CN106501396B - 一种痔疮药物指标成分含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种痔疮药物指标成分含量的检测方法，其属于医药技术领域。所述指标成分包括苦参碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱和氢溴酸东莨菪碱。为了规避仅测定单一成分或两种成分的含量，本发明采用高效液相色谱法，从痔疮药物供试品溶液的配制、对照品溶液的配制以及色谱条件选择上成功地实现了同时且快速测定四个指标成分含量。该检测方法还具有准确度、精密度高，稳定性、重复性及专属性好的特点。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种痔疮药物指标成分含量的检测方法。
背景技术
痔疮是一种位于肛门部位的常见疾病，随着年龄增长，发病率逐渐增高。用于治疗痔疮的痔疮药按类别可以分为三大类：西药、中药和中西药复方制剂，中药有痔炎消颗粒、痔康片和痔疮止血丸等，中西药复方制剂有化痔栓等，相比西药，中药和中西药复方制剂的成分相对复杂。
《中国药典》2015年版一部公开了化痔栓的处方为：次没食子酸铋200g、苦参370g、黄柏92.5g、洋金花55.5g、冰片30g。化痔栓的制法为：苦参、黄柏、洋金花加水煎煮二次，第一次4h，第二次2h；合并煎液，过滤并静置12h，将上清液浓缩至相对密度为1.12(60～65℃)的清膏，干燥后粉碎成最细粉；将2.6g的羟苯乙酯用适量乙醇溶解；另取基质适量，加热熔化，加入次没食子酸铋、上述最细粉、冰片以及16.8g聚山梨酯80、羟苯乙酯乙醇液，混匀、灌注，即制成1000粒。本品清热燥湿，收涩止血，用于大肠湿热所致的内外痔、混合痔疮。目前，《中国药典》仅收载了次没食子酸铋及冰片中龙脑的含量测定方法。化痔栓作为中西药复方制剂，不是若干成分简单地加合，而是多个活性成分整体发挥疗效作用。现有技术仅对次没食子酸铋、冰片中的龙脑和苦参中的苦参碱进行检测，仍有多个指标成分未得到检测，缺乏全面性而不能反映药品整体质量。
此外，相关文献有公布过：检测含苦参、黄柏或洋金花药材的中药相关成分的含量，但这些方法仍旧比较片面，难以适用于化痔栓乃至痔疮药物的质量检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种更全面、可靠的痔疮药物指标成分含量的检测方法，本发明将盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、苦参碱和氢溴酸东莨菪碱作为化痔栓乃至痔疮药的指标成分，采用高效液相色谱法同时快速地定量测定，避免仅靠检测单一成分而误判药物的质量。
本发明采用的技术方案为：一种痔疮药物指标成分含量的检测方法，所述指标成分包括苦参碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱和氢溴酸东莨菪碱，所述检测方法包括以下步骤：
1)痔疮药物供试品溶液的配制：将痔疮药物粉末置于醇溶液中提取，过滤，浓缩滤液；
对照品溶液的配制：配制苦参碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱和氢溴酸东莨菪碱的对照品溶液；
2)分别精密吸取痔疮药物供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定；其中色谱条件选择为：采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为含有十二烷基磺酸钠的酸溶液，检测波长为210～230nm，柱温为20～30℃。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述检测波长为220nm，柱温为20℃，此时各指标成分(苦参碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱和氢溴酸东莨菪碱)之间分离效果较佳。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述痔疮药物供试品溶液的配制具体为：将痔疮药物粉末置于醇溶液中，相对于每克痔疮药物，所述醇溶液的体积为20～30mL；超声处理30～60min，冷却后添加醇溶液，补足减小的重量；冷冻30～60min后进行过滤，将滤液浓缩至原体积的2/25～1/8。
更优选地，相对于每克痔疮药物，所述醇溶液的体积为25mL，浓缩液的体积为原体积的1/10，此时醇溶液提取的指标成分含量更佳，不需要过度浓缩，且适合高效液相色谱的测定。
更优选地，所述痔疮药物溶液配制的超声处理时间为45min，冷冻时间为45min。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述对照品溶液的配制具体为：称取苦参碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、盐酸小檗碱对照品和氢溴酸东莨菪碱的对照品，加入所述醇溶液配制成苦参碱浓度为241.3～3860.0μg/mL、盐酸黄柏碱浓度为27.4～438.4μg/mL、盐酸小檗碱浓度为25.9～414.0μg/mL、氢溴酸东莨菪碱浓度为10.1～161.8μg/mL的混合溶液。对照品混合液浓度在上述范围内时，得出的线性关系更优，检测的指标成分含量更准确。
作为对上述技术方案的更进一步改进，所述醇溶液为50％～100％甲醇溶液或50％～100％乙醇溶液。50％～100％甲醇或乙醇提取的四种指标成分效果更好，含量检测的结果比较客观。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述醇溶液为60％甲醇溶液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述流动相B中的酸为冰醋酸、磷酸或甲酸，所述酸在流动相B中的体积百分数为0.05％～0.3％，所述十二烷基磺酸钠在流动相B中的质量百分数为0.1％～0.3％。
作为对上述技术方案的更进一步改进，所述酸在流动相B中的体积百分数为0.1％，所述十二烷基磺酸钠在流动相B中的质量百分数为0.2％。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述梯度洗脱的程序为：
0～9min，流动相A为33％→35％，流动相B为67％→65％；
9～18min，流动相A为35％→40％，流动相B为65％→60％；
18～30min，流动相A为40％→50％，流动相B为60％→50％；
30～50min，流动相A为50％→60％，流动相B为50％→40％；
以上涉及的百分比均为体积百分比。
该梯度洗脱的程序能在保证分离四种指标成分的前提下，缩短各组分的保留时间，提高检测效率，同时确保色谱基线比较平稳。
作为对上述技术方案的进一步改进，测定时使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述痔疮药物为化痔栓。
本发明的有益效果在于：本发明将盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、苦参碱和氢溴酸东莨菪碱作为化痔栓乃至痔疮药物的指标成分，规避了仅测定单一成分或两种成分含量的问题；但是，中药和中西药复方制剂成分复杂，易影响分离、测定，本发明为此采用高效液相色谱法，从供试药物溶液、对照品溶液的制备以及色谱条件和流动相系统选择上通过大量创造性的劳动成功地实现了同时且快速测定四个指标成分含量。该检测方法同时还具有准确度、精密度高，稳定性、重复性及专属性好的特点。
附图说明
图1是盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、苦参碱和氢溴酸东莨菪碱混合对照品溶液的HPLC色谱图；
图2是化痔栓供试药物溶液的HPLC色谱图；
图3是阴性样品溶液的HPLC色谱图，其中阴性样品不包括盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、苦参碱和氢溴酸东莨菪碱。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及附表对本发明作进一步说明。
实施例1
1)供试品溶液的配制：取化痔栓粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中；向锥形瓶中精密加入60％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理45min；放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量；摇匀，冷冻45min；过滤，精密移取续滤液20mL，浓缩至2mL，即得。
对照品溶液的配制：取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、苦参碱对照品和氢溴酸东莨菪碱对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成苦参碱浓度为1930.0μg/mL、盐酸黄柏碱浓度为109.6μg/mL、盐酸小檗碱浓度为103.5μg/mL、氢溴酸东莨菪碱浓度为20.2μg/mL的混合对照品溶液。
2)高效液相色谱的测定条件：色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为含0.2％十二烷基磺酸钠的0.1％磷酸溶液；检测波长为220nm，柱温为20℃，进样量为10μL，梯度洗脱的程序见表1(其中，涉及的百分比为体积百分比)。供试品溶液的指标成分含量(浓度)＝(对照品溶液浓度×供试品溶液峰面积)/对照品峰面积，下同。
表1为梯度洗脱程序
实施例2
检测步骤参照实施例1，不同的是：供试药物溶液和对照品溶液的配制过程中，以50％甲醇作为提取溶剂；供试品溶液配制过程中，超声处理和冷冻时间为30min；混合对照品溶液中苦参碱浓度为241.3μg/mL、盐酸黄柏碱浓度为27.4μg/mL、盐酸小檗碱浓度为25.9μg/mL、氢溴酸东莨菪碱浓度为10.1μg/mL；高效液相色谱测定时，流动相B为含0.3％十二烷基磺酸钠的0.05％磷酸溶液，检测波长为210nm，柱温为25℃。
实施例3
检测步骤参照实施例1，不同的是：供试药物溶液和对照品溶液的配制过程中，以甲醇作为为提取溶剂；供试品溶液配制过程中，超声处理和冷冻时间为60min；混合对照品溶液中苦参碱浓度为3860.0μg/mL、盐酸黄柏碱浓度为438.4μg/mL、盐酸小檗碱浓度为414.0μg/mL、氢溴酸东莨菪碱浓度为161.8μg/mL；高效液相色谱测定时，流动相B为含0.1％十二烷基磺酸钠的0.3％磷酸溶液，检测波长为230nm，柱温为30℃。
实施例4
检测步骤参照实施例1，不同的是：供试品溶液和对照品溶液的配制过程中，以50％乙醇作为提取溶剂。
实施例5
检测步骤参照实施例1，不同的是：供试品溶液和对照品溶液的配制过程中，以70％乙醇作为提取溶剂。
实施例6
检测步骤参照实施例1，不同的是：供试品溶液和对照品溶液的配制过程中，以乙醇作为提取溶剂。
实施例7
检测步骤参照实施例1，不同的是：高效液相色谱测定时，流动相B为含0.2％十二烷基磺酸钠的0.1％冰醋酸溶液。
实施例8
检测步骤参照实施例1，不同的是：高效液相色谱测定时，流动相B为含0.1％十二烷基磺酸钠的0.05％冰醋酸溶液。
实施例9
检测步骤参照实施例1，不同的是：高效液相色谱测定时，流动相B为含0.3％十二烷基磺酸钠的0.3％冰醋酸溶液。
实施例10
检测步骤参照实施例1，不同的是：高效液相色谱测定时，流动相B为含0.2％十二烷基磺酸钠的0.1％甲酸溶液。
实施例11
检测步骤参照实施例1，不同的是：高效液相色谱测定时，流动相B为含0.1％十二烷基磺酸钠的0.05％甲酸溶液。
实施例12
检测步骤参照实施例1，不同的是：高效液相色谱测定时，流动相B为含0.3％十二烷基磺酸钠的0.3％甲酸溶液。
实施例13
指标成分含量测定的验证
1 试验材料
本发明检测方法中所用试剂均为市售，其中用于含量测定的乙腈为色谱纯(LABSCIENCE公司生产)，水为超纯水，其它试剂为分析纯。化痔栓由广州白云山敬修堂药业股份有限公司提供；苦参碱对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号805-9001，含量为100％；盐酸黄柏碱对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号为111895-201303，含量为95.8％；盐酸小檗碱对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号为110713-201212，含量为86.7％；氢溴酸东莨菪碱对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号100049-200308，含量为100％。
2 仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪，光电二极管阵列检测器(DAD)，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，Agilent ZORBAX SB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，Phenomenex Synergi 4μFusion-RP 80A柱(250mm×4.6mm，4μm)。KQ-600DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，Precisa 404A、ME204T/02型电子分析天平。
3 痔疮药物供试品溶液的配制
取化痔栓粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中；精密加入60％甲醇25mL；密塞锥形瓶，称定重量，超声处理45min；放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量；摇匀，冷冻45min；过滤，精密移取续滤液20mL，浓缩至2mL，即得。
4 对照品溶液的配制
取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、苦参碱对照品和氢溴酸东莨菪碱对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成苦参碱浓度为1930.0μg/mL、盐酸黄柏碱浓度为109.6μg/mL、盐酸小檗碱浓度为103.5μg/mL、氢溴酸东莨菪碱浓度为20.2μg/mL的混合对照品溶液，即得。
5 高效液相色谱的测定条件
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；以乙腈为流动相A，以含0.2％十二烷基磺酸钠的0.1％磷酸溶液为流动相B；检测波长为220nm；柱温为20℃，进样量为10μL；见表1梯度洗脱的程序。
6 线性关系考察
精密称取对照品盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、苦参碱和氢溴酸东莨菪碱适量，加60％甲醇制成盐酸小檗碱浓度为414.0μg/mL，盐酸黄柏碱浓度为438.4μg/mL，苦参碱浓度为3860.0μg/mL，氢溴酸东莨菪碱浓度为161.8μg/mL的混合对照品溶液。通过稀释即得混合对照品溶液中的盐酸小檗碱浓度分别为25.9、51.8、103.5、207.0、414.0μg/mL，对应的盐酸黄柏碱浓度分别为27.4、54.8、109.6、219.2、438.4μg/mL，对应的苦参碱浓度分别为241.3、482.5、965.0、1930.0、3860.0μg/mL,对应的氢溴酸东莨菪碱浓度分别为10.1、20.2、40.4、80.9、161.8μg/mL。分别精密吸取上述对照品混合溶液各10μL，注入液相色谱仪，按含量测定方法测定。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X，μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程见表2。从表2中，可以得出苦参碱浓度为241.3～3860.0μg/mL、盐酸黄柏碱浓度为27.4～438.4μg/mL、盐酸小檗碱浓度为25.9～414.0μg/mL、氢溴酸东莨菪碱浓度为10.1～161.8μg/mL的混合溶液中，四个指标成分均呈现良好的线性关系。在日常检测中，只要样品浓度在标曲浓度范围内，则无需每次绘制标曲，可采用外标一点法进行检测。
表2为线性关系考察结果
7 稳定性试验
取同一份化痔栓药物，制备后，按含量测定方法，分别在0、2、4、8、16、24、32h进样测定。结果发现化痔栓溶液自制备后32h内测定基本稳定，见表3。
表3为稳定性试验结果
8 重复性试验
取同一批化痔栓6份，参照“供试药物溶液的制备”，采用高效液相色谱进行盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、苦参碱和氢溴酸东莨菪碱含量的测定，结果见表4。
表4为重复性试验结果
9 不同色谱柱的比较
取同一批化痔栓2份，按含量测定方法，分别用A柱(Agilent Eclipse Plus C18柱，规格250mm×4.6mm，5μm)、B柱(Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格250mm×4.6mm，5μm)、C柱(Phenomenex Synergi 4μFusion-RP 80A柱，规格250mm×4.6mm，4μm)三种型号的色谱柱测定。结果发现采用三种型号的色谱柱进行测定，化痔栓的含量无明显差别，结果见表5。
表5为不同色谱柱的测定结果
10 加样回收率试验
取同一批已知含量的化痔栓6份，每份取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中；分别精密加入1mL盐酸小檗碱对照品溶液(0.1235mg/mL)、1mL盐酸黄柏碱对照品溶液(0.1226mg/mL)、1mL苦参碱对照品溶液(2.821mg/mL)和1mL氢溴酸东莨菪碱(0.02674mg/mL)，余下按“供试品溶液的制备”进行处理并测定，结果见表6～表9。
表6盐酸小檗碱的回收率
表7为盐酸黄柏碱的回收率
表8为苦参碱的回收率
表9为氢溴酸东莨菪碱的回收率
11 专属性试验
按化痔栓处方称取除黄柏、苦参和洋金花以外的药材，按制备工艺制成阴性样品。再按供试药物溶液的制备方法制成阴性样品溶液。精密吸取对照品溶液、化痔栓溶液和阴性样品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，按含量测定方法进行测定。结果发现在与盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、苦参碱对照品和氢溴酸东莨菪碱对照品色谱相应的位置上，阴性样品溶液无干扰，说明该测定方法具有较好的专属性，见附图1～3。
综合上述，以上试验结果表明：该检测方法操作简便、可操作性强、结果准确、专属性及重现性好，适合作为质量控制方法，且在同一个HPLC方法条件下能同时测定盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、苦参碱和氢溴酸东莨菪碱四个指标成分的含量。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质。
Claims (5)
1.一种痔疮药物指标成分含量的检测方法，其特征在于：所述指标成分包括苦参碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱和氢溴酸东莨菪碱，所述检测方法包括以下步骤：
1)痔疮药物供试品溶液的配制：将痔疮药物粉末置于醇溶液中提取，过滤，浓缩滤液；
对照品溶液的配制：配制苦参碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱和氢溴酸东莨菪碱的对照品溶液；
痔疮药物供试品溶液和对照品溶液配制时采用的溶剂为50％～100％甲醇溶液或50％～100％乙醇溶液；
所述痔疮药物为化痔栓；
2)分别精密吸取痔疮药物供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定；其中色谱条件选择为：采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为含有十二烷基磺酸钠的酸溶液，所述流动相B中的酸为冰醋酸、磷酸或甲酸，所述酸在流动相B中的体积百分数为0.05％～0.3％，所述十二烷基磺酸钠在流动相B中的质量百分数为0.1％～0.3％；检测波长为210～230nm，柱温为20～30℃，测定时使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；
所述梯度洗脱的程序为：
0～9min，流动相A为33％→35％，流动相B为67％→65％；
9～18min，流动相A为35％→40％，流动相B为65％→60％；
18～30min，流动相A为40％→50％，流动相B为60％→50％；
30～50min，流动相A为50％→60％，流动相B为50％→40％。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述痔疮药物供试品溶液的配制具体为：将痔疮药物粉末置于醇溶液中，相对于每克痔疮药物，所述醇溶液的体积为20～30mL；超声处理30～60min，冷却后添加醇溶液，补足减小的重量；冷冻30～60min后进行过滤，将滤液浓缩至原体积的2/25～1/8。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述对照品溶液的配制具体为：称取苦参碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、盐酸小檗碱对照品和氢溴酸东莨菪碱的对照品，加入所述醇溶液配制成苦参碱浓度为241.3～3860.0μg/mL、盐酸黄柏碱浓度为27.4～438.4μg/mL、盐酸小檗碱浓度为25.9～414.0μg/mL、氢溴酸东莨菪碱浓度为10.1～161.8μg/mL的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述醇溶液为60％甲醇溶液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述酸在流动相B中的体积百分数为0.1％，所述十二烷基磺酸钠在流动相B中的质量百分数为0.2％。
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