CN106662580A - 检测分析物的新聚簇 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测分析物的聚簇，所述聚簇包括多个可目测的有色颗粒和多个发光颗粒，其中(i)所述颗粒彼此结合，和(ii)至少一种分析物结合伴侣与有色颗粒和/或发光颗粒结合。
Description
本发明涉及用于检测分析物的聚簇(cluster)，所述聚簇包括多个可目测的有色颗粒和多个发光颗粒，其中(i)所述颗粒彼此结合，和(ii)至少一种分析物结合伴侣与有色颗粒和/或发光颗粒结合。
本说明书中，引用了包括专利申请和厂商手册在内的多个文件。这些文件的公开内容通过引用全文纳入本文，尽管其不视作与本发明的专利性相关。更特别地，所有参考文献通过引用纳入的程度与各单独文献通过引用特定和单独指示纳入相同。
免疫分析是以高特异性检测病原体、污染物和其它分析物的前景广阔的工具。就需要医疗点(point-of-care，POC)评价的应用而言，对侧流免疫层析法(LFIA)特别感兴趣。LFIA是一种成熟技术且是诊断行业中增长最快的产品类别。在1990年生产了第一种商业LFIA作为妊娠试验。自此，该技术、其应用和行业持续增长。2006年，全球超过200家公司生产了一系列测试形式，在主要细分市场中的总价值达到约21亿美元(USD)(Won,R.C.和Tse,H.Y.,In Lateral Flow Immunoassay,Springer,New York,2009,p.35.)。LFIA提供低成本和快速分析，而不需要专门人才进行处理或贵重仪器进行读取(Posthuma-Trumpie,G.A.,Korf,J.,Amerongen,A.,2009.Anal.Bioanal.Chem.393,569–582)。由于这些特征，LFIA是脱离实验室或资源贫乏环境的良好替代选择。所述测试允许现场分析，提供实时结果并避免昂贵样品运输和长时间等待结果(Bai,Y.等.,2012.RSC Advances 2,1778–1781.)。该技术应用从临床诊断大大扩展到多样化领域如兽医、农业、生物战、食品、环境健康与安全、工业检测以及更新的领域如分子诊断和治疗诊断学。大部分LFIA遵循同一原理。加入样品时，分析物和标记由毛细力推动进行色谱样迁移通过膜，在固定捕获剂位点读取结果。关于LFIA的专利和公开显示此原理和组件结构变化，改变样品垫(其中发生样品制备)、缀合物释放垫(含有标记)、生物反应器(陷获污染物/干扰物质)、反应膜(其中是固定的捕获试剂)和吸收垫(芯)。
常规LFIA采用胶体金(Gandhi,S.等,2009.Biosens.Bioelectron.25,502–505；和Zhang,D.等2011.Biosens.Bioelectron.26,2877–2882.)、染料(Ho,J.A.A.等,2008.Anal.Bioanal.Chem.391,479–485)或乳胶珠(Takanashi,S.等,2008.J.Virol.Methods 148,1–8.)作为标记以产生视觉信号。一个综述表明75％LFIA具有金纳米颗粒作为标记以检测病原体和化学污染物，然后是炭黑4.2％、发光颗粒4.2％等(Ngom,B.等,2010.Anal.Bioanal.Chem.397,1113–1135)。具体地，基于胶体金的测试条已大量商业化生产用于多种应用(Bai,Y.等2012.RSC Advances 2,1778–1781)。然而，当要检测低浓度分析物时，如在诸如登革热(DF)等疾病的早期诊断中，LFIA的适用性有限。DF由埃及伊蚊(Aedes aegypti)传播的病毒感染引起，埃及伊蚊是有全球性分布的蚊子种类，估计每年影响1亿人，其中50万例是登革出血热(DHF)。对于DHF，早期治疗能挽救生命，死亡率从高于20％减少到低于1％(Allwinn,R.,2011.Med.Microbiol.Immunol.,200,155–159)。LFIA的灵敏度限制在商业系统上持续存在并减少其应用，如8个基于IgG/IgM检测的DF商业试剂盒所例示(Blacksell S.D.J.Biomed.Biotechnol.2012,1-12)。所有试剂盒中仅一个显示考虑临床应用(>50％)所需的特异性(97.6％)和灵敏度(65.3％)。这意味着仅一个试验中正确鉴定的实际阳性比例(灵敏度)高于50％且正确鉴定的阴性比例(特异性)高于50％。对检测极限改良的试验需求不仅就DF而言突出，而且对其它疾病的市售可得医疗点检验也如此(Fu,E等.2011.Anal.Chem.83,7941–7946)，如衣原体感染(van Dommelen,L.等,2010.Sex.Transm.Infect.86,355–359；Vasoo,S.等,2009.Clin.Infect.Dis.49,1090–1093；和Skidmore,S.2010.Sex.Transm.Infect.86,330)和流感(Vasoo,S.等.,2009.Clin.Infect.Dis.49,1090–1093；Drexler等.,2009Emerging Infect.Dis.15,1662–1664)。
由于其提高的灵敏度，荧光免疫测定有希望成为常规比色检测法的替代选择(Linares,E.M.等,2013,Biosens.Bioelectron.41,180–185.)。近期，由Khreich和共同作者进行的工作(Khreich,N.等,2008.Anal.Biochem.377,182–188.)评估了不同标记(胶体金、荧光微球、葡聚糖若丹明、染料微球和脂质体)用于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)肠毒素B(SEB)检测。比色标记允许检测低至0.5ng/mL浓度的SEB。胶体金显示灵敏度是染料微球的2倍。另一方面，荧光微球显示灵敏度优于任一比色标记，引起灵敏度强烈增加，检测极限接近0.02ng/mL浓度。
尽管荧光标记一般提供更低检测极限，但其需要使用荧光读取仪，这与贫瘠环境的简单测试概念相反。因此，已进行若干尝试提高基于可见信号的快速免疫测定灵敏度。Horton和同事(Horton,J.K.等,1991.Immunol.Methods 140,131–134,和Kalogianni,D.P等.,2011.Anal.Bioanal.Chem.400,1145–1152.)报告了通过侧流试纸条浸入银增强溶液来使检测极限下降100倍。报告包括检测极限提高约10倍，使用酶扩增体系(Parolo,C.等,2012.Biosens.Bioelectron.,出版中)。然而，在这些研究中，用户仍需要执行多个步骤，限制适合医疗点使用的形式。
从上文的本领域讨论可见，不断需要如下测试形式：操作简单并同时赋予对多种疾病如DF早期诊断所需的灵敏度。本发明处理此需要。
因此，本发明的第一个实施方式涉及检测分析物的聚簇，所述聚簇包含多个可目测的有色颗粒和多个发光颗粒，其中(i)所述颗粒彼此结合，和(ii)至少一种分析物结合伴侣与所述有色颗粒和/或发光颗粒结合。
聚簇一般是很靠近的一组化合物。根据本发明，这些化合物是可目测的有色颗粒、发光颗粒和至少一种分析物结合伴侣。如下文进一步详述，这些化合物在本发明的聚簇中彼此结合。本发明的聚簇优选不包括包被，其中包被是遍布聚簇完整表面的非单层的一种或多种物质。尤其优选聚簇表面包括至少一些可目测的有色颗粒，其中所述可目测的有色颗粒优选包括金属/金属氧化物或由其组成和/或在其组成中不包含有机金属结构。更优选聚簇表面同时包括至少一些可目测的有色颗粒和至少一些发光颗粒。
分析物是作为分析对象的化学物质，根据本发明，所述分析即检测分析物。例如，分析物可选自氨基酸序列(包括蛋白或肽)、核酸分子(包括DNA和RNA)、脂质(包括例如细胞膜脂质、脂多糖、胆固醇和视黄醇)和糖(包括例如单糖、二糖、寡糖和多糖或者糖化蛋白或肽的糖部分)。
分析物一般存在于液体样品内。样品是有限数量的来源，所述来源量相当大。样品意在与来源类似并代表来源。液体样品优选是生物学液体样品，如获自水源(如污水)、土壤、植物或动物的样品。液体样品优选获自动物。动物样品可获自组织或体液，如羊水、房水和玻璃体液、胆汁、血液或血清、母乳、脑脊液、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴和外淋巴、渗出液、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓汁、发炎性分泌物、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、痰、滑液、眼泪、汗、阴道分泌物、呕吐物和尿。所述动物优选是人。本领域经常测量生物样品中的分析物以用于医学与研究目的。
分析物可定量或定性检测。定性检测确定分析物存在与否，而定量检测确定样品中的分析物含量。例如，定量可用竞争性检测方法实现，其中样品内的未标记分析物与标记分析物竞争结合一结合伴侣。然后，测量标记、未结合的分析物的量。样品中的分析物越多，就有越多的标记分析物被竞争脱离，因而标记、未结合的分析物的量与样品中未标记分析物的量成比例。或者，基准样品可用于定量。已知基准样品包含给定浓度的待检测分析物。比较采用一种或多种基准样品的检测结果与实际样品检测，使得根据样品中分析物存在或浓度来解释信号强度可行。
颗粒是小的局部化物体，物理或化学性质如体积或质量归因于此。根据本发明，所述颗粒具有1000nm的最大直径，优选750nm，更优选500nm和甚至更优选250nm，最优选200nm。最小直径是1nm，优选2nm，更优选5nm和甚至更优选10nm，最优选20nm。因此，所述颗粒的尺寸范围是1nm-1000nm、2nm-750nm、5nm-500nm、10nm-250nm和20nm-200nm，依次更优选。所述颗粒由于其尺寸也在本文称为“纳米颗粒”。应理解可目测的有色颗粒和发光颗粒的尺寸能独立选择。尤其优选可目测的有色颗粒具有至少20nm的直径，优选至少30nm和更优选至少40nm。
可目测的有色颗粒是在人可见光谱范围内具有颜色的颗粒。可见光谱是人眼可见的电磁谱部分。人眼通常对约390-700nm范围的波长有反应。颗粒颜色由离开颗粒表面的光颜色确定。在此方面，强调可目测的有色颗粒本身-可目测性是颗粒固有的性质-在人可见光谱范围内具有颜色(虽然单一有色颗粒也可能过小而肉眼不可见)。本发明的发光颗粒在本发明的聚簇环境下存在时，展示其颜色。聚簇的形成不显著干扰颜色。此外，不需要额外步骤用于诱导可目测的有色颗粒的颜色的能见度。这优选指所述颗粒在白光下展示其颜色，如日光或等同的人工白光。本发明可目测的有色颗粒能通过目测在完整聚簇环境下简单观察，例如在下文详述的本发明方法中。具体地，不需要本发明可目测的有色颗粒内的原子激发以产生可目测颜色。例如，不需要UV光(即低于380nm)和/或红外(IR)光(即高于700nm)激发。WO 2007/070115描述发光金属簇颗粒和其应用。这些发光金属簇颗粒仅在光诱导激发后发出可见光谱内的光，应注意激发是通过UV光。这种发光金属簇颗粒和任何其它需要额外步骤诱导颗粒颜色的颗粒-包括下文详述的本发明发光颗粒-必须保持不同于本发明可目测的有色颗粒。
因此，优选本发明可目测的有色颗粒没有发光性质。换言之，优选可目测的有色颗粒不发射光，这是通过光，更优选通过热以外的任何能量，激发颗粒内的原子的结果。
可能需要数个可目测的有色颗粒很靠近和/或共定位，从而人能真实看到本发明可目测的有色颗粒的颜色。因此，优选本发明可目测的有色颗粒在本发明的聚簇环境下为人肉眼可见(即不用任何放大仪器，如放大镜、双筒望远镜或显微镜)。
发光颗粒发射光，这是通过热以外的能量，通常是光，激发颗粒内的原子的结果。这与白炽体，如燃烧的木材或煤、熔铁和由电流加热的电线，发出的光相反。当存在于本发明的聚簇环境时，本发明的发光颗粒具有发射光的能力，这是通过热以外的能量，通常是光，激发颗粒内原子的结果。聚簇的形成不显著干扰发光颗粒的发光性质。本发明发光颗粒的发光性质能在完整聚簇环境下诱导，例如在下文详述的本发明方法中。由于本发明发光颗粒也通常并优选是纳米颗粒，可能需要数个可目测的有色颗粒很靠近和/或共定位，从而发光变得能用仪器或人肉眼检测。发光可由化学、生化或晶体变化、亚原子颗粒运动或辐射诱导原子系统激发而引起。根据本发明，发光优选是光致发光。光致发光颗粒在吸收光子(电磁辐射)后发光。荧光是由单重态-单重态电子张弛和磷光引起的光致发光，由三重态-单重态电子张弛引起的光致发光(典型寿命：数毫秒到数小时)。根据本发明，荧光和光致发光是优选发光模式并如下进一步详述。
发光颗粒可以是玻璃或聚合物颗粒，其用发光染料功能化。关于聚合物，可使用能纳入染料分子的所有聚合物种类。出于此目的，发光颗粒可包被有发光或能纳入发光染料的分子(例如表面活性剂)。能用于制备聚合物颗粒的合适聚合物的非限制性示例是含环糊精的聚合物，尤其是含阳离子环糊精的聚合物、聚已内酯(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚乳酸(PLA)、聚L-乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、L-乳酸-乙醇酸共聚物(PLLGA)、聚(D,L)-丙交酯(PDLA)、聚L丙交酯(PLLA)、D,L-丙交酯-己内酯共聚物、D,L-丙交酯-己内酯-乙交酯共聚物、D,L-丙交酯-PEO-D,L-丙交酯共聚物、D,L-丙交酯-PPO-D,L-丙交酯共聚物、聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkyl cyanoacralate)、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚羟酸、聚酐、聚正酯、聚酰胺酯、聚酰胺、聚酯醚、聚碳酸酯、聚亚烷基如聚乙烯和聚丙烯、聚烷撑二醇如聚乙二醇(PEG)、聚烯化氧(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷基酯如聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯乙醚、聚乙烯酯如聚乙酸乙烯、聚卤乙烯如聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯，纤维素衍生物如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝酸纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素，丙烯酸类聚合物如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八酯(本文统称为“聚丙烯酸”)以及其共聚物和混合物、聚二恶烷酮和其共聚物、聚羟基脂肪酸酯、聚富马酸丙二醇酯、聚甲醛、泊咯沙姆、聚原酸酯、聚丁酸、聚戊酸、聚(丙交酯-co-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚正酯、聚磷腈和聚磷酸酯。聚合物颗粒优选是聚苯乙烯颗粒。
关于发光染料，应注意本领域已知数种染料、其性质和可能的应用(参见例如数据库fluorophores.org)。根据本发明发光颗粒和聚簇的应用和所需特性，技术人员能选择合适的发光染料。
可使用本身是发光染料的颗粒，而不是用发光染料功能化的颗粒。非限制性示例是荧光纳米晶体(也称为量子点)。荧光纳米晶体由半导体材料制成，其小到足以展示量子机械性质，其激子特定限于所有三维空间。通过改变纳米晶体尺寸，量子点的激发和发射可调。发射频率随着纳米晶体尺寸减小而增加，引起发射光中的颜色从红色转变到蓝色。
根据本发明，所述颗粒彼此化学结合。化学键是允许化学物质形成的原子之间的吸引力，所述物质包含2个或更多原子。所述键由相反电荷之间吸引的静电力引起，在电子与核之间，或作为偶极引力的结果。化学键的强度差异很大；有“强键”如共价或离子键和“弱键”如偶极-偶极相互作用、伦敦色散力和氢键。颗粒之间的键优选是“强键”。所述颗粒可用颗粒官能团直接相互结合或通过第三化合物间接结合。间接结合颗粒的手段和方法如下文进一步详述。
根据本发明，聚簇内的颗粒彼此结合。即，聚簇内的各颗粒必须结合至少一个其它颗粒，从而所有颗粒集合形成连续聚簇。只要满足此前提，聚簇内各可目测的有色颗粒不必需结合发光颗粒，或各可目测的有色颗粒结合一个可目测的有色颗粒，或各发光颗粒结合一个发光颗粒。聚簇内的颗粒优选随机彼此结合。
然而，所述颗粒还可结合以形成某一模式。例如，本发明也包括聚簇，其具有一个聚簇部分中可目测的有色颗粒和另一聚簇部分中的发光颗粒。此情况下，一个部分中各可目测的有色颗粒结合一个可目测的有色颗粒，另一部分中各发光颗粒结合一个发光颗粒。仅在2个部分的边界面处，可目测的有色颗粒结合发光颗粒。分别载有可目测的有色颗粒和发光颗粒的聚簇部分可具有相同或不同尺寸。载有可目测的有色颗粒的部分与载有发光颗粒的部分之比优选是50:50-80:20重量％，更优选60:40-80:20重量％，甚至更优选70:30-80:20重量％且最优选约80:20重量％。
聚簇也可有浓度差异或浓度梯度，发光颗粒浓度向聚簇一端增加而可目测的有色颗粒浓度向另一聚簇端增加。在浓度差异的情况下，例如，一个聚簇部分可显示约50:50重量％的可目测有色颗粒与发光颗粒之比，而第二部分显示约80:20重量％的可目测有色颗粒与发光颗粒之比。
聚簇还可包括2个或更多如3、4或5个部分，所述部分各自仅载有可目测的有色颗粒，或仅载有发光颗粒，或同时载有可目测的有色颗粒和发光颗粒，彼此处于某一比例。所述比例可就各部分独立选择。此外，不同部分能随机彼此结合或再次形成某一模式，如通过载有可目测的有色颗粒的部分与载有发光颗粒的部分交替。
根据本发明，有色颗粒和/或发光颗粒也结合至少一种分析物结合伴侣。因此，分析物结合伴侣可仅结合有色颗粒，或可仅结合发光颗粒，或同时结合有色颗粒与发光颗粒。在上述实施方式中，其中所述聚簇包括2个或更多如3、4或5个部分，其可就各部分单独决定分析物结合伴侣仅结合有色颗粒，或仅结合发光颗粒，或同时结合有色颗粒与发光颗粒。颗粒与分析物结合伴侣之间的键也是如上文所定义的化学键。另一方面，可目测的有色颗粒和发光颗粒在聚簇中交替。可目测的有色颗粒和发光颗粒有序排列的其它形式在普通技术以内并落入本发明要求保护的范围内。
分析物结合伴侣可以是能与分析物形成吸引相互作用的任何分子，所述相互作用产生稳定，其中分析物与结合伴侣彼此接近。分析物结合伴侣优选特异结合分析物。分析物与其分析物结合伴侣之间的吸引键合一般弱于共价键。结合伴侣示例如下文所述。
术语“多个颗粒”从最广义上指至少2个颗粒，和至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个和至少10个颗粒，依次更优选。术语“多个颗粒”同样指定上限多至50个颗粒，多至40个颗粒，多至30个颗粒和多至20个颗粒，依次更优选。多个颗粒内的所示最小和最大颗粒数目能自由组合。例如，术语“多个颗粒”指至少2个和多至50个颗粒，至少4个和多至40个颗粒，至少5个和多至30个颗粒以及至少6个和多至20个颗粒，依次更优选。由于术语“多个颗粒”从最广义上指至少2个颗粒，于是本发明的聚簇必须包括至少2个可目测的有色颗粒和至少2个发光颗粒。因此，其中仅存在一个可目测的有色颗粒和/或仅一个发光颗粒的聚簇不在本发明范围内。例如，Draz等，(2012),ACS Nano,6(9):7634-7643描述杂合纳米簇等离子体共振器以检测乙肝病毒，其包括一个中央量子点和一些其结合的金纳米颗粒。因而，Draz等(2012)的纳米簇在结构上不同于本发明的聚簇。此外，Draz等(2012)的聚簇在功能上不同于本发明的聚簇，因为其在分析物乙肝病毒存在下分解。量子点仅在此分解状态发光，该状态中其与金纳米颗粒不相连。金纳米颗粒淬灭完整纳米簇内中央量子点的发光。由此，Draz等(2012)描述的完整纳米簇不发光。
本发明描述由2类颗粒构成的新型聚簇，即可目测的有色颗粒(其根据本发明示例优选是金颗粒)和发光颗粒(其根据本发明示例优选是荧光颗粒)。通过目测颜色，新型聚簇提供提高水平的分析物检测，因为有色颗粒在聚簇中浓缩。聚集增加颜色的信号强度，从而相较于例如包括于溶液中的单一有色颗粒以及多个未连接的单一有色颗粒，提高分析物检测极限。与有色颗粒相当，聚簇也浓缩发光颗粒，从而增加光发射信号。此设置使检测极限相较当前测试改进，后者采用例如包括于溶液中的单一发光颗粒以及多个未连接的单一发光颗粒。
信号和分析物检测灵敏度也通过组合有色颗粒与发光颗粒来增强。结合本发明的聚簇的分析物的存在可首先通过目测颜色确定，即通过眼睛检测本发明的聚簇的有色颗粒的颜色。通过眼睛检测颜色和因而检测试验结果是有利的，因为不需要人眼以外的设备。然而，缺点是人眼检测极限受限，因此结合本发明的聚簇的低浓度分析物可能不再被眼睛检测到。
发光检测是可选的。在分析物已由眼睛测得的情况下，通过发光检测的步骤可能不必需。而为了平衡目测颜色的缺点(例如由目测判断问题产生的)，分析物的存在能另外通过检测本发明的聚簇的发光颗粒来确定。如果视觉颜色仅为弱阳性，从而提供不确定结果，或如果视觉颜色甚至完全不可检测，尤其需要进行此检测。发光颗粒必须由光激发。例如，紫外(UV)灯或发光二极管(LED)能用于激发发光颗粒，其随后发出可检测的发光信号。由此，发光检测步骤也简单且仅需要便宜的设备。发光的检测极限优于目测颜色的检测极限。如果检测样品中的分析物可指示疾病(如在获自患者的血样中)或污染(如在饮用水样品中)的存在，低检测极限特别重要。低检测极限允许在早期检测疾病或污染。如实施例所述，基于聚簇的LFIA法显示直到10ng/mL分析物浓度的可见信号，但在UV光下，检测极限达到更低值，直到2.5ng/mL分析物浓度。因此，本发明的聚簇优选能检测浓度3.5ng/mL-1.5ng/mL的分析物，更优选浓度3.0ng/mL-2.0ng/mL，最优选浓度约2.5ng/mL。
本领域描述了由2种不同类型颗粒形成的聚簇应用。例如，Bai和共同作者(Bai,Y.等,2012.RSC Advances 2,1778–1781.)将CdTe量子点(QD)结合到较大硅纳米颗粒上，这由于QD积聚而大幅增加荧光强度。然而，二氧化硅颗粒仅用作QD载体以浓缩标记且检测完全基于荧光。Bai和共同作者没有将可目测的有色颗粒纳入其聚簇。
更近期，Tang和共同作者(Tang,D.等,2009.Biosens.Bioelectron.25,514–518.)开发了免疫试纸条测定用于快速筛选食品中的黄曲霉毒素B2(AFT B2)。检测试剂由磁性纳米金微球(MnGMs)组成，纳米Fe2O3颗粒作为核心且金纳米颗粒作为壳，并用单克隆抗AFT B2抗体生物功能化。结果显示截断检测值比金纳米颗粒低3倍，后者为0.9ng/mL AFT B2。然而，Fe2O3纳米颗粒用作金纳米颗粒集合的底物，在信号增强中不起到直接作用。此外，Fe2O3纳米颗粒必须保持不同于本发明的聚簇中存在的发光颗粒。
根据本发明的一个优选实施方式，可目测的有色颗粒是金属或金属氧化物颗粒，优选由Au、Ag、Ni、Pt、Cd、Fe、Cu、其氧化物或其任何组合制成的颗粒，更优选由Au、Ag、Fe氧化物或其任何组合制成的颗粒。在此方面，优选本发明的金属或金属氧化物颗粒不包括任何有机金属络合物。
金属纳米颗粒广泛用于生物医学科学和工程(综述参见Mody等.(2010),J PharmBioallied Sci.；2(4):282–289)。金属纳米颗粒通常制备自Au、Ag、Ni、Pt、Cd、Fe、Cu、其氧化物或其任何组合。例如，Au、Ag和Fe氧化物纳米颗粒如下进一步所述。
在优选实施例中，金属颗粒是金纳米颗粒(也称为胶体金)。胶体金颗粒目前用于高技术应用，如有机光伏、传感探针、治疗剂、生物和医学应用中的药物递送、电子导体和催化。金纳米颗粒的光学和电子性质可通过改变尺寸、形状、表面化学或聚集状态来调整。更详细地，金纳米颗粒与光的相互作用由其环境、尺寸和物理维度有力地决定。在胶体纳米颗粒附近传播的光线的振荡电场与自由电子相互作用，引起电子电荷的协调振荡，其与可见光的频率共振。这些共振振荡称为表面等离子体振子。对于小的(～30nm)单分散金纳米颗粒，表面等离子体振子共振现象引起光谱中蓝绿部分的光(～450nm)被吸收而红光(～700nm)被反射，产生大红色。随着颗粒尺寸增加，表面等离子体振子共振相关吸收的波长移向更长、更红的波长。然后，红光被吸收而蓝光被反射，产生淡蓝或紫色的溶液。表面等离子体振子共振能如下调整：改变纳米颗粒的尺寸或形状，产生的颗粒具有就不同应用定制的光学性质。因此，根据其尺寸，金纳米颗粒为深红色(对于小于100nm的颗粒)或蓝/紫色(对于更大颗粒)。不同尺寸(直径5nm-400nm)的金纳米颗粒市售可得，例如来自Invitrogen。还可使用银纳米颗粒。60nm银纳米颗粒用白光照射时，呈现亮蓝色。亮蓝色归因于在450nm波长达到峰值的表面等离子体振子共振。银纳米颗粒的独特性质在于该SPR峰值波长能通过改变颗粒尺寸和颗粒表面附件的局部折射率从400nm(紫光)调至530nm(绿光)。AuAg双金属纳米颗粒也用于本领域。
由于其尺寸、磁特性和生物相容性，超顺磁金属氧化物(FexOx)纳米颗粒成为多种生物医学应用的有希望的候选物，如用于MRI的增强分辨造影剂、靶向药物递送和成像、热疗、基因疗法、干细胞示踪、分子/细胞示踪、磁性分离技术(如快速DNA测序)、早期检测炎症、癌、糖尿病和动脉粥样硬化(参见Mody等.(2010),J Pharm Bioallied Sci.；2(4):282–289)。氧化铁纳米颗粒优选是铁(II/III)氧化物纳米颗粒。铁(II/III)氧化物(Fe3O4)是所有天然存在矿物质中磁性最强的，也是三个主要铁氧化物之一，而另两个氧化物是FeO和Fe2O3。
根据本发明的另一优选实施方式，所述发光颗粒是荧光颗粒或磷光颗粒。
关于本发明的优选发光颗粒，能使用显示荧光或磷光性质的任何有机或无机染料。
荧光是吸收光或其它电磁辐射的物质的光发射。可与本发明联用的荧光染料包括但不限于FluoSpheres、Alexa Fluor染料、Atto Fluor染料、FAM Fluor染料、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5、FITC、AMCA、荧光素、若丹明、TAMRA。大部分情况下，发射光具有比所吸收辐射更长的波长，和因而更低的能量。然而，当吸收的电磁辐射强烈时，一个电子可能吸收2个光子；此双光子吸收能引起比所吸收辐射波长短的辐射发射。发射辐射也可具有与吸收辐射相同的波长，称为“共振荧光”。许多分析过程涉及使用荧光计(即用于测量荧光参数的装置，尤其是波长和强度)，通常用单一激发波长和单一检测波长。由于所述方法提供的灵敏度，能测量低至万亿分之一的荧光分子浓度。荧光分析的灵敏度可比其它技术高几个数量级。
当吸收辐射处于人眼不可见光谱的紫外区而发射光处于可见区时，出现最优选的荧光。此情况下，简单UV灯/LED能用于激发荧光染料。
不同于荧光，磷光材料不立即再发射其吸收的辐射。再发射的较慢时标与量子力学中的“禁止”能量状态过渡相关。由于这些过渡在某些材料中的发生极慢，吸收的辐射可以较低强度再发射，持续多至初始激发后数小时。简言之，磷光现象是一种过程，其中物质吸收的能量以光形式相对缓慢释放。
根据本发明的另一优选实施方式，所述所述颗粒之间的键是共价键，优选肽键。
共价键是涉及共享原子间电子对的化学键。肽键(酰胺键)是当一个分子的羧基与另一分子的氨基反应时，2个分子之间形成的共价化学键，所述反应导致水分子(H2O)释放。因此，该过程是脱水合成反应(也称为浓缩反应)，通常在氨基酸之间发生。所得C(O)NH键称为肽键，所得分子是酰胺。四原子官能团-C(＝O)NH-称为肽连接。多肽和蛋白是由肽键连接在一起的氨基酸链。
根据下文的实施例，本发明的颗粒在本发明的聚簇内由肽键连接。为建立这些肽键，可目测的有色颗粒和发光颗粒包被有白蛋白且白蛋白分子之间开始形成肽键。因此，颗粒之间的肽键优选通过用蛋白和/或肽包被颗粒且随后使蛋白和/或肽相互连接来实现。这是将本发明的颗粒间接结合在一起形成聚簇的特定示例，因为所述颗粒彼此不直接结合，而是经包被颗粒的蛋白和/或肽的第三方结合。
根据本发明的另一优选实施方式，所述结合伴侣选自蛋白如抗体，DNA，RNA和适体如spiegelmer。
技术人员能根据待检测分析物选择合适的结合伴侣。
根据本发明使用的术语“抗体”包括例如多克隆或单克隆抗体。此外，术语“抗体”也包括仍保留结合特异性的其衍生物或片段。抗体片段或衍生物包括Fab或Fab'片段、Fd、F(ab')2、Fv或scFv片段、单结构域VH或V样结构域，如VhH或V-NAR-结构域，以及多聚形式，如微抗体、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体或化学缀合的Fab'-多体(参见例如Altshuler等.,2010.,Holliger和Hudson,2005)。术语“抗体”也包括实施方式如嵌合(人恒定域、非人可变域)、单链和人源化(人抗体，除了非人CDR)抗体。用于生成抗体和其片段的多种技术为本领域熟知并描述于例如Altshuler等.,2010。因此，多克隆抗体能在用抗原与添加剂和佐剂的混合物免疫后获自动物血液，单克隆抗体能通过经连续细胞系培养提供抗体的任何技术生成。这类技术的示例描述于例如Harlow和Lane(1988)及(1999)，且包括最初由Kohler和Milstein,1975描述的杂交瘤技术、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor,1983；Li等.,2006)和EBV-杂交瘤技术以生成人单克隆抗体(Cole等.,1985)。此外，重组抗体可获自单克隆抗体或能用多种展示法重新制备，如噬菌体、核糖体、mRNA或细胞展示。用于表达重组(人源化)抗体或其片段的合适系统可选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(参见例如美国专利6,080,560；Holliger和Hudson,2005)。此外，就生成单链抗体所述的技术(参见美国专利4,946,778)能适于生成对本发明靶标特异的单链抗体。BIAcore系统所采用的表面等离子体振子共振能用于增加噬菌体抗体效率。能针对氨基酸序列(此情况中是氨基酸表位)、核酸分子(如针对dsDNA)、脂质(如针对磷脂酰肌醇)和糖(如针对唾液酸聚N-乙酰乳糖胺糖链)产生抗体。因此，抗体能用于检测广泛范围的分析物。本发明所述抗体优选是单克隆抗体。
抗体特异性结合各自的抗原。抗原包括至少一个表位。蛋白质或肽抗原由氨基酸序列组成。表位(也称为抗原决定簇)是由抗体识别的抗原部分。蛋白质或肽表位根据其结构和与抗体的相互作用分成2类，即构象表位(不连续的氨基酸段(stretch))和线性表位(连续的氨基酸段)。
结合伴侣能用于检测广泛范围的分析物，包括其它氨基酸序列(其可通过例如生长因子结合蛋白或含SH2或3结构域的蛋白检测)、核酸分子(其可通过例如RNA-或DNA-结合蛋白，如Poly-A结合蛋白或转录因子，检测)、脂质(其可通过例如脂多糖结合蛋白或脂肪酸结合蛋白检测)、糖(其可通过例如麦芽糖结合蛋白检测)或小有机化合物(其可通过例如钙结合蛋白、铁结合蛋白或叶酸结合蛋白检测)。结合伴侣也包括肽模拟物。肽模拟物是设计成模拟某一肽的小蛋白样链。其通常如下产生：修饰现有肽，或设计模拟肽的类似系统，如类肽和β肽。不论方法如何，经改变的化学结构设计成有利地调整分子性质，如稳定性或生物活性。这可在从现有肽开发药物样化合物中发挥作用。这些修饰包括不天然存在的肽变化(如改变的骨架和纳入非天然氨基酸)。
DNA或RNA优选是反义核酸分子。术语“反义核酸分子”在本领域已知且指与代表编码区的核酸分子互补的核酸。本发明所述的反义分子能与编码靶核酸相互作用，更特别地，与其杂交。通过形成杂交体，靶基因转录和/或靶mRNA翻译减少或阻断。已描述了涉及反义技术的标准方法(参见例如Melani等.,Cancer Res.(1991)51:2897-2901)。
适体是结合特定靶分子的寡核酸(DNA或RNA)或肽分子。适体通常选自大随机人工序列库，但天然适体也存在于核糖开关。适体能作为大分子药物用于基础研究和临床目的。肽适体由短的可变肽结构域组成，两个末端都附着于蛋白支架。其设计成干扰细胞内的其它蛋白相互作用。其双重结构约束使肽适体的结合亲和性大幅增加到与抗体相当水平(纳摩尔范围)。可变环长度通常由10-20个氨基酸组成，支架可以是具有良好溶解性的任何蛋白。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白A是最常用的支架蛋白，可变环插入还原活性位点内，其在野生型蛋白中是-Cys-Gly-Pro-Cys-环，2个半胱氨酸侧链能形成二硫键。肽适体选择能用不同系统完成，但目前最常用的是酵母双杂交系统。核酸适体是通过重复数轮体外选择或等同的SELEX(指数式富集配体系统进化)改造的核酸种类，以结合多种分子靶标如小分子、蛋白、核酸和甚至细胞、组织及生物体。适体可用于生物技术和治疗应用，因为其提供分子识别特性，与具有特异结合能力的常用生物分子竞争，尤其是抗体。除了其区分识别，适体还提供相比抗体的优势，因为其能在试管内完全改造，易通过化学合成生成，具有想要的存储性质，并在治疗应用中很少引起或不引起免疫原性。
适体一般用天然寡核苷酸建立。spiegelmer-作为特定适体种类-用作为天然寡核苷酸对映异构体的L-核糖建立。如同其它适体，spiegelmer能结合分子如肽、蛋白和低分子量物质。相较正常适体，spiegelmer在血清中具有高度稳定性，因为其不易受酶水解切割影响。不同于其它适体，spiegelmer不用SELEX(指数式富集配体系统进化)直接制成，因为L-核酸不适合酶法，如SELEX所用的PCR。因此，选择用镜像靶分子完成。
根据本发明的一个优选实施方式，所述结合伴侣是抗体，所述分析物是蛋白质或肽抗原。
在下文实施例中，所述抗体是针对登革热病毒NS1糖蛋白的单克隆抗体，所述抗原是登革热病毒NS1糖蛋白的抗原。
根据本发明的更优选实施方式，所述合伴侣是针对登革病毒蛋白的抗体，所述分析物是所述蛋白的抗原。登革热病毒基因组编码3个结构蛋白，衣壳蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E，和7个非结构蛋白，NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。关于上述实施方式，登革病毒蛋白优选选自7个非结构蛋白。
根据本发明的甚至更优选实施方式，所述合伴侣是针对登革热病毒NS1糖蛋白的抗体，所述分析物是登革热病毒NS1糖蛋白的抗原。
根据本发明的一个优选实施方式，所述聚簇的直径为1nm-20μm，优选10nm-10μm，更优选20nm-1μm且最优选50nm-500nm。
如下文所讨论，本发明的聚簇在用于侧流免疫层析法(LFIA)时特别有用。具体地，对于在侧流免疫层析法中应用聚簇，有利的是聚簇直径在上面优选实施方式所示范围内，所述直径允许聚簇能沿免疫检测平稳流动。此外，技术人员充分认识到聚簇直径也取决于颗粒组成和尺寸。
根据本发明的另一优选实施方式，多个所述聚簇的平均直径小于10μm，优选小于1μm，更优选小于500nm且最优选小于250nm。
这些平均直径也与上述范围重叠，允许大部分聚簇能沿免疫检测平稳流动，尤其是LFIA。直径范围和平均直径值也可组合。因此，多个所述聚簇可具有例如小于10μm的平均直径，其中所述多个聚簇的每个聚簇具有1nm-20μm的直径；优选小于1μm的平均直径，其中所述多个聚簇的每个聚簇具有小于10nm-10μm的直径；更优选小于250nm的平均直径，其中所述多个聚簇的每个聚簇具有50nm-500nm的直径。
根据本发明的另一优选实施方式，所述聚簇内的颗粒具有1μm-1nm的直径，优选500nm-10nm，更优选100nm-20nm且最优选约40nm。
直径范围可就可目测的有色颗粒和发光颗粒独立选择。因此，聚簇内的可目测的有色颗粒可具有1μm-1nm的直径，优选500nm-10nm，更优选100nm-20nm且最优选约40nm。同样，聚簇内的发光颗粒可具有1μm-1nm的直径，优选500nm-10nm，更优选100nm-20nm且最优选约40nm。
采用具有这些直径范围的颗粒能产生聚簇，所述聚簇具有足够数量的可目测的有色颗粒和发光颗粒，这允许通过目测颜色和检测发光来检测分析物。
根据本发明的另一优选实施方式，所述可目测的有色颗粒与发光颗粒之比是50:50-80:20重量％，优选60:40-80:20重量％，更优选70:30-80:20重量％且最优选约80:20重量％。
关于此优选实施方式，术语“约”指±5重量％、±4重量％、±3重量％、±2重量％和±1重量％，依次更优选。下文实施例所用的聚簇由80重量％可目测的有色颗粒和20重量％发光颗粒组成，因此最优选约80:20重量％的比例。如所述，目测颜色的灵敏度小于发光测定。可目测的有色颗粒与发光颗粒之比保持在给定比例范围内，对确保颜色以及发光能检测(若存在分析物)尤其有利。
根据本发明的另一优选实施方式，所述颗粒包被了有允许颗粒结合在一起的官能团的物质。
所述颗粒具有的表面无法结合或仅不充足地结合在一起。这种情况下，颗粒用具有允许颗粒结合在一起的官能团的物质包被。可目测的有色颗粒与发光颗粒可包被有相同或不同物质，只要所述物质具有允许颗粒结合在一起的官能团。此外，仅可目测的有色颗粒或发光颗粒必须用具有允许颗粒结合在一起的官能团的物质包被。
术语“官能团”指定允许颗粒间形成化学键的任何残基。这类官能团的非限制性示例是残基-Na+,-Cl-,-NH2,-COOH,-N3,-C≡CH,-NHS和-SH。所述官能团优选是-NHS和-SH残基，其能使颗粒通过肽键结合在一起。
具有允许颗粒结合在一起的官能团的物质可以是蛋白、多糖或线性或分支聚合物，其中最优选蛋白。合适的蛋白包括但不限于白蛋白和酪蛋白。优选使用白蛋白。合适的糖包括但不限于壳聚糖和葡聚糖。合适的直链或分支聚合物包括但不限于聚乙二醇。
本发明还涉及检测液体样品中分析物的装置，所述装置包括多个本发明所述聚簇，其中所述装置优选包括具有样品位点的固相，其中在样品位点放置所述多个聚簇。
多个聚簇确定足以检测分析物的一些聚簇。出于此目的，一般使用过量聚簇以确保液体样品中可能存在的所有分析物都能检测到。术语“多个聚簇”从最广义上指至少2个颗粒，至少5个、至少10个、至少20个、至少50个颗粒，依次更优选。由术语“多个聚簇”指定的聚簇数目当然也取决于装置类型。在所述装置是LFIA装置，斑点试验或基于硝酸纤维素膜的装置的情况下，所述多个聚簇是至少5x 105、至少5x 106、至少5x 107和至少5x 108个聚簇，依次更优选。
所述多个聚簇优选在装置上通过冷冻干燥或风干来干燥。冷冻干燥也称为冰冻干燥、冻干或冷冻脱水，是通常用于保存易腐材料或使材料运输更方便的脱水过程。冷冻干燥通过冷冻材料，然后降低周围压力以使材料中冻结的水能升华，直接从固相到气相。
液体样品优选是溶液且更优选是水性液体样品。水性溶液是其中至少一种溶剂是水的样品。当用于临床诊断时，样品可以是例如尿、唾液、血清、血浆、全血、粪便或渗出液(来自伤口或病灶)。当用于非临床应用时，样品可以例如获自固体、灰尘、植物或食品，或环境采集拭子如来自食品加工厂。
本发明的装置的形式没有特定限制。例如，所述装置可采用悬液形式，其中本发明所述所述多个聚簇悬于液体样品。在此情况下，所述装置可以是携带液体样品的小室，其中悬浮有所述多个聚簇。然而，优选所述装置包括具有样品位点的固相，其中在样品位点放置所述多个聚簇。例如，固相可以是纤维素(和衍生物如硝酸纤维素、醋酸纤维素等)、聚合物载体、二氧化硅(玻璃)或金属表面。在固相样品位点是金属表面的情况下，本发明的颗粒可通过磁引力在装置上浓缩。在固相样品位点是纤维素的情况下，本发明的颗粒可通过干燥置于装置上。
含固相的装置可具有任何已知装置形式用于检测液体样品中的分析物，如侧流免疫层析法(LFIA)、阵列、斑点试验或柱色谱装置。
本文所用的阵列(最主要是微阵列)指定固体基质(通常载玻片或硅薄膜电池)上的2D阵列，能检测样品中的2个或更多不同分析物，优选用高通量筛选小型化、多重和平行加工及检测方法。2个或更多不同分析物是至少5个、至少10个、至少50个、至少100个、至少500个和至少1000个不同分析物，依次更优选。阵列的概念首先在1983的抗体微阵列中引入并阐述，因此在本领域良好确立。本发明的阵列优选包括多个本发明所述的聚簇，其中各不同类型的聚簇能检测不同类型的分析物且各不同类型的聚簇在阵列的不同、非重叠位点固定。由此，不同分析物的数目与不同聚簇的数目直接成比例。
斑点试验是简单试验，其中多个本发明所述的聚簇固定在不同固相斑点上，所述固相优选纤维素或基于纤维素的膜。在斑点试验用于检测分析物是否存在的情况下，固相上的一个斑点足够。在斑点试验用于检测分析物浓度的情况下，含不同量本发明所述聚簇的斑点可在固相上存在和/或不同量的本发明液体样品可施用于斑点。斑点试验即免疫斑点试验在实施例中例证(还参见图4)。因此，斑点试验优选是免疫斑点试验。免疫斑点试验是测量液体中分析物存在或浓度的生化试验，通过使用抗体或免疫球蛋白作为分析物结合伴侣。
柱亲和性色谱装置是能用于分离来自液体样品的单独分析物的装置。在柱亲和性色谱中，固定相是吸附剂，置于垂直柱内，通常是玻璃柱。硅胶(SiO2)和氧化铝(Al2O3)是两种常用于柱色谱的固定吸附剂。根据本发明，固定相固定多个本发明所述的聚簇。固定相与聚簇之间的键优选是共价键。待由柱色谱分析的液体样品(流动相)置于柱顶部内并通过重力或应用空气压力来穿过柱。在分析物存在于样品的情况下，分析物结合固定于固定相的聚簇，从而分开单个分析物与液体样品。然后，洗脱溶剂置于柱顶部内并通过重力或应用空气压力来穿过柱。洗脱溶剂使分析物与聚簇之间的连接溶解。合适的洗脱溶剂广泛用于本领域，例如通过改变pH和/或盐浓度来分开聚簇与分析物之间的键。由此，分析物在分离中获得。根据溶剂如何沿柱向下流，柱色谱能分成2大类。如果溶剂能通过重力或渗滤沿柱向下流，称为重力柱色谱。如果溶剂通过正空气压力沿柱向下流，称为快速色谱。目前尚不清楚此应用中采用聚簇的优势，因为识别分子能例如直接结合硅胶。有趣的应用也许是使用聚簇(含磁颗粒)来通过磁过滤富集和通过聚簇中的第二颗粒检测(比色法、荧光等)。
本发明的装置优选采用侧流免疫层析法形式(参见图1的LFIA示例)。侧流免疫层析法(LFIA)也称为侧流试验，免疫色谱试纸条(ICS)检测或在本领域中简单称为试纸条检测。自从1980年代后期首次引入后，其已成为诊断试验的流行平台。侧流试验用于本领域以特异定性或半定量检测许多分析物，包括抗原、抗体和甚至核酸扩增试验的产物。一种或多种分析物能在同一试纸条上同时检测。
在本发明所述LIFA中，首先，液体样品置于取样处，所述位点一般在试纸条一端。液体样品可包括试验特定缓冲液或与之混合。此缓冲液可仅是稀释剂/运行缓冲液或可能复杂得多，并且具有使LFIA适当运行所需的特定组分或特性，如细胞裂解缓冲液。加入液体样品，使多个本发明所述的聚簇溶解。溶解时，若样品中存在分析物，则所述聚簇与样品中的分析物混合并结合。然后，毛细管作用将流体混合物从取样处引向上游进入固相，一般是膜。样品/聚簇分子混合物继续向固相上游移动，直至其到达捕获分子能结合本发明分析物/聚簇复合体的位点。应理解本发明分析物/聚簇复合体仅在捕获位点被捕获。在样品中不存在分析物的情况下，聚簇不结合。仅当分析物试验为阳性时，本发明的聚簇的颜色和/或发光能在捕获位点测得。捕获位点一般靠近试纸条另一端或在试纸条另一端处，即与取样处所处的末端相反。
大部分LFIA计划在纯定性基础上操作。然而，在捕获位点测量颜色和/或发光强度以确定液体样品中分析物的量是可行的。本领域称为侧流读取器的手持式诊断装置能用于提供全定量测试结果。通过联用独特光波长照射与CMOS或CCD检测技术，能生成实际捕获位点的信号丰富图像。采用特定设计用于具体测试类型和介质的图像处理算法，线强度可随后与分析物浓度相关联。替代的非光学技术也能报告定量测试结果。一个这种示例是磁性免疫测定(MIA)，其也能获得量化结果。
如上文定义的本发明优选装置包括多个本发明所述聚簇和具有样品位点的固相，其中在样品位点放置所述多个聚簇。因此，此装置包括样品位点和固相。
另一方面，LFIA装置包括至少以下3种基本组件：(i)样品位点，(ii)固相和(iii)捕获位点。因此，除了该优选装置的组件，LFIA装置还包括捕获位点。
LFIA的样品位点一般包括在上面加样液体样品的样品垫，和携带多个本发明所述的聚簇的结合垫(conjugate pad)。样品垫和结合垫可以是一个垫(如纤维素或玻璃纤维垫)或可以是2个不同垫，其中结合垫在样品垫上游且2个垫放置成允许其之间的毛细管流动连通。样品垫可由纤维素、玻璃纤维或任何其它能安装和处理样品的材料制成。样品垫可另外完成一个或多个以下任务：修改样品pH，从样品滤出固体组分，分离样品成分，和吸附出样品中不需要的组分。样品施加于样品垫前，所述垫优选如下预处理：将其浸入含溶液混和物的特定缓冲液，所述溶液由可溶性蛋白、表面活性剂/去垢剂和其它聚合物组成。此预处理增强稳定流动和/或防止样品组分非特异结合垫。
结合垫可由非吸附材料制成，如玻璃纤维垫、聚酯、人造丝或类似材料。结合垫优选由确保本发明的聚簇有效释放的合成材料制成。本发明所述聚簇可加入结合垫，例如通过浸渍或喷雾。在浸渍情况下，结合垫浸没在含聚簇的悬液中。在喷雾情况下，所述垫包被有本发明的聚簇，使用例如定量、定向气溶胶分布，与喷墨式打印机类似。优选喷雾，因为聚簇应用能得到更好控制并防止稀释和洗去任何垫预处理(若存在)。
固相材料不特定受限，只要材料提供足够的分析物/聚簇复合体结合从而能在捕获位点处生成尖锐和强烈信号，而同时非特异背景水平使得结果(即分析物是否存在)能得到真实解释。合适材料是多孔纤维素或基于多孔纤维素的材料，或烧结聚合物。固相优选是硝酸纤维素(NC)膜。迄今为止，LFIA测试硝酸纤维素使用最广泛。硝酸纤维素的益处是成本低、毛细管流动、对蛋白的高结合亲和性、易处理和切割以及厂商改变膜厚度和组分以适应客户和市场需求的能力。通过硝酸酯和蛋白肽键的相互作用，硝酸纤维素能静电结合蛋白。膜的结合容量由技术人员根据可用的表面积确定。此表面积由孔径、多孔性(孔密度)、膜厚度和该特定聚合物的独特物理性质确定。这些因素也影响毛细管流速，其也能显著影响LFIA总体性能。如果试纸条流动过快，则灵敏度可能损失，如果流动过慢，则特异性可能损失(如背景增加)。
固相可用阻断剂处理以防止样品和聚簇非特异结合并限制沿着膜的背景信号。阻断也可用于控制流速和稳定试验。阻断过程可包括固相浸入蛋白、表面活性剂和/或聚合物的水溶液。阻断后，一般干燥固相。
根据另一个优选实施方式，所述装置额外包括捕获位点，其中多种结合分析物的捕获剂在捕获位点处固定，且其中捕获位点和样品位点放置成允许捕获位点与样品位点之间的毛细管流动连通。
此优选实施方式所述装置包括LFIA基本组件，因此是LFIA装置。
在捕获位点处固定的捕获剂可以是能与分析物形成吸引相互作用的任何分子，从而产生分析物与捕获位点的稳定连接。捕获剂优选特异结合分析物。分析物与捕获剂之间的吸引结合一般弱于共价键。当捕获剂存在于分析物/聚簇复合体时，必须能结合分析物。因此，捕获剂不应结合分析物位点，其当结合本发明的聚簇即结合分析物结合伴侣时，被空间阻断。然而，捕获剂可识别对分析物/聚簇复合体特异的结构。因此，捕获位点(或结果位点，或测试位点)包括捕获剂，其能在LFIA背景下结合分析物/聚簇复合体。分析物/聚簇复合体(若存在)变得在捕获位点处固定，这由本发明的聚簇的颜色和/或发光指示。本发明所述捕获剂可加入捕获位点，例如通过浸渍或喷雾，所述方法在上文详述。捕获位点优选采用线形式。
本文所用术语“捕获剂”和“分析物结合伴侣”必须保持不同。两者都能与分析物形成吸引相互作用，其在装置中的位置不同。如所讨论，捕获剂固定于捕获位点，而分析物结合伴侣与可目测的有色颗粒和/或发光颗粒结合并因此形成部分本发明的聚簇。“捕获剂”和“分析物结合伴侣”优选选定，从而其不竞争结合分析物。这可如下实现：选择结合分析物位点的捕获剂，所述位点不同于分析物结合伴侣识别的位点。
分析物结合伴侣的示例结合针对本发明的聚簇的实施方式，在上文详细讨论。这些分析物结合伴侣可能用作捕获剂以通过固定在捕获位点来生成本发明LFIA的捕获位点。LFIA可具有大于一个捕获位点，从而允许平行捕获2个或更多分析物。此情况下，本发明的聚簇一般也包括2个或更多不同的分析物结合伴侣，各不同的分析物结合伴侣对具体且不同的分析物特异。
WO 2009/152209涉及用于侧流免疫层析法(LFIA)的目视和荧光检测方法组合。通过向金属颗粒加入少量荧光染料或荧光胶乳颗粒，来增强可视读取的侧流免疫测定试验的灵敏度。然而，使用彼此不结合的荧光颗粒和金属颗粒-与本发明的聚簇内结合在一起的2类颗粒相反-不防止2种不同类型的颗粒(金属和胶乳)在LFIA中单独侧流。由此，如WO2009/152209所述使用的2种不同类型的颗粒不同时到达LFIA捕获位点。
通过使用本发明的聚簇，LFIA通过浓缩标记显示提高的信号强度。此外，LFIA的结果重复性更好，因为结合的颗粒避免2种不同颗粒类型之间的优先相互作用和不同迁移率。由本发明第一个实施方式可见，在本发明的聚簇内，可目测的有色颗粒和发光颗粒彼此结合。因此，本发明的聚簇是含可目测的有色颗粒和发光颗粒的连续结构。如上文更详细讨论，在LFIA中，毛细管作用将含聚簇的液体混合物从取样处引向上游进入固相，直至聚簇到达捕获位点。2类颗粒之间的结合有利确保2种颗粒在聚簇环境下以同一速度流动到捕获位点。因此，所述结合确保可目测的有色颗粒和发光颗粒同时到达捕获位点。这进而确保目测颜色和发光检测的结果非常稳定且可靠。可目测的有色颗粒与发光颗粒在捕获位点处之比反映了本发明的聚簇中可目测的有色颗粒与发光颗粒之比，因为在聚簇中，可目测的有色颗粒与发光颗粒一起流到捕获位点，作为连续结构。
因此，本发明提供聚簇，其能通过浓缩有色和发光颗粒作为单一结构以识别分析物分子来提高LFIA的灵敏度和重复性。聚簇中这类颗粒的组合提供特性相较现有标记改良的结构：双重检查信号(比色和发光)，避免差异颗粒迁移的简易流动，以及另外，相较单一颗粒，有更多表面积/标记的多重相互作用点以使分析物结合伴侣结合聚簇。
更优选本发明的LFIA装置包括一个或多个可选的装置组件，如以下本发明优选实施方式所定义。
根据本发明的一个优选实施方式，所述装置额外包括对照位点，其中在该对照位点固定多种结合聚簇的对照剂，优选结合聚簇结合伴侣，且其中对照位点放置成允许样品位点与对照位点之间的毛细管流动连通。
在对照位点处固定的对照剂可以是能与聚簇形成吸引相互作用的任何分子，从而产生聚簇与对照位点的稳定连接。尽管不严格必需，优选LFIA在样品位点上游纳入对照位点(优选采用线形式)，其搭载未结合分析物的本发明的聚簇。在样品中存在分析物的情况下，这些聚簇是过量聚簇，或在样品中不存在分析物的情况下，其是几乎所有聚簇。因此，对照位点必须包括能特异结合本发明的聚簇的对照剂。重要的是，对照剂不显著结合，优选不结合分析物。采用最简单的形式，这类对照剂本身可以是固定于对照位点的分析物，或仍由分析物结合伴侣识别的分析物片段，其存在于本发明的聚簇内。例如，在聚簇内的分析物结合伴侣是抗体的情况下，固定于对照位点的对照剂可以是抗体的抗原或Fc-受体。此示例中，固定抗原或Fc-受体能与本发明的聚簇内存在的抗体形成吸引相互作用，从而产生聚簇与捕获位点的稳定连接。对照位点确认试验操作正确。在分析物存在的情况下，对照位点处呈现颜色和/或发光，且任选地，如果对照位点处也有过量聚簇不携带分析物，指示样品中存在分析物，而有效负检验仅在对照位点生成颜色和/或发光。
根据本发明的一个优选实施方式，所述装置额外包括吸收垫，其位于流程下游，在样品位点、捕获位点和(若存在)对照位点后。
吸收垫在本领域也称为芯或芯吸垫。吸收垫有利于使液体样品脱离膜并允许膜的毛细管流动以合适方向和合适速度保持流动。如果没有吸收垫根据所用固相使用，液体样品(和可选的缓冲液)可沿膜向下流并且能提高背景或可能导致假阳性。吸收垫可制备自无纺布、纤维素纤维板。这些垫能以多种厚度和密度制造以适合装置需求，尤其是LFIA。
根据本发明的另一个优选实施方式，所述装置额外包括衬靶纸，优选纸或塑料粘合衬靶纸。
由于LFIA所用材料的易碎性质以及维持组件之间精确直接接触的需求以确保合适试剂和样品流，本发明的装置优选包括衬靶纸。衬靶纸通常用压敏胶粘剂预处理，所述胶粘剂就其在试验中的稳定性进行选择并确保其不浸出可能干扰结果的化学物质。厂商的一个相关关注是胶粘剂强到足以适当结合材料与卡片，但不流到其中过远并通过降低可用床体积来抑制毛细管作用。胶粘剂卡片初始可覆盖有衬垫，其可以是用于更简单装配测试组件的预狭缝。根据试验平台和LFIA的产品配置，许多材料可用。更常见的材料是塑料粘合衬靶纸，由聚苯乙烯、乙烯基、聚酯(透明或不透明)和/或聚脂薄膜制成。
根据本发明的另一个优选实施方式，所述装置额外包括层压盖带。
层压盖带是胶带，用作保护屏障并防止试剂蒸发和帮助限制试剂回流。用一些特别易碎的材料时，盖带对维持装置完整性必要，尤其是LFIA装置。所述带可具有其上印迹的任意数量的设计，如试验标识或商品名。盖带应在装置的测试和对照线区上清楚。如上讨论的“衬靶纸”，必须在粘合强度与胶粘剂迁移之间达到精密平衡以防止试验干扰和床体积损失。
根据本发明的另一个优选实施方式，所述装置额外包括外壳。
外壳通常由2个拼接到一起并保护装置尤其是LFIA装置组装的块件组成。所述装置包含在此外壳内，使该单元更易手持并保护装置免于损伤和环境污染。在LFIA装置的情况下，外壳侧的窗口允许施加液体样品以及检测捕获位点和对照位点(若存在)处的颜色和/或发光。在所有位点处，此窗口可以是一半外壳中的一个小洞。窗口也可以是透明塑料或玻璃窗，保护膜免于意外损伤和飞溅，同时仍能在捕获位点和/或对照位点可视观察这些位点。
本发明还涉及检测分析物的试剂盒，包括(i)本发明的聚簇，或本发明所述装置和(ii)如何使用试剂盒的信息和/或说明书。
所述试剂盒意在用于本发明方法，如下文进一步详述。因此，如何使用试剂盒的信息和/或说明书优选描述如何执行本发明方法。
本发明还涉及检测液体样品中分析物的方法，包括(a)使本发明的聚簇或本发明的装置接触液体样品，和(b)测定分析物的存在，通过(i)目测颜色和可选的(ii)检测发光。
如上文所定义，本发明的聚簇包括多个可目测的有色颗粒和多个发光颗粒。根据此方法，发挥上述可选择通过目测颜色和检测发光来检测分析物的优势。就眼睛检测颜色而言，不需要人眼以外的设备。在未观察到颜色的情况下，更低浓度的分析物仍可通过发光检测来测得。
本发明还涉及通过本发明的装置检测液体样品中分析物的方法，所述装置包括的固相具有样品位点(其中在样品位点放置所述多个聚簇)和捕获位点(其中在捕获位点固定多种分析物结合物)，其中捕获位点和样品位点放置成允许捕获位点与样品位点之间的毛细管流动连通，所述方法包括(a)使液体样品接触样品位点，(b)允许液体样品流到捕获位点，(c)测定捕获位点处分析物的存在，通过(i)目测颜色和可选的(ii)检测发光。
根据本发明使用的装置包括LFIA基本特征，即如上文定义的(i)样品位点、(ii)固相和(iii)捕获位点。因此，此方法所述装置是LFIA装置。如上所讨论，本发明的聚簇用于LFIA时尤其有利，这归因于可目测的有色颗粒和发光颗粒在本发明的聚簇中结合在一起。
另外，同样根据此方法，发挥上述可选择通过目测颜色和检测发光来检测分析物的优势。
根据上述方法的一个优选实施方式，所述装置额外包括对照位点，其中在对照位点固定多种聚簇粘合剂，优选聚簇结合伴侣的粘合剂，且其中对照位点放置成允许样品位点与正对照之间的毛细管流动连通，所述方法还包括(b’)允许液体样品流到对照位点，和(c’)测定对照位点处分析物的存在，通过(i)目测颜色和可选的(ii)检测发光。
除了上文定义的对照位点，根据本发明使用的装置包括3个LFIA基本特征。因此，本发明所述装置还是LFIA装置。如上文更详细所讨论，对照位点确认试验操作正确并因此优选包括在基于LFIA的方法。
附图简要说明
图1：示范性侧流免疫层析
图2：分离后的聚簇透射电子显微镜检测。(a)金纳米颗粒、(b)聚苯乙烯纳米颗粒和(c)金纳米颗粒及聚苯乙烯纳米颗粒低能损谱的明场像。来自同一区域的明场(d)和25eV能损(e)，显示就聚苯乙烯纳米颗粒观察而言的更佳分辨率。用于侧流试验的25eV的聚簇图像(e-g)和聚簇移出部分的图像(h和i)。
图3：登革病毒NS1蛋白检测的侧流免疫层析分析，基于聚簇(a)、UV光下(b)和金纳米颗粒(c)。视觉检测界限如红圈所示。
图4：基于聚簇的登革热检测的免疫斑点分析。右侧影像在UV光下拍摄。
图5：各商业试剂盒(Standard Diagnostics，SD和Biorad，BR)的2个血清稀释系列图片。各浓度具有遵循以下顺序的试验图片：(1)商用试验，SD或BR，(2)比色，Cl和(3)荧光，Fl，基于聚簇的试验信号。圆圈指示观察者肉眼能识别的最低浓度。
实施例举例说明本发明。
实施例1-材料与方法
为阐述本发明，金和荧光纳米颗粒聚簇用于检测登革热。来自病毒的非结构蛋白NS1选作靶分析物。结果与基于金的LFIA作对比。
化学品
金纳米颗粒(平均直径：40nm)、牛血清白蛋白(BSA)粉末、生物素、链霉亲和素、抗链霉亲和素IgG抗体、N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、透析膜(MWCO100kDa和130kDa)、蔗糖、磷酸一钾和磷酸二钾购自Sigma-Aldrich(美国密尔沃基)。链霉亲和素标记的金纳米颗粒(平均直径：40nm)购自British Biocell(英国加的夫)。FluoSpheres(PS)羧化微球(激发：580nm/发射：605nm)0.04μm和硝酸纤维素AC99膜分别获自Invitrogen(美国卡尔斯巴德)和Whatman(英国梅德斯通)。样品垫和结合垫获自Pall(德国德赖艾希)。吸收垫和衬靶纸分别获自Millipore(美国比勒利卡)和Lohmann(美国圣何塞)。登革病毒NS1糖蛋白小鼠单克隆抗体(上清)和Melon胶IgG纯化试剂盒分别获自Abcam(英国剑桥)和Thermo Scientific(美国罗克福德)。登革热NS1Ag ELISA购自StandardDiagnositics(韩国龙仁市)
制备金和聚苯乙烯纳米颗粒蛋白质缀合物
15％金纳米颗粒分散体用NaOH 0.01M调至pH 8，将30μL浓度为1mg/mL的白蛋白溶液加入0.3mL金分散体。混合物搅拌30分钟，然后，为移除过量蛋白，在4℃ 5000rpm离心15分钟。仔细移出清澈的上清，沉淀的金缀合物重悬于400μL 0.01M磷酸盐缓冲液,pH 7.4，4℃保存。遵循同一过程生成缀合有NS1抗体的金纳米颗粒。白蛋白包被的聚苯乙烯纳米颗粒如Linares和同事所述制备(Linares,E.M.等,2013,Biosens.Bioelectron.41,180–185)。
制备金-聚苯乙烯纳米颗粒(PS)聚簇
先前包被有白蛋白的胶体金和荧光颗粒通过用水溶性碳二亚胺激活表面羧基在白蛋白分子之间形成肽键共价结合。为生成80:20(wt.％)金:PS的聚簇，300μL 15％金纳米颗粒的固体混合562μL 2％PS纳米颗粒，并在摇床中室温孵育30分钟。随后，向悬液加入2mgEDC(1‐乙基‐3‐(3‐二甲基氨基)丙基碳二亚胺盐酸盐)并室温孵育3小时。之后，悬液以3000rpm，2分钟离心2次，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4洗涤。聚簇堆积在离心管中的1mL 1mol/L蔗糖溶液上，在4℃ 13000rpm离心30分钟。移出100μL等分样品，剩余的分成2个等分样品。顶部的等分样品在通过220μm滤器后用于测试。
用生物分子功能化聚簇
聚簇缀合链霉亲和素以及单克隆NS1登革热抗体。将500μL聚簇分散体80:20金:PS的等分样品加入溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH 6的500μL 0.5mg/mL蛋白溶液。悬液室温孵育30分钟。随后，加入1mg EDC并通过涡旋混合，pH用稀释的NaOH调至6.5。分散体在摇床上室温孵育3小时。为分离蛋白标记的聚簇与未结合蛋白，悬液以3000rpm，10分钟室温离心3次。终悬液在含1％BSA的磷酸盐缓冲液中保存。
试纸条检测和免疫斑点试验
在设置试纸条检测用于聚簇之前，所有使用的膜接受不同处理：样品垫浸入0.01mol/L磷酸盐缓冲液,pH 7.4，所述缓冲液含有5％BSA和0.05％Tween20，并在60℃干燥2小时；结合垫先前浸入有10％蔗糖的1mmol/L硼酸盐缓冲液,pH 9，然后5％(w/v)聚簇沉积并室温干燥；溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液,pH 7.4的1mg/mL浓度的抗NS1蛋白抗体和生物素化白蛋白滴到硝酸纤维素上，从而用来自Fujifilm(美国圣克拉拉)的Dimatix打印机形成检测和对照线。BSA根据Guesdon,J.L.等,1979.J.Histochem.Cytochem.27,1131–1139.Ho,J.A.A.,Zeng,S.C.,Tseng,W.H.,Lin,Y.J.,Chen,C.H.2008.Anal.Bioanal.Chem.391,479–485进行生物素化。检测垫室温干燥；且吸收垫直接使用。随后，所有膜在衬靶纸上层压，之间重叠2mm。所述膜以4mm宽切割。血清样品通过在样品垫上加入100μL来分析。流动终止时，加入100μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液,pH 7.4。同一缓冲液用作空白。25分钟后进行分析。
免疫斑点分析
对于多种测试，4μL血清堆积在硝酸纤维素膜(7cm x 10cm)上，各点之间间隔15mm以避免污染和检查其之间的排列从而适应ELISA微板的孔。此样品体积是观察清晰结果所需的最小体积。10分钟后，加入在磷酸盐缓冲液0.01mol/L,pH 7.4中含BSA 3％的阻断溶液以室温覆盖完整膜15分钟。随后，移出阻断溶液，加入溶于磷酸盐缓冲液0.01mol/L,pH 7.4的3mL荧光缀合物1％，孵育30分钟。
用商业试剂盒比较
2种试剂盒，Standard Diagnostics BiolineDengue Duo和Biorad Strip，用于通过推荐试验比较其性能。试剂盒根据其如Blacksell S.D.J.Biomed.Biotechnol.2012,1-12所述的性能选择。8个感染的血清样品用磷酸缓冲液稀释生成NS1浓度较低的溶液。稀释随着初始NS1浓度而变化，其用酶联免疫吸附试验测定。一组14个观察者分析试验并确认其能观察到的最小稀释。视觉检测界限由至少一半观察者能检测到的浓度确立。试验一式两份进行且观察者能在浓度相同的试纸条检测中目测到相同信号。记录图片，测试线信号(区域：1mm x 4mm)转换成灰度并随后用灰度相比NS1浓度的图比较。UV灯下所得图像转换成灰度且信号在标度中倒转以促进比色信号对比。
实施例2-使用本发明的聚簇检测NS1
聚簇表征
金(图2a)和聚苯乙烯(图2b)纳米颗粒的来自EELS(电子能量损失谱)的谱获自图像中所示的区域，并示于图1c。聚苯乙烯谱在低能耗的强度高于金，因此其在能量图中会显得更亮。亮场(图1d)和其在25eV的图像(图2e)更清晰显示聚苯乙烯颗粒在亮场观察不佳，但在低能耗图中观察更佳。第一部分(离心管中从上到下)浓缩更小的聚簇，如图2e-g所观察，其中能观察聚簇多至具有混合组成的5种颗粒。来自第二部分的图像指示存在组成和形式可变的更大聚簇。各部分的试验显示第一部分生成更好的信号和重复性。
基于聚簇的LFIA检测极限并与金纳米颗粒对比
基于聚簇的LFIA(图3a-b)显示直到10ng/mL的可见信号，但当试纸条检测在UV光下时，检测极限达到更小值，直到2.5ng/mL。为比较聚集对检测极限的影响，建立基于金纳米颗粒的LFIA并示于图3c。显示可见测试线直至500ng/mL，直到250ng/mL处的信号几乎无法观察到。结果证明聚簇提供的检测极限比金纳米颗粒低50倍，其在UV灯下降至200倍。
因此，如果有色信号为弱阳性，表明结果无法确定，灯/LED能用于激发荧光颗粒且荧光团会在可见光谱中发射。这会提供优于比色信号4倍的灵敏度。
用于在免疫斑点试验中检测NS1的聚簇
一组48个登革热感染患者样品沉积在硝酸纤维素上并用金荧光纳米颗粒聚簇检测。图4表明荧光纳米颗粒提供额外信号，有助于使测定更可靠。根据揭露的结果，纳米颗粒聚簇代表克服LFIA灵敏度限制的强有力选择。
商业试剂盒比较
图5显示用推荐试验比较2种试剂盒，显示每试剂盒2种血清稀释的图片。图5表明血清稀释系列和与基于聚簇的试验对比商业试剂盒性能。观察者可见的所示最低浓度由圆圈表示。基于聚簇的试验显示性能优于商业试剂盒。
表1：推荐方法和Biorad试纸条的视觉检测界限。
就Biorad试纸条获得的检测界限是200ng/mL，就基于聚簇的试验观察到的检测界限是100ng/mL(用于比色信号)和50ng/mL(用于荧光信号)。
Biorad试纸条检测显示性能优于Standard Diagnostics Bioline Dengue Duo，但灵敏度低于基于聚簇的试验。
与LFIA其它标记的标记比较
比较用于登革热检测的不同标记。结果表明颗粒聚簇显示的性能优于大部分LFIA或免疫斑点试验的所用标记。
表2：用于登革热检测的标记比较。
聚簇制备过程中的优化
执行许多反应以开发和优化聚簇，包括以下项目：
·颗粒功能化：优选避免链霉亲和素/抗体在颗粒表面直接固定
·间隔区：生物功能化优选用基于BSA包被的间隔区提高。
·聚簇组成：根据本本发明的聚簇的特定应用，优化颗粒组成，例如通过在聚簇生产过程中改变颗粒浓度、反应时间和活化剂浓度。
表3：基于聚簇的试验用于登革热检测的优势总结。
Claims (15)
1.一种用于检测分析物的聚簇，所述聚簇包含多个可目测的有色颗粒和多个发光颗粒，其中：
(i)所述颗粒彼此结合，和
(ii)至少一种分析物结合伴侣与所述有色颗粒和/或发光颗粒结合。
2.如权利要求1所述的聚簇，其中所述可目测的有色颗粒是金属或金属氧化物颗粒，优选由Au、Ag、Ni、Pt、Cd、Fe、Cu、其氧化物或其任何组合制成的颗粒，所述可目测的有色颗粒优选是非有机金属化合物。
3.如权利要求1或2所述的聚簇，其中所述发光颗粒是荧光颗粒或磷光颗粒。
4.如权利要求1-3中任一项所述的聚簇，其中所述颗粒之间的键是共价键，优选肽键。
5.如权利要求1-4中任一项所述的聚簇，其中所述结合伴侣选自蛋白质如抗体、DNA、RNA和适体如spiegelmer。
6.如权利要求5所述的聚簇，其中所述结合伴侣是抗体，所述分析物是蛋白质或肽抗原。
7.如权利要求6所述的聚簇，其中所述抗体是针对登革热病毒NS1糖蛋白的抗体，所述蛋白质或肽抗原是登革热病毒NS1糖蛋白的抗原。
8.如权利要求1-7中任一项所述的聚簇，其中所述聚簇的直径为1nm-20μm，优选10nm-10μm，更优选20nm-1μm且最优选50nm-500nm。
9.如权利要求1-8中任一项所述的聚簇，其中所述可目测的有色颗粒与发光颗粒之比是50:50-80:20重量％，优选60:40-80:20重量％，更优选70:30-80:20重量％且最优选约80:20重量％。
10.如权利要求1-9中任一项所述的聚簇，其中所述颗粒用物质包被，所述物质至少具有允许将颗粒结合在一起的双官能度。
11.一种检测液体样品中分析物的装置，所述装置包含多个权利要求1-10中任一项所述的聚簇，其中所述装置优选包含具有样品位点的固相，其中多个所述聚簇放置在所述样品位点。
12.如权利要求11所述的装置，其中所述装置额外包含捕获位点，其中多种结合所述分析物的捕获剂固定在所述捕获位点，和
其中将所述捕获位点和样品位点放置在允许样品位点与捕获位点之间的毛细管流动连通的位置。
13.一种检测分析物的试剂盒，所述试剂盒包含
(i)权利要求1-10中任一项所述的聚簇，或权利要求11或12所述的装置，和
(ii)如何使用试剂盒的信息和/或说明书。
14.一种检测液体样品中分析物的方法，所述方法包括
(a)使权利要求1-10中任一项所述的聚簇或权利要求11或12所述的装置接触液体样品，和
(b)测定分析物的存在，所述测定通过以下进行：
(i)目测颜色，和任选地，
(ii)检测发光。
15.一种通过权利要求12所述装置检测液体样品中分析物的方法，所述方法包括
(a)使液体样品接触所述样品位点，
(b)使液体样品流到所述捕获位点，
(c)测定捕获位点处分析物的存在，所述测定通过以下进行：
(i)目测颜色，和任选地，
(ii)检测发光。
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