CN106596785A

CN106596785A - 一种快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法

Info

Publication number: CN106596785A
Application number: CN201611205080.XA
Authority: CN
Inventors: 胡文彦; 杨军; 孙小杰; 王玉梅; 刘新梅
Original assignee: Nanjing Food And Drug Supervision And Inspection Institute
Current assignee: Nanjing Food And Drug Supervision And Inspection Institute
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及应用液相色谱串联质谱法快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法。五种毒素分别为恩镰孢菌素A、A1、B、B1，以及白僵菌毒素。本发明采用微波辅助分散固相萃取技术(MAE‑QuEChERS)提取样品，无需固相萃取柱净化，也不需要浓缩，可有效节约成本，提高效率。使用Agilent XDB C₁₈色谱柱进行分离，以乙腈和水溶液为流动相梯度洗脱，采用多反应监测(MRM)正离子模式检测，外标法定量。该方法快速、准确、有效，可操性强，可作为食品安全监管的有力手段推广使用，可在食品质量安全检测或出入境检验检疫中应用。

Description

一种快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法

一.技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及应用液相色谱串联质谱法快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法。

二.背景技术

霉菌毒素是一类由丝状真菌的次生代谢产物构成的毒性物质，由于它对人体的毒害性且近年来在食品和植物种子中频繁检出而引起世界的广泛关注。在农作物生长过程及后续储藏运输过程中，镰刀霉菌、麦角菌、曲霉菌、青霉菌及链格孢菌都可能产生霉菌毒素，而其中镰刀霉菌产生的毒素最为流行，在美洲、欧洲及亚洲农产品中普遍存在。

镰刀霉菌类至少包含100种以上的植物病菌，他们产生的毒素多数化学性质稳定，易残留于最终加工食品中，如我们熟知的脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)及伏马毒素(fumonisins)。国家标准《安全国家标准食品中真菌毒素限量》(GB2761-2011)虽对部分已知毒素的限量做了规定，但还远不能满足当前食品安全监管的需求。近年来，随着研究的不断深入，新兴的镰刀霉菌毒素(Emerging FusariumMycotoxins)不断被发现，其中最引人关注的为4种恩镰孢菌素(enniatin)A、A1、B、B1，以及白僵菌毒素(beauvericin)。文献资料表明这些物质均有不同的毒性，有些毒性甚至超过先前发现的其他毒素，且可能与其他毒素产生协同毒害作用。有国外学者曾对全球多个国家和地区的粮食进行该类毒素的筛查，发现潮湿气候的地区粮食中新兴镰刀霉菌毒素的检出率非常高。我国南方地区温暖潮湿，粮谷储存不当极易引起霉菌滋生，产生毒素。而到目前为止，国内并无公开的该类毒素的检测方法，更没有学者对国内生产的粮食作物及其深加工产品中的新兴镰刀霉菌毒素开展食品安全风险预警评估工作。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是采用串联液相色谱质谱联用法准确测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法。这5种镰刀霉菌毒素分别为恩镰孢菌素A、A1、B、B1，以及白僵菌毒素(以下简称ENA、ENA1、ENB、ENB1、BEA)。

本发明技术原理

首先，如何从粮谷中快速有效的将这5种真菌毒素快速提取出来，同时最大限度减低基质干扰。经过大量的试验筛选，本发明最终选择纯乙腈作为样品的提取溶剂，考虑到5种真菌毒素均为大分子低极性化合物，在乙腈溶液中的溶解性较好，且作为最终上机测试的溶液，与液相色谱流动相体系的兼容性较好，不需要做溶剂置换，造成损失。此外，因后续需要用C₁₈粉末吸附掉样品中的脂肪、色素及其他亲脂性杂质，选择这种比例的混合溶剂，可以最大限度的保留待测目标物，减少其在吸附剂上的死吸附，提高实验回收率。本发明中的前处理方法采用采用微波辅助分散固相萃取技术(microwave-assisted extraction，MAE-QuEChERS)，这样的前处理步骤实践证明其简单快速，而且成本低廉，非常适合在各个食品安全检测实验室推广应用。

其次，如何选择最优的色谱及质谱条件，使得在尽可能短的时间内对样品中的5种真菌毒素进行同时的分析，并产生最高的灵敏度。近年来，液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)在检测毒素的优势得到体现，因其采用选择离子监测技术.可大大提高检测的灵敏度和特异性，因此可以采用比传统方法更为简便的前处理技术，是同时检测多种毒素的理想方法。本发明在对5种真菌毒素的化学性质进行详细了解的前提下，不断优化仪器条件，最终选定的液相条件为采用流动相A为水，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min，流动相梯度洗脱程序为：B在5min内由20％线性升至80％，再于1min后回到20％，保持2min，选择离子丰度最高的子离子作为定量离子，选择丰度次高的子离子作为定性离子，使用外标法定量。

本发明的技术方案：

1.质谱参数的选择

所研究的目标物为真菌毒素，基于其化学结构属于离子载体型，易形成单价或二价态的离子。文献表明，流动相中提供的钠离子和氢离子易与目标物结合，形成[M+Na]⁺或者[M+H]⁺离子，当然如果我们额外加入铵盐，铵根离子则可能替换上述两种离子，成为最关键的待测离子。但实验表明，[M+NH₄]⁺的稳定性却不如[M+Na]⁺或者[M+H]⁺离子，后两者中，[M+H]⁺的响应值高于加钠离子，所以最终选择[M+H]⁺作为待监测的母离子。

在实验前采用系统的autotune功能对质谱系统各参数进行快速优化。5种真菌毒素的分子量在600-800之间，因此选择扫描范围m/z100-1000，断开色谱柱，进样器将标准溶液直接进质谱分析，同时采集正负离子信号，发现目标物在正离子模式下的响应值远大于负离子模式，该现象与其为离子载体型化合物相关。在做MRM测试中我们选择离子丰度最高的子离子作为定量离子，选择丰度次高的子离子作为定性离子，尽量不选择质核比在100以下的离子，以免流动相中的低分子量杂质对检测造成影响，最后对其裂解电压参数及碰撞电压进行优化，本发明中最终设定的质谱检测条件见表1。

2.色谱条件的选择

在对流动相进行优化时，首先比较了甲醇-水和乙腈-水两种体系，发现绝大多数化合物在乙腈-水体系中的响应较高。由于分析物较多，杂质比较复杂，因此流动相的比例选择上采用等度洗脱并不合适，选择采用梯度洗脱进行分析，不仅能缩短出峰时间，还能有效地去除色谱柱中残留的杂质。

一个合格的液质联用分析方法必须要良好的色谱分析条件为前提。5种毒素在反相色谱柱上的保留较强，且本实验前处理过程较为简单，需要较好的色谱分离条件作为补充。本实验采用梯度洗脱的方式不仅能使目标物与干扰组分完全分离，降低了基质影响，同时避免了连续进样过程中强保留物质的堆积效应。同时本次实验选择了填料粒径仅为2.1μm高分离度色谱柱，如果不冲洗彻底很容易造成堵塞，降低色谱柱的寿命。

在实验中把LC的管路调整为低延迟状态主要通过断开阻尼器与溶剂混合器来降低系统的死体积，这在低流量做梯度洗脱时非常有用。

3.前处理条件的优化

选择提取的体积与提取溶剂的性质尤为关键，我们在实验设计中选择了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、以及甲醇-水、乙腈-水的混合体系进行测试。结果表明，用甲醇提取的方式，5种毒素的回收率都能达到70％以上，而用甲醇-水或乙腈-水的混合体积进行提取，不仅回收率达不到要求，而且因为水的加入，导致后期浓缩步骤难度很大。实验表明，使用纯乙腈进行提取，回收率最高，所有毒素均能达到88～102％的回收率水平。由此可见，选择乙腈作为提取溶剂是最有效的。接着我们测试了不同体积的提取液对检测结果的影响，选择30mL、50mL、70mL共3种不同体积的乙腈进行提取，发现30mL的溶剂平均提取平均回收率为70～90％，选择50mL或70mL的平均回收率均大于70％，且比较接近，基于成本考虑，最终选择30mL乙腈作为提取溶剂。ENA1的沸点只有66-67℃，因此选择浓缩的温度时必须在此温度范围以下，防止其挥发损失。在提取方式上，比较了超声、涡旋及手振摇的方式，发现超声提取的效果要优于涡旋或手工振摇。初步选定超声提取方式后，对超声的时间的功率进行了考察，依次选择2min、5min、10min的超声提取时间以及250W、500W及1000W的提取功率，采用双变量正交实验设计，结果表明250W的功率下提取2min能最大程度保证提取的效率。

QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Rugged，Safe)的提取方法最早主要用于农残测试，其原理是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。由于其具备简便、快速、可塑性强等优点，近年来逐渐广泛运用于各种检测领域，其中也包括真菌毒素的分析。本发明采用了改进的QuEChERS方法，在对氯化钠和C₁₈吸附粉末的加入量以及提取步骤上做了相应的调整，对氯化钠和C₁₈吸附剂的量进行梯度优化，最终选择1g的NaCl和0.5g的C₁₈粉末可以明显降低基质干扰，取代繁琐的固相萃取过程。

实验证明，采用乙腈提取，微波辅助分散固相萃取法净化的方法，高效，结果准确，不需要再通过其它复杂的净化过程，更不需要浓缩即可上机测试，非常适用于食品安全监管中的快速检测。

4本发明所述一种快速液相串联质谱联用测定方法，由以下步骤构成：

(1)采用微波辅助分散固相萃取技术(MAE-QuEChERS)提取样品，具体步骤为：准确称取5g均化后的样品于50mL离心管中，加入30mL乙腈，于超声提取仪中提取2min，再加入1gNaCl，0.5g的C₁₈粉末，拧紧盖子，上下振摇30次，取出于离心机中以5000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜后上机测试；

(2)液相色谱柱为Agilent XDB C₁₈柱(2.1×50mm，1.8mm)，柱温35℃，进样量1μL，流动相A为水，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min，流动相梯度洗脱程序为：B在5min内由20％线性升至80％，再于1min后回到20％，保持2min；

(3)质谱电离模式：ESI(+)，毛细管电压3500v，干燥气温度320℃，干燥气流速9.0L/min，雾化气压力40ps，其余参数通过仪器自动调谐至最优化，选择多反应监测模式。

本发明与现有技术相比其有益效果是：

超高效液相-串联质谱法(UPLC-MS/MS)具有高灵敏度、高分离度的特点，在痕量物质分析、食品非法添加物检测领域具有独特的优势。本发明首次建立了粮谷中5种镰刀菌毒素的HPLC-MS/MS快速检测方法，该方法快速、准确、有效，可操性强，可作为食品安全监管的有力手段推广使用。该方法的建立将在很大程度上有效控制粮食质量，保证广大群众的食品安全。本发明准确、科学、有效，在实际工作中具有很大意义，可在食品质量安全检测或出入境检验检疫中应用。

四.附图说明

图1加标样品多反应监测(MRM)色谱图

五.具体实施方式

1.样品提取与净化。准确称取5g均化后的样品于50mL离心管中，加入30mL乙腈，于超声提取仪中250W功率下提取2min，再加入1gNaCl，0.5g的C₁₈粉末，拧紧盖子，上下振摇30次，取出于离心机中以5000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜后上机测试；

2.色谱与质谱条件

色谱条件

液相色谱柱为Agilent XDB C₁₈柱(2.1×50mm，1.8mm)，柱温35℃，进样量1μL，流动相A为水，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min，流动相梯度洗脱程序为：B在5min内由20％线性升至80％，再于1min后回到20％，保持2min；加标样品测试谱图见附图1。

质谱条件

质谱电离模式：ESI(+)，毛细管电压3500v，干燥气温度320℃，干燥气流速9.0L/min，雾化气压力40ps，其余参数通过仪器自动调谐至最优化，选择多反应监测模式。具体参数见表1。

表1质谱检测条件

3.标准曲线的建立

分别准确称取5种真菌毒素标准物质约10mg，用少量乙腈溶解后，定容到100mL量瓶中，此标准储备液浓度为100μg/mL。

将5种真菌毒素标准储备液用空白基质溶液稀释成0.1、0.5、2.0、5.0、10.0μg/mL五个不同浓度的标准工作液，将标准工作液上机测试，外标法定量，建立响应值与浓度的线性拟合方程。

空白基质溶液为不含5种真菌毒素的空白样品，按照方法规定的要求进行提取，所得到的乙腈溶液。

4.检出限(LOD)和定量限(LOQ)

以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比作为定量限。ENA、ENA1、ENB、ENB1，以及BEA的LOD及LOQ分别为：0.015/0.03，0.21/0.42，0.20/0.40，0.56/1.12以及0.50/1.0μg/kg。

Claims

1.一种快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法，其特征是液相串联质谱联用测定方法，由以下步骤构成：

(1)采用微波辅助分散固相萃取技术MAE-QuEChERS提取样品，具体步骤为：准确称取5g均化后的样品于50mL离心管中，加入30mL乙腈，于超声提取仪中提取2min，再加入1gNaCl，0.5g的C₁₈粉末，拧紧盖子，上下振摇30次，取出于离心机中以5000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜后上机测试；

(2)液相色谱柱为Agilent XDB C₁₈柱2.1×50mm，1.8mm，柱温35℃，进样量1μL，流动相A为水，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min，流动相梯度洗脱程序为：B在5min内由20％线性升至80％，再于1min后回到20％，保持2min；

2.根据权利要求1所述一种快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法，其特征是镰刀霉菌毒素为恩镰孢菌素A或恩镰孢菌素A1或恩镰孢菌素B或恩镰孢菌素B1，或白僵菌毒素。

3.权利要求1所述一种快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法在食品质量安全检测或出入境检验检疫中的应用。