[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN106554955A - 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途 - Google Patents

构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN106554955A
CN106554955A CN201610932549.3A CN201610932549A CN106554955A CN 106554955 A CN106554955 A CN 106554955A CN 201610932549 A CN201610932549 A CN 201610932549A CN 106554955 A CN106554955 A CN 106554955A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
round
pkhd1
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610932549.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106554955B (zh
Inventor
刘琦
赵金银
邢晓星
杨兰
许立志
于闯
李�杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Jingtai Medical Laboratory Co ltd
Original Assignee
Dalian Gentalker Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Gentalker Biotechnology Co Ltd filed Critical Dalian Gentalker Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610932549.3A priority Critical patent/CN106554955B/zh
Publication of CN106554955A publication Critical patent/CN106554955A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106554955B publication Critical patent/CN106554955B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了高通量测序技术构建PKHD1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途。本发明的构建PKHD1基因突变的测序文库的方法包括以下步骤：第一轮扩增；消化引物；第二轮扩增；纯化回收所有DNA条带；测序；分析。

Description

构建PKHD1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是通过高通量测序技术构建PKHD1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途。
背景技术
多囊肾疾病(PKD)是指在肾脏中发生多个囊肿并导致肾脏结构和功能损害的疾病，这种囊肿累及到其他器官。根据遗传方式不同，PKD又分为常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)和常染色体隐性遗传多囊肾病(ARPKD)。PKD患者囊肿往往表现出持续性的不断形成和增大。
ARPKD是一种隐性遗传疾病，其在活婴中的发病率为1/20000。ARPKD主要是对胎儿、新生儿及儿童产生严重的影响。ARPKD可造成胎儿重度的多囊肾表型，如胆道缺陷，羊水过少等。大约一半的ARPKD的新生儿出生后因羊水过少造成肺发育不良而呼吸功能不全死亡。在存活的婴儿中，全身性高血压、肾功能不全、门静脉高压症也是引起高发病频率和死亡的一大原因。研究证明，ARPKD是由PKHD1基因变异引起，本发明主要针对常染色体隐性遗传多囊肾病(PKHD1基因变异)。
PKHD1是目前所知人类常染色体隐性遗传多囊肾病的唯一致病基因。ARPKD是一种多发于儿童、以多囊肾为表型的单基因遗传病。ARPKD的临床表征在家族内外都有较大差异。约50％患者在胎儿期已经发病，约30％出生时伴随呼吸和肾功能障碍而死亡。有人认为PKHD1突变的多样性可能是ARPKD临床表征多样性的原因。目前已经报道了至少300种PKHD1突变。其中包括184个错义突变，37个无义突变，62个插入或缺失(移码)突变以及21个经典剪接位点突变。这些突变几乎分布于整个PKHD1基因,PKHD1突变位点与临床症状之间的初步分析表明，编码截短的突变具有错义突变的患儿大多在围产期和新生期即死亡，而度过新生儿期能存活下来的患儿多携带有至少一个错义的突变。由于PKHD1的基因是一个非常大的基因，有67个外显子，其中蛋白编码区域外显子有66个，共编码4074个氨基酸。因此，对PKHD1基因的检测是一件费时费力且技术要求高的工作。
目前ARPKD疾病的分子诊断发展出了多种方法，但是各方法均存在一定的不足。
DNA家系基因连锁分析方法：是基于家系研究的一种方法。它是利用遗传标记在家系中进行分型，再利用数学手段计算遗传标记在家系中是否与疾病产生共分离。连锁分析是利用连锁的原理研究致病基因与参考位点(遗传标记)的关系。通过覆盖密度适当的遗传标记物(marker)，可以找到与致病基因紧密连锁的某一标记物，从而得到致病基因在染色体上的准确位置。这种方法的缺点是需要足够数量的家系成员一同参与鉴定，并且当先证者是新发变异时，连锁分析方法也将不适用。
DNA高压液相层析(DHPLC)方法：其基本原理是首先对目的区域PCR进行扩增，然后将PCR产物加热变性为单链状态，再通过高压液相层析技术检测其中碱基峰值的改变，以此来判断有无突变发生。DHPLC方法灵敏度较高，对变异的检出率可达到78％，但此方法费用较高，不适用于大范围应用。
其他变异筛查方法：变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性分析(SSCP)、高分辨溶解曲线法(HRM)也均可应用于PKHD1基因的检测，但这些方法的缺点是不能直接明确变异位点，只能对有无突变进行筛查。
虽然传统的一代测序(Sanger测序)仍是诊断人类遗传性疾病变异的金标准，但由于此技术本身的局限性，其测序效率低、成本高、通量小等缺陷使此技术无法胜任巨大基因和大样本量的测序要求，如果需要对整个基因组范围内全部外显子的测序以发现新的变异基因或位点，此方法更是无能为力。此外，sanger测序需要非常复杂的前期准备工作，整个实验流程包括扩增、纯化、测序PCR、再纯化等多个步骤，不仅耗时耗力，成本高，更存在交叉污染及PCR扩增失败的可能。随着分类基因组测序技术的发展以及国际人类基因组单倍体型图谱(HapMap)构建完成，以外显子测序技术为主的高通量测序技术(NGS)得到了空前的发展。它不仅能高通量精确鉴别出常见变异或罕见变异，而且测序成本也大大降低。NGS已引发了新一轮探究复杂遗传疾病的热潮，并在短短几年时间内已经发现并发明了大量与人类性状或复杂性疾病关联的新遗传变异，为进一步了解人类遗传疾病发生的分子机制提供了重要依据。
NGS技术的出现使测序成本大大降低，其具有高通量、低成本、测序错误率低等特点，在近几年得到快速发展。应用NGS技术，可以对混合的核酸分子进行序列测定，同时分辨和测出每个独立的序列，使得大批量的目标序列测序能够同时进行。
序列捕获技术是一种对基因组特定区域进行选择性富集的技术，其通过合适的方法将目标区域从基因组中调取出来进行测序。目前常用的序列捕获方法主要有两种：PCR法和杂交法。PCR法具有高灵敏性、高特异性和重复性好等优点，在二代测序技术平台有很好的应用前景，适合用于捕获一些较小的区域，特别是一些连续的区域。应用NGS技术将显著提高PKHD1基因突变的检测效率、灵敏度及特异性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的发明人进行了广泛深入的研究，由此完成本发明。
本发明的一个目的是提供一种用于构建PKHD1基因突变的测序文库的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于构建PKHD1基因突变的测序文库的试剂盒。
为实现上述目的，本发明利用PCR反应在产物两端各引入一段寡核苷酸序列，这两段寡核苷酸序列分别与illumina公司的D5接头引物(D5adaptor)序列和N7接头引物(N7adaptor)序列相同，通过PCR产物两端引入的寡核苷酸序列，PCR产物可以直接作为测序文库应用于illumina公司的Nextseq500/550，Hiseq 2000/2500/3000、Miseq等测序仪。
本发明在产物两端引入寡核苷酸序列的同时，结合了多重PCR的扩增策略，可以同时实现对各样本的PKHD1基因的一个或多个特定外显子进行扩增，直接得到样本的PKHD1基因的一个或多个特定外显子的测序文库。
本发明在样品的PCR产物两端分别引入可区分的D5接头引物序列和N7接头引物序列，其中D5接头引物和N7接头引物中包含的标签(index)信息可以用作后续区分不同样品的标签序列。
本发明中，所述D5接头引物序列由5’端通用的测序引物序列、标签序列(即，i5，见下文粗体部分)和3’端通用的测序引物序列串联连接组成，以及所述N7接头引物序列由5’端通用的测序引物序列、标签序列(即，i7，见下文粗体部分)和3’端通用的测序引物序列串联连接组成。
本发明中，利用PCR反应在产物两端各引入一段寡核苷酸序列，所述两段寡核苷酸序列分别与D5接头引物序列和N7接头引物序列相同，其中，所述D5接头引物序列选自：
D501
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:1)、
D502
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:2)、
D503
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:3)、
D504
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:4)、
D505
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:5)、
D506
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:6)、
D507
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:7)和
D508
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:8)中，以及
所述N7接头引物序列选自：
N701
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:9)、
N702
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:10)、
N703
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:11)、
N704
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:12)、
N705
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:13)、
N706
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:14)、
N707
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:15)、
N708
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:16)、
N709
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:17)、
N710
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:18)、
N711
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:19)和
N712
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)(SEQ ID NO:20)中。
因此，一方面，本发明提供了一种构建PKHD1基因突变的测序文库的方法，包括以下步骤：
第一轮扩增：采用包括由与选自上述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者的3’端通用的测序引物序列的全部或部分(即，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列，例如，CCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:23))相同的序列和PKHD1基因各个外显子的正向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮正向扩增引物以及由与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者的3’端通用的测序引物序列的全部或部分(即，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的另一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列，例如，TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:24))相同的序列和PKHD1基因各个外显子的反向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮反向扩增引物的第一轮扩增引物的组合对各样本的PKHD1基因的一个或多个外显子进行扩增，此时多重扩增起作用的是每个外显子的特异性扩增引物序列，扩增的结果致使每个扩增产物片段的两端都加上了所述通用的测序引物序列的部分或全部，其中，所述D5接头引物序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8中，所述N7接头引物序列选自SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20中；
消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
第二轮扩增：以第一轮扩增的产物为模板，采用由与选自所述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成的第二轮扩增引物的组合(即，D5接头引物序列和N7接头引物序列的组合)，此时扩增起作用的是所述通用的测序引物序列，扩增的结果致使最后的扩增产物又都加上了可区分各样本的对应于D5接头引物序列和N7接头引物序列的标签序列，其中，所述D5接头引物序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8中，所述N7接头引物序列选自SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20中；
纯化回收所有DNA条带，优选使用纯化磁珠筛选回收目标区域范围之间的所有DNA条带；
测序：回收的产物进行定量后，将不同标签的产物按照测序数据量要求混合后进行上机测序；
分析：基于每个样本的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
本发明中，优选地，所述PKHD1基因的外显子可以包括选自PKHD1基因1-67号外显子中的一个或多个。
本发明的构建PKHD1基因突变的测序文库的方法中，优选地，所述第一轮扩增引物的组合包括选自SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230中的一对或多对，优选所述第一轮扩增引物的组合包括SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230，更优选所述第一轮扩增引物的组合由SEQID NO:25～SEQ ID NO:230组成。
本发明中，优选地，所述样本的数量可为96个以下(8种D5接头引物和12种N7接头引物进行一一组合)。
该文库可以直接应用于illumina公司的Nextseq500/550，Hiseq 2000/2500/3000、Miseq等测序仪进行上机测序。同时，经过第二轮扩增，产物里引入了illumina公司通用的D5接头引物序列和N7接头引物序列，可以直接用于测序文库进行高通量测序。
另一方面，本发明提供了一种构建PKHD1基因突变的测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一轮扩增引物的组合：根据待测的PKHD1基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和测序方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5`端分别加上一段与D5接头引物序列和N7接头引物序列的通用的测序引物序列的全部或部分相同的序列，组成第一轮扩增引物组合，其中，所述第一轮正向扩增引物由与选自上述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者的3’端通用的测序引物序列的全部或部分(即，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的另一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列，例如CCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO:23))相同的序列和PKHD1基因的各外显子的正向特异性扩增引物序列串联连接组成，以及所述第一轮反向扩增引物由与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者的3’端通用的测序引物序列的全部或部分(即，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的另一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列，例如，TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:24))相同的序列和PKHD1基因的各外显子的反向特异性扩增引物序列串联连接组成，其中，所述D5接头引物序列选自D501-D508(SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:8)中，所述N7接头引物序列选自N701-N712(SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20)中；
本发明的通用的测序引物序列illumina公司的高通量测序通用的测序引物序列，分别对应D5接头引物和N7接头引物上的3’端通用的测序引物序列；
第二轮扩增引物的组合：由与选自所述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成(即，D5接头引物序列和N7接头引物序列的组合)。
第二轮扩增引物的组合是根据样本的数量使用不同的D5接头引物和N7接头引物序列的标签序列组合(标签序列是D5接头引物和N7接头引物序列中的一段序列(即，[i5]和[i7]))以使各样本可区分，采用由与选自所述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成的第二轮扩增引物的组合(即，D5接头引物序列和N7接头引物序列的组合)，其中，所述D5接头引物序列选自D501-D508(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8)中，所述N7接头引物序列选自N701-N712(SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20)中，其中，所述第二轮扩增引物的组合包括选自由D501～D508(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8)中之一和N701～N712(SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20)之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分。
本发明的构建PKHD1基因突变的测序文库的试剂盒中，优选地，所述第一轮扩增引物的组合包括选自SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230中的一对或多对，优选所述第一轮扩增引物的组合包括SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230，更优选所述第一轮扩增引物的组合由SEQID NO:25～SEQ ID NO:230组成。
本发明中，优选地，所述试剂盒进一步包括DNA聚合酶，所采用的酶均为高保真DNA聚合酶，由此减少扩增带来的DNA突变率。
本发明中，优选地，所述试剂盒进一步包括单链消化酶，所用的单链消化酶为核酸外切酶I(Exonuclease I)，该酶为单链特异性3’→5’核酸外切酶，不分解双链DNA及RNA。
本发明中，优选地，NGS技术将显著提高PKHD1基因突变的检测效率、灵敏度及特异性。
本发明中，更优选地，本发明提供了一种构建包括PKHD1基因外显子区域的测序文库的试剂盒，其中，所述PKHD1外显子区域可以包括选自下列67个外显子区域的一个或多个外显子区域(优选地，可以包括下列67个外显子区域；更优选地，可以由下列67个外显子区域组成)，所述试剂盒包括：
第一轮扩增引物组合：包括选自下表中的引物的一对或多对，优选地，包括下表中的引物，更优选地，由下表中的引物组成，
本发明中，上述外显子为本领域公知的，其序列信息例如来自GenBank，PKHD1NM138694。
第二轮扩增引物的组合，其包括选自由D501～D508(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8)中之一和N701～N712(SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20)之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分：
本发明具有如下有益效果：
本发明通过优化多重PCR反应的循环数，使第一轮多重PCR反应只进行线性扩增，最大限度的减少多重引物之间的扩增效率差别，通过第二轮扩增时通用引物的平行扩增，使多重扩增产物中PKHD1基因的各外显子的相关产物量尽量接近，提高了测序数据的有效性。
在本发明中，第一轮扩增采用的是高通量测序通用的测序引物序列+PKHD1基因各个外显子的特定引物组成的扩增引物组合的混合物，这时候多重扩增起作用的是每个外显子的特定序列，每个外显子的前面都加上了通用的测序引物序列。第二轮扩增引物采用的是高通量测序的接头序列+标签序列+通用的测序序列，这时候扩增起作用的是通用的测序序列，最后的产物前面又都加上了可区分的标签序列，同时，产物可以直接作为测序文库进行高通量测序(illumina公司的Nextseq500/550，Hiseq 2000/2500/3000、Miseq等)。通过以上合理的引物设计和PCR策略，在PCR产物的5`末端直接添加D5接头引物和N7接头引物序列。通过对每个样本都引入可区分的标签序列，使样本在第二代高通量测序技术检测时，每个样本的测序结果都可以通过其独特的标签序列找回，可以应用于同时检测大量样本的多个不同基因位点，大大降低了测序成本。
具体实施方式
现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
以下实施例中所使用的设备和试剂如下：血液基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，高速离心机SIGMA 3-30K，核酸扩增仪ABI 9700，Illumina测序仪，多重扩增试剂GeneRead DNAseq panel PCR Kit v2(181942)，高保真扩增酶Kapa BiosystemsHiFi HS(kk2602)，核酸外切酶Takara(Exonuclease I(E.coli))，纯化磁珠Beckman AgencourtAMPure XP。
实施例1
导致常染色体隐性遗传多囊肾病的基因PKHD1的67个外显子测序，共15例，即15例正常人基因组DNA样本。
1)引物设计：
针对PKHD1基因的67个外显子设计相应的扩增引物，相关参数：Tm值58.0℃－62.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小22±3bp。在正向扩增引物和反向扩增引物的5`端分别加上一段与D5接头引物和N7接头引物的3’端高通量测序通用的测序引物序列相同的序列，所设计的引物如下，其中下划线是引入的高通量测序通用的测序引物序列(即，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)：
在本实施例中，第二轮扩增的引物选择时，根据15个样本采用15对标签序列组合，在第二轮扩增时对每个样本的各个目的片段都加上可以区分的标签序列，所设计的引物如下，其中下划线是引入的通用的测序序列(即，第一轮的通用序列，第二轮扩增时候这个序列起到扩增引物的作用)：
表1：15个样本对应15对标签的列表
D504 D505 D506 D507 D508
N703 1# 4# 7# 10# 13#
N704 2# 5# 8# 11# 14#
N705 3# 6# 9# 12# 15#
2)第一轮扩增：
每对引物单独调试合格后，将103对引物分别稀释到100μM，然后等量混合，PCR体系：4.4μL 5x PCR buffer，2μL混合引物，1.5μL taq(5U/μL)，2.5μL模板DNA(5ng/μL)，ddH2O补充到22μL。PCR反应按下述条件进行：模板DNA变性95℃保持15min。PCR反应循环条件：
以下进行20个循环：
第1步：95℃进行30秒；
第2步：60℃进行4分钟；
20个循环完成后，72℃保持10min，最后保持在4℃。
3)消化引物
第一轮扩增产物采用Takara Exonuclease I对第一轮扩增产物进行消化残留引物，酶切体系：Exonuclease I(50U/μL)0.5μL，PCR产物20μL，
酶切反应按下述条件进行：37℃，30min；
4)纯化回收：0.6-0.9x磁珠进行筛选200-400bp之间的片段(减少了第二轮扩增的非特异扩增)
5)第二轮扩增
通过标签引物上下游分别配对组成15对可区分的标签组合，在第二轮PCR扩增时对15个样本分别加上可识别的标签序列，样本两端标签组合见表2，PCR体系：HiFiHS(kk2602)2X mix 25μL，0.75μL正向扩增引物，0.75μL反向扩增引物，5-10μL消化引物后筛选的PCR产物(消化后筛选的pcr产物所加量为80-120ng之间)，ddH2O补充到50μL。PCR反应按下述条件进行：模板DNA变性98℃保持45s。PCR反应循环条件：
以下进行8个循环：
第1步：98℃进行15s；
第2步：60℃进行30s；
第3步：72℃进行30s；
13个循环完成后，72℃保持1min,最后保持在4℃。
表2样本两端标签组合表
D504 D505 D506 D507 D508
N703 1# 4# 7# 10# 13#
N704 2# 5# 8# 11# 14#
N705 3# 6# 9# 12# 15#
6)回收：回收350bp-450bp范围之间的所有DNA条带；
7)测序：回收的产物进行定量后，将不同标签的产物按照测序数据量要求混合后进行上机测序(Nextseq500，PE150)；
8)分析：Illumina Nextseq500产物的测序结果是一系列DNA序列，通过查找测序结果中15个样本各自可区分的标签序列，将获得的测序结果首先与样本一一对应，然后根据每个外显子各自的引物序列，再将序列对应到样本的各个目标区域上。15个样本的每个外显子都能够在测序结果中找到对应的数据，每个样本对应的reads数(序列条数)如下表3所示，每个外显子序列对应的序列条数如下表4所示(仅列出1#样本的数据)。
表3每个样本对应的序列条数和GC_数
表4PKHD1外显子区域目标序列对应的序列条数(以1号样本为例)
表3表明通过上述方法，成功构建了应用于测序的文库，并且每个文库都能对应的获得相应的测序序列证明通过高通量测序技术对PKHD1基因突变检测是成功的。
表4以其中一个样品为例，列举了多重扩增中103对引物的序列数，表明多重扩增的有效性进一步说明针对PKHD1基因67个外显子设计的引物都可用。
<110> 大连晶泰生物技术有限公司
<120> 构建PKHD1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途
<130> DI16-1142-XC37
<160> 230
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D501
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgcaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D502
<400> 2
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctataca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D503
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atcctctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D504
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gagtagaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D505
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg taaggagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D506
<400> 6
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctgcataaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D507
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca aggagtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D508
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc taagcctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N701
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agattaaggc gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N702
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatcgtact aggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N703
<400> 11
caagcagaag acggcatacg agataggcag aagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N704
<400> 12
caagcagaag acggcatacg agattcctga gcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N705
<400> 13
caagcagaag acggcatacg agatggactc ctgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N706
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agattaggca tggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N707
<400> 15
caagcagaag acggcatacg agatctctct acgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N708
<400> 16
caagcagaag acggcatacg agatcagaga gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N709
<400> 17
caagcagaag acggcatacg agatgctacg ctgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 18
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N710
<400> 18
caagcagaag acggcatacg agatcgaggc tggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N711
<400> 19
caagcagaag acggcatacg agataagagg cagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 20
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N712
<400> 20
caagcagaag acggcatacg agatgtagag gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D5接头引物序列的3'端通用的测序引物序列
<400> 21
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N7接头引物序列的3'端通用的测序引物序列
<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D5接头引物序列的3'端通用的测序引物序列的部分
<400> 23
cctacacgac gctcttccga tct 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N7接头引物序列的3'端通用的测序引物序列的部分
<400> 24
ttcagacgtg tgctcttccg atct 24
<210> 25
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon1-F
<400> 25
cctacacgac gctcttccga tctacctttt ttttctgttt ctgtctcc 48
<210> 26
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon2_1-F
<400> 26
cctacacgac gctcttccga tctttaaacc caaaagcaaa taccttaaca cc 52
<210> 27
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon2_2-F
<400> 27
cctacacgac gctcttccga tctacacatt ctactgacct gccaaaa 47
<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon3-F
<400> 28
cctacacgac gctcttccga tctcccttca ggcccacttt taca 44
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon4-F
<400> 29
cctacacgac gctcttccga tctagataag caaaaatccc tcatcctgtc 50
<210> 30
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon5-F
<400> 30
cctacacgac gctcttccga tctctggctc atttacaatt tgcctttca 49
<210> 31
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon6-F
<400> 31
cctacacgac gctcttccga tctgaagaag ttaaattttc ccactcataa aaacca 56
<210> 32
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon7_1-F
<400> 32
cctacacgac gctcttccga tctccagttg caattacatt aacaaagttt gc 52
<210> 33
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon7_2-F
<400> 33
cctacacgac gctcttccga tctaacaaac acacacttac ctatcaatgt act 53
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon8-F
<400> 34
cctacacgac gctcttccga tcttgtgttg tatccatgtg gacgaa 46
<210> 35
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon9-F
<400> 35
cctacacgac gctcttccga tctttatcct catgagaacc aatcttgcaa t 51
<210> 36
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon10-F
<400> 36
cctacacgac gctcttccga tcttccgtca taaaaagata aagaaagtaa gcaaga 56
<210> 37
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon11-F
<400> 37
cctacacgac gctcttccga tctgggtgtt aatggtcatc aagaaatgg 49
<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon12-F
<400> 38
cctacacgac gctcttccga tctcttcctc ctgcatccct catg 44
<210> 39
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon13-F
<400> 39
cctacacgac gctcttccga tctgctcact gagtaagcca gtcaaata 48
<210> 40
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon14-F
<400> 40
cctacacgac gctcttccga tcttccttat ctgtctccta gcctcac 47
<210> 41
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon15-F
<400> 41
cctacacgac gctcttccga tctacatgag agccttaact ttgattcttt ct 52
<210> 42
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon16_1-F
<400> 42
cctacacgac gctcttccga tcttgaatct ggacaccaat cctcatc 47
<210> 43
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon16_2-F
<400> 43
cctacacgac gctcttccga tctcagcaag gttataatga cccctcag 48
<210> 44
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon17-F
<400> 44
cctacacgac gctcttccga tctttgaaga agtctcccac cagatg 46
<210> 45
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon18-F
<400> 45
cctacacgac gctcttccga tcttgatgaa aaagacaatc agaatgaagc c 51
<210> 46
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon19-F
<400> 46
cctacacgac gctcttccga tctccagaga gcaataccaa tacctacc 48
<210> 47
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon20-F
<400> 47
cctacacgac gctcttccga tctactgtcc ccaaaacagt gaatcc 46
<210> 48
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon21-F
<400> 48
cctacacgac gctcttccga tctgcttgtg gaggagagag aatttgat 48
<210> 49
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon22-F
<400> 49
cctacacgac gctcttccga tctaaggcca acaagcattc ttagga 46
<210> 50
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon23-F
<400> 50
cctacacgac gctcttccga tctggatgtt gttcccttgg gaatgt 46
<210> 51
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon24-F
<400> 51
cctacacgac gctcttccga tctgcagcaa atccatgcca ctag 44
<210> 52
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon25-F
<400> 52
cctacacgac gctcttccga tctcacttag ggtggcccat tca 43
<210> 53
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon26-F
<400> 53
cctacacgac gctcttccga tctatcacca gctacatggc ctcta 45
<210> 54
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon27_1-F
<400> 54
cctacacgac gctcttccga tctagagggt ctcaccaaca tcaaga 46
<210> 55
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon27_2-F
<400> 55
cctacacgac gctcttccga tctagtaaac aaaagacagt gagtcacagt 50
<210> 56
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon28-F
<400> 56
cctacacgac gctcttccga tcttatatta acagtggtca ctcacccaga 50
<210> 57
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon29-F
<400> 57
cctacacgac gctcttccga tctttgattg ccctttttat aggaccaatg 50
<210> 58
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon30-F
<400> 58
cctacacgac gctcttccga tctccatcaa acaaatccaa aattaatgca agtg 54
<210> 59
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon31-F
<400> 59
cctacacgac gctcttccga tcttctctga cctcactggc aaattaatc 49
<210> 60
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_1-F
<400> 60
cctacacgac gctcttccga tcttgtggtt accagagaca ccca 44
<210> 61
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_2-F
<400> 61
cctacacgac gctcttccga tctttccaga agtgaaagga gctacc 46
<210> 62
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_3-F
<400> 62
cctacacgac gctcttccga tctccctaat cagcacagtg gtcag 45
<210> 63
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_4-F
<400> 63
cctacacgac gctcttccga tctcattccc tgtgggaaca atgc 44
<210> 64
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_5-F
<400> 64
cctacacgac gctcttccga tctccagaac aagcataccc atttcttg 48
<210> 65
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_6-F
<400> 65
cctacacgac gctcttccga tctaattgct ggagcaccac aga 43
<210> 66
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_7-F
<400> 66
cctacacgac gctcttccga tctaggctaa cctggcagag aatg 44
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_8-F
<400> 67
cctacacgac gctcttccga tctgctcgcc tccgttaagt tca 43
<210> 68
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_9-F
<400> 68
cctacacgac gctcttccga tctttgtgat ttctccttgc atggc 45
<210> 69
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon33_1-F
<400> 69
cctacacgac gctcttccga tcttaacagg tggcctcaga ttctaacta 49
<210> 70
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon33_2-F
<400> 70
cctacacgac gctcttccga tcttgtagca ttagccagga ctcg 44
<210> 71
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon34_1-F
<400> 71
cctacacgac gctcttccga tctctgccca atgatctggc aca 43
<210> 72
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon34_2-F
<400> 72
cctacacgac gctcttccga tctctgccca atgatctggc aca 43
<210> 73
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon35_1-F
<400> 73
cctacacgac gctcttccga tctagcgttt ccgtatctca gtaatcttg 49
<210> 74
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon35_2-F
<400> 74
cctacacgac gctcttccga tctaactatg aattcagata ttgtgcatta gacca 55
<210> 75
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon36_1-F
<400> 75
cctacacgac gctcttccga tcttgagtcc aaagaaaggc ctttca 46
<210> 76
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon36_2-F
<400> 76
cctacacgac gctcttccga tctatgcttg tgttagtgtc cagca 45
<210> 77
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon37_1-F
<400> 77
cctacacgac gctcttccga tctgatcaat tgcctcactc accgt 45
<210> 78
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon37_2-F
<400> 78
cctacacgac gctcttccga tctagcaaac aattgggaac ggtagt 46
<210> 79
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon38_1-F
<400> 79
cctacacgac gctcttccga tctttgtcaa aatgtctacc attatttaag cagaag 56
<210> 80
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon38_2-F
<400> 80
cctacacgac gctcttccga tctagtgaca atctcttcca tcggtttg 48
<210> 81
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon39-F
<400> 81
cctacacgac gctcttccga tcttgctcat tagactttcc aacaaaacac 50
<210> 82
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon40-F
<400> 82
cctacacgac gctcttccga tctagaaaga aacatgagaa agtcctaggt c 51
<210> 83
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon41-F
<400> 83
cctacacgac gctcttccga tctgtgtcct acacaagaat gcagaaattc 50
<210> 84
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon42-F
<400> 84
cctacacgac gctcttccga tctatgcaca ataaacttaa gagacctaac attttg 56
<210> 85
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon43-F
<400> 85
cctacacgac gctcttccga tctcacccct gattgagaaa gaactttatg 50
<210> 86
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon44-F
<400> 86
cctacacgac gctcttccga tctgcccaaa gtgctctcat tgtg 44
<210> 87
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon45_1-F
<400> 87
cctacacgac gctcttccga tctaaaaagc ttacctgggc acca 44
<210> 88
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon45_2-F
<400> 88
cctacacgac gctcttccga tctagaaaat gacctaaccc tggattagtg 50
<210> 89
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon46-F
<400> 89
cctacacgac gctcttccga tctgggccca gcacatgtaa ttttg 45
<210> 90
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon47-F
<400> 90
cctacacgac gctcttccga tctgccttat ttatcatctg ttctgtctat tcaaat 56
<210> 91
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon48_1-F
<400> 91
cctacacgac gctcttccga tctatgattc agcagctgtc aaaattattc c 51
<210> 92
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon48_2-F
<400> 92
cctacacgac gctcttccga tctacccgac caaagcttga attga 45
<210> 93
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon49_1-F
<400> 93
cctacacgac gctcttccga tctttgcaat gagtaggtct cttggtc 47
<210> 94
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon49_2-F
<400> 94
cctacacgac gctcttccga tctagcttat attcatctgg ccaaaatact attgaa 56
<210> 95
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon50_1-F
<400> 95
cctacacgac gctcttccga tctccataac acacagctgt ccctt 45
<210> 96
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon50_2-F
<400> 96
cctacacgac gctcttccga tctggttctg acctggtgat ggaag 45
<210> 97
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon51-F
<400> 97
cctacacgac gctcttccga tctaacagta tgacaaggtg gaatttgtag aa 52
<210> 98
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon52-F
<400> 98
cctacacgac gctcttccga tctgggttca gcctgtctgt gatt 44
<210> 99
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon53-F
<400> 99
cctacacgac gctcttccga tctagcccct tctcacagaa tataattctc a 51
<210> 100
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon54-F
<400> 100
cctacacgac gctcttccga tctacaagca cacaatacac acacatg 47
<210> 101
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon55-F
<400> 101
cctacacgac gctcttccga tcttcatatt gtaacaaaat ctcaagcaga agc 53
<210> 102
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon56-F
<400> 102
cctacacgac gctcttccga tctaggttac caaacatggt cttcctag 48
<210> 103
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon57-F
<400> 103
cctacacgac gctcttccga tcttgtccca gatgaatagg ctcca 45
<210> 104
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_1-F
<400> 104
cctacacgac gctcttccga tctccactga tttggttctg aggtgaata 49
<210> 105
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_2-F
<400> 105
cctacacgac gctcttccga tctaccattg tggctatcaa tactcagc 48
<210> 106
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_3-F
<400> 106
cctacacgac gctcttccga tctgcagaaa atacatacac tactgccaaa ag 52
<210> 107
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_4-F
<400> 107
cctacacgac gctcttccga tctggcctga ccctctaaat ctatgc 46
<210> 108
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_5-F
<400> 108
cctacacgac gctcttccga tctacattgt cagaccaaag cagttca 47
<210> 109
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon59_6-F
<400> 109
cctacacgac gctcttccga tctttaatgt accttaccat tctaagattc atttct 56
<210> 110
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon59_7-F
<400> 110
cctacacgac gctcttccga tctttatctt ttatctttag catcctggtc ctc 53
<210> 111
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon60-F
<400> 111
cctacacgac gctcttccga tctacaagca cccttgcctc tac 43
<210> 112
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_1-F
<400> 112
cctacacgac gctcttccga tctctgttgg cgaatcacca atttcaa 47
<210> 113
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_2-F
<400> 113
cctacacgac gctcttccga tctaatcagc cctcatttgg atgtgaatat 50
<210> 114
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_3-F
<400> 114
cctacacgac gctcttccga tctaagcgca aaacttgagg agtttg 46
<210> 115
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_4-F
<400> 115
cctacacgac gctcttccga tcttcctctc cttgtaggac aacataca 48
<210> 116
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_5-F
<400> 116
cctacacgac gctcttccga tcttgtcagc aatggccttt aaggt 45
<210> 117
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_6-F
<400> 117
cctacacgac gctcttccga tctaactgga tataacttct gaattgccca a 51
<210> 118
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_7-F
<400> 118
cctacacgac gctcttccga tctgaaacag tgtcttaaca agtctttcca ttt 53
<210> 119
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon62-F
<400> 119
cctacacgac gctcttccga tctaaaagat aggctgaatg ctacatgct 49
<210> 120
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon63-F
<400> 120
cctacacgac gctcttccga tctaacattt tctgtgcaga taaagtggta ac 52
<210> 121
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon64-F
<400> 121
cctacacgac gctcttccga tctgaataaa agcacactgt ataaaattac ctggag 56
<210> 122
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon65_1-F
<400> 122
cctacacgac gctcttccga tcttttagag aagctcacaa aaatttgtct ttgg 54
<210> 123
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon65_2-F
<400> 123
cctacacgac gctcttccga tctgatgatg gtcgacttct ccttcc 46
<210> 124
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon66-F
<400> 124
cctacacgac gctcttccga tctaggctca gaccatccac agt 43
<210> 125
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon67_1-F
<400> 125
cctacacgac gctcttccga tctctctctt cttagttgtc ccagcag 47
<210> 126
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon67_2-F
<400> 126
cctacacgac gctcttccga tctgcttact cagccgactt tgc 43
<210> 127
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon67_3-F
<400> 127
cctacacgac gctcttccga tcttgtgatg ccagtagtac cagga 45
<210> 128
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon1-R
<400> 128
ttcagacgtg tgctcttccg atcttcatta aacttaccca tggtcagg 48
<210> 129
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon2_1-R
<400> 129
ttcagacgtg tgctcttccg atctcctggc tgatctctct gatgagta 48
<210> 130
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon2_2-R
<400> 130
ttcagacgtg tgctcttccg atcttcctta atttcccagg tttcagaaca g 51
<210> 131
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon3-R
<400> 131
ttcagacgtg tgctcttccg atctttgctt aaaatattgc agaaggtagt ggt 53
<210> 132
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon4-R
<400> 132
ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcctg tgtcaatgac aattctatgc 50
<210> 133
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon5-R
<400> 133
ttcagacgtg tgctcttccg atctcaagtg ggctgctagc tttg 44
<210> 134
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon6-R
<400> 134
ttcagacgtg tgctcttccg atctaccttc aagtaatgct gtctgagg 48
<210> 135
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon7_1-R
<400> 135
ttcagacgtg tgctcttccg atctggatta tcactggaag attggaaact tttg 54
<210> 136
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon7_2-R
<400> 136
ttcagacgtg tgctcttccg atctagtatt aattttctgg gccatgacct g 51
<210> 137
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon8-R
<400> 137
ttcagacgtg tgctcttccg atctgccatg tttcctctga gttttgtg 48
<210> 138
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon9-R
<400> 138
ttcagacgtg tgctcttccg atcttggttt tcttttgctt tctactttcc tg 52
<210> 139
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon10-R
<400> 139
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgatat tggagtcttt gggcttatga aa 52
<210> 140
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon11-R
<400> 140
ttcagacgtg tgctcttccg atctcaatag aggttagttc ccaatcttcc ttt 53
<210> 141
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon12-R
<400> 141
ttcagacgtg tgctcttccg atcttctagg tcatattctg gtctatattt ggaagc 56
<210> 142
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon13-R
<400> 142
ttcagacgtg tgctcttccg atctcacaca cacacataca taaatttctt taattcg 57
<210> 143
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon14-R
<400> 143
ttcagacgtg tgctcttccg atctaaggtg cgccctgtaa tgt 43
<210> 144
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon15-R
<400> 144
ttcagacgtg tgctcttccg atctagggca gtcatttgtt ggttca 46
<210> 145
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon16_1-R
<400> 145
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtttg agaaagagat gcctggaa 48
<210> 146
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon16_2-R
<400> 146
ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcag agcatcatgg gatagc 46
<210> 147
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon17-R
<400> 147
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgatgc tgtgttcctc agagatttc 49
<210> 148
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon18-R
<400> 148
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtctc tagtcagcca atccct 46
<210> 149
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon19-R
<400> 149
ttcagacgtg tgctcttccg atctcacatg tagggaagct ctgtctttt 49
<210> 150
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon20-R
<400> 150
ttcagacgtg tgctcttccg atctgactcc tcactacgta ttgtttgaat ga 52
<210> 151
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon21-R
<400> 151
ttcagacgtg tgctcttccg atctgctcta accggagagg actg 44
<210> 152
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon22-R
<400> 152
ttcagacgtg tgctcttccg atctcacaca gcaagtctac catcttaagt 50
<210> 153
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon23-R
<400> 153
ttcagacgtg tgctcttccg atctatcctt cagacaaggt cctcct 46
<210> 154
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon24-R
<400> 154
ttcagacgtg tgctcttccg atctggtgga ttaattagtg tctgtgtttt ctgta 55
<210> 155
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon25-R
<400> 155
ttcagacgtg tgctcttccg atcttagctg tctgattatc tgaaacacaa tgt 53
<210> 156
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon26-R
<400> 156
ttcagacgtg tgctcttccg atctagcttg ggagcacttc acatatac 48
<210> 157
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon27_1-R
<400> 157
ttcagacgtg tgctcttccg atctagaggt ctctcaaatg aagtaatatc actga 55
<210> 158
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon27_2-R
<400> 158
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtcag acagatttgc tacctgttg 49
<210> 159
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon28-R
<400> 159
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtctg cctgtatggt tggtg 45
<210> 160
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon29-R
<400> 160
ttcagacgtg tgctcttccg atctagttct cttcccttaa gtcagtcct 49
<210> 161
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon30-R
<400> 161
ttcagacgtg tgctcttccg atctccacat gtcagaggct attggatt 48
<210> 162
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon31-R
<400> 162
ttcagacgtg tgctcttccg atctacagtt tgctcttctc ctcaaaatac a 51
<210> 163
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_1-R
<400> 163
ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgac ggtgaacatc ggt 43
<210> 164
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_2-R
<400> 164
ttcagacgtg tgctcttccg atctggagct gcaaacattg acatttttat agg 53
<210> 165
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_3-R
<400> 165
ttcagacgtg tgctcttccg atctggtcct tttacttgtg tgattttgag ttt 53
<210> 166
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_4-R
<400> 166
ttcagacgtg tgctcttccg atctccagga ccccactacc tgt 43
<210> 167
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_5-R
<400> 167
ttcagacgtg tgctcttccg atctcatgga tgccttgtcc acaaac 46
<210> 168
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_6-R
<400> 168
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtatg aagcggcagc aaca 44
<210> 169
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_7-R
<400> 169
ttcagacgtg tgctcttccg atctagtacg tcagaagcag atggga 46
<210> 170
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_8-R
<400> 170
ttcagacgtg tgctcttccg atcttttcac taacacatgc cctaccttc 49
<210> 171
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon32_9-R
<400> 171
ttcagacgtg tgctcttccg atctggtact tgtgggcaat cggt 44
<210> 172
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon33_1-R
<400> 172
ttcagacgtg tgctcttccg atctggaatg tctcagctgc tgtgt 45
<210> 173
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon33_2-R
<400> 173
ttcagacgtg tgctcttccg atctgcggat tctgaggatg tgaaaaga 48
<210> 174
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon34_1-R
<400> 174
ttcagacgtg tgctcttccg atctgttctc tctgtggttc tttcctaatg g 51
<210> 175
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon34_2-R
<400> 175
ttcagacgtg tgctcttccg atctcctcta catttgcgag gaaagttc 48
<210> 176
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon35_1-R
<400> 176
ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcta atggcttgca atgattaata agagta 56
<210> 177
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon35_2-R
<400> 177
ttcagacgtg tgctcttccg atctgagtgt gagacgccca atca 44
<210> 178
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon36_1-R
<400> 178
ttcagacgtg tgctcttccg atctgacaac gtcacagtgg agaatg 46
<210> 179
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon36_2-R
<400> 179
ttcagacgtg tgctcttccg atctccgccc aaaaacaatg aatgaac 47
<210> 180
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon37_1-R
<400> 180
ttcagacgtg tgctcttccg atctcaggga ctgacaattt tccctttg 48
<210> 181
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon37_2-R
<400> 181
ttcagacgtg tgctcttccg atctcctggc tgtgaggaat ggaa 44
<210> 182
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon38_1-R
<400> 182
ttcagacgtg tgctcttccg atctaagttg tcatcatcag tggaacagg 49
<210> 183
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon38_2-R
<400> 183
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgggat tctttggcta aataacatca ca 52
<210> 184
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon39-R
<400> 184
ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgatg tcctcagttc tatcatcctc t 51
<210> 185
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon40-R
<400> 185
ttcagacgtg tgctcttccg atctacatgc tttaggttct ctggacttta ttt 53
<210> 186
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon41-R
<400> 186
ttcagacgtg tgctcttccg atctcaacag aatctcagga gccatatcta attt 54
<210> 187
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon42-R
<400> 187
ttcagacgtg tgctcttccg atctcacacc caaagaagta gtgttgc 47
<210> 188
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon43-R
<400> 188
ttcagacgtg tgctcttccg atctgaatca agggtgttga gttgagtaca 50
<210> 189
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon44-R
<400> 189
ttcagacgtg tgctcttccg atctaacaag agtctttctt tccagcaac 49
<210> 190
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon45_1-R
<400> 190
ttcagacgtg tgctcttccg atctccatct accttcattc tccctaatac attact 56
<210> 191
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon45_2-R
<400> 191
ttcagacgtg tgctcttccg atctctgttc cagagcttca cagtttg 47
<210> 192
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon46-R
<400> 192
ttcagacgtg tgctcttccg atctagctac aggaagtccg caag 44
<210> 193
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon47-R
<400> 193
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtgtc cagttttctt attttgcttt catc 54
<210> 194
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon48_1-R
<400> 194
ttcagacgtg tgctcttccg atcttcttgc ttctatggaa accctttcag 50
<210> 195
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon48_2-R
<400> 195
ttcagacgtg tgctcttccg atctgccatt gtgtaataat ctttctgttt tccaa 55
<210> 196
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon49_1-R
<400> 196
ttcagacgtg tgctcttccg atctaattga tgaaagagga atgtattgga ttcaga 56
<210> 197
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon49_2-R
<400> 197
ttcagacgtg tgctcttccg atctctaacc ctcgtggctg gatg 44
<210> 198
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon50_1-R
<400> 198
ttcagacgtg tgctcttccg atctgggagt cgagtgggtc tg 42
<210> 199
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon50_2-R
<400> 199
ttcagacgtg tgctcttccg atctgttgtt ttggcagggt ggtg 44
<210> 200
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon51-R
<400> 200
ttcagacgtg tgctcttccg atctctgttt tgaaaattta ggcaactaga atttagca 58
<210> 201
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon52-R
<400> 201
ttcagacgtg tgctcttccg atctggaggt gaaaatacca ctagcatcc 49
<210> 202
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon53-R
<400> 202
ttcagacgtg tgctcttccg atctaacacg taattcttgt ttttgtgaca tatctg 56
<210> 203
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon54-R
<400> 203
ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaatt tctccctctc tttcttttaa tttcaa 56
<210> 204
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon55-R
<400> 204
ttcagacgtg tgctcttccg atcttggaat gacttttact tacctggctt t 51
<210> 205
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon56-R
<400> 205
ttcagacgtg tgctcttccg atcttagatg atttgtgctg cactgttagt 50
<210> 206
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon57-R
<400> 206
ttcagacgtg tgctcttccg atctccagct agtgattttt gaaacaggtt tt 52
<210> 207
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_1-R
<400> 207
ttcagacgtg tgctcttccg atcttggaga tagagaacat tactctggta gac 53
<210> 208
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_2-R
<400> 208
ttcagacgtg tgctcttccg atctatccaa gaggaggtcg aattggta 48
<210> 209
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_3-R
<400> 209
ttcagacgtg tgctcttccg atcttttcac atccgaggcc acaa 44
<210> 210
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_4-R
<400> 210
ttcagacgtg tgctcttccg atctggaaag tacctgatga catgcatttg 50
<210> 211
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon58_5-R
<400> 211
ttcagacgtg tgctcttccg atctgagtac ttttaaatga caatattgtg tttggca 57
<210> 212
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon59_6-R
<400> 212
ttcagacgtg tgctcttccg atctagagaa cagtggaatt atgcaccc 48
<210> 213
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon59_7-R
<400> 213
ttcagacgtg tgctcttccg atctatcctg gatagcttta actaacttag ggt 53
<210> 214
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon60-R
<400> 214
ttcagacgtg tgctcttccg atctttcttc ttgctgctta tcatgaaatg aaag 54
<210> 215
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_1-R
<400> 215
ttcagacgtg tgctcttccg atctaaatca ggtttattca cgagatgcct 50
<210> 216
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_2-R
<400> 216
ttcagacgtg tgctcttccg atctcccaat gactgtggaa actatctcaa 50
<210> 217
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_3-R
<400> 217
ttcagacgtg tgctcttccg atctctgacc aagtggtcct aattcttgat ag 52
<210> 218
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_4-R
<400> 218
ttcagacgtg tgctcttccg atctccatca ggcaaatcac caaagtc 47
<210> 219
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_5-R
<400> 219
ttcagacgtg tgctcttccg atctatctat tggtgccaac tatttcaaca tca 53
<210> 220
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_6-R
<400> 220
ttcagacgtg tgctcttccg atctagttat agatgatggc aagagtgatg g 51
<210> 221
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon61_7-R
<400> 221
ttcagacgtg tgctcttccg atctgggtat tttcatttgg atgcaatgtg g 51
<210> 222
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon62-R
<400> 222
ttcagacgtg tgctcttccg atcttggaaa attgctacca tagggatatg tg 52
<210> 223
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon63-R
<400> 223
ttcagacgtg tgctcttccg atcttccatc ttttctaact tcacaaaatt ctcttct 57
<210> 224
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon64-R
<400> 224
ttcagacgtg tgctcttccg atctccttta ttgtccaaat gtctgccttc 50
<210> 225
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon65_1-R
<400> 225
ttcagacgtg tgctcttccg atctccattt gctgtcttgc ctgtg 45
<210> 226
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon65_2-R
<400> 226
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgttat tgttggaatc ttgtgattct ctagaaa 57
<210> 227
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon66-R
<400> 227
ttcagacgtg tgctcttccg atctcctaaa tgctgatggt cccactt 47
<210> 228
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon67_1-R
<400> 228
ttcagacgtg tgctcttccg atcttatgcc cagacttcag acaagaga 48
<210> 229
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon67_2-R
<400> 229
ttcagacgtg tgctcttccg atctaggaaa gttagccgcc acatt 45
<210> 230
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PKHD1_exon67_3-R
<400> 230
ttcagacgtg tgctcttccg atctttgtca gaaatgctaa gtatgcaaaa tgtg 54

Claims (8)

1.一种构建PKHD1基因突变的测序文库的方法，包括以下步骤：
第一轮扩增：采用包括由与ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列相同的序列和PKHD1基因各个外显子的正向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮正向扩增引物以及由与ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的另一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列相同的序列和PKHD1基因各个外显子的反向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮反向扩增引物的第一轮扩增引物的组合对各样本的PKHD1基因的一个或多个外显子进行扩增；
消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
第二轮扩增：以第一轮扩增的产物为模板，采用由与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成的第二轮扩增引物的组合进行扩增，其中，所述D5接头引物序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8中，所述N7接头引物序列选自SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20中，其中，所述第二轮扩增引物的组合包括选自由D501～D508(SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:8)中之一和N701～N712(SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20)之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分；
纯化回收所有DNA条带；
测序：回收的产物进行定量后，将不同标签的产物按照测序数据量要求混合后进行上机测序；
分析：基于每个样本的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
2.如权利要求1所述的方法，其中，第一轮扩增中，采用包括由与CCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:23)相同的序列和各个基因的正向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮正向扩增引物以及由与TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO:24)相同的序列和各个基因的反向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮反向扩增引物的第一轮扩增引物的组合对各样本的一个或多个特定基因进行扩增。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一轮扩增引物的组合包括选自SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230中的一对或多对，优选所述第一轮扩增引物的组合包括SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230，更优选所述第一轮扩增引物的组合由SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230组成。
4.一种构建PKHD1基因突变的测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一轮扩增引物的组合：包括由与ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列相同的序列和各个基因的正向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮正向扩增引物以及由与ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的另一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列相同的序列和各个基因的反向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮反向扩增引物的第一轮扩增引物的组合对各样本的一个或多个特定基因进行扩增；
第二轮扩增引物的组合：包括与选自所述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物，其中，所述D5接头引物序列选自SEQ ID NO:1～SEQID NO:8中，所述N7接头引物序列选自SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20中，其中，所述第二轮扩增引物的组合包括选自由D501～D508(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8)中之一和N701～N712(SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20)之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一轮扩增引物的组合包括由与CCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:23)相同的序列和各个基因的正向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮正向扩增引物以及由与TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO:24)相同的序列和各个基因的反向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮反向扩增引物。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一轮扩增引物的组合包括选自SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230中的一对或多对，优选所述第一轮扩增引物的组合包括SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230，更优选所述第一轮扩增引物的组合由SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:230组成。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括DNA聚合酶，优选高保真DNA聚合酶。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括单链消化酶，优选单链消化酶为核酸外切酶I。
CN201610932549.3A 2016-10-25 2016-10-25 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途 Active CN106554955B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610932549.3A CN106554955B (zh) 2016-10-25 2016-10-25 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610932549.3A CN106554955B (zh) 2016-10-25 2016-10-25 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106554955A true CN106554955A (zh) 2017-04-05
CN106554955B CN106554955B (zh) 2020-07-14

Family

ID=58443413

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610932549.3A Active CN106554955B (zh) 2016-10-25 2016-10-25 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106554955B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108486230A (zh) * 2018-05-18 2018-09-04 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 用于无创检测mitf基因突变的试剂盒及其制备方法
CN108531583A (zh) * 2018-05-18 2018-09-14 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 用于无创检测mitf基因突变的引物组合及检测方法
CN108753934A (zh) * 2018-05-18 2018-11-06 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 一种检测基因突变的方法、试剂盒及其制备方法
CN108949951A (zh) * 2018-05-18 2018-12-07 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒
CN109022559A (zh) * 2018-08-21 2018-12-18 华中农业大学 一种基于二代测序技术的分子标记检测方法
CN109554440A (zh) * 2018-12-26 2019-04-02 山东艾克韦生物技术有限公司 多重引物组及利用该引物组基于高通量测序构建人类t细胞免疫组库的方法
CN111139315A (zh) * 2020-04-03 2020-05-12 杭州启棣生物技术有限公司 一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060924A (zh) * 2011-10-18 2013-04-24 深圳华大基因科技有限公司 微量核酸样本的文库制备方法及其应用
CN105524983A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 大连晶泰生物技术有限公司 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒
CN105986015A (zh) * 2015-02-05 2016-10-05 大连晶泰生物技术有限公司 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060924A (zh) * 2011-10-18 2013-04-24 深圳华大基因科技有限公司 微量核酸样本的文库制备方法及其应用
CN105524983A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 大连晶泰生物技术有限公司 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒
CN105986015A (zh) * 2015-02-05 2016-10-05 大连晶泰生物技术有限公司 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108486230A (zh) * 2018-05-18 2018-09-04 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 用于无创检测mitf基因突变的试剂盒及其制备方法
CN108531583A (zh) * 2018-05-18 2018-09-14 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 用于无创检测mitf基因突变的引物组合及检测方法
CN108753934A (zh) * 2018-05-18 2018-11-06 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 一种检测基因突变的方法、试剂盒及其制备方法
CN108949951A (zh) * 2018-05-18 2018-12-07 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒
CN108949951B (zh) * 2018-05-18 2022-01-28 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒
CN108486230B (zh) * 2018-05-18 2022-02-08 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 用于无创检测mitf基因突变的试剂盒及其制备方法
CN108531583B (zh) * 2018-05-18 2022-05-17 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 用于无创检测mitf基因突变的引物组合及检测方法
CN109022559A (zh) * 2018-08-21 2018-12-18 华中农业大学 一种基于二代测序技术的分子标记检测方法
CN109554440A (zh) * 2018-12-26 2019-04-02 山东艾克韦生物技术有限公司 多重引物组及利用该引物组基于高通量测序构建人类t细胞免疫组库的方法
CN111139315A (zh) * 2020-04-03 2020-05-12 杭州启棣生物技术有限公司 一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106554955B (zh) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106554955B (zh) 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途
CN104372093B (zh) 一种基于高通量测序的snp检测方法
WO2019144582A1 (zh) 用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法
CN104131008A (zh) Dna标签、pcr引物及其应用
CN102586423B (zh) 一种检测结直肠癌易感基因的方法及试剂盒
CN102373287A (zh) 一种检测肺癌易感基因的方法及试剂盒
CN110218781B (zh) 21个微单倍型位点的复合扩增体系、下一代测序分型试剂盒及分型方法
CN105624272A (zh) 基因组预定区域核酸测序文库的构建方法及装置
CN102586420A (zh) 一种检测乳腺癌易感基因的方法及试剂盒
CN107217107A (zh) 一种快速检测cyp2c19基因多态性的方法和试剂盒
CN104830993A (zh) 一种高通量、多种类型分子标记通用的分型技术
CN109477245A (zh) 生成用于大规模平行测序的dna文库的方法和试剂盒
CN106755329A (zh) 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒
CN105734679A (zh) 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法
CN105603100A (zh) 检测f8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法
CN115715323A (zh) 一种高兼容性的PCR-free建库和测序方法
CN105018583A (zh) 用于检测华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因的多态性的试剂盒及其应用
CN111073964B (zh) 用于检测人类白细胞抗原hla-abcdrdq基因分型的试剂盒
CN108060227A (zh) 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法
CN114438210B (zh) 一种基于高通量测序子宫内膜癌分子分型的文库构建方法
CN110777154A (zh) 用于结核分枝杆菌耐药检测的突变基因、及其检测方法和试剂盒
CN111500748B (zh) 用于检测617种SNP和InDel的引物组合及其在法医鉴定和亲缘关系鉴定中的应用
CN107937493A (zh) 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物
KR101724130B1 (ko) 장 베체트병 진단용 바이오마커 및 이의 용도
CN111793623B (zh) 62个多等位snp-ngs的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20241112

Address after: 116600 no.9-2 Jinqi Road, Dalian Economic and Technological Development Zone, Liaoning Province

Patentee after: Dalian Jingtai medical laboratory Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: 116635 Jinqi Road 9-2, Advanced Equipment Manufacturing Park, Dalian Economic and Technological Development Zone, Liaoning Province

Patentee before: DALIAN GENTALKER BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Country or region before: China