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CN106574927A - 使用luterial的形态学特征筛选癌症预防剂或抗癌剂的方法 - Google Patents

使用luterial的形态学特征筛选癌症预防剂或抗癌剂的方法 Download PDF

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CN106574927A CN201580008493.6A CN201580008493A CN106574927A CN 106574927 A CN106574927 A CN 106574927A CN 201580008493 A CN201580008493 A CN 201580008493A CN 106574927 A CN106574927 A CN 106574927A
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cancer
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崔彰训
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Abstract

本发明涉及用于筛选抗癌剂或癌症预防剂的方法，其包括步骤：(a)从提取自患者或正常人的体液分离突变的Luterial或正常的Luterial；(b)用抗癌剂候选物或癌症预防剂候选物处理分离的突变体Luterial；且(c)当用候选物处理时，相比对照突变体Luterial，选择减少突变体Luterial的大小或变化突变体Luterial的形状或增加突变体Luterial的移动性的候选物作为抗癌剂，或者当用候选物处理时，相比对照Luterial，选择抑制Luterial的大小增加、最小化Luterial的形状变化或维持Luterial的移动性的候选物作为癌症预防剂。

Description

使用LUTERIAL的形态学特征筛选癌症预防剂或抗癌剂的方法
技术领域
本发明涉及基于Luterial的形态学特征筛选抗癌剂的方法，且更具体地，涉及基于与对照突变体Luterial或用抗癌剂或癌症预防候选物处理前的Luterial相比，抗癌剂或癌症预防候选物的诱导突变体Luterial的大小、形状或移动性的变化或者抑制Luterial的大小、形状或移动性的变化的能力来筛选并选择抗癌剂或癌症预防候选物的方法。
背景技术
癌症是危及人类健康的主要疾病之一，且是其中细胞通过一系列突变过程以无限制的和不可控制的方式增殖的疾病。已鉴定了与癌症相关的多种生化机制，且在过去十年已建立了用于癌症检测和大规模筛查的改进的方法。尽管有所改进，但用于从根本上治愈癌症的方法有待提出。具体地，用于晚期癌症(terminal cancer)的治疗至今仍非常有限。
随着多种抗癌剂的持续开发和临床应用，其抗癌治疗效果也有所增加。然而，多种癌症治疗的响应率仍不足，且由于该原因，即使将相当数量的癌症患者暴露至具有非常强细胞毒性的抗癌剂，缓解症状或延长癌症患者生存期(life span)的效果较低。为改善目前的状况，需要搜索更好的抗癌剂和用于癌症有效治疗的标准方法。
在这种情况下，已作出努力以通过鉴定与癌症相关的多种生物分子并筛选能够靶向这些分子的药物来开发抗癌剂。抗癌剂筛选是其中对抗癌剂候选物(如合成的化合物或天然物质)的治疗活性和细胞毒性进行评估的过程。
具体而言，抗癌剂筛选可指一系列过程，其中在用多种抗癌剂处理的样品和未处理样品之间对培养中的癌细胞的死亡或抑制增殖的效果进行比较。由此发现最理想的抗癌剂或选择出确信无效果的抗癌剂，且还测量了暴露至抗癌剂的癌细胞的死亡或增殖抑制的程度。
作为常规的体内筛选方法，可使用肾下被膜(subrenal capsule)测定法：从患者提取肿瘤组织；将提取的肿瘤组织切割成小尺寸；将切割的组织移植入小鼠的肾下被膜；用抗癌剂治疗小鼠；并测量移植的肿瘤的大小变化。然而，该方法对于筛选大数目的抗癌剂具有效率低下的缺点，这是由于对抗癌剂的剂量和注射频率依赖性效果的筛选需要长时间来进行。
此外，体外筛选方法包括：从癌症组织分离细胞；用抗癌剂处理分离的细胞；培养处理的细胞；并确定细胞是否死亡或细胞的增殖是否受到抑制。
为了基于从上述方法获得的实验结果筛选合适的抗癌剂，需要对抗癌剂的响应和实验结果进行分析的方法。具体地，可实施与之前建立的体外数据的比较，所述数据包括检查细胞死亡率(或增殖抑制率)、IC50、化学敏感性指数、抗癌剂反应性数据库中反应性的相对分布等。
通过该方法，确信具有效果的抗癌剂可与确信无效果的抗癌剂进行区分，且准确性可通过重复该方法增加。
在该语境中，本发明人发现：可通过观察提取自患者的体液中存在的微物质(micro-substance)的特征来诊断和预测疾病。该发现的内容在2014年1月14日提交用于专利申请(PCT/KR2014/00393)。本发明人将该微物质命名为"Luterial"。
此外，本发明人开发了能够有效分离从患者或正常人提取的体液中存在的微物质Luterial的方法并表征了分离的Luterial。该开发和表征的内容于2014年5月9日提交用于专利申请(PCT/KR2014/004197)。
Luterial与外来体或微泡不同在于其包括DNA和RNA两者且是粘附和移动的(图1)。在哺乳动物(包括人)的情况中，由本发明人命名的Luterial存在于血液、唾液、淋巴管、精液、阴道流体、母乳(特别是初乳)、脐带血、脑细胞、脊髓和骨髓中。此外，存在于植物中的Luterial样物质称为“Luterion”，且推测体液如血液中发现的Luterial的来源为来自干细胞或红细胞或来自植物来源的Luterion的摄入(图2)。
Luterial具有下列特征：(1)其为细胞或细胞样结构，具有对应原核和真核之间的中间阶段的那些的融合特征；(2)其存在于体液中，包括血液、精液、肠液、唾液、细胞流体等；(3)其在荧光测试中显示与Janus绿B、吖啶橙和罗丹明123的阳性染色反应；(4)在最佳环境中(pH 7.2-7.4)，其具有表达与β-变形菌和γ-变形菌同源的基因的性质且具有30-800nm的大小；(5)在酸性环境中，其不仅表达与β-变形菌和γ-变形菌同源的基因，还表达真核基因(特别是链型植物(Streptophyta)基因)，且生长至400-2000nm或更大的大小；(6)在正常条件下其参与ATP生成；且(7)其为不同于线粒体且完全不同于外来体的细胞样结构(PCT/KR2014/004197)。
在哺乳动物(包括人)的情况中，Luterial存在于血液、唾液、淋巴管、精液、阴道流体、母乳(特别是初乳)、脐带血、脑细胞、血细胞、干细胞、脊髓和骨髓。此外，在有角动物的情况中，Luterial还存在于角中(PCT/KR2014/00393)。
正常的Luterial具有50-800nm的大小，且通过融合形成的突变体Luterial具有数十微米的大小。术语“Luterial”可指包含mRNA、miRNA和DNA的原线粒体。Luterial的独特在于其不溶于消化流体并浸润入血液(PCT/KR2014/004197)。
预期Luterial不仅与信号转导、细胞分化和细胞死亡相关，其还与细胞周期和细胞生长的调节相关。本发明人已发现Luterial与癌症诊断密切相关(PCT/KR2014/00393)。
本发明已发现：使用此Luterial或其突变体，能够通过促进Luterial正常状态的维持或通过抑制、减少或恢复Luterial的异常状态而从候选物中筛选并鉴定预防或治疗癌症的作用剂，由此完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供通过使用在癌症患者中特异性发现的突变体Luterial(作为癌症标记物或癌症治疗的靶标)筛选用于癌症的预防和治疗的抗癌剂的方法。
技术方案
为实现上述目标，本发明提供用于筛选抗癌剂的方法，其包括步骤：
(a)从提取自患者的体液分离突变体Luterial；
(b)用抗癌剂候选物处理分离的突变体Luterial；且
(c)相比未用候选物处理的对照突变体Luterial，选择使突变体Luterial的大小减少、形状改变或移动性增加的候选物作为抗癌剂。
本发明还提供用于筛选癌症预防剂的方法，其包括步骤：
(a)从提取自正常人的体液分离正常Luterial；
(b)在癌症预防剂候选物存在下培养分离的正常Luterial；且
(c)相比未用候选物处理的对照Luterial，选择使Luterial的大小增加受到抑制、形状变化最小化或移动性维持的候选物作为癌症预防剂。
附图简述
图1显示了用光学显微镜(SR-GSD或CLSM)或电子显微镜(SEM或TEM)观察正常Luterial的结果。
图2示意性显示了Luterial的生命周期。
图3是显示与Luterial相关的癌症产生机制的示意图。
图4是鞭毛状Luterial的暗视野显微镜图像。
图5是微管Luterial的暗视野显微镜图像。
图6是块状Luterial的暗视野显微镜图像。
图7是棒状Luterial的暗视野显微镜图像。
图8是源自4期肺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图9是源自肺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图10是源自3b期肺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图11是源自肺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图12是源自具有转移至脑的非小细胞肺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图13是源自具有转移至锁骨上淋巴结和肝的肺癌(鳞状细胞癌)患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图14是源自具有转移至骨的肺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图15是源自肺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图16是源自肺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图17是源自胰腺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图18是源自具有转移至肝的胰腺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图19是源自具有转移至子宫的结直肠癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图20是源自具有转移至肝和肺的结直肠癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图21是源自具有转移至肝、肺和脑的结直肠癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图22是源自具有转移至肝的结直肠癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图23是源自具有转移至肺的肝癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图24是源自具有肝的血管肉瘤的患者的Luterial的共聚焦激光扫描显微镜图像。
图25是源自具有晚期胆囊癌的患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图26是源自具有转移至骨的前列腺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图27是源自具有前列腺癌的患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图28是源自3期乳腺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图29是源自3b期乳腺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图30是源自具有甲状腺乳头状癌(thyroid papillary cancer)的患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图31是源自肾癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图32是源自胃癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图33是源自胃癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图34是源自3b期乳腺癌患者的Luterial的暗视野显微镜图像。
图35是来自正常人血液的Luterial(阶段1)的暗视野显微镜图像。
图36显示了当用从漆树分离的Luterion(候选物)处理时突变体Luterial大小或形状的改变或移动性的恢复。
(a)：用候选物处理前；(b)：用候选物处理30分钟；和(c)：用候选物处理1小时。
图37显示了当用从连翘分离的Luterion(候选物)处理时突变体Luterial大小或形状的改变或移动性的恢复。
(a)：用候选物处理前；(b)：用候选物处理30分钟；和(c)：用候选物处理1小时。
图38显示了当用从茯苓分离的Luterion(候选物)处理时突变体Luterial大小或形状的改变或移动性的恢复。
(a)：用候选物处理前；(b)：用候选物处理30分钟；和(c)：用候选物处理1小时。
图39显示了当用从当归根分离的Luterion(候选物)处理时突变体Luterial大小或形状的改变或移动性的恢复。
(a)：用候选物处理前；(b)：用候选物处理30分钟；和(c)：用候选物处理1小时。
图40显示了当用从奇异果分离的Luterion(候选物)处理时突变体Luterial大小或形状的改变或移动性的恢复。
(a)：用候选物处理前；(b)：用候选物处理30分钟；和(c)：用候选物处理1小时。
图41显示了当用源自漆树的Luterion(a)、源自连翘的Luterion(b)、源自茯苓的Luterion(c)、源自当归根的Luterion(d)和源自奇异果的Luterion(e)处理癌细胞系时，抑制AsPC-1(胰腺癌细胞系)增殖的分析结果。
图42显示了当用源自漆树的Luterion(a)、源自连翘的Luterion(b)、源自茯苓的Luterion(c)、源自当归根的Luterion(d)和源自奇异果的Luterion(e)处理癌细胞系时，抑制A549(肺癌细胞系)增殖的分析结果。
图43显示了当用源自漆树的Luterion(a)、源自连翘的Luterion(b)、源自茯苓的Luterion(c)、源自当归根的Luterion(d)和源自奇异果的Luterion(e)处理癌细胞系时，抑制BT-20(乳腺癌细胞系)增殖的分析结果。
用于实施本发明的最佳模式
除非另外表明，本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所通常理解的相同的含义。一般而言，下文所述的本文使用的命名法和实验方法为已知并在本领域中通常采用的那些。
通过本发明人命名的如本文使用的术语"Luterial"和“Luterion”指分别存在于动物和植物中的活生物体或颗粒，和具有与约500nm的病毒大小(50-500nm(正常分裂阶段)/800nm或更大(异常融合阶段))相似的大小范围的大小的精细物质。
在本发明中使用的Luterial和Luterion与外来体或微泡不同之处在于其包括DNA和RNA且为运动和粘附的。已知线粒体可通过Janus绿B和荧光染料(包括罗丹明123、Mitotracker、吖啶橙和DAPI)染色，且发现Luterion也可通过与用于线粒体的那些相同的染料染色。与线粒体一样，Luterion具有多重环样膜而无内嵴(cristae)结构，且在用于线粒体的相同激光波长范围观察。在该方面，Luterion还可称为"假线粒体"、"线粒体类似物"或"原线粒体"。
在哺乳动物(包括人)的情况中，称为“Luterial”的物质存在于血液、唾液、淋巴管、精液、阴道流体、母乳(特别是初乳)、脐带血、脑细胞、红细胞、干细胞、脊髓和骨髓中。此外，称为“Luterion”的物质存在于植物中。在植物的情况中，Luterion大量存在于茎部分。
正常的Luterial和Luterion具有50-200nm的大小，且通过融合形成的突变体Luterial和Luterion具有数十微米的大小。术语“Luterial”和“Luterion”可指包含mRNA、miRNA和DNA的原线粒体。Luterial和Luterion特别之处在于其不溶于消化流体且浸润入血液。预期Luterial和Luterion不仅与信号转导、细胞分化和细胞死亡相关，还与细胞周期和细胞生长的调节相关。本发明人发现Luterial与癌症的诊断密切相关(PCT/KR2014/00393)。
正常的Luterial和Luterion预期发挥功能以预防癌细胞生长并使细胞回到健康免疫状态，且其功能推测通过起作用以标准化基因的其RNAi(RNA干扰)活性来实施。
在正常Luterial和Luterion中，具有200nm或更小尺寸的Luterial，例如50-150nm预期发挥功能以预防癌细胞的生长并使细胞回到健康免疫系统，且其功能通过具有标准化基因的潜力的RNAi(RNA干扰)来实施。当健康人或动物的血液中的RNA中的信息系统偏离正常状态并指导产生引起异常疾病的蛋白时，正常Luterial会有意地干扰信息系统从而抑制疾病如癌症的发生/发展(development)。当Luterial生长至200-500nm或更大的大小时，其还会参与能量代谢，且当用具有某些波长的光照射Luterial时，其会发挥功能以响应地放大光能量并会像叶绿素般起作用。因此，如果Luterial不履行正常功能，其可引起稳态(hemeostasis)和ATP产生中的严重病症并可引起呼吸和能量代谢中的疾病。
发现了Luterial具有如下特征：
(a)正常状态中；其具有小于红细胞的大小(50-200nm)，为圆形或椭圆形，且是移动的。
(b)其包含核酸；
(c)其在荧光染色测试中显示与线粒体相似的反应；
(d)其经历融合和/或分裂；
(e)其无融合时生长至300nm的大小、生长成包含DNA的假线粒体，且在SEM或TEM图像中显示与线粒体相似的结构；
(f)其存在融合时生长至数千nm的大小；
(g)源自患者的Luterial具有的大小(大直径：500nm或更多)大于源自健康人的Luterial且发生突变以形成具有非均匀形态学的突变体Luterial；且
(h)其显示不同于外来体的光反应。
此外，Luterial可具有一种或多种下列特征：
(i)其自发荧光；
(j)其产生200-400nm大小的ATP；
(k)其是粘附的；
(l)其具有多重环样膜结构；
(m)突变体Luterial在某些环境中破裂且在破裂后具有干性(stemness)；
(n)其具有调节p53基因和端粒的功能；且
(o)其具有CD39或CD73的表面抗原。
反之，如上文所述不能实施正常功能的来自癌症患者的Luterial显示不同于正常Luterial的现象和特征，且具有多种大小和形状(图2和3)。具体地，正常Luterial在其形成双孢子后停止生长，但在从癌症患者或具有慢性疾病的患者排出的体液中发现的突变体Luterial具有无限生长的特征，与干细胞相似，且因此具有800nm-200μM(200,000nm)或甚至更大的尺寸范围(PCT/KR2014/00393)。为将这些Luterial与正常Luterial加以区分，将这些Luterial称为“突变的Luterial”、“Luterial突变体”或"突变体Luterial"。
与此同时，从人或动物分离的Luterial在观察中具有难度，这是由于其在体外迅速解体或改变形状。此外由于正常Luterial在异常环境下在24小时内形态上变为突变体Luterial，这使精确诊断或治疗疾病更加困难。
然而，与源自血液的Luterial不同，源自植物的Luterion具有甚至在室温也不迅速解体以及即使长时间保存也不会通过融合而突变的性质。此外，Luterion可与源自患者血液的突变体Luterial反应从而抑制Luterial的生长，这导致Luterial融合的阻断。此外，Luterion可抑制源自患者血液的Luterial的成熟，由此防止Luterial通过融合而突变或生长。
由于源自植物的Luterion具有RNAi功能，预期该功能的使用可抑制或防止源自具有特定疾病患者的Luterial的突变或生长，这意味着Luterion可用作用于治疗或预防特定疾病的作用剂。
本发明的步骤(a)从提取自患者或健康人的体液分离Luterial。“提取自患者的体液”指示血液、唾液、淋巴管、精液、阴道流体，母乳(特别是初乳)、脐带血、脑细胞、红细胞、干细胞、脊髓或骨髓，但不限于此。
“癌症”在本文优选选自如下疾病组：脑癌、头颈癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、小肠癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌，但不限于此。
在一种方法中，Luterial可通过下述步骤分离自癌症患者的血液。
(1)去除血小板和源自血液的物质，所述物质具有大于来自血液的血小板的大小；(2)在去除血小板和具有大于血小板大小的源自血液的物质后离心血液级分；(3)通过收集从离心获得的上清来分离Luterial；和(4)洗涤分离的Luterial。
具体地，步骤(1)可包括使从患者收集的血液通过具有0.8-1.2μm孔径的过滤器并去除未滤过的物质的步骤。步骤(2)可包括以1,200-5,000rpm重复离心血液5-10分钟以去除一般的微泡如外来体并回收上清的步骤。步骤(3)可包括将从步骤(2)回收的上清暴露至红外光并通过移液分离移动的Luterial(其朝光聚集)的步骤。Luterial是自发荧光并移动的，且因此在其暴露至红外光后，上清中的Luterial颗粒可通过对在暗视野显微镜或共聚焦显微镜下观察到的Luterial移液(pipetting)而被分离。步骤(3)中分离的Luterial可穿过具有50nm孔径的过滤器，且未滤过的部分可用PBS洗出。由于Luterial具有50nm或更大的大直径，小于Luterial的源自血液的微物质可通过上述步骤去除。可获得具有50-800nm大直径的Luterial，并通过暗视野显微镜或共聚焦显微镜观察。获得的Luterial可根据其大小通过顺序使用200nm、400nm、600nm、800nm和1000nm过滤器分成50-200nm(发生期)/200-400nm(成熟期)/400-600nm(有丝分裂期)/600-800nm(超过有丝分裂期)/800nm或更大(突变体)。
另一方法中，可将具有特异性结合Luterial表面抗原的固定化抗体的颗粒添加至血液以诱导Luterial和颗粒间的结合，且可回收并分离与颗粒结合的Luterial。本文中，Luterial表面抗原是CD39或CD73，且Luterial可通过下述获得：添加固定化于磁性颗粒的抗CD39或抗CD73抗体，并通过使用磁体(应用磁性)仅分离Luterial结合的颗粒，且随后回收Luterial(韩国专利申请号10-2015-0004287)。
健康人中的正常Luterial仅形成双孢子(分裂)，但具有慢性疾病或癌症的患者中的Luterial(突变体Luterial)具有下述特征：融合、彼此凝结或破裂以与细胞如红细胞或癌细胞粘附由此异常地增加其大小。突变体Luterial高度粘附，因此融合通过上述周期加速，由此增加其大直径和/或小直径的尺寸至约800nm或更大，且任何这样的突变体Luterial还可具有200μm(200,000nm)或更大的大小。
步骤(b)是用抗癌剂或癌症预防候选物处理从提取自患者的体液分离的突变体Luterial或提取自健康人的Luterial的步骤。
在一个实例中，候选物可以是维持Luterial的正常状态或将Luterial的异常状态恢复至正常状态的作用剂的集合。候选物可以是选自下组的一种或多种：天然提取物、源自食物或植物的Luterion、RNAi、适体和化合物，但不限于此。
候选物可以是例如过敏原去除的漆树提取物或过敏原去除的漆树提取物和多种其他食物或药用植物提取物的组合。具体地，候选物可以是来自过敏原去除的漆树的包含Luterion的提取物。
过敏原去除的漆树提取物可通过下述获得：收获漆树树皮，并在高于大气压0.01-1atm的压力、25-100℃的温度和25-100％(v/v)的氧气浓度加热收集的漆树从而防止由漆树毒性导致的过敏。
除过敏原去除的漆树提取物外，其他食物或药用植物提取物或其级分可根据已知的方法获得，并与过敏原去除的漆树提取物以相同的比率混合。
在一个实例中，候选物可选自RNAi(miRNA或siRNA)、源自食物或植物的Luterions和适体。具体地，其可为针对表达于癌细胞中的特征性miRNA的RNAi分子。源自食物或植物的Luterion是包含于具有50-500nm大直径和/或小直径的Luterion中以呈现RNA干扰的RNAi分子。例如，源自食物或植物的Luterion可为包含于源自食物或药用植物如漆树的Luterion中的RNAi分子。
miRNA，一种21-25个核苷酸单链非编码RNA分子，其控制真核细胞中基因的表达。已知miRNA与一些基因的mRNA3'非翻译区(UTR)结合以抑制基因的翻译。实际上，在动物中研究的miRNA减少蛋白的表达而不影响一些基因的mRNA水平。miRNA与RISC(RNA诱导的沉默复合物)连接以与一些mRNA互补结合，但miRNA的中心区维持错配，因此与常规siRNA不同的是，miRNA不降解mRNA。与动物miRNA不同的是，食物或植物miRNA完全匹配其靶mRNA以诱导mRNA降解，由此诱导RNA干扰。
siRNA在RNA干扰(RNAi)途径中发挥一定的作用，特别是作为通过双链RNA(dsRNA)刺激的序列特异性RNA降解过程的RNA沉默途径。siRNA源自具有诱导沉默的小3'-悬突的较长dsRNA前体。其作为指导靶RNA降解的向导发挥作用。
术语“源自食物或药用植物的Luterion”意为使用与用于分离自血液的Luterial相似的方法从包含Luterion的食物或植物提取物分离的一种。由本发明人命名的术语"Luterion"指植物或食物中存在的活生物体，意指具有与病毒相似的大小至约500nm(50-500nm(正常分裂阶段)/800nm或更大(异常融合阶段))的大小范围的精细物质。
Luterion与外来体或微泡不同之处在于其包含DNA和RNA且是移动和粘附的。已知线粒体通过Janus绿B和荧光染料(包括罗丹明123、Mitotracker、吖啶橙和DAPI)阳性染色。Luterion也可通过与用于线粒体的染料相同的那些阳性染色。Luterion具有多重环样膜结构但无内嵴结构。其在与用于线粒体的相同激光波长范围观察。为此，Luterion还可称为"假线粒体"、"线粒体类似物"或"原线粒体"。
与源自血液的Luterial不同的是，源自食物或植物的Luterion甚至在室温短时间内也不溶解或消失，且即使保存长时间也不通过融合而突变。此外，Luterion可与源自患者血液的Luterial反应以抑制Luterial的生长从而Luterial的融合将不再发生。此外，Luterion可抑制源自患者血液的Luterial的成熟由此防止Luterial通过融合而突变或生长。
相信源自食物或植物的Luterion的抑制功能可归因于Luterion的RNAi功能。因此，预期该RNAi功能的使用可抑制或防止源自具有特定疾病的患者的Luterial的突变或生长，表明Luterion可用作用于治疗或预防特定疾病的作用剂。
源自食物或植物的Luterion具有1或更低的密度，其高于脂肪和脂质，且低于蛋白。因此，其可通过蒸汽蒸馏过程从植物分离，但不限于此。
例如，源自食物或植物的Luterion可通过包括下列步骤的方法分离：
(a)将溶剂添加至食物或植物，并在50-90℃的温度使用空气或氧气以间歇鼓泡振荡溶液；(b)捕获通过摇晃生成的蒸汽或气体，并冷却捕获的蒸汽或气体以获得冷凝物；(c)通过具有0.8-1.2μm孔径的过滤器过滤冷凝物；(d)离心冷凝物；并(e)从离心的上清分离源自食物或植物的Luterion(韩国专利申请号10-2015-00001195)。
在一些情况中，可将具有与Luterial表面抗原特异性结合的固定化的抗体的颗粒添加至包含Luterion的食物或植物提取物以诱导Luterial和颗粒之间的结合。与颗粒结合的Luterial可回收或分离。本文中，Luterial表面抗原是CD39或CD73，且Luterial可通过下述获得：将特异性结合每种抗原的抗CD39或抗CD73抗体固定化至磁性颗粒，并通过使用磁体(应用磁性)仅分离Luterial结合的颗粒，然后回收Luterial(韩国专利申请号10-2015-0004288)。
通过上述步骤，可分离具有50-80nm的大直径/或小直径的响应于IR光的移动的Luterion。Luterion的移动性可通过暗视野显微镜或共聚焦显微镜观察。
通过上述步骤获得的源自食物或植物的Luterion可通过暗视野显微镜或共聚焦显微镜观察。获得的Luterion可根据大小通过顺序使用200nm、400nm、600nm和800nm的过滤器分成50-200nm(发生期)/200-400nm(成熟期)/400-600nm(有丝分裂期)/600-800nm(超过有丝分裂期)。
通过上述方法分离的源自食物或植物的Luterion具有如下特征：
(a)其具有50-800nm的大直径和/或小直径，为圆形或椭圆形，且是移动的；
(b)其包含核酸；
(c)其在荧光染色测试中显示与线粒体相似的反应；
(d)其经历融合和/或分裂事件；
(e)其无融合时生长至500nm大小、生长成包含DNA的假线粒体，且在SEM或TEM图像中显示与线粒体相似的结构；
(f)其显示不同于外来体的光反应；且
(g)其在IR照射过程中生产分裂。
在一些情况中，Luterion可具有一种或多种下列特征：
(i)其自发荧光；
(j)其产生200-400nm的大直径和/或小直径大小的ATP；
(k)其是粘附的；
(l)其在与源自血液的Luterial反应时抑制源自血液的Luterial的融合或促进分裂；且
(m)其具有CD39或CD73的表面抗原。
源自食物或植物的Luterion可分为下列四类并保存：50-200nm；200-400nm；400-600nm和600-800nm。分离Luterion后，由于Luterion可在长期保存过程中溶解或变形因此需要小心注意。当Luterion要长时间保存时，优选在短时间内冷却至-80℃或更低并保存。当Luterion要在活的状态短时间保存时，优选在约4℃在0.5％盐水中保存同时将其以30cm的距离暴露至低温IR。当其要短时间保存时，可将其保存在PBS溶液中且还可在氮气下保存。在一些情况中，源自食物或植物的Luterion可在一种或多种选自如下的防腐剂的存在下保存：类黄酮漆黄素(flavonoid fisetin)、紫铆因(butein)和硫黄菊素(sulfuretin)。
在一些情况中，源自植物的Luterion可在液体中于18-30℃培养，同时将其暴露于IR光。可替换地，具有400-800nm的大直径和/或小直径的源自植物的Luterion可在液体中于18-30℃培养(优选20-25℃)同时将其暴露至IR光，由此诱导源自植物的Luterion的分裂。在温育过程中使用的液体可为盐水或PBS，但不限于此。源自植物的Luterion在培养前可根据上述分离方法获得，且可具有50-500nm的大直径和/或小直径。根据本发明的培养方法培养的源自植物的Luterion在培养后可具有300-500nm的大直径和/或小直径。培养时，可控制Luterion的大小以在用显微镜观察下具有500nm或更小的大直径和/或小直径。完成培养后，Luterion可根据大小分类，冷却并在-80℃保存。可替换地，其还可在氮气下保存或在大于零的温度保存。对于保存，可将防腐剂添加至Luterion。
由于Luterion存在于全部植物中，植物不受限制。优选地，选自表1-4所示的那些的药用植物可用于本发明。由于认为Luterion在植物的茎中大量分布，优选从茎部分离Luterion。
表1
表2
表3
表4
适体是显示与分子通过除传统的Watson-Crick碱基配对外的相互作用的高特异性结合亲和力的核酸分子。适体可特异性结合所选靶标以调节靶标的活性。例如，靶标的活性可通过适体结合阻断。具有10-15kDA(30-45核苷酸)大小的适体可以纳摩尔亲和力或更低与其靶标结合，且可在密切相关的靶标间加以区分。
在本发明中使用的候选物可从合成或天然化合物的文库获得。用于获得化合物的文库的方法也有所记载，其可从Brandon Associates(Merrimack,NH)和Aldrich Chemical(Milwaukee,WI)商业获得。细菌、真菌、食物、药用植物和动物提取物的天然化合物的文库可从多个来源商业获得，包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、Harbor BranchOceangraphics Institute(Ft.Pierce,FIa.)和PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,Mass.)。
步骤(c)是相比未用候选物处理的对照，选择减少突变体Luterial的大小、改变突变体Luterial的形状或增加突变体Luterial的移动性的候选物作为抗癌剂的步骤。可替换地，步骤(c)是相比未用候选物处理的对照，选择抑制Luterial大小的增加、最小化Luterial的形状变化或维持Luterial的移动性的步骤。
在其形成双孢子后，正常Luterial不再生长(图35)，但在癌症患者血液中发现的突变体Luterial具有无限生长的特征，与干细胞相似，且因此具有800nm或更大至200μm(200,000nm)或更大的大小。此外，癌症患者血液中突变体Luterial的移动性显著慢于正常Luterial。该Luterial的移动性可通过测量Luterial的纳米追踪速度而量化。
在一个实例中，可将相比未处理的对照突变体Luterial，减少突变体Luterial的大小的候选物选作抗癌剂。在步骤(c)中，癌症患者的突变体Luterial在无抗癌剂候选物时贯穿变形聚集物的形成具有异常融合，引起其大小大于正常Luterial。然而，当Luterial的融合通过抗癌剂候选物的存在而被抑制从而减少大小时，可将候选物选作抗癌剂。
在步骤(c)中，无抗癌剂候选物时，源自癌症患者的突变体Luterial可具有例如约1000nm-3500nm(多至200μm)的大直径和/或小直径。然而，用候选物治疗后30分钟或更久(优选1小时或更久)，相比未用候选物治疗的对照，Luterial的尺寸可减少至200-2,000nm的大小。
此外，当突变体Luterial的大小减少至用候选物处理前测量的对照突变体Luterial直径的约70％或更小时，可将候选物选作有效的抗癌剂。例如，用候选物处理30分钟(优选1小时或更久)后，当突变体Luterial减少至对照突变体Luterial的大直径和/或小直径的10-70％时，可将该候选物选作有效的抗癌剂。在本发明的测试实施例1中，发现了在用作为抗癌剂候选物的源自漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion处理1小时后，每处理组中突变体Luterial的大直径减少至处理前对照突变体Luterial的大直径的13-63％，且突变体Luterial的小直径减少至处理前对照突变体Luterial的小直径的12-67％。
在一个实例中，相比处理前的对照，可将改变突变体Luterial的形状的候选物选作抗癌剂。
当源自癌症患者的Luterial的形状通过抗癌剂候选物的存在改变时，可将该候选物选作抗癌剂。Luterial突变的形状的减少可指示具有鞭毛状、微管状、块状、棒状或组合形状的突变体Luterial的数目减少，或突变体Luterial恢复至在健康人的Luterial中观察到的圆形或椭圆形。例如，30分钟或更久或优选1小时或更久后，当用抗癌剂候选物将具有鞭毛状(图4)、微管状(图5)、块状(图6)、棒状(图7)或组合形状的Luterial的数目减少至对照突变体Luterial的80％或更少，优选50％或更少，更优选30％或更少时，则可将特定的抗癌剂候选物选作抗癌剂。当通过用抗癌剂候选物处理将具有鞭毛状、微管状、块状、棒状或组合形状的突变体Luterial的数目减少至对照(其中不存在抗癌剂候选物)的5-80％，优选10-50％，更优选10-30％时，可选择该抗癌剂候选物。
在具有鞭毛状Luterial的疑似恶性的情况中，大多患者可能诊断为IV期癌症。因此，减少鞭毛状或将其恢复至圆形或椭圆形的经筛选的治疗剂可为适于治疗IV期癌症患者的治疗剂。
在具有块状Luterial的疑似恶性的情况中，肿瘤可能发现于肝、结肠、消化器官、男性直肠和/或女性子宫中。因此，减少块状或将其恢复成圆形或椭圆形的经筛选的治疗剂可为适于治疗肝、结肠、消化器官、男性直肠和/或女性子宫的癌症的治疗剂。
在具有棒状Luterial的疑似恶性的情况中，肿瘤可能发现于肺、胰腺、甲状腺、骨、脑、男性前列腺、女性卵巢和/或乳腺。因此，减少棒状或将形状恢复至圆形或椭圆形的经筛选的治疗剂可为适于治疗肺、胰腺、甲状腺、骨、脑、男性前列腺、女性卵巢和/或乳腺的癌症的治疗剂。
在具有包括块状和棒状的组合形状的Luterial的疑似恶性的情况中，患者可能诊断为具有IV期转移的癌症。因此，减少组合形状或将形状恢复成圆形或椭圆形的经筛选的治疗剂可适于预防或治疗IV期转移的癌症。
在另一实例中，突变体Luterial的移动性可减少，其中纳米追踪速度范围为小于10nm/秒至0.5nm/秒或0nm/秒(无移动性)。然而，用候选物处理30分钟或更久(优选1小时或更久)后，移动性减少的程度降低或保留时，或用候选物处理后当纳米追踪速度恢复至12nm/秒或更快，例如50-600nm/秒，优选100-500nm/秒时，该候选物可选作有效的抗癌剂。
本发明要求保护可通过测量电泳迁移性而确定用候选物处理的移动性的改变。如本文使用，术语"电泳迁移性"指通过由带电颗粒电泳运动的速度除以该处的电场强度获得的值。如果颗粒的电泳迁移性高，则颗粒的移动性也高。
突变体Luterial的移动性可减少，且因此其电泳迁移性范围可为少于0.5μm cm/Vs至0μm cm/Vs(无移动性)。当突变体Luterial的移动性在用候选物处理30分钟(优选1小时或更久)后恢复且因此其电泳迁移性相比用候选物处理前的突变体Luterial对照增加30％或更多，例如30-300％时，该候选物可选作有效的抗癌剂。在本发明的测试实施例1中，发现用作为抗癌剂候选物的源自漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion处理1小时后，每治疗组中突变体Luterial的电泳迁移性相比对照增加了33-270％。
本发明人已通过检查具有1100-3100nm尺寸的源自癌症患者的突变体Luterial的变化和施用候选物后非常低的移动性或无移动性来筛选抗癌剂。作为结果，发现当突变体Luterial的直径减少无处理的对照突变体Luterial的直径的70％或更少时，或当突变体Luterial的纳米追踪速度恢复至100nm/秒或更大，且用候选物处理1小时后电泳迁移性增加30％或更多时，该候选物可选作抗癌剂。
用于筛选癌症预防剂的方法包括下述步骤(c)：选择相比无处理的对照抑制Luterial的尺寸增加、最小化Luterial的形状改变或维持Luterial的移动性的候选物。
在用于筛选癌症预防剂的方法的步骤(c)中，当用癌症预防剂候选物处理的组中源自健康人的Luterial的融合在30分钟或更久，优选1小时或更久都未观察到时，可选择候选物，指示维持了Luterial的大小。此外，当源自健康人的Luterial的大直径或小直径相比对照Luterial未增加10％或更多时，可将候选物选作癌症预防剂。
此外，当用癌症预防剂候选物处理的组中源自健康人的Luterial维持圆形或椭圆形(即100％的Luterial为圆形或椭圆形)30分钟或更久，优选1小时时，可选择癌症预防剂候选物。此外，当Luterial变为鞭毛状时，微管状、块状、棒状或组合形状被最小化(即，其形状变为鞭毛状时，微管状、块状、棒状或组合形状的Luterial为20％或更少)。
此外，当用癌症预防剂候选物处理的组中Luterial的移动性维持30分钟或更久，优选1小时或更久，即纳米追踪速度维持在100nm/秒或更快时，可将癌症预防剂候选物选作癌症预防剂。
在一些情况中，可通过下述将候选物选为癌症预防剂：首先用化学或物理处理诱导Luterial(阴性对照)的融合且其次进行观察以查看候选物是否减少了诱导的突变体Luterial的大小、形态学或移动性的改变。在其他情况中，可通过下述将候选物选为癌症预防剂：首先在36℃的温度和50％或更高湿度的条件下诱导Luterial的突变，且其次进行观察以查看候选物是否减少了诱导的突变体Luterial的大小、形态学或移动性的改变。例如，用细胞融合诱导剂如溶血卵磷脂或聚乙二醇6000处理Luterial，然后在癌症预防剂候选物存在下温育后，当Luterial大小的增加、形状的改变或移动性的减少被降低或抑制时可选择癌症预防剂候选物。
候选物对Luterial大小、形状或移动性的作用可通过用一种或多种选自下组的染料染色Luterial而确认：罗丹明123、Mito-tracker、吖啶橙、DAPI和Janus绿B。
可使用上述染料用于确认Luterial融合的抑制或大小、形状或移动性的变化的显微镜无具体限制，只要其为能够观察Luterial阳性染色的显微镜。具体地，显微镜可包括由本领域的技术专家通常使用的暗视野显微镜(Ultra显微镜)、拉曼光谱仪(使用532nm的波长)、莱卡、AFM(原子力显微镜)、MFM(磁力显微镜)、STM(扫描隧道显微镜)、CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)、NSOM(近场扫描光学显微镜)、SEM(扫描电子显微镜)或TEM(透射电子显微镜)。
实施例
此后，本发明将参照实施例以进一步细节进行说明。对本领域具有普通技术的人员显而易见的是这些实施例仅是说明目的且不应理解为限制本发明的范围。
实施例1：Luterial的分离
如下文表5所示，从下述患者的血液分离Luterial：(1)肺癌患者，(2)胰腺癌患者，(3)结肠癌患者，(4)肝癌患者，(5)前列腺癌患者，(6)乳腺癌患者，(7)甲状腺乳头状癌患者，(8)肾癌患者，(9)白血病患者，(10)具有晚期癌症的患者(胃癌、结直肠癌、胆囊癌)和(11)确认具有4期转移癌症的患者(肺癌、前列腺癌、乳腺癌)。从确认具有癌症的患者收集血液，然后离心以沉降血液中的材料。允许离心的血液放置5-10分钟，然后通过移液收集上清。随后，将5μl的CD39抗体缀合的铁磁性纳米颗粒或CD73抗体缀合的铁磁性纳米颗粒添加至100-200μl的血液并温育30分钟，其后将混合物维持在磁性分离器1-2分钟以收集Luterial结合的磁性纳米颗粒，并去除上清，随后洗涤。接下来，将0.033wt％BSA(牛血清白蛋白)/PBS缓冲剂添加至Luterial结合的铁磁性纳米颗粒，随后在25℃温育1小时。随后，仅BSA吸收的铁磁性纳米颗粒使用磁体分离。随后，将一定量的PBS添加至BSA吸收的铁磁性纳米颗粒，随后温育以通过解吸分离Luterial。分离的Luterial通过FP-640荧光分光光度计(JASCO)使用标准校准方法在280nm定量分析(发射狭缝：0.5nm，吸收狭缝：0.5nm)。使用共聚焦激光扫描显微镜，收集具有1,000-3,200nm大小的源自癌症患者的突变体Luterial。
表5
实施例：候选物的制备
将100g下列药用植物切割以适于2-3升(按体积20-至30-倍)大小的容器并置于容器中：漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果。随后将500-800g(等同于5-8倍植物重量，优选为6倍植物重量的600g)的蒸馏水添加至容器，随后在80℃摇晃约8小时，由此获得热水提取物。将CD39抗体缀合的铁磁性纳米颗粒或CD73抗体缀合的铁磁性纳米颗粒添加至100-200μl的热水提取物并温育30分钟。接下来，将混合物维持于磁性分离器1-2分钟以收集Luterion结合的磁性纳米颗粒，并丢弃上清，随后洗涤。接下来，将0.033wt％BSA(牛血清白蛋白)/PBS缓冲剂添加至Luterion结合的磁性纳米颗粒，随后在25℃温育1小时。接下来，使用磁体仅分离BSA吸附的铁磁性纳米颗粒，并将一定量的PBS添加至BSA吸附的铁磁性纳米颗粒，随后温育以实施解吸，由此获得分别源自下述的Luterion：漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果。
通过上述步骤，可获得具有50-500nm大直径的Luterion，如可通过暗视野显微镜或共聚焦显微镜观察的。根据与上述相同的方法，可从示于下文表1-4的药用植物获得Luterion。
测试实施例1：抗癌剂筛选
用实施例2中获得的源自下述每一项的Luterion(包含于PBS中)处理实施例1中分离的突变体Luterial：漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果。本文中，将源自连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion以1、5、10、50、100和500μg/ml(50μg/ml对应约7x 108Luterion/ml)的浓度使用，并将源自漆树的Luterion以0.1、0.5、1、5、10和50μg/ml(5μg/ml对应约7x107Luterion/ml)的浓度使用。
在30℃和pH 7.3的条件下在PBS中上述处理突变体Luterial 30分钟或1小时后，检查突变体Luterial的大小和移动性变化。通过用共聚焦激光扫描显微镜观察突变体Luterial的直径变化来检查突变体Luterial的大小变化，并通过纳米追踪(3i Inc.,USA)检查突变体Luterial的移动性变化。为检查移动性的变化，将追踪设定在Luterial的中心，并操作纳米追踪。随后，记录Luterial的实时运动轨迹并计算Luterial的速度每秒，由此测量纳米追踪速度。此外，使用Malvern ZetaSizer Nano ZSP仪器，将突变体Luterial置于细胞中(Universal Dip Cell:ZEN1002)，并将两电极浸没于细胞中，其后通过观察带点颗粒朝具有相反电荷的电极移动来测量电泳迁移性。
如下文表6所示，相比未接受处理的那些(对照)，施用源自下述的每一种Luterion后源自癌症患者的突变体Luterial的大小减少：源自漆树的Luterion(Luterion大小＝大直径x小直径：400nm X 350nm)、源自连翘的Luterion(400nm X 370nm)、源自茯苓的Luterion(450nm X 300nm)、源自当归根的Luterion(400nm X 300nm)和源自奇异果的Luterion(420nm X 330nm)。施用每种Luterion后，突变体Luterial的移动性也得到恢复。
表6
结果示于图36-40。如图36-40所示，未用Luterion处理的源自癌症患者的突变体Luterial对照(图36-40中的(a))显示i)约1,100-3,100nm的大小和ii)约0-10nm/秒的纳米追踪速度，和约0-0.5μm cm/Vs的电泳迁移性。
然而，在用源自漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion的每一种处理的组中(30分钟后：图36-40中的(b)，且1小时后：图36-40中的(b))，Luterial的大小显著减少，且部分Luterial的大小减少至正常Luterial(约800nm或更少)。
在用源自漆树的Luterion处理的组(图36(c))中，突变体Luterial的大小1小时后减少至突变体Luterial(对照)的大直径的约28％，且1小时后减少至突变体Luterial的小直径的约22％。在用源自连翘的Luterion处理的组(图37(c))中，突变体Luterial的大小1小时后减少至突变体Luterial(对照)的大直径的约63％，1小时后减少至突变体Luterial的小直径的约67％。在用源自茯苓的Luterion处理的组(图38(c))中，突变体Luterial的大小1小时后减少至突变体Luterial(对照)的大直径的约57％，且1小时后减少至突变体Luterial的小直径的约38％。在用源自当归根的Luterion处理的组(图39(c))中，突变体Luterial的大小1小时后减少至突变体Luterial(对照)的大直径的约13％，且1小时后减少至突变体Luterial的小直径的约12％。在用源自奇异果的Luterion处理的组(图40(c))中，突变体Luterial的大小1小时后减少至突变体Luterial(对照)的大直径的约27％，且1小时后减少至突变体Luterial的小直径的约30％。
关于移动性，已显示在突变体Luterial中纳米追踪速度慢于10nm/秒，但在用源自漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion的每一种处理的组中为约100-500nm/秒，指示治疗组的移动性得到恢复。
此外，电泳迁移性的测量结果显示在突变体Luterial中测量出慢于约0-0.5μmcm/Vs的电泳迁移性，但在用源自漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion的每一种处理的组中得到恢复。具体地，用源自漆树的Luterion处理的组的电泳迁移性为约0.73μmcm/Vs，其比突变体Luterial(对照)高约46％，且用源自连翘的Luterion处理的组的电泳迁移性为约0.4μm cm/Vs，其比突变体Luterial(对照)高约33％。此外，在用源自茯苓的Luterion处理的组的电泳迁移性为约0.31μm cm/Vs，其比突变体Luterial(对照)高约210％，且在用源自当归根的Luterion处理的组的电泳迁移性为约0.37μm cm/Vs，其比突变体Luterial(对照)高约270％。此外，用源自奇异果的Luterion处理的组的电泳迁移性为约0.86μm cm/Vs，其比突变体Luterial(对照)高约72％。
总之，可见用源自作为药用植物的漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的每一种的Luterion处理的突变体Luterial相比对照的突变体Luterial，可减少Luterial的融合、减少尺寸且抑制形状的变化，并且可恢复在癌症患者中发现的Luterial移动性的减少。因此，可将源自作为药用植物的漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的每一种的Luterion选作抗癌剂。
测试实施例2：所选候选物对癌症细胞系体外活力的作用的测量
检查了在测试实施例1中确认具有抗癌效果的源自漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion的每一种对于抑制癌症细胞系增殖的作用。从韩国细胞系库(Korean CellLine Bank)(KCLB)获得的AsPC-1(胰腺癌细胞系)、A549(肺癌细胞系)和BT-20(乳腺癌细胞系)的每一种使用包含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640和DMEM培养基培养。
取决于其生长速率，将每种细胞系以不同的浓度接种于96孔板中，且随后在37℃培养16-24小时，其后逐步用五种浓度的实施例2中分离的源自漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion处理每种细胞系。
72小时后，将15μl的MTT染料溶液(Promega)添加至每孔，随后在37℃温育4小时。接下来，每孔用100μl的显色溶液/终止溶液混合物处理，并在37℃温育过夜。将150μl的DMSO添加至每孔，且随后使用酶标仪(Bio-Rad,USA)测量在590nm的吸收，由此确定每种细胞系的细胞活力。
作为结果，如图41-43所见，源自漆树、连翘、茯苓、当归根和奇异果的Luterion的每一种减少了AsPC-1(胰腺癌细胞系)、A549(肺癌细胞系)和BT-20(乳腺癌细胞系)的每一种的活力，指示Luterion显著抑制了每种癌症细胞系的增殖。
工业实用性
本发明基于分离自癌症患者的突变体Luterial提供了能够筛选抗癌剂或癌症预防剂的新方法。根据本发明的筛选方法，可通过观察当用抗癌剂或癌症预防剂候选物处理突变体Luterial时出现的突变体Luterial在大小、形状或移动性的变化或者正常Luterial是否维持在正常状态，而在相对短的时间之内容易地筛选抗癌剂或癌症预防剂。
尽管本发明已参照具体特征详细地说明，对于本领域的技术人员显然的是此说明仅用于优选的实施方案且并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求及其等同物限定。

Claims (15)

1.一种用于筛选抗癌剂的方法，其包括步骤：
(a)从提取自患者的体液分离突变体Luterial；
(b)用抗癌剂候选物处理分离的突变体Luterial；且
(c)通过测试候选物相比无处理的对照突变体Luterial使突变体Luterial大小减少、形状变化或移动性增加的能力选择其作为抗癌剂。
2.一种用于筛选癌症预防剂的方法，其包括步骤：
(a)从提取自正常人的体液分离正常的Luterial；
(b)在癌症预防剂候选物存在下培养分离的正常Luterial；且
(c)选择相比无处理的对照Luterial使Luterial的大小增加受到抑制、形状变化最小化或移动性维持的候选物作为癌症预防剂。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)中提取的体液选自下组：血液、唾液、淋巴管、精液、阴道流体、母乳、初乳、脐带血、脑细胞、脊髓和骨髓。
4.权利要求1或2的方法，其中步骤(b)中的所述候选物是选自下组的一种或多种：天然提取物、源自食物或植物的Luterion、RNAi、适体和化合物。
5.权利要求4的方法，其中所述源自植物的Luterion是一种或多种选自下组的药用植物：漆树(Rhus verniciflua stokes)、连翘(Forsythiae fructus)、茯苓(Poria cocas)、当归(Angelica gigas)根和奇异果。
6.权利要求4的方法，其中所述源自植物的Luterion具有50-500nm的大直径或小直径。
7.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括相比未用所述候选物处理的对照Luterial，当具有鞭毛状状、微管状状、块状、棒状或组合形状的突变体Luterial的数目减少至80％或更少或当突变体Luterial恢复至圆形或椭圆形时，将所述候选物选作抗癌剂。
8.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括用所述候选物处理1小时后，当突变体Luterial的大小减少至无处理的对照突变Luterial的直径的约70％或更小时，将所述候选物选作抗癌剂。
9.权利要求8的方法，其中用所述候选物处理1小时后，当突变体Luterial的大小减少至无处理的对照突变体Luterial的大直径和小直径的约70％或更小时，将所述候选物选作抗癌剂。
10.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括用所述候选物处理1小时后，相比无处理的对照突变体Luterial，当纳米追踪速率恢复至12nm/秒或更大时，将所述候选物选作抗癌剂。
11.权利要求10的方法，其中用所述候选物处理后，相比对照突变体Luterial的情况，当纳米追踪速度恢复至100-120nm/秒时，将所述候选物选作抗癌剂。
12.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括用所述候选物处理后，相比对照突变体Luterial的情况，当突变体Luterial的电泳迁移增加30％或更多时，将所述候选物选作抗癌剂。
13.权利要求1或2的方法，其中步骤(c)包括用选自下组的一种或多种染料对Luterial染色：罗丹明123(Rhodamine 123)、Mitotracker、吖啶橙(Acridine Orange)、DAPI和Janus绿B(Janus green B)，并通过显微镜观察Luterial荧光颜色的变化。
14.权利要求13的方法，其中通过下述观察Luterial：暗视野显微镜、拉曼光谱仪、莱卡(Leica)、AFM(原子力显微镜)、MFM(磁力显微镜)、STM(扫描隧道显微镜)、CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)、NSOM(近场扫描光学显微镜)、SEM(扫描电子显微镜)或TEM(透射电子显微镜)。
15.权利要求14的方法，其中通过下述观察Luterial：暗视野显微镜、拉曼光谱仪、莱卡、AFM(原子力显微镜)、MFM(磁力显微镜)、STM(扫描隧道显微镜)、CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)、NSOM(近场扫描光学显微镜)、SEM(扫描电子显微镜)或TEM(透射电子显微镜)。
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