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CN106460056A - 新型试样内检测对象物的检测方法及利用其的检测试剂盒 - Google Patents

新型试样内检测对象物的检测方法及利用其的检测试剂盒 Download PDF

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CN106460056A CN201580027380.0A CN201580027380A CN106460056A CN 106460056 A CN106460056 A CN 106460056A CN 201580027380 A CN201580027380 A CN 201580027380A CN 106460056 A CN106460056 A CN 106460056A
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Abstract

本发明涉及新型试样内检测对象物的检测方法及利用其的检测装置。在本发明的检测方法中，通过使用在金纳米粒子和检测对象物结合特异性抗体的“桥复合体”来诱导抗体与检测对象物之间的充分的结合反应，从而可提高反应性。由此，具有如下的优点，即，可通过提供优秀的分解能力或分离能力来准确地测定试样内检测对象物的浓度，可增大测定信号。并且，在本发明的方法中，可有效地检测激素、维生素等分子量小的小分子。

Description

新型试样内检测对象物的检测方法及利用其的检测试剂盒
技术领域
本专利申请要求于2014年5月23日向韩国专利局提交的韩国申请专利第10-2014-0062143号的优先权，上述专利申请的公开内容引入本说明书作为参考。
本发明涉及新型试样内检测对象物的检测方法及利用其的检测试剂盒。
背景技术
睾酮(Testosterone)作为呈现二次性征的男性激素，属于雄激素组的类固醇，主要在生殖腺分泌。睾酮与男性更年期的(1)性欲减退及勃起能力及频率下降，(2)智力活性、认知功能、空间知觉能力的减退、疲劳、情绪低落及不安的情绪变化，(3)睡眠障碍，(4)与肌肉量及肌肉强度的减退相关的体脂肪量减少，(5)内脏脂肪的增加，(6)体毛的减少及皮肤疾病，以及(7)因骨密度减少而导致的骨质减少症及骨折危险增加有关。
主要通过分析存在于血液内的睾酮的量来诊断，睾酮的增加与雄性激素抵抗性、卵巢癌、睾丸癌、先天性肾上腺皮质增生症(ngenital adrenal hyperplasia)或儿童性早熟有关，睾酮的减少与慢性疾病、脑下垂体异常、青春期延迟、睾丸异常或由导致催乳素过剩的脑下垂体细胞形成的未癌化的肿瘤有关。
另一方面，存在于生物体内的睾酮大部分以与蛋白质相结合的状态存在，而不是以游离状态存在。即，游离状态是睾酮仅为约2～3％，44～65％的睾酮以与性激素结合球蛋白(Sex Hormone Binding Globu lin，SHBG)相结合的状态存在，33～54％的睾酮以与白蛋白相结合的状态存在。因这种原因，难以检测存在于血液内的睾酮。
通常，为了去除与睾酮相结合的蛋白质，需要利用引起蛋白质变性的酸溶液，或者使用作为具有类似于睾酮结构的激素的2-甲氧雌二醇(2-ME)。根据情况，为了获取用于获取充分的信号的游离(free)状态的睾酮，可调节反应条件及反应试剂。
另一方面，将睾酮(分子量为288.42)等的激素适用于以往的检测方法的情况下，因分子量小而无法适用夹心测定法(Sandwich Assay)。
在本发明中所要利用的检测方法是利用了竞争性分析反应(comp etitiveassay)，将金纳米粒子使用为媒介物，相比于利用以往的竞争反应的分析法提高反应灵敏度来增大测定信号，从而确立可更加准确地检测如睾酮的小分子的方法。
本说明书全文中，参考并引用了多篇论文及专利文献。所引用的论文及专利文献的全部公开内容引入本说明书作为参考，对本发明所属技术领域的水平及本发明的内容进行更加明确的说明。
发明内容
技术问题
本发明人为了开发新型试样内检测对象物的检测方法而不断进行研究。其结果，发明人开发了如下的方法，即，在试样内存在检测对象物的情况下，试样内检测对象物与“桥复合体”相结合，由此，结合有检测对象物的“桥复合体”及产生信号的“竞争者载体复合体”与支撑体上的等效结合物不相结合，最终，在上述支撑体上不产生信号，从而可准确地检测试样内检测对象物。在以往的流体流动检测方法(liquid flow assay)中，利用酸性化或检测对象物的类似物(analog)等来分离与检测对象物相结合的非目标(nontarget)物质后，直接适用于分析，与此不同地，在本发明的方法中，使从上述结合蛋白质分离的试样内检测对象物与粒子相接触，上述粒子使特异性结合剂(例如，抗体)与检测对象物相结合，以使检测对象物、结合剂及粒子的复合体适用于流动分析。通过执行上述过程，诱导检测对象物与结合剂的充分反应来完成适合本发明的检测方法的状态的装载(loading)试样，由此，确认能够进行更精密的定性及定量分析。并且，本发明的新型试样内检测对象物的检测方法具有如下优点，即，无需进行额外的清洗过程，因此，通过最小化因外部因素而产生的影响来提高数据的安全性，并可通过提供相比于以往的方法更精密的分解能力(resolution)来准确地测定试样内检测对象物的的浓度，并可增大测定信号。
因此，本发明的目的在于，提供新型试样内检测对象物的检测方法。
本发明的另一目的在于，提供新型试样内检测对象物的检测试剂盒。
本发明的其他目的及优点通过下述的发明的详细说明、发明要求保护范围及附图而变得更加明确。
解决问题的方案
根据本发明的一方面，本发明提供试样内检测对象物的检测方法，包括：步骤(a)，使试样与竞争者载体复合体(i)及桥复合体(ii)相接触(contacting)，上述竞争者载体复合体与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物(binding equivalents)相结合且可产生信号(acompetitor carrier complex having an analyte and being capable ofgenerating signal)，上述桥复合体与结合剂(binder)相结合，上述结合剂与检测对象物特异性结合，在上述试样内存在检测对象物的情况下，上述试样内检测对象物与上述桥复合体相结合；步骤(b)，使上述步骤(a)的产物与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相接触，上述检测对象物与支撑体上的试验区域(test zone)相结合；在上述试样内存在检测对象物的情况下，与上述试样内检测对象物相结合的上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物不相接触，在上述支撑体上不产生信号，在上述试样内不存在检测对象物的情况下，上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物相结合，上述竞争者载体复合体与上述桥复合体相结合，从而在上述支撑体上产生信号；步骤(c)，在上述步骤(b)的产物中对从上述竞争者载体复合体产生的信号的强度进行测定。
本发明人为了开发新型试样内检测对象物的检测方法而不断进行研究的结果，开发了如下的方法，即，在试样内存在检测对象物的情况下，试样内检测对象物对“产生信号的竞争者载体复合体”以竞争的方式与“桥复合体”相结合，由此，结合有检测对象物的桥复合体与支撑体上的等效结合物不相结合，最终，在上述支撑体上不产生信号，从而可准确地检测试样内检测对象物。在以往的流体流动检测方法中，利用酸性化或检测对象物的类似物等来分离与检测对象物相结合的非目标物质后，直接适用于分析，与此不同地，在本发明的方法中，使从上述结合蛋白质分离的试样内检测对象物与粒子相接触，上述粒子使特异性结合剂(例如，抗体)与检测对象物相结合，以使检测对象物、结合剂及粒子的复合体适用于流动分析。通过执行上述过程，诱导检测对象物与结合剂的充分反应来完成适合本发明的检测方法的状态的装载试样，由此，确认可进行更精密的定性及定量分析。并且，无需进行额外的清洗过程，因此，通过最小化因外部因素而产生的影响来提高数据的安全性，并可通过提供相比于以往的方法更精密的分解能力来准确地测定试样内检测对象物的的浓度，并可增大测定信号。
本发明的检测方法作为利用竞争性反应(competitive reaction)来检测存在于分析试样内的检测对象物的方法，本发明人考虑如下问题，并为了开发用于改善这种问题的试样内检测对象物的检测方法而作出努力，其结果，设计了本发明的检测方法，即，以往的竞争性分析反应中，(i)在流体流动中的反应(内部反应)中，使检测对象物与固定于支撑体(support)的抗体相结合的情况下，试样内检测对象物与抗体的反应时间不充分，因此难以实现准确的定量分析，(ii)在适用流体流动前试管内反应(外部反应)中，在将检测对象物与抗体进行反应的情况下，并在不产生检测信号或通过使抗体与微珠(bead)相结合来进行外部反应的情况下，当测定信号时，需要去除与微珠相结合的抗体的额外的清洗过程(washing)。
根据本发明的实施例，为了分离结合有作为检测对象物的睾酮而使用了竞争者激素(例如，2-甲氧雌二醇)，但此外，可以使用用于从非目标物质分离检测对象物的多种公知的方法。
在本发明的方法中，①通过使用在金纳米粒子和检测对象物特异性结合抗体的“桥复合体”来诱导抗体与检测对象物之间的充分的结合反应，从而可提高反应性，②因优秀的分解能力或分离能力而可将检测对象物分离为细密的浓度范围，由此，可准确地测定试样内检测对象物的浓度。③并且，在本发明的方法中，可有效地检测激素、维生素等分子量小的小分子(small molecule)。
在本说明书中，术语“试样”作为包含检测对象物的物质，包括来源于所有哺乳动物的有机物质(organic materials)及人工合成的有机分子(organic molecules)，但并不局限于此。例如，上述试样包括来源于病毒、细菌、细胞或组织的提取物、溶解产物(lysate)或纯化物、血液、血浆、血清、淋巴液、骨髓液、唾液、眼球液、精液、脑提取物、脊髓液、关节液、胸腺液、腹水或羊膜液等的生物性试样、污染物质、毒素、有毒化学物质、法医学性物质或与此类似的物质。上述有机分子是指在碳、氮、氧和/或硫原子之间具有共价键的分子。有机分子可选自如一氧化碳的小尺寸的分子、如共聚物(polymer)的复杂的大尺寸的分子。
在本说明书中，术语“等效结合物”是指具有与检测对象物相同的结合特性的所有生化化合物。在本发明中，检测对象物及等效结合物可为蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、核酸或化合物。上述检测对象物及等效结合物包括公知的多种化学激素(chemical hormone)及它们的类似物，例如，睾酮、促甲状腺激素(TSH)、人体生长激素、孕酮、人绒毛膜促性腺激素(hCG)及它们的类似物激素。根据本发明的一实施例，上述等效结合物为睾酮-3-羧甲基肟-牛血清白蛋白(BSA)。
根据本发明，上述检测对象物及等效结合物为化学激素及与蛋白质相结合的化学激素，更详细地，上述检测对象物及等效结合物为睾酮、与性激素结合球蛋白相结合的睾酮或与白蛋白(Albumin)相结合的睾酮。另一方面，本发明的方法不仅使用于检测睾酮，而且还可以广泛地使用于检测如维生素D的小分子。
在本说明书中，术语“竞争者载体复合体”作为包含等效结合物及粒子或微珠的复合体，上述粒子或微珠与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合。上述粒子或微珠可产生信号，例如，上述粒子或微珠包括纳米粒子、微米粒子、纳米微珠或微米微珠。上述粒子或微珠的直径可为200nm至1000nm，根据本发明，上述粒子或微珠的直径为200nm至500nm。根据本发明，上述竞争者载体复合体可为等效结合物与微珠相结合的复合体，更详细地，等效结合物可与抗体相结合，上述等效结合物与上述竞争者载体复合体的微珠相结合，上述抗体与桥复合体相结合。
在本说明书中，术语“结合剂”作为与检测对象物特异性结合的物质，例如，包括对检测对象物具有特异性作用的结合的蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、核酸及化合物。例如，上述结合剂为抗体、变形抗体、抗体类似物、艾普肽(aptide，结合了抗体与肽的优点的新物质)、受体、链霉亲和素、抗生物素蛋白、中性亲和素、核酸适体、凝集素、底物(substrate)、脱氧核糖核酸、核糖核酸、脂质或病毒蛋白质。根据本发明，上述结合剂为抗体。
在本说明书中，术语“桥复合体”作为包含结合剂及粒子或微珠的复合体(complex)，上述粒子或微珠与结合剂相结合，上述结合剂与检测对象物特异性结合，结合剂可与试样内检测对象物或等效结合物相结合，上述结合剂与上述桥复合体相结合。上述粒子或微珠包括纳米粒子、微米粒子、纳米微珠或微米微珠。上述粒子或微珠的直径可为20nm至80nm，根据本发明，上述粒子或微珠的直径为40nm至50nm。
根据本发明，上述桥复合体为“对金纳米粒子和检测对象物具有特异性作用的抗体”的复合体。另一方面，上述桥复合体的每一个粒子可包含多个结合剂。
以下，对如上所述的本发明的方法的试样内检测对象物的检测方法进行具体的说明。
步骤(a)：试样、竞争者载体复合体及桥复合体的接触
首先，使试样与竞争者载体复合体(i)及桥复合体(ii)相接触，上述竞争者载体复合体与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合，上述桥复合体与结合剂相结合，上述结合剂与检测对象物特异性结合。
在上述试样内存在检测对象物的情况下，上述试样内检测对象物与上述桥复合体相结合。
与桥复合体相结合的试样内检测对象物与竞争者载体复合体可同时以竞争的方式进行反应，或者分别能够以选择的方式依次进行反应。例如，(i)在使试样、竞争者载体复合体及桥复合体同时接触的情况下，上述桥复合体以与上述竞争者载体复合体竞争的方式与上述试样内检测对象物相结合，(ii)在以选择的方式依次接触的情况下，与同时接触的情况不同地，桥复合体与检测对象物(试样)或等效结合物(竞争者载体复合体)相结合，且几乎不发生竞争性反应。
根据本发明，首先，形成试样内检测对象物和桥复合体结合的复合体后，桥复合体的残余结合剂可与竞争者载体复合体相结合。例如，通过使试样与桥复合体进行反应来形成检测对象物-桥复合体的复合体后，适用于本发明的检测试剂盒的情况下，上述复合体与试验区域的等效结合体相结合后，竞争者载体复合体与桥复合体的非结合抗体相结合。
根据本发明，上述竞争者载体复合体包含作为粒子的色粒子(coloredparticle)，从上述色粒子直接产生信号。例如，上述色粒子为荧光分子的粒子、显色性金属粒子、显色性脂质体、炭黑粒子、显色性共聚物粒子、磷光分子的粒子或双分子的粒子。
根据本发明，上述竞争者载体复合体的粒子或微珠还包含可检测的信号产生标识，上述信号可从上述信号产生标识产生。术语“信号”是指可检测的参数(parameter)，包括光学性、电性或磁性参数的流动、荧光辐射、红外线辐射、紫外线辐射、化学发光、光反射或上述信号的吸收程度。产生可检测的信号的标识包括化学物质(例如，生物素)、酶(碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶及细胞色素P450)、放射性物质、化学发光物质(chemiluminescent)及荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，但并不局限于此。多种标签及标注方法记载在Ed Harlow and David Lane，UsingAntibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999。
上述标识可根据发散的波长观察到各不相同的荧光信号。上述标识可包含公知的多种荧光物质，例如，荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、藻红蛋白、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶基异硫氰酸酯、萤光黄VS、4-乙酰氨基-4’-异硫-氰酰芪-2，2’-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4’-异硫氰酰基苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺基-芘丁酸、4-乙酰氨基-4’-异硫氰酰芪-2，2’-二磺酸衍生物、LCTM-Red 640、LCTM-Red 705、PC5、Cy5、Cy5.5、丽丝胺、异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、二亚乙基三胺五乙酸酯、1-二甲胺基萘基-5-磺酸盐、1-苯氨基-8-萘磺酸盐、2-p-甲苯胺基-萘磺酸盐、3-苯基-7-异氰酸基香豆素、9-异硫氰酰吖啶、吖啶橙、N-(p-(2-苯并恶唑基)苯基)马来酰亚胺、苯并恶二唑、芪及嵌二萘，但并不局限于此。
在本发明的方法中，在上述检测对象物为与蛋白质相结合的化学激素情况下，上述步骤(a)可包括如下的子步骤(sub-step)。
子步骤(a-1)，使经过解离剂(displacement agent)处理的上述试样与上述桥复合体相接触，上述解离剂用于从上述与蛋白质相结合的化学激素解离上述化学激素；以及子步骤(a-2)，使上述子步骤(a-1)中的产物与上述竞争者载体复合体相接触。
上述解离剂作为用于分离化学激素和蛋白质的试剂，可使用酸、碱、重金属或有机溶剂及竞争者激素等。根据本发明，上述解离剂为竞争者激素(例如，2-甲氧雌二醇)，上述竞争者激素以竞争的方式作用于上述化学激素(例如，睾酮)，从而分离与上述化学激素相结合的蛋白质(性激素结合球蛋白或白蛋白)。
另一方面，在执行上述步骤(a)之前，上述竞争者载体复合体位于上述支撑体上试验区域的上游侧。在此情况下，试样与竞争者载体复合体一同经由试验区域，上述试验区域与等效化合物相结合。
根据本发明，包括“试样区域”(i)、“竞争者载体复合体区域”(ii)及“试验区域”(ⅲ)，向上述“试样区域”(i)中投入试样，上述“竞争者载体复合体区域”(ii)用于使上述试样与竞争者载体复合体相接触，上述“试验区域”(ⅲ)可与桥复合体和/或竞争者载体复合体相结合，三个上述区域能够以流动的方式依次位于上述支撑体上。例如，在上述检测对象物为与蛋白质相结合的化学激素的情况下，在上述步骤(a)中，使经过解离剂处理的上述试样与上述桥复合体相接触，来获取试样/桥复合体反应物后，在上述试样区域适用上述试样/桥复合体反应物，上述解离剂用于从上述与蛋白质相结合的化学激素解离上述化学激素，在上述步骤(b)中，可通过流体流动来使上述试样/桥复合体反应物和上述竞争者载体复合体向上述试验区域移动，从而使上述试样/桥复合体反应物和上述竞争者载体复合体与等效结合物相接触，上述等效结合物与上述试验区域相结合。
步骤(b)：试验区域的等效结合物及上述步骤(a)的产物的接触
接着，使上述步骤(a)的产物与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相接触，上述检测对象物与支撑体上的试验区域相结合。
在上述试样内存在检测对象物的情况下，与上述试样内检测对象物相结合的上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物不相接触，在上述支撑体上不产生信号，在上述试样内不存在检测对象物的情况下，上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物相结合，上述竞争者载体复合体与上述桥复合体相结合，从而在上述支撑体上产生信号。
根据本发明，支撑体与等效结合物相结合，上述等效结合物存在于实现反应物的连续性流动的一个反应容器的底物表面上，上述反应容器为具有微通道的微晶片。
在本说明书中，术语“支撑体”的意思可与“固相底物、固相支撑体(solidsupport)或固相(solid phase)”的意思相同，是指非液相物质。可在上述支撑体的内部形成有微通道，例如，可作为膜(memb rane)、毛细管的一部分或在微通道内流动/粘合的小直径微珠(small diameter beads)而存在。这种形态的公知的物质包含聚苯乙烯、聚丙烯、玻璃、金属及如胶的碳化氢聚合物。上述支撑体能够以量油计、微量滴定板、粒子(例如，微珠)、亲和柱及免疫印迹膜(例如，聚偏二氟乙烯膜)的形态存在(参照：美国专利第5143825号、第5374530号、第4908305号及第5498551号)。
步骤(c)：信号测定
接着，使用信号测定装置来对在上述步骤(b)的产物中从上述竞争者载体复合体产生的信号的强度进行测定。
根据本发明的方法，竞争者载体复合体所包含的标识所释放的信号作为荧光信号而被测定，可通过测定试验区域的荧光信号来确认是否存在检测对象物，可通过一系列过程对经由试验区域的试样进行定量分析。根据本发明，可通过韩国授权号第10-1353930号中所记载的方法来实施对象物的定量分析。
根据本发明，上述支撑体上的微通道包括试验区域及标准区域(referencezone)，上述试验区域的表面与等效结合物相结合，上述标准区域可与检测抗体相结合，上述检测抗体被选定为来源于动物的肽或可与此相结合的物质。根据情况，等效结合物或检测对象物可与特异性检测抗体相结合。
在本说明书中，术语“试验区域”作为为了进行流体流动分析而包含在上述支撑体的微通道的区域划，试验区域的表面可与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合。
在本说明书中，术语“标准区域”作为包含在上述支撑体的微通道内的区域划，可与检测抗体相结合，上述检测抗体被选定为来源于动物的肽或可与此相结合的物质。根据情况，等效结合物或检测对象物可与特异性抗体相结合，从而可与经由试验区域的等效结合物或检测对象物相结合。
上述等效结合物或抗体可借助物理吸附或化学吸附而附着于固相底物。通过在存在于适当的缓冲液的抗体或抗原与固相的材料之间的反应来执行物理吸附。作为缓冲液，有磷酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。以在4～37℃的温度，尤其，在室温混合上述缓冲液特定小时并维持的方式进行反应。可通过使用肽附着方法中的碳二亚胺法来执行化学附着。另一化学法为利用如戊二醛或三聚氯氰(“肽合成法”，丸善(Maruzen)，1975或“酶免疫测定法”，共立(kyoritsu)，“蛋白质核酸酶”、特别号31，1987)等二价横键试剂来执行的方法。
根据本发明，上述试样适用于上述微晶片，通过形成于上述微通道的流动与上述试验区域及标准区域相接触。
对上述信号测定方法的详细的说明记载在韩国授权号第10-1353930号。
根据本发明的另一方面，本发明提供试样内检测对象物的检测试剂盒，上述试样内检测对象物的检测试剂盒的特征在于包括：
支撑体(a)，收容试样并具有用于进行反应的微通道(microchannel)；
竞争者载体复合体区域(b)，(i)形成于上述微通道的一个部位，(ii)与竞争者载体复合体相结合，上述竞争者载体复合体与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合，且能够产生信号；以及
试验区域(c)，(i)形成于上述微通道的一个部位，(ii)与具有与上述检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合，上述等效结合物能够与桥复合体相结合，上述桥复合体与结合剂相结合，上述结合剂与检测对象物特异性结合，
在上述试样内存在检测对象物的情况下，上述试样内检测对象物与上述桥复合体相结合，与上述试样内检测对象物相结合的上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物不相接触，在上述支撑体上不产生信号，在上述试样内不存在检测对象物的情况下，上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物相结合，上述竞争者载体复合体与上述桥复合体相结合，从而在上述支撑体上产生信号。
本发明的检测装置为利用上述的本发明的试样内检测对象物的检测方法的检测装置，为了避免本说明书的过于复杂性，省略其两者之间的共同的内容
对本发明的装置的各个结构进行如下的详细的说明。
结构(a)：具有微通道的支撑体
本发明的检测装置包括收容试样并具有用于进行反应的微通道的支撑体。在上述支撑体内具有用于收容分析试样的微通道，上述微通道可具有多种深度(depth)。
可收容分析试样的上述微晶片可包括一种以上的微通道，上述微通道可与用于分别检测不同检测对象物的等效化合物及检测抗体相结合。上述微通道可包括试样区域、反应开始区域、竞争者载体复合体区域、试验区域、标准区域及反应结束区域，例如，各上述区域所在位置可依次为试样区域、反应开始区域、竞争者载体复合体区域、试验区域、标准区域及反应结束区域。
上述微通道可包括可注入试样的试样主入口，若试样经由上述主入口向微通道内部流入，经过微通道并与位于试验区域的等效结合物相结合或不相结合。
另一方面，为了探测检测对象物，可在微通道内进行利用荧光物等的分析试样的标注(labelling)反应或利用抗原-抗体等的分析试样的特异性反应(specific reaction)等。即，利用蛋白质的抗原-抗体特异性反应(specification)等，随后可利用传感器等多种探测单元来仅筛选所需的对象进行确认。已标识的分析试样经由微通道内部，此时，微通道的一端面暴露于光学传感器，也可以利用其来探测荧光信号。
结构(b)：竞争者载体复合体区域
在本发明的检测装置中，上述竞争者载体复合体区域形成于上述微通道的一个部位，上述竞争者载体复合体区域与竞争者载体复合体相结合，上述竞争者载体复合体与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合，且可产生信号。
根据本发明，上述竞争者载体复合体区域位于上述支撑体上试验区域的上游侧。
结构(c)：试验区域
在本发明的抗原检测装置中，上述试验区域形成于上述微通道的一个部位，上述试验区域与等效结合物相结合，上述等效结合物可与桥复合体相结合，上述桥复合体与结合剂相结合，上述结合剂与检测对象物特异性结合。
在上述试样内存在检测对象物的情况下，上述试样内检测对象物与上述桥复合体相结合，与上述试样内检测对象物相结合的上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物不相接触，在上述支撑体上不产生信号，在上述试样内不存在检测对象物的情况下，上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物相结合，上述竞争者载体复合体与上述桥复合体相结合，从而在上述支撑体上产生信号。
根据本发明，本发明的检测装置所包括的支撑体包括试样区域(i)、竞争者载体复合体区域(ii)及试验区域(iii)，三个上述区域以流动的方式依次位于上述支撑体上。
本发明的检测装置还可包括标准区域，上述标准区域形成于上述微通道的一个部位，上述标准区域的表面与标准物质(reference subst ance)相结合，上述标准物质与检测对象物或等效结合物特异性结合。
根据本发明，上述装置可包含标准物质，上述标准物质作为与用于产生可检测的信号的标识相结合且与上述检测对象物或等效结合物特异性结合的检测抗体。
根据本发明，上述装置还可包括用于测定从上述标识产生的信号的测定单元，或者，上述装置还可包括用于计算在上述试验区域及标准区域中测定的信号的强度的比例的分析单元。
本发明的方法及装置能够以多种方式来利用，例如，在检测作为小分子的激素的情况下，通过将试样内非目标蛋白质和激素有效地解离为游离激素状态，来提供优秀的分解能力或分离能力，从而可试样内的检测对象物分离为细密的浓度范围。
发明的效果
以下，简要地说明本发明的特征及优点。
(a)本发明涉及新型试样内检测对象物的检测方法及利用其的检测装置。
(b)在本发明的检测方法中，通过使用在金纳米粒子和检测对象物特异性结合抗体的“桥复合体”来诱导抗体与检测对象物之间的充分的结合反应，从而可提高反应性。
(c)由此，可通过提供优秀的分解能力或分离能力，来准确地测定试样内检测对象物的浓度，并可增大测定信号。
(d)并且，在本发明的方法中，可有效地检测激素、维生素等分子量小的小分子。
附图说明
图1为本发明的检测方法的示意图。
图2为示出基于睾酮的浓度来测定解离(displacement)程度的图。图2a示出基于没有使用金纳米粒子的以往的检测方法1及检测方法2的校准曲线(Calibration curve)，图2b示出基于使用金纳米粒子的本发明的方法的校准曲线。横轴表示对标准区域信号(reference intensity)的试验区域信号(test intensity)的比例(ratio)，纵轴表示睾酮的浓度。在利用本发明的方法的情况下，可确认所测定的信号的平均值的范围及解离程度(Dis.％)更宽，由此，确认本发明的方法可提供高的分离能力。
图3示出基于检测方法的相关关系。图3a示出基于以往的检测方法1及检测方法2(图6a及图6b)的相关图，图3b示出基于以往的检测方法3(图6c)的的相关图，图3c示出基于本发明的方法的相关图。在图3a的情况下，相关性为0.7414而低，在图3b的情况下，相关性高，存在需要额外的清洗过程的缺点。在本发明的情况下，无需经过清洗过程，而且相关性也高。
图4为用于对使用包含金纳米粒子的媒介物的情况及不使用包含金纳米粒子的媒介物的情况的分解能力进行比较的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果。在使用金纳米粒子的情况下，确认到O.D.值的测定范围宽。
图5a及图5b为示出测定基于维生素D的浓度的解离程度的图。图5a示出基于没有使用金纳米粒子的以往的检测方法1及检测方法2的校准曲线，图5b示出基于使用金纳米粒子的本发明的方法的校准曲线。
图6a至图6c示出利用本发明的检测装置并利用以往的睾酮检测方法来检测睾酮的方法(分别为以往的反应1、反应2及反应3)。试样(sample)表示血液(a：试样注入口、b：竞争者载体复合体区域、c：试验区域、d：标准区域)。
※略语
Anti-Testosterone F.B.：抗睾酮荧光微球(Anti-Testosterone Fluore scencebead)
Testo-3CMO:睾酮-3-羧甲基肟-牛血清白蛋白-生物素(Tes tosterone-3-carboxymethyloxime-bovine serum albumin-Biotin)
抗睾酮-生物素(Anti-Testosterone-Biotin)
2-ME：2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol)
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，对本发明所属领域的技术人员而言，根据本发明的要旨，本发明的范围并不限定于这些实施例是显而易见的。
实施例
实施例1：金纳米粒子和抗体的耦合(Antibody coupling with Goldnanoparticle)
在试管内将直径为约40nm的金纳米粒子(Gold nanoparticle)和抗体(抗睾酮或抗维生素D(Vitamin D))以规定的比例混合后，在常温下反应1小时。添加上述抗体，以使最终浓度变为5μg/mL。
之后，向上述反应混合物中添加10％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin)，以使上述牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲液(PB buffer)中的浓度变为1.1％，并在常温下反应1小时。
在10000rpm的条件下对上述反应物进行离心分离15分钟后，去除上层液。
在上层液被去除的管中放入贮存缓冲液(Storage buffer，2mM的硼酸盐中的浓度为0.1％的酪蛋白)进行悬浮。反复进行上述离心分离及再悬浮过程2次之后，在4℃的温度下进行保管。
实施例2：荧光微米微珠和抗原的耦合(Antigen coupling with Fluorescentmicroparticle)
利用1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)来使直径为约500nm的荧光微米粒子(或微米微珠)活性化。接着，在试管内将活性化的荧光微米粒子和抗原抗原[睾酮-3-羧甲基肟-牛血清白蛋白(Testosterone-3-carboxymethyloxime-bovine serum albumin，Testosterone-3-CMO-BSA)或维生素D]以规定的比例混合后(100μL的2％的荧光微米粒子及250μg的抗原)，在常温下反应2小时。
之后，向上述反应混合物中添加10％的牛血清白蛋白，以使上述牛血清白蛋白在蒸馏水中的最终浓度变为1％，并在常温下反应1小时。
上向上述反应物中添加1M的甘氨酸至最终浓度变为50mM后，在常温下反应30分钟。接着，反复进行上述实施例1的离心分离及再悬浮过程之后，在4℃的温度下进行保管。
实施例3：睾酮-3-羧甲基肟-牛血清白蛋白的生物素化(biotinylation)反应
将睾酮-3-羧甲基肟-牛血清白蛋白和生物素(biotin)以规定的比例混合后，在常温下反应1小时(20mol的生物素/1mol的抗体)。
之后，为了去除残留的未反应生物素而在磷酸盐缓冲液(PBS)中进行透析(dialysis)。更换为新的磷酸盐缓冲液3次至4次，以在上述透析过程中充分去除未反应生物素。利用紫外光谱仪来确认生物素被去除的抗体的浓度后，在4℃的温度下进行保管。
实施例4：准备芯片(Chip)
在结合有抗生物素蛋白(avidin)的芯片的下部基板打点(dotting)生物素化的睾酮(Biotinylated-Testosterone)或生物素化的维生素D(Biotinylated-Vitamin D)后，在常温下反应1小时。
接着，利用清洗溶液(Washing buffer)清洗芯片，并在37℃的温度下充分干燥后，在下部基板打点样品缓冲液(2-甲氧雌二醇)和睾酮-荧光微米粒子后，在37℃的温度下充分干燥。使准备好的下部基板与上部基板相结合后，在干燥器进行保管至使用前为止。
实施例5：测定睾酮
在常温下混合2-甲氧雌二醇、实施例1的金纳米粒子溶液及血液后，进行反应5分钟。将35μL的上述混合反应物滴在实施例4的芯片上后，若反应物均经过芯片的反应途径，则利用FREND(NanoenTek，韩国)来测定荧光信号。
当利用本发明的方法及以往的检测方法比较睾酮的解离程度时，在本发明的检测方法的情况下，可确认所测定的信号的平均值的范围及解离程度(Dis.％)更宽，由此，确认本发明的方法可提供高的分离能力。
表1
基于以往的反应1及以往的反应2的数值
表2
基于本发明的方法的数值
实施例6：测定维生素D
混合包含释放剂(Releasing reagent)的金纳米粒子溶液和血液后，在49℃的温度下反应10分钟。将35μL的上述混合反应物滴在实施例4的芯片上后，若反应物均经过芯片的反应途径，则利用FREND来测定荧光信号。
与上述实施例5相同地，在本发明的检测方法的情况下，可确认所测定的信号的平均值的范围及解离程度(Dis.％)更宽。
表3
基于以往的反应1及以往的反应2的数值
表4
基于本发明的方法的数值
以上，对本发明的特定部分进行了详细的记述，对本发明所属领域的技术人员而言，这种具体的记述仅为优选实例，而本发明的范围并不局限于此是显而易见的。因此，本发明的实质上的范围应由所附的发明要求保护范围和其等价物来定义。

Claims (18)

1.一种试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，
包括：
步骤(a)，使试样与竞争者载体复合体(i)及桥复合体(ii)相接触，上述竞争者载体复合体与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合且能够产生信号，上述桥复合体与结合剂相结合，上述结合剂与检测对象物特异性结合，在上述试样内存在检测对象物的情况下，上述试样内检测对象物与上述桥复合体相结合；
步骤(b)，使上述步骤(a)的产物与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相接触，上述检测对象物与支撑体上的试验区域相结合，在上述试样内存在检测对象物的情况下，与上述试样内检测对象物相结合的上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物不相接触，在上述支撑体上不产生信号，在上述试样内不存在检测对象物的情况下，上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物相结合，上述竞争者载体复合体与上述桥复合体相结合，从而在上述支撑体上产生信号；
步骤(c)，在上述步骤(b)的产物中对从上述竞争者载体复合体产生的信号的强度进行测定。
2.根据权利要求1所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述检测对象物及等效结合物为蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、核酸或化合物。
3.根据权利要求2所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述检测对象物及等效结合物为化学激素。
4.根据权利要求3所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述检测对象物及等效结合物为与蛋白质相结合的化学激素。
5.根据权利要求4所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，
上述检测对象物为与蛋白质相结合的化学激素，
上述步骤(a)包括：
子步骤(a-1)，使经过解离剂处理的上述试样与上述桥复合体相接触，上述解离剂用于从上述与蛋白质相结合的化学激素解离上述化学激素；以及
子步骤(a-2)，使上述子步骤(a-1)中的产物与上述竞争者载体复合体相接触。
6.根据权利要求1所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述竞争者载体复合体包含粒子或微珠。
7.根据权利要求6所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述粒子为色粒子，并从上述色粒子直接产生信号。
8.根据权利要求6所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述粒子还包含信号产生标识。
9.根据权利要求1所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述桥复合体所包含的上述结合剂为抗体、变形抗体、抗体类似物、艾普肽、受体、链霉亲和素、抗生物素蛋白、中性亲和素、核酸适体、凝集素、底物、脱氧核糖核酸、核糖核酸、脂质或病毒蛋白质。
10.根据权利要求1所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述桥复合体包含粒子或微珠。
11.根据权利要求1所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述桥复合体的每一个粒子包含多个结合剂。
12.根据权利要求1所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，在上述步骤(a)中，首先使上述试样与上述桥复合体相接触后，接着使上述试样与上述竞争者载体复合体相接触。
13.根据权利要求1所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，在执行上述步骤(a)之前，上述竞争者载体复合体位于上述支撑体上试验区域的上游侧。
14.根据权利要求1所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，上述支撑体包括试样区域(i)、竞争者载体复合体区域(ii)及试验区域(iii)，三个上述区域以流动的方式依次位于上述支撑体上。
15.根据权利要求14所述的试样内检测对象物的检测方法，其特征在于，
上述检测对象物为与蛋白质相结合的化学激素，
在上述步骤(a)中，使经过解离剂处理的上述试样与上述桥复合体相接触来获取试样/桥复合体反应物后，在上述试样区域适用上述试样/桥复合体反应物，上述解离剂用于从上述与蛋白质相结合的化学激素解离上述化学激素，
在上述步骤(b)中，通过流体流动使上述试样/桥复合体反应物和上述竞争者载体复合体向上述试验区域移动，从而使上述试样/桥复合体反应物和上述竞争者载体复合体与等效结合物相接触，上述等效结合物与上述试验区域相结合。
16.一种试样内检测对象物的检测试剂盒，其特征在于，
包括：
支撑体(a)，收容试样并具有用于进行反应的微通道；
竞争者载体复合体区域(b)，(i)形成于上述微通道的一个部位，(ii)与竞争者载体复合体相结合，上述竞争者载体复合体与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合且能够产生信号；以及
试验区域(c)，(i)形成于上述微通道的一个部位，(ii)与具有与检测对象物相同的结合特性的等效结合物相结合，上述等效结合物能够与桥复合体相结合，上述桥复合体与结合剂相结合，上述结合剂与检测对象物特异性结合，
在上述试样内存在检测对象物的情况下，上述试样内检测对象物与上述桥复合体相结合，与上述试样内检测对象物相结合的上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物不相接触，在上述支撑体上不产生信号，
在上述试样内不存在检测对象物的情况下，上述桥复合体与上述支撑体上的等效结合物相结合，上述竞争者载体复合体与上述桥复合体相结合，从而在上述支撑体上产生信号。
17.根据权利要求16所述的检测试剂盒，其特征在于，上述竞争者载体复合体区域位于上述支撑体上试验区域的上游侧。
18.根据权利要求16所述的检测试剂盒，其特征在于，上述支撑体包括试样区域(i)、竞争者载体复合体区域(ii)及试验区域(iii)，三个上述区域以流动的方式依次位于上述支撑体上。
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