro Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Ser Asn Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Ser
85 90 95
Ile Thr Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Phe Ala Thr Phe Pro Asp Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Xaa
115 120 125
Arg Arg Ala Asp Ala Ala Xaa
130 135
<210> 12
<211> 468
<212> DNA
<213> 黑鼠
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (467)..(467)
<223> n为a、c、g或t
<400> 12
atggaatgga actgggtctt tctcctcctc ctgtcagtaa ctgcagaagt ccagtcccag 60
gtccagctgc agcagtctgg agcggagctg gcaaagcctg gctcctcagt gaagatttcc 120
tgcaaggctt ccggctacac cgtcaccgcc tattatataa gttggataag gcagacgatt 180
ggacagggcc ttgagtatgt tggatatatt gacatgggaa atggaaggac taactacaat 240
gcgaggttca agggcaaggc cacattgact gtggacaaat cctccagcac agccttcatg 300
caactcagca gcctgacacc tgacgactct gcggtctatt actgtgcaag ggactccaac 360
tggggggttg attactgggg ccaaggagtc atggtcacag tctcctcagc tgaaacaaca 420
gccccatctg tctatccact ggctcctgga actgcttctc aaaagtna 468
<210> 13
<211> 156
<212> PRT
<213> 黑鼠
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (156)..(156)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 13
Met Glu Trp Asn Trp Val Phe Leu Leu Leu Leu Ser Val Thr Ala Glu
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val
35 40 45
Thr Ala Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Thr Ile Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Tyr Val Gly Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Ala Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val
130 135 140
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Ser Gln Lys Xaa
145 150 155
<210> 14
<211> 408
<212> DNA
<213> 黑鼠
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (403)..(403)
<223> n为a、c、g或t
<400> 14
atgaaaatga cgacacctgc tcagttcctt gggcttctgt tgctctggtt tccaggtgcc 60
aggtgtgaca tccagttgac ccagtctcca tccacattgc ctgcatctct gggagagaga 120
gtcaccatca gttgcagagc aagtcagagt attggcaata gtttaagctg gtttcagcag 180
aaaccagatg gatctgttaa acgcctgatc tactctacat ccactttaga atctggtgtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctctccat caccagtctt 300
gagtctgaag attttgcaat gtattactgt ctacagtttg ctacttatcc ggacacgttt 360
ggaactggga ccaaactgga actgagacgg gctgatgctg cancaact 408
<210> 15
<211> 136
<212> PRT
<213> 黑鼠
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (135)..(135)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 15
Met Lys Met Thr Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr
20 25 30
Leu Pro Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Gly Asn Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Ser Val Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Ser
85 90 95
Ile Thr Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Phe Ala Thr Tyr Pro Asp Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu
115 120 125
Arg Arg Ala Asp Ala Ala Xaa Thr
130 135
<210> 16
<211> 471
<212> DNA
<213> 黑鼠
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (469)..(469)
<223> n为a、c、g或t
<400> 16
atggaatgga actgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcagaagt ccagtcccag 60
gtccagctgc agcagtctgg agcggagctg gcaaagcctg gctcctcaat gaagatttcc 120
tgcaaggctt ccggctaccc cgtcaccagc tattatataa gttggataaa gcagacgact 180
ggacagggcc ttgagtatat tggatatgtt gacatgggaa atggacggac taactacaat 240
gagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agccttcatg 300
caactcagca gcctgacacc tgacgactct gcggtctatt actgtgcaag ggactccaac 360
tggggggttg attactgggg ccaaggagtc atggtcacag tctcctcagc tgaaacaaca 420
gccccatctg tctatccact ggctcctgga actgctctca aaagtaacnc c 471
<210> 17
<211> 157
<212> PRT
<213> 黑鼠
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (157)..(157)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 17
Met Glu Trp Asn Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Glu
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val
35 40 45
Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Tyr Ile Gly Tyr Val Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val
130 135 140
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Xaa
145 150 155
<210> 18
<211> 449
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码人轻链分泌信号和人κ恒定区的核苷酸序列
<400> 18
gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60
gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120
cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180
cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240
gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300
cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360
cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420
ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物3.3-F1
<400> 19
tataccgtcg acctctagct agagcttggc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物3.3-R1
<400> 20
gctatggcag ggcctgccgc cccgacgttg 30
<210> 21
<211> 1132
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码人重链分泌信号和人IgG1恒定区的核苷酸序列
<400> 21
gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60
tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc ctccaccaag 120
ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 180
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 240
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 300
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 360
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 420
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 480
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 660
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 780
cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 840
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900
gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 960
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1020
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1080
tccctgtctc ccggcaaatg agatatcggg cccgtttaaa cgggggaggc ta 1132
<210> 22
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码cR118_L的核苷酸序列
<400> 22
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccagt tgacccagtc tccatccaca ttgcctgcat ccctgggaga gagagtcacc 120
atcagttgca gagcaagtca gagtattagc aatagtttaa gctggtttca acagaaacca 180
gatggaactg ttaaacgcct gatctattct acatccactt tagaatctgg tgtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctct ccatcaccag tcttgagtct 300
gaagattttg caatgtatta ctgtctacag tttgctactt ttccggacac gtttggaact 360
gggaccaaac tggaactgag acgggctgtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gttag 705
<210> 23
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> cR118_L的氨基酸序列
<400> 23
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Ser Asn Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Ser Ile Thr
85 90 95
Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala
100 105 110
Thr Phe Pro Asp Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg
115 120 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 24
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码cR198_L的核苷酸序列
<400> 24
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccagt tgacccagtc tccatccaca ttgcctgcat ctctgggaga gagagtcacc 120
atcagttgca gagcaagtca gagtattggc aatagtttaa gctggtttca gcagaaacca 180
gatggatctg ttaaacgcct gatctactct acatccactt tagaatctgg tgtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctct ccatcaccag tcttgagtct 300
gaagattttg caatgtatta ctgtctacag tttgctactt atccggacac gtttggaact 360
gggaccaaac tggaactgag acgggctgtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gttag 705
<210> 25
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> cR198_L的氨基酸序列
<400> 25
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Gly Asn Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ser Val
50 55 60
Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Ser Ile Thr
85 90 95
Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala
100 105 110
Thr Tyr Pro Asp Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg
115 120 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 26
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码cR118_H的核苷酸序列
<400> 26
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtccagctgc agcagtctgg agcggagctg gcaaagcctg gctcctcagt gaagatttcc 120
tgcaaggctt ccggctacac cgtcaccgcc tattatataa gttggataag gcagacgatt 180
ggacagggcc ttgagtatgt tggatatatt gacatgggaa atggaaggac taactacaat 240
gcgaggttca agggcaaggc cacattgact gtggacaaat cctccagcac agccttcatg 300
caactcagca gcctgacacc tgacgactct gcggtctatt actgtgcaag ggactccaac 360
tggggggttg attactgggg ccaaggagtc atggtcacag tcagctcagc ctccaccaag 420
ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 480
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gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> cR118_H的氨基酸序列
<400> 27
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tggggggttg attactgggg ccaaggagtc atggtcacag tcagctcagc ctccaccaag 420
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gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080
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gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320
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tccctgtctc ccggcaaatg a 1401
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
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<400> 33
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<400> 35
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Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Gly Asn Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala
100 105 110
Thr Phe Pro Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
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<211> 705
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_L4的核苷酸序列
<400> 36
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
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<400> 37
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Gly Asn Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val
50 55 60
Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala
100 105 110
Thr Phe Pro Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
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210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 38
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_H1的核苷酸序列
<400> 38
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
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ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 540
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
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cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320
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tccctgtctc ccggcaaatg a 1401
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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Gly Lys
465
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_H2的核苷酸序列
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gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 780
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aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080
cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1380
tccctgtctc ccggcaaatg a 1401
<210> 41
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_H2的氨基酸序列
<400> 41
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
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<220>
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aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080
cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
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<211> 466
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<213> 人工的
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1 5 10 15
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
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195 200 205
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435 440 445
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Gly Lys
465
<210> 44
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_H4的核苷酸序列
<400> 44
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcct ctggctaccc cgtgaccgcc tactacatca gctggatcag acaggcccca 180
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ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
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<223> hR198_H4的氨基酸序列
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<220>
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<400> 48
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<211> 31
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<220>
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<400> 49
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<400> 51
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<400> 53
tcattatttg tcatcgtcat ctttatagtc gaattcttcg ccacgattaa aggatttggt 60
gac 63
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gaggacttcg ccatgtacta ctgcctgcag ttcgccatct tccccgacag ctttggccag 360
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ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gttag 705
<210> 56
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG1的氨基酸序列
<400> 56
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ala
100 105 110
Ile Phe Pro Asp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 57
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_LG2的核苷酸序列
<400> 57
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ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gttag 705
<210> 58
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG2的氨基酸序列
<400> 58
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
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35 40 45
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230
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<211> 705
<212> DNA
<213> 人工的
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<400> 59
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gaggacttcg ccatgtacta ctgcctgcag ttcgccatct tccccgacag ctttggccag 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
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<210> 60
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG3的氨基酸序列
<400> 60
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Arg Asn
35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_HG1的核苷酸序列
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_HG1的氨基酸序列
<400> 62
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1 5 10 15
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Gly Lys
465
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<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_HG2的核苷酸序列
<400> 63
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_HG2的氨基酸序列
<400> 64
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1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Gly Arg Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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465
<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_HG3的核苷酸序列
<400> 65
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_HG3的氨基酸序列
<400> 66
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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355 360 365
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385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 67
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_H4-LALA的核苷酸序列
<400> 67
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcct ctggctaccc cgtgaccgcc tactacatca gctggatcag acaggcccca 180
ggccagggcc tggaatacgt gggctacatc gacatgggca acggccggac caactacaac 240
gcccggttta agggcagagc caccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag agacagcaac 360
tggggcgtgg actattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tcagctcagc ctccaccaag 420
ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 480
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 540
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaagccg cggggggacc ctcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080
cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1380
tccctgtctc ccggcaaatg a 1401
<210> 68
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_H4-LALA的氨基酸序列
<400> 68
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val
35 40 45
Thr Ala Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Tyr Val Gly Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Ala Arg Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 69
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_HG1-LALA的核苷酸序列
<400> 69
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcct ctggctaccc cgtgaccgcc tactacatca gctgggtcag acaggcccca 180
ggccagggcc tggaatacgt gggctacatc gacatgggca acggccggac cgactacaac 240
gcccggttta agggcagagc caccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag agacagcaac 360
tggggcgccg actattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tcagctcagc ctccaccaag 420
ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 480
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 540
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaagccg cggggggacc ctcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
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gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080
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gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1380
tccctgtctc ccggcaaatg a 1401
<210> 70
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_HG1-LALA的氨基酸序列
<400> 70
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val
35 40 45
Thr Ala Tyr Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Tyr Val Gly Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Ala Arg Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 71
<211> 1118
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码人重链分泌信号和人IgG2恒定区的核苷酸序列
<400> 71
gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60
tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc cagcaccaag 120
ggcccttccg tgttccctct ggccccttgt agccgttcca ccagcgagtc caccgccgcc 180
cttggctgtc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga ccgtgagctg gaactccgga 240
gcccttacca gcggcgtgca caccttccct gccgtgctgc agtccagcgg cctttactcc 300
ctgagctccg tggtgaccgt gcctagctcc aacttcggca cccaaaccta cacctgtaac 360
gtggaccaca agcctagcaa caccaaggtg gacaagaccg tggagcgtaa gtgttgtgtg 420
gagtgtcctc cttgtcctgc ccctcctgtg gccggacctt ccgtgttcct tttccctcct 480
aagcctaagg acaccctgat gatcagccgt acccctgagg tgacctgtgt ggtggtggac 540
gtgtcccacg aggaccctga ggtgcagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 600
aacgccaaga ccaagcctcg tgaggagcaa ttcaacagca ccttccgtgt ggtgtccgtg 660
cttaccgtgg tgcaccaaga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgtaa ggtgagcaac 720
aagggacttc ctgcccctat cgagaagacc atctccaaga ccaagggcca acctcgtgag 780
cctcaagtgt acacccttcc tcctagccgt gaggagatga ccaagaacca agtgtccctt 840
acctgtctgg tgaagggctt ctaccctagc gacatcgccg tggagtggga gtccaacgga 900
caacctgaga acaactacaa gaccacccct cctatgcttg acagcgacgg ctccttcttc 960
ctgtacagca agctgaccgt ggacaagtcc cgttggcaac aaggcaacgt gttcagctgt 1020
tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaaa agagcctttc cctgagccct 1080
ggaaagtgat atcgggcccg tttaaacggg ggaggcta 1118
<210> 72
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码2C1.1的重链的核苷酸序列
<400> 72
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgc agcagtgggg agccggcctg ctgaagccca gcgagacact gagcctgacc 120
tgcgctgtgt acggaggcag cttcagcggc tactactggt cctggatccg gcagccccct 180
ggcaagggcc tggaatggat cggcgagatc gaccacagcg gcagcaccaa ctacaacccc 240
gccctgaagt cccggctgac catcagcgtg gacaccagca agaaccagtt cagcctgaag 300
ctgagcagcg tgacagccgc cgacaccgcc gtgtactact gtgccagagc cggcagcggc 360
ggctacgagg attggttcga tccttggggc cagggcaccc tggtgaccgt cagctcagcc 420
agcaccaagg gcccttccgt gttccctctg gccccttgta gccgttccac cagcgagtcc 480
accgccgccc ttggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgagctgg 540
aactccggag cccttaccag cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca gtccagcggc 600
ctttactccc tgagctccgt ggtgaccgtg cctagctcca acttcggcac ccaaacctac 660
acctgtaacg tggaccacaa gcctagcaac accaaggtgg acaagaccgt ggagcgtaag 720
tgttgtgtgg agtgtcctcc ttgtcctgcc cctcctgtgg ccggaccttc cgtgttcctt 780
ttccctccta agcctaagga caccctgatg atcagccgta cccctgaggt gacctgtgtg 840
gtggtggacg tgtcccacga ggaccctgag gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcaca acgccaagac caagcctcgt gaggagcaat tcaacagcac cttccgtgtg 960
gtgtccgtgc ttaccgtggt gcaccaagac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 1020
gtgagcaaca agggacttcc tgcccctatc gagaagacca tctccaagac caagggccaa 1080
cctcgtgagc ctcaagtgta cacccttcct cctagccgtg aggagatgac caagaaccaa 1140
gtgtccctta cctgtctggt gaagggcttc taccctagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
tccaacggac aacctgagaa caactacaag accacccctc ctatgcttga cagcgacggc 1260
tccttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagtccc gttggcaaca aggcaacgtg 1320
ttcagctgtt ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccaaaa gagcctttcc 1380
ctgagccctg gaaag 1395
<210> 73
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 2C1.1的重链的氨基酸序列
<400> 73
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Ser Gly Gly Tyr Glu Asp Trp Phe Asp Pro
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210 215 220
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
225 230 235 240
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 74
<211> 739
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码2C1.1的轻链的核苷酸序列
<400> 74
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
cagtccgtgc tgacccagcc tccttccgtg tctggcgccc ctggccagag agtgaccatc 120
agctgtaccg gcagcagcag caacatcgga gccggctaca acgtgcactg gtatcagcag 180
ttcccccgga ccgaccccaa gctgctgatc tacgtgtaca acatccggcc cagcggcgtg 240
cccgaccggt tttctggcag cagaagcggc acaagcgcca gcctggccat caccggcctg 300
cagaccgagg acgaggccga ctactactgc cagagctacg acagcagcct gagcggcgtg 360
gtgttcggcg gaggcaccaa gctgacagtg ctgggccagc ccaaggccaa ccccaccgtg 420
accctgttcc ccccaagcag cgaggaactg caggccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 480
atcagcgact tctaccctgg cgccgtgaca gtggcctgga aggccgatgg atctcccgtg 540
aaggccggcg tggaaaccac caagcccagc aagcagagca acaacaaata cgccgccagc 600
agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagtcccacc ggtcctacag ctgccaggtg 660
acacacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccca ccgagtgcag ctaggggccc 720
gtttaaacgg gggaggcta 739
<210> 75
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 2C1.1的轻链的氨基酸序列
<400> 75
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
20 25 30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Arg Thr
50 55 60
Asp Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Tyr Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145 150 155 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
165 170 175
Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln
180 185 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
195 200 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
210 215 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 76
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码5H3.1的重链的核苷酸序列
<400> 76
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgctagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgac tactacatga actgggtgcg ccaggctcca 180
ggacagggcc tggaatggat gggctggatc aaccccaaca gcggcggcac caaatacgcc 240
cagaaattcc agggcagagt gaccatgacc cgggacacca gcatccggac cgcctacatg 300
gaactgagcc ggctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag agagtacggc 360
ggcaacagcg attggttcga cccctggggc cagggcaccc tggtgaccgt cagctcagcc 420
agcaccaagg gcccttccgt gttccctctg gccccttgta gccgttccac cagcgagtcc 480
accgccgccc ttggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgagctgg 540
aactccggag cccttaccag cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca gtccagcggc 600
ctttactccc tgagctccgt ggtgaccgtg cctagctcca acttcggcac ccaaacctac 660
acctgtaacg tggaccacaa gcctagcaac accaaggtgg acaagaccgt ggagcgtaag 720
tgttgtgtgg agtgtcctcc ttgtcctgcc cctcctgtgg ccggaccttc cgtgttcctt 780
ttccctccta agcctaagga caccctgatg atcagccgta cccctgaggt gacctgtgtg 840
gtggtggacg tgtcccacga ggaccctgag gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcaca acgccaagac caagcctcgt gaggagcaat tcaacagcac cttccgtgtg 960
gtgtccgtgc ttaccgtggt gcaccaagac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 1020
gtgagcaaca agggacttcc tgcccctatc gagaagacca tctccaagac caagggccaa 1080
cctcgtgagc ctcaagtgta cacccttcct cctagccgtg aggagatgac caagaaccaa 1140
gtgtccctta cctgtctggt gaagggcttc taccctagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
tccaacggac aacctgagaa caactacaag accacccctc ctatgcttga cagcgacggc 1260
tccttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagtccc gttggcaaca aggcaacgtg 1320
ttcagctgtt ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccaaaa gagcctttcc 1380
ctgagccctg gaaag 1395
<210> 77
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 5H3.1的重链的氨基酸序列
<400> 77
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Trp Phe Asp Pro
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210 215 220
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
225 230 235 240
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 78
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码5H3.1的轻链的核苷酸序列
<400> 78
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
cagtccgtgc tgacccagcc tccttccgtg tctggcgccc ctggccagag agtgaccatc 120
agctgtaccg gcagcagcag caacatcgga gctggatacg acgtgcactg gtatcagcag 180
ctgcccggca ccgcccccaa gctgctgatc tacggcaaca gcaaccggcc cagcggcgtg 240
cccgatagat tcagcggcag caagagcggc accagcgcca gcctggccat taccggactg 300
caggccgagg acgaggccga ctactactgc cagagctacg acaaccggct gagcgacagc 360
gtggtgatcg gcggaggcac caagctggcc gtgcagggac agcccaaggc caaccccacc 420
gtgaccctgt tccccccaag cagcgaggaa ctgcaggcca acaaggccac cctggtgtgc 480
ctgatcagcg acttctaccc tggcgccgtg acagtggcct ggaaggccga tggatctccc 540
gtgaaggccg gcgtggaaac caccaagccc agcaagcaga gcaacaacaa atacgccgcc 600
agcagctacc tgagcctgac ccccgagcag tggaagtccc accggtccta cagctgccag 660
gtgacacacg agggcagcac cgtggaaaag accgtggccc ccaccgagtg cagctagggg 720
cccgtttaaa cgggggaggc ta 742
<210> 79
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 5H3.1的轻链的氨基酸序列
<400> 79
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
20 25 30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asp Asn Arg Leu Ser Asp Ser Val Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Ala Val Gln Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
145 150 155 160
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala
165 170 175
Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys
180 185 190
Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro
195 200 205
Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu
210 215 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 80
<211> 1433
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码10F8的重链的核苷酸序列
<400> 80
ccagcctccg gactctagag ccaccatgaa gcacctgtgg ttctttctgc tgctggtggc 60
cgctcccaga tgggtgctgt ctcaggtgca gctgcagcag tctggcgccg aactcgtgcg 120
gcctggaagc agcgtgaaga tcagctgcaa ggccagcggc tacgccttcc ggtcctactg 180
gatgaactgg gtcaagcaga ggccaggcca gggcctggaa tggatcggcc acatctatcc 240
cggcgacggc gacaccaact acaacggcaa gttcaagggc aaggccaccc tgaccgccga 300
caagagcagc agcacagcct acatgcagct gtccagcctg accagcgagg acagcgccgt 360
gtacctgtgt ggcagaggcg gcacaaccgt ggtggtggat tattggggcc agggcaccac 420
actgaccgtg tccagcgcca agaccacccc cccatctgtg tatcctctgg cccctggatc 480
tgccgcccag accaacagca tggtcaccct gggctgcctc gtgaagggct acttccctga 540
gcctgtgacc gtgacctgga acagcggctc tctgtctagc ggcgtgcaca cctttccagc 600
cgtgctgcag agcgacctgt acaccctgag cagctccgtg accgtgccta gcagcacctg 660
gcctagcgag acagtgacct gcaacgtggc ccaccctgcc agctctacca aggtggacaa 720
gaaaatcgtg ccccgggact gcggctgcaa gccctgtatc tgtaccgtgc ccgaggtgtc 780
ctccgtgttc atcttcccac ccaagcccaa ggacgtgctg accatcaccc tgacacccaa 840
agtgacatgt gtggtggtgg acatcagcaa ggacgacccc gaggtgcagt tcagttggtt 900
cgtggacgac gtggaagtgc acacagccca gacccagccc agagaggaac agttcaacag 960
caccttcaga agcgtgtccg agctgcccat catgcaccag gactggctga acggcaaaga 1020
attcaagtgc agagtgaaca gcgccgcctt ccctgccccc atcgagaaaa ccatctccaa 1080
gaccaagggc agacccaagg ccccccaggt gtacacaatc cccccaccca aagaacagat 1140
ggccaaggac aaggtgtccc tgacctgcat gatcaccgat ttcttcccag aggacatcac 1200
cgtggaatgg cagtggaacg gccagcccgc cgagaactac aagaacaccc agcctatcat 1260
ggacaccgac ggcagctact tcgtgtacag caagctgaac gtgcagaagt ccaactggga 1320
ggccggcaac accttcacct gtagcgtgct gcacgagggc ctgcacaatc accacaccga 1380
gaagtccctg tcccacagcc ccggcaaatg agtttaaacg ggggaggcta act 1433
<210> 81
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 10F8的重链的氨基酸序列
<400> 81
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Arg Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Leu Cys Gly Arg Gly Gly Thr Thr Val Val Val Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
130 135 140
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
145 150 155 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
225 230 235 240
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
275 280 285
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
305 310 315 320
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
325 330 335
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
355 360 365
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
370 375 380
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
405 410 415
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
420 425 430
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
435 440 445
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 82
<211> 770
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码10F8的轻链的核苷酸序列
<400> 82
ccagcctccg gactctagag ccaccatggt gctgcagacc caggtgttca tcagcctgct 60
gctgtggatc agcggcgcct acggcgacat cgtgatgagc cagagcccta gcagcctggc 120
cgtgtctgcc ggcgagaaag tgaccatgag ctgcaagagc agccagtccc tgctgaacag 180
ccggacccgg aagaactacc tggcctggta tcagcagaag cccggccagt cccccaagct 240
gctgatctac tgggccagca ccagagaaag cggcgtgccc gatagattca ccggcagcgg 300
ctctggcacc gacttcaccc tgacaatcag cagcgtgcag gccgaggacc tggctgtgta 360
ctactgcaag cagagctaca acctgccctg gaccttcggc ggaggcacca agctggaaat 420
caagagagcc gacgccgctc ccaccgtgtc catctttcca cctagcagcg agcagctgac 480
cagcggcgga gctagcgtcg tgtgcttcct gaacaacttc taccccaagg acatcaacgt 540
gaagtggaag atcgacggca gcgagcggca gaacggcgtg ctgaatagct ggaccgacca 600
ggacagcaag gactccacct acagcatgtc cagcaccctg accctgacca aggacgagta 660
cgagcggcac aacagctaca catgcgaggc cacccacaag accagcacct cccccatcgt 720
gaagtccttc aaccggaacg agtgctgagt ttaaacgggg gaggctaact 770
<210> 83
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 10F8的轻链的氨基酸序列
<400> 83
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile
165 170 175
Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
195 200 205
Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His
210 215 220
Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235 240
<210> 84
<211> 1436
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码14F74的重链的核苷酸序列
<400> 84
ccagcctccg gactctagag ccaccatgaa gcacctgtgg ttctttctgc tgctggtggc 60
cgctcccaga tgggtgctgt ctcaggtgca gctgcagcag tctggcgccg aactcgtgcg 120
gcctggaagc agcgtgaaga tcagctgcaa ggccagcggc tacgccttca gcagctactg 180
gatgaactgg gtcaagcagc ggccaggcca gggcctggaa tggatcggcc atatctatcc 240
cggcgacggc gacaccaact acaacggcaa gttcaagggc aaggccaccc tgaccgccga 300
caagagcagc agcacagcct acatgcagct gagcggcctg accagcgagg acagcgccgt 360
gtacttctgc gccagaagcg gcagactgag attcgccatg gactactggg gccagggcac 420
cagcgtgaca gtgtctagcg ccaagaccac cccccccagc gtgtaccctc tggctcctgg 480
atctgccgcc cagaccaaca gcatggtcac cctgggctgc ctcgtgaagg gctacttccc 540
tgagcctgtg accgtgacct ggaacagcgg ctctctgtct agcggcgtgc acacctttcc 600
agccgtgctg cagagcgacc tgtacaccct gagcagctcc gtgaccgtgc ctagcagcac 660
ctggcctagc gagacagtga cctgcaacgt ggcccaccct gccagctcta ccaaggtgga 720
caagaaaatc gtgccccggg actgcggctg caagccctgt atctgtaccg tgcccgaggt 780
gtccagcgtg ttcatcttcc cacccaagcc caaggacgtg ctgaccatca ccctgacacc 840
caaagtgacc tgtgtggtgg tggacatcag caaggacgac cccgaggtgc agttcagttg 900
gttcgtggac gacgtggaag tgcacacagc ccagacccag cccagagagg aacagttcaa 960
cagcaccttc agaagcgtgt ccgagctgcc catcatgcac caggactggc tgaacggcaa 1020
agaattcaag tgcagagtga acagcgccgc cttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc 1080
caagaccaag ggcagaccca aggcccctca ggtgtacaca atccccccac ccaaagaaca 1140
gatggccaag gacaaggtgt ccctgacctg catgatcacc gatttcttcc cagaggacat 1200
caccgtggaa tggcagtgga acggccagcc cgccgagaac tacaagaaca cccagcctat 1260
catggacacc gacggcagct acttcgtgta cagcaagctg aacgtgcaga agtccaactg 1320
ggaggccggc aacaccttca cctgtagcgt gctgcacgag ggcctgcaca atcaccacac 1380
cgagaagtcc ctgtcccaca gccccggcaa atgagtttaa acgggggagg ctaact 1436
<210> 85
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 14F74的重链的氨基酸序列
<400> 85
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Arg Leu Arg Phe Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
145 150 155 160
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
210 215 220
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
225 230 235 240
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
245 250 255
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
260 265 270
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
275 280 285
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
290 295 300
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
305 310 315 320
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
325 330 335
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
355 360 365
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
370 375 380
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
405 410 415
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
420 425 430
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
435 440 445
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 86
<211> 767
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码14F74的轻链的核苷酸序列
<400> 86
ccagcctccg gactctagag ccaccatggt gctgcagacc caggtgttca tcagcctgct 60
gctgtggatc agcggcgcct acggcgacat cgtgatgagc cagagcccta gcagcctggc 120
cgtgtctgcc ggcgagaaag tgaccatgag ctgcaagagc agccagtccc tgctgaacag 180
ccggacccgg aagaactacc tggcctggta tcagcagaag cccggccagt cccccaagct 240
gctgatctac tgggccagca ccagagaaag cggcgtgccc gatagattca ccggcagcgg 300
ctctggcacc gacttcaccc tgacaatcag cagcgtgcag gccgaggacc tggctgtgta 360
ctactgcaag cagagctaca acctgcggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcca 420
gagagccgac gccgctccca ccgtgtccat ctttccacct agcagcgagc agctgaccag 480
cggcggagct agcgtcgtgt gcttcctgaa caacttctac cccaaggaca tcaacgtgaa 540
gtggaagatc gacggcagcg agcggcagaa cggcgtgctg aatagctgga ccgaccagga 600
cagcaaggac tccacctaca gcatgtccag caccctgacc ctgaccaagg acgagtacga 660
gcggcacaac agctacacat gcgaggccac ccacaagacc agcacctccc ccatcgtgaa 720
gtccttcaac cggaacgagt gctgagttta aacgggggag gctaact 767
<210> 87
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 14F74的轻链的氨基酸序列
<400> 87
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Gln Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp
165 170 175
Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
195 200 205
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
210 215 220
Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 88
<211> 1436
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码17F6的重链的核苷酸序列
<400> 88
ccagcctccg gactctagag ccaccatgaa gcacctgtgg ttctttctgc tgctggtggc 60
cgctcccaga tgggtgctgt ctcaggtgca gctgcagcag tctggcgccg aactcgtgcg 120
gcctggaagc agcgtgaaga tcagctgcaa ggccagcggc tacgccttca gcagctactg 180
gatgaactgg gtcaagcagc ggccaggcca gggcctggaa tggatcggcc atatctatcc 240
cggcgacgcc gacaccaact acaacggcaa gttcaagggc aaggccaccc tgaccgccga 300
caagagcagc agcacagcct acatgcacct gtccagcctg accagcgagg acagcgccgt 360
gtacttctgc agccggcagc tgggcttcag atacgccatg gactattggg gccagggcac 420
cagcgtgacc gtgtctagcg ccaagaccac cccccctagc gtgtaccctc tggcccctgg 480
atctgccgcc cagaccaaca gcatggtcac cctgggctgc ctcgtgaagg gctacttccc 540
tgagcctgtg accgtgacct ggaacagcgg ctctctgtct agcggcgtgc acacctttcc 600
agccgtgctg cagagcgacc tgtacaccct gagcagctcc gtgacagtgc ccagctctac 660
ctggcccagc gagacagtga cctgcaacgt ggcccaccct gccagcagca ccaaggtgga 720
caagaaaatc gtgccccggg actgcggctg caagccctgt atctgtaccg tgcccgaggt 780
gtccagcgtg ttcatcttcc cacccaagcc caaggacgtg ctgaccatca ccctgacacc 840
caaagtgacc tgtgtggtgg tggacatcag caaggacgac cccgaggtgc agttcagttg 900
gttcgtggac gacgtggaag tgcacacagc ccagacccag cccagagagg aacagttcaa 960
cagcaccttc agaagcgtgt ccgagctgcc catcatgcac caggactggc tgaacggcaa 1020
agaattcaag tgcagagtga acagcgccgc cttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc 1080
caagaccaag ggcagaccca aggcccccca ggtgtacaca atccccccac ccaaagaaca 1140
gatggccaag gacaaggtgt ccctgacctg catgatcacc gatttcttcc cagaggacat 1200
caccgtggaa tggcagtgga acggccagcc cgccgagaac tacaagaaca cccagcctat 1260
catggacacc gacggcagct acttcgtgta cagcaagctg aacgtgcaga agtccaactg 1320
ggaggccggc aacaccttca cctgtagcgt gctgcacgag ggcctgcaca atcaccacac 1380
cgagaagtcc ctgtcccaca gccccggcaa atgagtttaa acgggggagg ctaact 1436
<210> 89
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 17F6的重链的氨基酸序列
<400> 89
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Arg Gln Leu Gly Phe Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
145 150 155 160
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
210 215 220
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
225 230 235 240
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
245 250 255
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
260 265 270
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
275 280 285
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
290 295 300
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
305 310 315 320
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
325 330 335
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
355 360 365
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
370 375 380
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
405 410 415
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
420 425 430
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
435 440 445
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 90
<211> 767
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码17F6的轻链的核苷酸序列
<400> 90
ccagcctccg gactctagag ccaccatggt gctgcagacc caggtgttca tcagcctgct 60
gctgtggatc agcggcgcct acggcgacat cgtgatgagc cagagcccta gcagcctggc 120
cgtgtctgcc ggcgagaaag tgaccatgag ctgcaagagc agccagtccc tgctgaacag 180
ccggacccgg aagaactacc tggcctggta tcagcagaag cccggccagt cccccaagct 240
gctgatctac tgggccagca ccagagaaag cggcgtgccc gatagattca ccggcagcgg 300
ctctggcacc gacttcaccc tgacaatcag cagcgtgcag gccgaggacc tggctgtgta 360
ctactgcaag cagagctaca acctgcggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa 420
gagagccgac gccgctccca ccgtgtccat ctttccacct agcagcgagc agctgaccag 480
cggcggagct agcgtcgtgt gcttcctgaa caacttctac cccaaggaca tcaacgtgaa 540
gtggaagatc gacggcagcg agcggcagaa cggcgtgctg aatagctgga ccgaccagga 600
cagcaaggac tccacctaca gcatgtccag caccctgacc ctgaccaagg acgagtacga 660
gcggcacaac agctacacat gcgaggccac ccacaagacc agcacctccc ccatcgtgaa 720
gtccttcaac cggaacgagt gctgagttta aacgggggag gctaact 767
<210> 91
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 17F6的轻链的氨基酸序列
<400> 91
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp
165 170 175
Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
195 200 205
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
210 215 220
Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 92
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Ser Leu Ser
1 5 10
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG1的CDRL1
<400> 93
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Ser Leu Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG2的CDRL1
<400> 94
His Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Ser Leu Ser
1 5 10
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG3的CDRL1
<400> 95
His Ala Ser Arg Asn Ile Gly Gly Ser Leu Ser
1 5 10
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 96
Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser
1 5
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG2的CDRL2
<400> 97
Leu Thr Ser Thr Leu Asp Trp
1 5
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG3的CDRL2
<400> 98
Leu Thr Ser Ser Leu Asp Trp
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 99
Leu Gln Phe Ala Thr Phe Pro Asp Thr
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 100
Leu Gln Phe Ala Thr Tyr Pro Asp Thr
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_LG1至LG3的CDRL3
<400> 101
Leu Gln Phe Ala Ile Phe Pro Asp Ser
1 5
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 102
Ala Tyr Tyr Ile Ser
1 5
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 103
Ser Tyr Tyr Ile Ser
1 5
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 104
Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ala Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 105
Tyr Val Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_HG1的CDRH2
<400> 106
Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_HG2的CDRH2
<400> 107
Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Gly Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_HG3的CDRH2
<400> 108
Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Met Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 109
Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr
1 5
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_HG1至HG3的CDRH3
<400> 110
Asp Ser Asn Trp Gly Ala Asp Tyr
1 5
<210> 111
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_H0的核苷酸序列
<400> 111
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcct ctggctaccc cgtgaccagc tactacatca gctggatcag acaggcccca 180
ggccagggcc tggaatggat cggctatgtg gacatgggca acggccggac caactacaac 240
gagaagttca agggcagagc caccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag agacagcaac 360
tggggcgtgg actattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tcagctcagc ctccaccaag 420
ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 480
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 540
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080
cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1380
tccctgtctc ccggcaaatg a 1401
<210> 112
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_H0的氨基酸序列
<400> 112
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val
35 40 45
Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Val Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 113
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码hR198_H5的核苷酸序列
<400> 113
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcct ctggctaccc cgtgaccgcc tactacatca gctggatcag acaggcccca 180
ggccagggcc tggaatggat cggctacatc gacatgggca acggccggac caactacaac 240
gcccggttta agggcagagc caccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag agacagcaac 360
tggggcgtgg actattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tcagctcagc ctccaccaag 420
ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 480
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 540
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080
cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1380
tccctgtctc ccggcaaatg a 1401
<210> 114
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hR198_H5的氨基酸序列
<400> 114
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val
35 40 45
Thr Ala Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Ala Arg Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 115
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Ser Gly Ser Gly Phe Leu Pro Leu Lys Lys Gln Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Pro Thr Ser Lys Pro Pro Ala Ser Gly Ala Ala Ala Asn Val Ser Thr
20 25 30
Ser Gly Ile Thr Pro Gly Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ser Thr Thr Ile
35 40 45
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 116
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Ser Leu Ser
1 5 10

Claims (30)

1.抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中所述抗体包含由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
2.权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
3.权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 70代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
4.抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中所述抗体包含由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 58代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
5.权利要求4的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 58代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
6.抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中所述抗体包含由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 60代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
7.权利要求6的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 62代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 60代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
8.抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中所述抗体包含由来自SEQ ID NO: 64代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
9.权利要求8的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 64代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
10.抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中所述抗体包含由来自SEQ ID NO: 66代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
11.权利要求10的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 66代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
12.抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，其中所述抗体包含由来自SEQ ID NO: 43代表的氨基酸序列中的位置20-136的氨基酸残基组成的重链可变区序列和由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-126的氨基酸残基组成的轻链可变区序列。
13.权利要求12的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体由重链序列和轻链序列组成，所述重链序列由来自SEQ ID NO: 43代表的氨基酸序列中的位置20-465或20-466的氨基酸残基组成且所述轻链序列由来自SEQ ID NO: 56代表的氨基酸序列中的位置21-234的氨基酸残基组成。
14.权利要求1-13中任一项的抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab')2、Fab'和Fv。
15.权利要求1、4、6、8、10和12中任一项的抗体，其中所述抗体是scFv。
16.药物组合物，其包含权利要求1-15的至少任一种抗体或抗体的抗原结合片段。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述药物组合物是用于移植排斥、免疫相关疾病、变应性疾病、炎性疾病或癌症的治疗和/或预防剂、抗血小板或抗血栓活化剂或Orai1表达细胞活化的抑制剂。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述移植排斥是针对移植器官或组织的排斥反应、宿主抗移植物反应、和由移植造血细胞引起的移植物抗宿主病。
19.权利要求18的药物组合物，其中所述器官或组织是心、肾、肝、骨髓、或皮肤。
20.权利要求18的药物组合物，其中所述造血细胞是骨髓细胞、外周血细胞或脐带血细胞。
21.权利要求17的药物组合物，其中所述免疫相关疾病是结缔组织或肌肉骨骼疾病、血液病、胃肠道疾病、神经系统疾病、眼疾病、血管疾病、表皮疾病和内分泌疾病，变应性疾病是特应性皮炎、哮喘、过敏反应、类过敏反应、鼻炎、中耳炎、药物反应、昆虫咬伤反应、对植物的反应、结膜炎和荨麻疹，和炎性疾病是炎症性肾病、炎性肺部疾病、炎症性肠疾病、炎症性肝病、炎性心脏病、炎症性皮肤疾病、炎症性眼病、炎症性中枢神经疾病、炎症性关节疾病和全身炎症。
22.权利要求21的药物组合物，其中所述过敏反应是食物过敏或乳胶过敏。
23.权利要求17的药物组合物，其中所述免疫相关疾病选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、重症肌无力、葡萄膜炎、白塞病、韦格纳肉芽肿、银屑病、天疱疮、白斑病、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯氏病和桥本氏病，和炎性疾病是肾病、慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、间质性肺炎、溃疡性结肠炎、回肠炎、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、心肌炎、缺血性心脏病、动脉粥样硬化、接触性皮炎、湿疹、沙眼、眼内炎、脑膜炎、脑脊髓炎、自身免疫性脑炎、关节炎、骨关节炎、败血症、出血、超敏反应和由癌症化疗引起的休克症状。
24.权利要求23的药物组合物，其中所述肾病是肾小球肾炎。
25.权利要求17的药物组合物，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、皮肤癌和白血病，和抗血小板或抗血栓活性可用于治疗和/或预防的病例是心肌梗死、中风、缺血性心脏病和血栓形成，和抑制Orai1表达细胞活化可用于治疗和/或预防的病例是肥大细胞白血病、肥大细胞增多症、嗜碱细胞性白血病、子宫内膜异位症、Stormorken综合征、管状聚集性肌病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和特应性皮炎。
26.多核苷酸，其编码权利要求1-15中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。
27.载体，其包含权利要求26的多核苷酸。
28.转化的宿主细胞，其包含权利要求26的多核苷酸。
29.转化的宿主细胞，其包含权利要求27的载体。
30.用于产生权利要求1-15中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其包括培养权利要求28或29的宿主细胞和从培养产物纯化抗体的步骤。
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