CN1064217A - 肺炎球菌多糖结合疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了采用新方法生产的一种新的结合 疫苗，其含有经过部分水解的高度纯化的由与免 疫载体蛋白连接的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)类(Pn)产生的荚膜多糖(Ps)。该结合 蛋白可用于防止肺炎球菌的感染。含有1至10种 不同肺炎球菌多糖免疫蛋白(Pn-Ps-PRO)结合物 的疫苗可以广泛地诱导受体对产生多糖成分的同类 病原体的保护性免疫应答。通常对Pn-Ps不能产生 保护性免疫应答的儿童和2岁以下的婴儿通过接种 这些Pn-Ps-PRO结合物能产生保护性免疫应答。

Description

根据细菌的荚膜多糖（Pn-Ps，作为病原菌的肺炎链球菌（Streptoc-occus  pneumoniae）（pneumococci，Pn）已经分为84种抗原血清型。由这些病原菌引起的疾病包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症和慢性支气管炎的急性转剧、窦炎、关节炎和结膜炎。但是这些疾病的优势却由84种已知分离物中有限的几种菌引起的。因此，含有由非常流行的这些病原菌分离物得到的Pn-Ps的多价疫苗，能够对这类报导很多的比例很高的病原体提供保护。

已经生产的多价疫苗对成年人中的肺炎球菌能够有效地产生保护性免疫应答。例如“PNEUMOVAX  23”（多价肺炎球菌疫菌MSD;参阅PDR，1990年版第1431页）是含有23种不同的未结合的肺炎球菌多糖（每种含量50μg/ml）的液体组合物，这些菌种全部保藏在ATCC，并且为本发明的原料提供一条可能得到的途径。“PNEUMOVAX  23”含有下述各种游离的未结合的多糖：1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19F，19A，20，22F，23F和33F，含量约为90%肺炎球菌血液分离物。但是这些疫苗在很大程度上对肺炎球菌感染疗效很差，仍冒着危险性，例如B细胞免疫协调的个体，依赖于T细胞免疫保护应答的中年以上的人和2岁以下的婴儿。由于未结合的多糖是T细胞免疫应答的极差诱导物，所以将Pn-Ps转化为能够诱导T细胞应答的免疫原，在这项任务中产生充分保护作用的关键。但是，使用并不限于这类对象。例如将含有一种或多种新结合物的疫苗在导致母体中产生抗体的受孕前或怀孕期间施用于雌性哺乳动物，从而能被动保护发育中的胎儿和喂奶期的婴儿，致使疫苗不直接施用于胎儿或婴儿。这种结合物还证明可用于诱导产生最大限度地被动保护受威胁群体（例如受感染的新生婴儿或同胞）的抗体。

现已证明，本身免疫性很差的多糖一旦与免疫蛋白（PRO）相结合，就能成为极好的免疫原（参阅：Marburg  et  al.，美国专利4695624;Schneerson  et  al.，New  Dev.，with  Hum＆Vet.Vaccines，77-94，1980;Schneerson  et  al.，J.Exptl.Med.，152，361，1980;Anderson，Infection  and  Immunity，39，233，1983）。但是，生产这类结合物的主要问题在于多糖原料的粘必和不均匀性，因此难于在化学上限定结合产物。于是需要提供一种方法，其中原料尽可能是已知的，而且每一步合成路线都可测定所形成的中间体。本申请公开的方法由于提供了对产生Pn-Ps的同类病源体具有很高免疫性的结合免疫原，从而满足了上述要求。该结合物可用于2岁以下的婴儿。

Marburg等（J.Am.Chem.Soc.，108，5282，1986）和美国专利4695624、4830852、4882317介绍了一种方法，即通过属间空间将多糖与免疫蛋白结合。衍生物的PRO具人亲核或亲电子基团（PRO＊），而其中的Ps则具有相反的反应作用的基团（Ps＊）。通过Ps＊与PRO＊的结合，使Ps与PRO连接在一起（Ps-PRO）形成属间空间。通过酸水解，属间空间释放出异常的氨基酸，经氨基酸定量分析，从而提供证明共价结合的方法。

本发明公开了改进美国专利4695624、4830852和4882317所介绍的方法，该改进包括Pn-Ps原料比Pn-Ps粗制品具有更高的特异性、重现性和处理性的物理性质，包括增加溶解度、过滤度、纯度（降低族特异性C多糖（C-Ps）的污染）和降低分子量、多分散度和粘度。与美国专利4695624相比，生成本申请所公开的结合物，在增加稠度、制备难度、增加最终产品抗原力和纯度等诸方面都有了改进。特别显著的是与美国专利4695624中的预结合Ps制剂相比，本发明在Pn-Ps预结合中，族特异性C多糖和肽聚糖降低3-20倍。虽然C多糖污染的存在并不影响对类型特异性抗原的免疫应答，但是在结合反应中沉淀出的C-Ps使其对类型特异性Ps的特异性和可控性降低。此外，抗C多糖抗体的产生与在某些尚未解决的肺炎球菌感染中所观察到的组织分解有关。

除了新结合产物外，本发明还公开了制备部分水解的高度纯化的肺炎球菌多糖中间产物的新方法、含有1至10种不同结合物的新组合物和使用本发明的方法。具有特殊意义的是包含在“PNEUMOVAX  23”中的荚膜多糖Pneumococcal  Vaccine  Polyvalent，MSD;参阅PDR，1990  edition，p.1431）。最佳的例子是肺炎链球菌（Streptococcus  pneumo-niae）亚型6B、23F、19F、14、18C、4和9V的荚膜多糖，这一小类肺炎球菌亚型都能解决婴儿和儿童中75-85%肺炎球菌的感染。本发明提供的方法还可用于广泛收集各种肺炎球菌和其他细菌的多糖。

在化学上能高度限定的肺炎球菌多糖（Pn-Ps）的制备方法是将Pn-Ps制剂粗制品部分水解至预定的终点，保持Pn-Ps的抗原整体性。将经过部分水解的Pn-Ps基本纯化后，用于Pn-Ps免疫蛋白（PRO）结合物（Pn-Ps-PRO）的制备。

本发明的新的高抗原Pn-Ps-PRO结合物含有外膜蛋白复合物（OMPC）或脑膜炎双球菌（Neisseria  meningitidis）b或其重组的或纯化的亚单位，例如MIEP，或与由一般的肺炎链球菌分离物产生的经部分水解并高度纯化的Pn-Ps中间体共价结合的其他免疫载体，这种结合在哺乳运动体内可用于预防肺炎球菌感染。尤其可在哺乳运动、特别是B细胞免疫损害的个体、中年以上的人和2岁以下的婴儿中用于刺激抗肺炎球菌免疫应的疫苗组合物，这种结合物还可刺激T细胞应答。制备Pn-Ps-OMPC和Pn-Ps-MIEP结合物的方法包括下述步骤：由肺炎链球菌的培养物中分离出荚膜Ps，部分水解或物理切变Pn-Ps，分离所述的Pn-Ps，得到分子大度、多分散度、粘度都减低的Pn-Ps产物，然后将Pn-Ps与OMPC或MIEP共价结合。

本发明的目的之一在于提供新的、经部分水解并高度纯化的具有抗原类型特异性的肺炎球菌荚膜多糖（Pn-Ps），该多糖可作为中间体用于制备Pn-Ps和免疫原蛋白的T细胞依赖的结合物。本发明的目的之二在于提供Pn-Ps和免疫原蛋白的T细胞依赖的结合物，将其用于疫苗组合物，以预防肺炎球菌的感染，尤其是2岁以下的婴儿和B细胞免疫损伤的人。本发明的目的之三在于提供优于美国专利4695624介绍的制备肺炎球菌多糖-免疫原蛋白共价结合（Pn-Ps-PRO）的方法，其中所述的改进包括原料Pn-Ps、中间体、最终产物的具有更高的化学限定、稠度提高，并且方法又易于实施。本发明的目的之四在于根据本发明的改进方法，提供在化学上予以限定的Pn-Ps-PRO结合物，显示T细胞的依赖性，将这种结合物用于诱导抗病原体肺炎球菌的保护性血清抗体，尤其是用于2岁以下的婴儿和免疫损害者。本发明的目的之五在于提供一种治疗方法，即在疫苗配制剂中使用免疫有效量的这些结合物，以预防肺炎球菌诱发的名种疾病，例如中耳炎、脑膜炎、肺炎、菌血症和慢性关节炎的急性转剧、窦炎、支气管炎和结膜炎。

本发明的详细说明：

A.新的Pn-Ps-PRO结合物和多糖中间体

本发明的Pn-Ps-PRO结合产物的Pn-Ps与PRO的比为0.05-0.5mg糖/mg蛋白，其具有高度的共价性，由游离的Pn-Ps构成的结合物。杂质含量极低，新的多糖组份使该结合物具有均一的物理化学性质。

该结合物含有通过间隔基与新的部分水解并高度纯化的肺炎球菌荚膜多糖（Pn-Ps）共价结合的免疫蛋白（PRO）。所述免疫蛋白最好是由脑膜炎双球菌（Neisseria  meningitidis）b的培养物衍生的外膜蛋白复合物（OMPC）。制备OMPC的一个方法基本上如美国专利4271147和实施例1所介绍的方法。此外，也可优先使用由能离OMPC或其重组表达产物产生的OMPC的亚单位，例如MIEP。制备该产物的一个方法可参阅USSN专利555978，555329和555204（Merck  Case＃′s  18110，18159和18160，均于1990年7月19日申请）和实施例2，16-23。

新的经部分水解和高度纯化的肺炎球菌荚膜多糖（Pn-Ps）是由一种肺炎球菌亚型培养物衍生的抗原多糖的制剂（将在新的结合方法和实施例3-10部分详述）。Pn-Ps的平均分子量约为1×10⁵-1×10⁶道尔顿，平均每个分子约低于1000重复单位，C-多糖杂质量约低于3%，抗原性指数为0.4-1.1，优选0.7-1.1。最后一个参数是与保藏在ATCC的Pn-Ps粗制品相比，每单位新Pn-Ps结合抗肺炎球菌类型特异性抗体的相对量。此外，新的Pn-Ps适合于与免疫蛋白结合，产生本发明的Pn-Ps-PRO产物。2种不同的Pn6B-Ps制剂和2种不同的Pn23F-Ps制剂的一些物理化学性质在表1中给出，同时说明了如何测定这些性质。以下所公开的方法提供了制备Pn-Ps中间体和Pn-Ps-PRO与各种肺炎球菌亚型的结合物的方法，所述肺炎球菌亚型包括选自亚型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19F，19A，20，22F，23F和33F，但并不限于上述亚型。为上所述，较佳的一组肺炎球菌多糖是由肺炎球菌亚型4，6B，9V，14，18C，19F和23F衍生的多糖。本领域的专业人员显然知道，除了上述多糖或可代替的多糖外，其他多糖也可取代，但需要冒些风险。因此，Pn1-Ps和Pn5-Ps可像Pn4-Ps或Pn9V-Ps一样处理，如同脑膜炎双球菌B，C或B族链球菌多糖;而Pn7F-Ps可像Pn14-Ps一样处理，下面将详细说明，并且包含在多价疫苗中。本领域的专业人员还清楚地知道，由于包括了Pn6B-Ps，所述交叉反应的抗体可以保护Pn6A。实际上还有大量其他肺炎球菌亚型。

多价疫苗是含有各种分别制备的不同的Pn-Ps-PRO结合物与所给出的Pn-Ps亚型的混合物。另外，多价疫苗是其中若干不同的Pn-Ps亚型一次或连续与给出的PRO结合的那些疫苗。

1.新多糖中间体的特征

经过部分水解、纯化的肺炎球菌荚膜多糖中间体的物理化学性质决定于衍生该多糖中间体的肺炎球菌亚型和近本发明方法的操作。一般说来，与粗制品细菌培养物衍生的多糖相比，Pn-Ps中间体的分子量和多分散度低2-10倍。考虑到经改进的多糖的处理，在结合时和结合后对比大小可以除去游离Pn-Ps，较高的Pn-Ps纯度/均一性、较低的Pn-Ps分子量的多分散度和基本未改变的抗原性。这些新的Pn-Ps特征主要由于在组分上形成了高度限定的具有高度类型特异性的抗原Pn-Ps-PRO产物。

ⅰ.Pn-Ps分子量和多分散度：

采用扩散、沉积或色谱方法测定重量均分子量MW，采取依数性（例如粘度、冰点降低或沸点升高）测定数均分子量MN，从而得到Pn-Ps制剂的多分散度（用MW/MN表示），这个值越趋近一致，多糖制剂的均一性越高。本文给出了许多Pn-Ps制剂的多分散度，并且还提供了获得高均一性的方法。

根据本领域已知方法，通过等份多糖的粒度排阻色谱法（SEC）或高效粒度排阻色谱法（HPSEC），测定各个粗工和部分水解的Pn-Ps制剂的分配系数。分配系数：

Kd＝（Ve-Vo）/（Vi-Vo）

其中Vo＝柱空体积，

Vi＝总渗透体积，

Ve＝样品的洗脱容积，

Kd＝样品的分配系数。

由此得到的Kd用于测定多糖制剂的平均流体动力学体积。根据所公开的方法，通过物理切变或通过热水解或超声水解，推导出Pn-Ps的分子大小，Pn-Ps的洗脱窖Ve增加，因此KD也随之增加。

为上述目的所用的较佳柱基质是SEPHAROSE  CL2凝胶（Pharmacia№17-0120-01）。柱空体积（VO）用兰色葡聚糖2000（Pharmacia№17-0360-01）测定，而总参透体积（Vi）则由氯化钠盐峰值测定。根据另一方法，Pn-Ps样品在2.5mg/ml蒸馏水条件下制备，采用1ml注射体积。Vo/Vi比为0.32-0.37。葡聚糖T500（Pharmacia  №17-0320-01）的Kd值为0.37-0.49。较佳的HPSEC系统包括加热至50℃的7.5×600mm  TSK  G600  PW柱。另一个更佳的方法是将SEC或HPSEC与能检测分析物相对浓度（用洗脱窖的函数表示）的差示折光计和能检测分析物特异性粘度（用洗脱容积的函数表示）的差示粘度计结合使用。通用的标定曲线〔10g（特性粘度×分子量）与保留体积的关系〕是经一系列标准单分散聚环氧乙烷的分析中确定的。浓度和特异性粘度构型可用于计算样品的分子量与洗脱容积构型的关系，并可用于计算MN和MW的值，由此计算多分散度指数（MW/MN）（参阅Yau，W.W.and  Rementer，S.W.，J.Liq.Chromatog.，13，627-675，1990;Nagy，J.Liq.Chrom.，13，677-691，1990;Benoit，et  al.，J.Ch.Phys.Tome.，63，1507-1514，1966）。本发明中的特性粘度是用pH7.2的0.1M磷酸钠缓冲液测定的。

当Pn-Ps制剂的平均分子量测定后，每个分子重复单位的平均数可将聚合物分子量除以重复单位分子量即能很容易测定（见表Ⅱ）。

ⅱ.Pn-Ps类型特异性抗原性的保留

对经过物理切变或化学、热、超声或酶水解的所有Pn-Ps粗制品来说，重要的是确定抗原整体性开始分散的终点，该终点通过与本领域已知的大量免疫测定中任何一种测定相关的粘度即能很容易确定。采用一种较佳的方法，即使用肺炎球菌亚型特异性抗体，通过平板双向免疫扩散测定法测量等份多糖溶液。在经过一定时间的扩散后，琼脂中与相邻穴中的Pn-Ps粗制品样品的沉淀素带相连接的白色沉淀素带的出现即可定性测定各反应物，并且证明多糖抗原整体性仍保持完整无损。定量免疫测定可采用速率散射浊度分析法或RIA测定法测定。

速率散射浊度分析法可测定抗原-抗体复合物形成时散射光强度的变化及其变化速率。反应是在一个能通过光束的反应杯中进行的。在本发明中，复合物是在特异性抗体（Ab）与其特异性抗原（Ag）（即Pn-Ps）反应时，通过在溶液中发生的免疫沉淀素反应形成的。由于Ag-Ab复合物的形成决定于是否存在最佳比例的Ag和Ab分子，所以当Ab为恒定量时，复合物形成的程度随着Ag量增至最高水平;Ag量越大，导致形成的复合物越少。因此，通过保持Ab的恒定量和测定光散射随着Ag浓度的增高，就能形成一条标准曲线。当样品在与用于获得标准曲线的相同条件下与其特异性Ab反应进，就能计算Ps（或衍生的Ps）的Ag浓度。

将由速率散射浊度计经免疫学方法计算的浓度与由化学或物理方法（比色法，折光指数或单糖的全水解和定性分析，下面将要详述）得到的浓度相比较，就能得到Ps样品的抗原性指数。多糖的干重分析法仅仅适能于粉末制剂中的挥发性成份是已知的。公众已知多糖具有吸湿性质，并且可含5-30%（重量）挥发性物质。对多糖中或多糖本身进行干重测量并不特别可靠。用于高精度测定多糖浓度的一个可采用的方法是比色法，该方法是有意义的标准多糖溶液进行标定。例如Pn6B-Ps、Pn18C-Ps、Pn19F-Ps和Pn23F-Ps都可采用Sische和Shettles的甲基戊糖测定法（参阅J.Biol.Chem.，175，595-603，1948）进行定量测定。Pn4-Ps、Pn9V-Ps、Pn14-Ps和Pn19F-Ps可采用己糖胺含量测定法进行定量测定，而Pn9V可采用糖醛酸含量测定法进行定量测定。酚-硫酸测定法（参阅Dubois  et  al.，Anal.Chem.，28，350-356，1956）可作为结合物制备时的部分测定方法用于定量测定所有Pn-Ps制剂。另一个可用的方法是用折光指数信号测定分析物，也可用有意义的标准多糖溶液标定。虽然比色法可在衍生和结合过程中用于检测样品中的多糖含量，但是在多糖制剂物理特征的形成过程中，通过HPSEC通用标定分析，仍然可采用后者所述方法，并用于计算抗原性指数。从Pn-Ps粗制品开始，确定抗原性指数值为1.0。计算试验样品的相对抗原性指数，并且可肯定地认为该值为0.4-1.1。如果在水解和分离步骤中对多糖进行高度纯化，则得到的抗原性指数可能大于1.0。通过提高多糖分子的挠性，从而减少抗原决定部位周围的空间干涉，则仅仅减小大度也能提高制剂的抗原性指数，这从理论上说是可能的。完成这些测定也可作为检查水解、分离和衍生Ps样品的一种方法。相对抗原性＜0.4的样品则会被排斥，即不能被结合。所得到的抗Pn-Ps抗体制剂可用于具有特性的肺炎球菌多糖。抗Pn-Ps抗体源来自Health  Research，Inc.，Albany，NY.和Staten  Serum  Institute。此外，类型特异性抗Pn-Ps抗体可以根据本领域已知方法用市售Pn-Ps粗制品作为抗原进行制备（参阅[Ba-ker  et  al.，Immunology  20，469（1971）;Brooke，M.S.，J.Immunol.，95，358（1966）;Kearney，R.and  Halladay，W.J.，Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.，48，227（1970）;Schneerson，R.et  al.，Prog.Allergy，33，144（1983）;Robbins，J.B.，Infect.Immun.，26  1116（1979）]。

保持抗原整体性的另一方面就是保持Pn-Ps制剂的正确的化学组分。例如Pn6B-Ps具有重复单位〔α-Gal（1-3）-α-Glu（1-3）-α这-L-鼠李糖（1-4）-D-核糖醇-5-PO4（2）〕，使碳水化合物组分核糖醇∶鼠李糖∶半乳糖∶葡萄糖的摩尔比约为1∶1∶1∶1。这个摩尔比的测定可以通过用36%氢氟酸在45-65℃下水解多糖的2小时，然后用2M三氟乙酸在100℃下水解大约10-20小时，再用装有脉冲电流检测装置的高效阴离子交换色谱依测定。因此，代替碳水化合物各组分大致相等摩尔量的四个峰值表示保持抗原的完整性。本发明所有新的Pn-Ps化合物都保持碳水化合物的理论比在大约20%之内，偏离理论值的原因主要由于不同方法的局限性。因此，通过完全的水解，各化合物的比值约为：

Pn23F-Ps：丙三醇∶鼠李糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1∶2∶1∶1;

Pn14-Ps：N-乙酰基-葡萄胺∶半乳糖∶葡萄糖＝1∶2∶1;

Pn19F-Ps：鼠李糖∶N-乙酰基-甘露糖胺∶葡萄糖＝1∶1∶1;

Pn18C-Ps：葡萄糖∶半乳糖∶鼠李糖∶丙三醇∶乙酸酯＝3∶1∶1∶1∶1;

Pn9V-Ps：葡萄糖∶半乳糖∶N-乙酰基-甘露糖胺∶葡萄醛酸∶半乳糖醛酸∶乙酰酯＝2∶1∶1∶1∶1∶1∶7;

Pn4-Ps：N-乙酰基-甘露糖胺∶N-乙酰基-岩藻糖胺∶半乳糖胺∶半乳糖∶丙酮酸酯＝1∶1∶1∶1∶1。

此外，最近已经发现Pn4-P4如同Pn5-Ps一样，还含有另一组份，通过HPLC分析证明该组份为2-aminopneumosamine（2-氨基-2，6-脱氧塔罗糖）（参阅Barker  et  al.，Carbohydrate  Res.，224-233，1966）。Pn19F-Ps也有另一个组分，或许是己糖胺，还未见文献报导，因此尚特证明。上述和其他理论上的多糖重复组分在下列文献中已见报导：J.E.G.van  Dam  et  a.，Carbohyd.Res.187，267，1988;H.J.Jennings，Adv.Carbohyd.Chem.，41，155，1983及其中的参考文献;J.C.Richards  and  M.Perry，Biochem.Cell.Biol.，66，758，1988。除了碳水化合物的组份外，在若干有意义的具有某些免疫显性特征的Pn-Ps中还有磷酸酯、乙酸酯和丙酮酸酯的亚类。这些级分也可进行检测（参见实施例30）。单糖的定量测定也是对样品中多糖浓度的定量测定的可采用的方法。

保持本发明多糖抗原性的另一方面是保持多糖中的所谓“构象决定部位”（例如见Wessels，M.R.and  Kasper，D.L.，J.Exp.Med.，169，2121-2131，1989）。抗原性的这一方面似乎仅表面在高分子量形式的糖中，本申请所述各种方法也是针对保持多糖免疫性的问题。

ⅲ.最低的C-多糖杂质

另一个重要参数就是C-多糖杂质，这个值可通过多糖制剂的全酸水解、水解产物的色谱分析和胆碱的电导检测等方法得到（参阅Hermans，et  al.，Reci.Trav.Chim.Pays-Bas，107，600，1988）。另外，未水解的多糖可采用胆碱的NMR进行分析。NMR技术将胆碱信息与甲基鼠李糖信息（含鼠李糖Pn-Ps;与其他Pn-Ps的不同信息）之比用于计算C-Ps含量。色谱法将胆碱信息与由电导测定法测得的多糖含量或一个Pn-Ps组份峰值之比用于计算C-Ps含量。还有一种方法，即用C-Ps的理论重复结构，以已知胆碱浓度为标准直接计算多糖制剂中胆碱的含量（Herman  et  al.，引文同上），测定多糖制剂中的COPs浓度。根据本领域已知方法，测定Pn-Ps样品中的多糖浓度。例如，多糖的总浓度可通过多糖的完全水解和具体单糖浓度的测量予以测定。将C-Ps浓度与多糖总浓度作对比，即可测定C-多糖杂质量（W/W）。C-多糖低于多糖总量的3%（W/W）则可接受，但以低于1%为佳。

两组Pn6B-Ps和两组Pn23F-Ps的化学物理性质汇总于表1。这些数据说明，采用本发明的新方法得出的各组参数都具有可现性。

表Ⅰ：经水解和分离的Pn-Ps的特征

Pn-Ps制剂  6B-1  6B-2  23F-1  23F-2

粘度终点  1.094  1.147  1.350  1.376

Kd（HPSEC）  0.62  0.62  0.49  0.49

Kd（CL-2B）  0.64  0.60  0.41  N.D.

单糖  S  S  S  S

抗原性：

平板双向扩散法  S  S  S  S

散射浊度法  S  S  S  S

（苯酚：硫酸）  S  S  S  S

＊S表示良好。

表Ⅱ给出了若干肺炎球菌多糖粗制品和相应的经过水解和分离（Hyd+frac）的本发明的新化合物的化学物理参数。表中数值表示近似在试验误差和检测所制备的复合多糖化合物的限度范围内。

表中Crude表示粗制品，hyd-frac表示经水解和分离。

2.新的Pn-Ps-PRO结合物的特征

ⅰ.Pn-Ps的相同性和含量的分析

通过独立技术检查最终结合物中Pn-Ps的含量和化学完整性，以证明抗原性（完整性）和计算Pn-Ps/PRO之比则是一项十分可用的方法。一个方法是根据各具体的Pn-Ps的最佳水解时间，在100℃下用2M  TFA进行5-16小时的完全水解。采用装有脉冲电流检测装置的高效阴离子交换色谱方法，分析等量的Pn-Ps-PRO结合物和PRO水解产物（以罗氏蛋白计），得到单糖构型。为了校准由OMPC中脂多糖（LPS）产生的PRO对单糖造成的影响，采用适当的计算机软件（例如Nelson程序）从Pn-Ps-PRO结合物中“除去”PRO构型。然后将已知量的衍生的Pn-Ps水解产物和修正的Pn-Ps-PRO结合物的构型作对比，计算结合物中Pn-Ps的含量。使用该方法还能测定Pn-Ps/PRO之比例。

ⅱ.显示结合和载帽的新的氨基酸的分析

在Pn-Ps与PRO结合后，将结合物样品置于6N  HCl中水解并进行氨基酸分析。该方法可检测单一氨基酸（例如S-羧基甲基-高半氨酸（S-CMHC）和S-羧基甲基-半胱胺（S-CMCA））的存在和存在量。前者的氨基酸是作为通过衍生的Pn-Ps和PRO之间的化学反应形成的化学连接的一部分（详见以下方法部分所述）并被认为是衍生的Pn-Ps与PRO共价连接的明确证据。这种共价连接的形成对结合物疫苗的T细胞免疫性是必需的。在紧接着完成结合反应后，未反应的溴乙酰胺部分用N-乙酰半胱胺戴帽。该环的连的水解导致S-羧基甲基半胱胺（S-CMCA）的释放，并且还在氨基酸分析中被检测到。该氨基酸的检测肯定了溴乙酰胺反应基团已成功地形成了戴帽，因此使它们不能为不需要的化学反应所利用。可接受的共价和戴帽的量约为1-15%（S-CMHC/Lys和0-5%（S-CMCA/Lys）之间。

ⅲ.氢氧化铝吸附疫苗的分析

在一个较佳实施例中，将Pn-Ps-PRO结合物吸附到氢氧化铝（Al（OH）₃）凝胶上（见以下C部分所述），形成对疫苗免疫应答的势差现象。另一个可能的疫苗配制含有生理上可接受的稀释剂、其他助剂、免疫调节剂或除氢氧化铝以外的惰性赋形剂。该氢氧化铝吸附物质的分析方法如下：

分析吸附氢氧化铝的Pn-Ps-PRO中的组分和稳定性，然后将结合物解吸附除去氢氧化铝。能吸附可在室温下将吸附氢氧化铝的Pn-Ps-PRO对3%柠檬酸钠溶液透析16小时后完成。生成可溶解的柠檬酸铝盐从透析膜流出，留下Pn-Ps-PRO。为了肯定吸附氢氧化铝的配制剂中Pn-Ps-PRO的修正量，该方法具有重要的意义。但是，某些配制剂（例如Pn6B-Ps-OMPC和Pn23F-Ps-OMPC）含有10，5，2和1mcg  Pn-Ps/ml（详见下述C部分），浓度低于化学检测法很多。因此，为了进行碳水化合物的组分分析，首先将吸附的Pn-Ps-OMPC疫苗粉碎，除去液体水，再将碎片悬浮于在柠檬酸盐溶解前1/5原体积中。透析后，溶解的Pn-Ps-OMPC的浓度为50，25，10和5mcg  Pn-Ps/ml。这些浓度适合于进Pn-Ps和蛋白分析，以肯定剂量水平。

柠檬酸盐吸附样品还可用于分析是否存在游离的Pn-Ps，这个问题对于产物的免疫性和稠并具有重要意义。这个分析右在将Pn-Ps-OMPC与Pn-Ps分离的SEPHAROSE  L-2或SEPHACRYL  S1000SF装料柱上经色谱分析完成。通过速率散射浊度测定法，从抗原角度上测定游离Pn-Ps的存在及其含量。Pn-Ps-OMPC中游离Pn-Ps杂质的含量低于Pn-Ps总量的15%。

ⅳ.热原测定：不存在明显的热原

本发明的结合产物经测定，不存在温升反向效应。按本申请提供的方法已经生产了结合产物，并且发现具有可接受的热原质的量。

方法（I.V.）

按21CFR  610.13（b）部分所述方法测定Pn-Ps结合物疫苗。

1）方法（I.M.）

另一个测定热原质的方法是免IM测定法。该测定非常近似于将产物用于临床，并且还更精确地反应产物的表观内毒素负荷。

将每个兔子肌内注射1.0ml疫苗，测定至少用3只兔子，注射后控制温度5小时。其他的测定方法参阅21  CFR  610.13（b）的介绍。（测定量以多糖浓度计）。

ⅴ.共价环连的性质

Pn-Ps-PRO（例如Pn-Ps-OMPC或Pn-Ps-MIEP）结合物可通过含硫醚基团和伯胺的属间间隔的结合，与多糖和PRO（例如OMPC或MIEP）形成水解不稳定的共价键。本发明较佳的结合物是由式Pn-Ps-A-E-S-B-PRO或Pn-Ps-A′-S′-E′-B′-PRO表示的结合物。A-E-S-B和A′-S′-E′-B′构成属间间隔物，其含有水解稳定的共价硫醚键并与大分子PRO和Pn-Ps形成共价键（例如水解不稳定的酯或酰胺键）。在间隔物A-E-S-B中，S表示硫，E表示已与硫醇基反应的亲硫基的转化产物，由下式表示：

式中R是H或CH₃，P等于1-3，A是 ，其中W是O或NH，m等于0-4，n等于0-3，Y是CH₂，O，S，NR′或CHCO₂H（R′是H或C1-烷基或C2-烷基），如果Y是CH₂，m和n不能都等于0;如果Y是O或S，m和n都大于1，B是-（CH₂）_PCH（CH₂）gD-，其中q等于0-2，Z是NH₂，

，COOH或H（R′和p的含义同上），D是

，NR′，或 。在间隔物A′-S-E′-B′中，S是硫，A′是

（其中a等于1-4，R″是CH₂或

，式中Y′是NH₂或NHCOR′），W，P和R′定义同上，E′是已与硫醇基反应的亲硫基的转化产物，由式

表示，式中R定义同上，B′是

，或E′是下式

B′是

，式中P等于1-3。此外，属间间隔物A-E-S-B和A′-S-E′-B′中，E-S-B和A′-S-E′组分是可以测定的并且可以定量测定，这些测定反映了由共价修饰的多糖产生的硫醚硫侧面与由功能蛋白产生的间隔物侧面环连的结合键的共价性。

本发明的结合物Pn-Ps-A-E-S-B-PRO可含有间隔物，其组分包括以下的衍生物：二氧化碳，1，4-丁二胺和S-羧基甲基-N-乙酰高半胱氨酸;二氧化碳，1，5-戊二胺和S-羧基甲基-N-乙酰高半胱氨酸;二氧化碳，3-氧杂-1，5-戊二胺和S-羧基甲基-N-乙酰高半胱氨酸;二氧化碳，1，4-丁二胺和S-羧基甲基-N-乙酰半胱氨酸;二氧化碳，1，3-丙二胺和S-羧基甲基-N-苯甲酰高半胱氨酸;二氧化碳，3-氮杂-1，5-戊二胺和S-羧基甲基-N-乙酰半胱氨酸;二氧化碳，1，2-乙二胺，甘氨酸和S-（琥珀-2-酰基）-N-乙酰高半胱氨酸。本发明的结合物Pn-Ps-A′-S-E′-B′-PRO可含有间隔物，其组分包括以下所述的衍生物;二氧化碳和S-羧基甲基胱胺;二氧化碳和S-（α-羧基乙基）胱胺;二氧化碳和S-羧基甲基高胱胺;二氧化碳，S-（琥珀-2-酰基）胱胺和甘氨酸;二氧化碳和S-羧基甲基半胱氨酸。

B.制备新的Pn-Ps中间体和Pn-Ps-PRO结合物的方法

在提供的制备方法中，分若干阶段介绍。

Ⅰ.多糖的制备：

（a）分离肺炎球菌多糖Pn-Ps粗制品;

（b）部分水解或机械切变Pn-Ps粗制品;

（c）按粒度和纯度分离经部分水解的Pn-Ps;

Ⅱ.结合：

（a）将已经分离的Pn-Ps形成亲电或亲核反应物Pn-Ps＊，最好使每100个Pn-Ps低聚糖重复单位具有大约21个溴乙酰反应基团;

（b）分离免疫原蛋白（PRO），优选脑膜炎双球菌B  OMPC或其亚单位;

（c）使PRO产生亲核或亲电子反应物PRO＊，优选OMPC或其亚单位，例如MIEP，使其具有可反应的硫氢基部分;

（d）将步骤（a）的多糖（Pn-Ps＊）与步骤（c）的蛋白（PRO＊）结合;

（e）使Pn-Ps-PRO结合物形成戴帽，去除残余的官能团;

（f）分离结合产物。

Ⅰa.分离肺炎球菌多糖Pn-Ps粗制品

由于一定的荚膜多糖血清型的低聚糖重复单位的组份和环连的不同，所以肺炎球菌荚膜多糖在化学上和抗原性上也各不相同。根据一定的多糖的物理特征，多糖的分离也必须有所不同。但是，一般说来，都按已知方法（实施例3和Williams，C.A.and  Chase，M.W.，Methods  in  Immunology  and  Immunochemistry，Vol.I，Academic  Press，1967），培养细菌和回收Pn-Ps，而病原体本身则可从ATCC得到。简言之，先在本领域已知的适当的营养培基中大规模培养细菌，使肺炎球菌生长，然后加杀菌剂（例如苯酚或甲苯）杀菌（实施例3）。

接着分两步进行多糖的醇分馏。每一步用低浓度醇沉淀出细胞碎屑和其他不需要的杂质，同时在溶液中保留着Pn-Ps粗制品。然后将水混溶醇加到预定浓度，沉淀出荚膜多糖，而在上清液中还有其他杂质。采用已知方法，例如核酸酶或蛋白水解消化或溶剂提取，将其再悬浮在水介质中，除去杂质蛋白核酸。用醇沉淀法回收多糖，干燥后得到Pn-Ps粉末粗制品（实施例3）。

Ⅰb.部分水解或机械切变Pn-Ps粗制品

基本上按上述方法（并参阅实施例3）制取的多糖粗制品，以未结合状态用于配制成年人和2岁以上儿童用的肺炎球菌疫苗。然后经过一系步骤，得到具有独特和限定的化学物理性质的新的经部分水解和纯化的Pn-Ps产物（见表Ⅱ），可用于制备结合物疫苗。Pn-Ps粗制品大度的减小是由于纯化步骤的成功，从而得到高纯度Pn-Ps产物。此外，当用于制备结合物时，使用本发明的新的Pn-Ps，则可使结合更为有效。这是由于粗制品多糖物质的水溶液很粘，溶解性差，所以其结合物的溶解性和过滤性也很差。结合方法本身不会导致结合物的产率降低。另外，当预结合的Pn-Ps的粒度和粘度都降低，并且溶解度得到提高时，也能从最终结合物中除去未结合的Pn-Ps。这说明在结合物制剂中游离Pn-Ps的存在，就很难确定施用Pn-Ps结合物的实际剂量，由于经过结合的Pn-Ps具有显著的T细胞刺激作用，所以未结合的Pn-Ps的存在则表示与免疫有关的Pn-Ps的减少。

按上述方法制备的干燥的荚膜多糖粗制品也可以进行纯化，例如实施例6中所述的Pn14-Ps，这是在部分水解前后，采用阴离子交换色谱方法或其他色谱方法都能进行纯化。色谱吸附-解吸附可采用主动和被动两种方法。采用主动式时，在Pn-Ps能吸附前，先洗去留在溶液中的杂质，然后将Pn-Ps吸附在树脂上。采用被动方式时，将Pn-Ps溶液中的杂质先进行吸附后除去，使留在溶液中的Pn-Ps处于纯化状态。此外，还可以将Pn-Ps直接进行部分热水解（如实施例4中的Pn6B-Ps）或超声水解（如实施例6中的Pn14-Ps）。其他的水解方法，例如化学方法，醇方法或物理方法（如高压池）也都是已知方法。

通过在水介质中进行有限度的热处理，优先在50-110℃下进行大约1-48小时的有限度的热处理，也能完成部分水解。此外，在冷却过程中达到所需粘度或Kd终点需要许多时间时，则可用有限度的高能超声处理5秒至5分钟。对具有复杂结构的多糖，超声水解法优于热水解法（详述如后）。本领域中已知能有效地部分水解多糖的其他各种适宜方法也都可使用。例如用酸进行有限度的化学水解，内溶酶处理或在捣碎机、碾磨机中进行物理剪切，都可用于降低Pn-Ps链的平均长度。

在一个较佳实施例中，在温度约为0℃-30℃和压力约为2000PSI-15000PSI条件下，将Pn-Ps经过均化器进行物理剪切，预计可得到具有所需链长、多分散度和抗原性的特征的Pn-Ps产物（见实施例10）。

对实验性规模的多糖，通过溶液粘度或高效筛析色谱法即能很容易测定的水解目标终点是可以预计的，从而使多糖的抗原性不致消失。如上所述，结合抗肺炎球菌类型特异性抗体的标准能力，即对等浓度的Pn-Ps原料粗制品所具有的的结合能力不低于70%被认为令人满意。这并不是说，MN，MW或每个分子重复单位数非常低的Pn-Ps（表Ⅱ）不能由该方法生产。这也并不是说，用速率散射浊度测定法测定的可以未与70%以上进行反应的Pn-Ps通过结合就可以动物体内具有免疫性。应该说，由于缺乏适当的结合类型特异性抗Pn-Ps抗体的能力，呈结合状态的低分子量Pn-Ps可被哺乳动物免疫系统所识别，并且可以产生良好的类型特异性抗肺炎球菌应答。在这种情况下，作为接受或排斥特定Pn-Ps制剂的操作根据“抗原”一词应被“免疫原”代之。但是，实际上作为一种控制方法，利用体外抗原性参数比利用全内免疫性参数方便得多。

一般说来，减低链长的同一个方法可用于大多数多糖。但是，Pn6B-Ps通过处长加热降低链长还能保持其抗原性，而Pn23F-Ps则由于经过超声方法或物理剪切方法链长降低不多而可失去其结构的完整性（去除了丙三醇-磷酸侧链）。由于某些原因，在Gaulin均化器中进行物理剪切则是一种较佳方法。首先，该方法适合于按比例扩大。其次，超声和加温水解法一般都要求对经水解过的Pn-Ps继续进行分离，以达到多分散度为1.0-1.5。

但是用物理剪切法所得到的Pn-Ps产物无需进一步分离，分散度也在这个范围内，虽然需要时可进行分离，使纯度进一步提C-多糖杂质降低。第三，与加温或超声水解方法相比，物理剪切法对任何给定的Pn-Ps具有较大再现性的优点。第四，物理剪切法在生产Pn-Ps产品方面具有某些优点，即与由超声或加温水解方法生产的具有相同链长的Pn-Ps相比，对一定链长的Pn-Ps而言，具有更高的抗原性。

与Pn-Ps平均分子量有关的粘度是一项在加工处理过程中非常容易检测的参数，并且在以后的水解过程中对链长降低的程度很容易限制和控制。大量在化学和物理上没有区别的Pn6B-Ps和Pn23F-Ps可通过将多糖的链长降低到协调的目标终点粘度（见表Ⅰ）而可很简单地制取。在处理过程中采用这种粘度测量方法也可应用于各种多粗制品，使它们无需改变形成的Pn-Ps抗原特性，就能通过水解降低链的长度。如上所述，通过平板双向扩散法、速率散射浊度法或本领域已知的其他方法，很容易确定抗原性的保持情况。

表Ⅲ给出了1mg/ml的若干Pn-Ps制剂的0.9%氯化钠（盐）溶液的目标终点粘度。这些数值同样也可用于由其他肺炎球菌亚衍生的Pn-Ps。

表Ⅲ：粗制的和经水解的Pn-Ps的溶液粘度

Pn-Ps亚型  Pn-Ps粗制品的粘度（厚沲）  目标终点粘度（厘沲）

Pn4-Ps  1.8  1.5-1.00

Pn6B-Ps  1.4  1.3-1.00

Pn9V-Ps  1.4  1.3-1.00

Pn14-Ps  1.2  1.1-0.95

Pn18C-Ps  2.0  1.5-1.00

Pn19F-Ps  1.4  1.3-1.00

Pn23F-Ps  1.6  1.5-1.00

在某些肺炎球菌多糖的情况下，在部分水解前后，再进行附加的纯化步骤，例如离子交换步骤，则更为有利。在Pn14-Ps的情况下，在部分超声水解前，用WHATMAN  DE52树脂分次吸附阴离子杂质，即可完成该步骤。多糖经微酸性pH处理后呈中性，在水解完毕后回收其上清液部分。

Pn6B-Ps制剂的分子量在降低链长和分离前约为900千道尔顿（KD），在其后约为300KD。Pn23F-Ps的分子量，在其前后分别约为1000KD或高于1000KD和400-500KD。因此，将Pn-Ps链长降至大约500±300KD时，则是对各个Pn-Ps亚型在这个处理阶段的适宜目标。如IC部分中所述，用预定浓度的醇将已部分水解的材料再进行沉淀，则可回收并进一步纯化已经部分水解过的Pn-Ps。

Ⅰc.按链长和纯度分离经部分水解的Pn-Ps

Pn-Ps制剂的多分散度不仅说明各种亚型特异性Pn-Ps链的长度，而且还可说明族特异性C多糖以及其他杂质仍保留在Pn-Ps制剂中。如上所述，残留的C多糖杂质毫无用处，其可能与有害的免疫应答有关。

选择窄范围的多糖平均分子量（多分散度降低）可通过使用低级醇（例如乙醇，优选异丙醇（IPA）以及分子量降低后的溶解度即可很容易完成。该选择的基础在于对一定的Pn-Ps制剂而言，醇的溶解度与链长成反比，而与分子量成正比。因此，以均匀性显著高于开始减小的Pn-Ps，将该方法成功地应用于定量分离经过分级的分子集居体。在处理过程中，可进行预示用于沉淀Pn-Ps的异丙醇的用量范围的小型试验，控制异丙醇的分级分离。将抗体散射浊度法用于检测该分离，以确保定量回收Pn-Ps。通过上述改进，由许多不同肺炎球菌分离物所共有的C多糖即族特异性多糖造成的杂质比Pn-Ps制剂粗制品降低3-20倍。另外，Pn-Ps制剂的分子大小多分散度也随之降低到大约1.0-1.4。

对已经减小的Pn-Ps的异丙醇分离的另一项研究就是已经减小的Pn-Ps通过适当的筛析树脂，例如用CL-2B树脂或任何其他能够包含并分离分子量为200-1000KD的多糖的树脂进行色谱分离。使用刚度大的筛析基质的HPSEC适宜用于这一方面，以降低延迟和提高分解。以预定粘度或保留时间或直接检测的方法，选择由分离柱上洗脱下来的各部分，得到具有如上介绍的所需大小、粘度和纯度的特片的Pn-Ps分子的集居数。

在化学结合过程中，要始终贯穿异丙醇或色谱分离的其他步骤，因此能产生具有再现性特征的结合物。得到的Pn-Ps纯度显著增加，特别是C多糖明显降低。

由于采用上述的操作和测定方法，得到Pn-Ps中间体较佳和特征，见于表Ⅱ。

Ⅱa.使经分离的Pn-Ps形成亲电子或亲核子反应物Pn-Ps＊，最好使其每100个Pn-Ps单体单位具有大约10-40个可反应的溴乙酰基

由上述步骤Ⅰc得到的Pn-Ps非常均匀，并且具有若干特征，例如溶解度提高，沾度降低，使Pn-Ps适宜于结合。许多不同的方案都可使本领域的专业人员用于制备多糖和其他部分的结合物。本申请所述方法仅仅中利用本发明新的经过部分水解和分离的Pn-Ps中间体构成结合物的一种可能的路线，而不应将其视为利用Pn-Ps中间体的唯一方法。

由Marburg等介绍的属间间隔物方法（参阅Marburg，S.et  al.，U.S.Patent  4695624;J.Am  Chem.Soc.108，5282，1986）是将经过分离的并且减小的Pn-Ps与免疫原蛋白结合的一种较佳方法。应使Pn-Ps具有亲电子或亲核的基团。然后使Pn-Ps＊能够与作用相反的蛋白PRO＊反应。本发明的方法还包括亲核或双亲核基团的选择，所述基团与活化的多糖反应后，与亲电子侧位或硫醇侧基形成共价修饰的蛋白反应前，避免需要进一步使双亲核修改饰的多糖发生作用。在上述步骤中，根据选择的反应物，用几个步骤使蛋白与任一部分发生作用。

不管所需的Pn-Ps＊的官能度如何，经过减小和分离的Pn-Ps首先必须在不受方法干扰的溶剂中溶液。由于Pn-Ps的羟基非常适宜于官能化，所以由水中除去Pn-Ps，可使初始官能化非常严格。用诸如四丁基铵或叔丁基铵的疏水阳离子取代酸性Pn-Ps氢，能使Pn-Ps溶于非水溶剂（例如DMSO或DMF中。当然在中性的Pn-Ps中（例如Pn14-Ps或Pn7F-Ps）不需要进行这种取代。当在非水溶液中，Pn-Ps可与双亲电子试剂（例如羰二酰亚胺吡咯）反应，形成咪唑基二尿烷。与Pn-Ps总单体相比，加入有限量约为1/5羰二酰亚胺吡咯试剂以摩尔计，使100个Pn-Ps单体单位中平均仅产生10-40个官能团，从而将每100个Pn-Ps单体单位的官能团数控制在这个范围内。这类物质由于使用下述试剂，对亲核取代很敏感，即使用（ⅰ）能形成亲核Pn-Ps＊衍生物的胱胺二盐酸盐;或（ⅱ）使用能形成亲电子Pn-Ps＊衍生物的1，4-丁二胺（参阅美国专利4695624和Marburg，et  al.，J.Am.Chem.Soc.，108，5282，1986）。

最近已经发现，由于某些酸性肺炎球菌多糖，例如Pn9V-Ps，Pn9V-Ps，Pn4-Ps，Pn1-Ps，Pn5-Ps和脑膜炎双球菌B或C多糖具有游离羧酸基和游离羟基，所以这些多糖的结合化学的略为不同于中性多糖或因存磷二酯键（如在多核糖基核糖醇磷酸中）的方式进行处理。一般说来，无羧酸多糖的结合化学是通过将游离多糖羟基转化为尿烷环连，即由Pn-Ps-OH转化为 （式中R^a表示连接多糖与蛋白的原子链的残余部分）。但是在含羧酸的多糖中，例如含葡糖醛酸的Pn9V-Ps或含丙酮酸基的Pn4-Ps，化学处理上是将

转化为

（式中R^a表示连接多糖与蛋白的原子链的残余部分）。因此可以看到，或在含羧酸的多糖中不形成尿烷的酯官能度，或在这些部位形成简单的酰胺键。由于羧酸官能度的存在，结合化学可以较快的速率处理。

由于羧酸官能度被认为是这类阴离子多糖的抗原性和免疫原性的重要组分，结合化学必须谨慎控制这些多糖。在最终结合物中，对多糖与蛋白的高比例的要求必须与保留抗原完整性的要求相平衡。这种平衡可通过限制介导激活的起始羰基二亚酰胺吡咯的用量予以解决。当酰胺形成时，就可如上所述和以下所作的讨论，进行下一步的处理，包括用胱胺二盐酸盐或1，4-丁二胺处理。

此外，羧基可被逆向保护后，再用三甲基硅烷基或类似保护基团（其中后者可用温和的碱性条件除去）去保护，或用对酸不稳定的2，4-二甲氧基苄酯去保护。在这种情况下，结合化学可按常规方法通过多糖羟基进行处理。

1.亲核Pn-Ps＊的制备

以上得到的经羰基二亚酰胺吡咯激活、减小和分离过的Ps可在水或其他溶剂中与美国专利4695624中介绍的试剂反应，较佳的试剂是胱胺二盐酸盐，然后去除多余的胱胺，并用二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇还原，得到亲核硫氢基官能化的Pn-Ps。该Pn-Ps＊衍生物能与亲电子PRO＊反应，例如其中的蛋白修饰成具有溴乙酰侧基。

2.亲电子Pn-Ps＊的制备

以上得到的经羰基二亚酰胺吡咯激活、减小和分离过的Pn-Ps可在水或其他溶剂中与美国专利4695624介绍的试剂反应，优先与1，4-丁二胺（BuA2）。然后用溴乙酸硝基苯酯或类似试剂将Pn-Ps-BuA2酰化，产生能与亲核PRO＊（例如经硫氢基修饰的蛋白）反应的亲电子Pn-Ps-BuA2-BrAc衍生物。衍生的程度可用NMR和1，4-丁二胺与常规单糖倍号（例如鼠李糖的甲基信号）的对比进行测量。较佳的衍生量为10-40%，最佳的衍生量维为20%。

ⅡB.分离免疫原蛋白（PRO），优选脑膜炎双球菌B、OMPC或其亚单位

蛋白质部分应是一种免疫增强剂。在选择蛋白质时，最好避免选用导致非特异性激活受体免疫应答（活化性）的蛋白质。在美国专利4695624中，Marburg等将由脑膜炎双球菌衍生的外膜蛋白复合物（OMPC）用于制备多糖-蛋白结合物。现已证明，OMPC适宜用于本发明，尽管其他免疫原蛋白也可使用，例如破伤风或白喉类毒素或非日毒素。

纯化由革兰氏阴性菌产生的OMPC的各种方法已由文献作了介绍[Frasch  et  al.，J.Exp.Med.140，87（1974）：Frasch  et  al.，J.Exp.Med.147，629（1978）;Zollinger  et  al.，US  patent  4，707，543（1987）;Helting  et  al.，Acta  Path.Microbiol.Scand.Sect.C89，69（1981）;Helting  et  al.，US  Patent  4，271，147]。本发明所用的OMPC按实施例1所述方法制备。此外，由分解OMPC或重组表达编码OMPC组成蛋白，特别是主膜蛋白（亦称促细胞分裂诱导蛋白-MIP或主免疫增强-MIEP_的材料分离到的蛋白质亚单位也属于优选蛋白质。获得亚单位蛋白的一种方法已经公开在实施例2，16-23和美国专利USSN  555978，555329，555204和639457（Merck案号：18110，18159和18160，于1990年7月19日申请;以及181601A，于1991年1月10日申请）。

ⅡC.使PRO产生亲核或亲电子反应物PRO＊，优先使OMPC或其亚单位具有可反应的硫氢基部分

将按上述Ⅱb分离到的PRO进一步功能化，使其具有亲电子或亲核基团，使PRO＊能够与按上述Ⅱa方法制备的相反作用的Pn-Ps反应。

1.亲电子PRO＊衍生物的形成

经过分离的PRO，例如奈瑟氏菌属的OMPC或由OMPC衍生的MIEP，优先与能够PRO上赖氢酸的ε-氨基反应的试剂进行反应，所述试剂例如有N-（溴乙酰基）-6-氨基己酸硝基苯酯。生成的溴乙酰基化的PRO＊能与按以上Ⅱa1所述方法制备的Pn-Ps＊亲核衍生物反应。

2.亲核PRO＊衍生物的形成

经过分离的PRO，例如奈瑟氏菌属的OMPC或MIEP，与诸如试剂N-乙酰基高半胱氨酸硫化内酯反应，产生蛋白质的硫氢基衍生物。该亲核衍生物能与按以上Ⅱa2所述方法制备的亲电子Pn-Ps＊反应。该方法在此阶段得到的硫氢基滴定度约为0.1-0.3μm/mg蛋白。

Ⅱd.步骤Ⅱa的多糖（Pn-Ps＊）与步骤Ⅱc的蛋白（PRO＊）的结合

通过以上步骤Ⅱa和Ⅱc反应物Pn-Ps＊和PRO＊的组成，将逆向激活的反应组分以1∶1质量比互相接触。反应混合物应用氮气清洗去，密封，并在室温（17°-40℃）下反应约4天。这些反应的实例包括：

其中已与4-溴乙酰氨基丁胺反应过的激活多糖与已与N-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯反应过的蛋白质反应，形成结合物，以及

（其中Y″表示C2-C8烷基），其中已与激活的马来亚氨酸反应过的氨基衍生的多糖与已用氨基硫醇胺化的羧基激活的蛋白反应，形成结合物。

同样，经硫醇侧基共价修饰过的多糖可与具有亲电子中心的细菌蛋白OMPC或MIEP反应，生成共价结合物。该反应的一个实例是：

其中已与氨基硫醇反应过的激活多糖与已与二胺的一囱代乙酰基衍生物反应过的羧基激活的蛋白反应，形成共价物。按本发明的更佳环连是下式的间隔物

通过多糖羟基进行环连，或在具有羧酸基的多糖的情况下，是下式的间隔物

如果需要除去多余的囱代乙酰基的亲电子活性，则结合物与低分子量硫醇（例如N-乙酰胱胺）反应，即可达到该目的。使用N-乙酰胱胺还可确定所用囱代乙酰基部分的用量，因为采用Spackman，Moore和Stein方法完全能检测到已形成的S-羧甲基胱胺。

Ⅱe.将Pn-Ps-PRO结合物戴帽，除去残余物的官能团

在反应结束时，加入多于结合物上残余反应基团纺约2倍至10倍摩尔的低分子量的亲核试剂（例如N-乙基马来酰亚胺（NEM）），使PRO＊或Pn-Ps＊上的残余亲电子基团骤冷，使残余的游离硫氢基戴帽;或加入亲电子试剂（例如N-乙酰胱胺），使残余的溴乙酰基部分戴帽。

Ⅱf.分离结合产物

采用超速离心或过滤方法，将戴帽的结合物与未结合的PRO，Pn-Ps和其他反应物分离。将结合物碎片悬浮在缓冲液中洗涤，可包括洗涤剂处理（例如0.5%脱氧胆碱），盐处理（例如0.1M  Tris，pH7-9）以及约10mM  EDTA，除去残余的热原。结合物在室温下静置1-25小时。再将结合物粉成碎片，悬浮在不含洗涤剂的缓冲液中。在大约1°-20℃下，超速离心（约100000Xg，固定角转子）约2小时，也可采用任何一种其他的纯化方法进行纯化，包括过滤凝胶渗透法，离子交换色谱法，梯度离心法或其他差示吸附色谱法。为了除去非共价键合的多糖和蛋白质，可使用Ps，PRO和速率散射浊度测定法，以及属间间隔物共价测定法（详述如后）和按所需生物活性的离体方法。

反应物的进一步分离可采用柱筛析色谱法，或在非常大的不溶蛋白的情况下，可采用超速离心法。将结合物悬浮在无菌水中，于4℃下熟化约1天，使完全溶解，然后低速离心，除去不溶颗粒。上清液含有最终产物，可经无菌过滤后，配制成免疫有效剂量的疫苗组合物，无菌装入瓶中。

为了证实结合物的共价性和稳定性，先将结合物水解（优先在110℃下用6N  HCl水解20小时），然后定量分析含硫醚键的对水解稳定的间隔物中各氨基酸和组成蛋白质的各基酸。根据需要，通过与有关蛋白质的适当的标准氨基酸对比，与反映结合物共价性的氨基酸值对比，去除蛋白氨基酸的组分，或将蛋白质标准氨基酸排除在外，将间隔物中的氨基酸用于分析。为了提高生物活性成份的浓度，共价测定法也可用于检测纯化处理。在上述实施例中，通过裂解肽连锁和其他水解不稳定键上的Ps-A-E-S-B-PRO分子，水解

释放出S-羧甲基高半胱氨酸：

水解

释放出氨基二羧酸：

以及水解

释放出S-羧甲基胱胺：H₂NCH₂CH₂SCH₂CO₂H。色谱法，例如Spackman，Moore和Stein所介绍的方法，很容易应用和测定各组成氨基酸之比。

IgG抗体的最佳生产需要B和T淋巴细胞与有意义抗原的特异性相结合。T淋巴细胞不能识别多糖，但是如果多糖与能够识别T细胞的蛋白共价连接，则T淋巴细胞有且于抗多糖IgG抗体应答。

C.疫苗配制剂和药效

在一个较佳实施例中，将结合产物吸附在氢氧化铝凝胶上，通过制备相当于20μg/ml Pn-Ps浓度的结合物贮备溶液即可完成此项工作。用无菌水按1∶1，1∶5和1∶10稀释成若干份，每份样品都含有20μg/ml贮备溶液，然后按1∶1比例用含有0.85mg/ml Al⁺³，1.7%NaCl（W/V）和100μg/ml乙基汞硫代水杨酸钠的氢氧化铝稀释液进行稀释。用含有Pn-Ps浓度为10，5，2和1μg/ml的1N NaOH溶液将上述溶液的pH调至7.5左右。这些配制剂分别含有大约0.1ml至0.75ml的剂量，适用于不同年龄和体重范围的受体。现已发现，按所述方法配制的疫苗在2-3个月婴猴中，对Pn6B-Ps-OMPC，Pn14-Ps-OMPC，Pn19F-Ps-OMPC和Pn23F-Ps-OMPC显著提高了亚型特异性抗肺炎球菌多糖的免疫应答。此外，还发现，Pn-Ps-OMPC结合物疫苗在无胸腺鼠中与T细胞有关。

从以上所述可清楚地看到，具有本文所限定的特征的其他多糖和制备具有这些特征的Ps的方法可以用于制备各种结合物，正是这些结合物含有经过部分水解和分离的肺炎球菌多糖。这些结合物可用于防止由其他病原菌引起的种种疾病。例如引起新生儿脑脊膜炎的B族链球菌，引起幼儿脑脊膜炎的脑膜炎双球菌B或C，主要引起尿道和其他碱染的大肠杆菌都可用途多糖源。这些多糖和Pn-Ps及其共价结合物也都可为疫苗配制剂组合物提供高种重要的级份。这种组合物可以含有免疫有些量的佐剂，例如弗罗因德氏佐剂，Ribi佐剂或免疫调节化合物，例如白介素，干扰素（例见列于Market  Letter（Nov.30，1987，p.26-27）中的化合物或其他免疫原。在一个较佳实施例中，含有免疫有效量的本发明结合物的组合物包含一种或多种抗下列病原体的疫苗：乙型肝炎，甲型肝炎，非甲非乙型肝炎，爱滋病，白喉，百日咳，破伤风，麻疹，流行性腮腺炎，风疹，水痘，脊髓灰质炎，流感嗜血杆菌b，从以上所述的其他较佳疫苗则是选自Pevax HIB^R，Recombivax HB^R，M-M-R^R和三价DTP疫苗。

以下的实施例是为了进一步说明本发明，但不应视为限制本发明。

实施例1：脑膜炎双球菌B11血清型2  OMPC的制备

1.脑膜炎双球菌B11族

将装有冰冻干燥的脑膜炎双球菌培养物（由M.Artenstein博士处得到Walter Reed Army Institute of Research-WRAIR，Washington，D.C.）的试管打开，加入Eugonbroth（BBL）。培养物条铺在Mueller Hinton琼脂斜面上，在37℃和5%CO₂条件下温育36小时，即将培养物收集到10%脱脂乳培养基（Difco）中。整份培养物在-70℃冰冻。通过与由WRAIR提供的特异性抗血清和由Difco提供的典型血清的凝聚作用证明细菌的同一性。

将一小瓶第二代培养物解冻后，条铺在10块哥伦比亚关血琼酯板（CBAB-BBL）上，在37℃和5%CO₂条件下温育18小时，然后将培养物收集到100ml的10%脱脂乳培养基中，取0.5ml为一整份，全部整分培养物冰冻在-70℃下。通过与特异性抗血清的凝集、糖发醇和革兰氏染色，证明细菌为阳性反应。

将一小瓶该代细菌培养物解冻，用Mueller-Hinton培养基稀释，条铺在40个Mueller-Hinton琼脂板上，在37℃和6%CO₂条件下温育18小时，然后将生长培养物收集到17ml的10%脱脂乳培养基中，以0.3ml为一份，在-70℃下冰冻。经革兰氏染色，与特异性抗血清凝集和氧化酶测定，证明该细菌呈阳性反应。

2.细胞糊状物的发酵和收集

a.接种物的展开：从上述一小瓶冰冻的脑膜炎双球菌B，B-11族（第4代）取出已经生长的接种物，接种在10个Mueller-Hinton琼脂斜面上，约18小时后收集6个斜面的培养物，用作3×250ml装有Gotschilic酵母透析液培养基的烧瓶中，pH6.35。将OD660调至0.18，温育至OD660为1-1.8。取1ml该培养物，接种到5×2L三角烧瓶中，每瓶含有1升培养基（详述于后），在37℃下于200rpm摇床中温育。接种后每隔1小时检查OD变化情况。结束时，OD660为1.28，营养培养物达到4升。

70升种子发酵罐：将大约4升种子培养物接种到装有大约40升完全生产培养基（详述于后）的70升无菌发酵罐中。70升发酵条件：37℃，185rpm，每分钟10升通气量，pH恒定控制在大约7.0约2小时。2小时后，这批培养物的最终OD660为0.732。

800升生产发酵罐：将大约40升种子培养物接种到装有568.2升完全生产培养基（见后）的800升无菌发酵罐中。在37℃下温育，100rpm，每分钟60升通气量，pH恒定控制在7.0。接种后13小时，这批培养物的最终OD为5.58。

3.三角烧瓶、70升和800升发酵罐的完全培养基：

A部分

L-谷氨酸  1.5g/l

NaCl  6.0g/l

Na₂HOP₄（无水） 2.5g/l

NH₄Cl 1.25g/l

KCl  0.09g/l

L-半胱氨酸HCl  0.02g/l

B部分（Gotschlich酵母透析液）：

将1280g的Difco酵母膏溶解于6.4升蒸馏水中，该溶液在2个Amicon DC-30中空纤维透析装置（有3个H10SM筒）中进行透析。将384g MgSO₄·7H₂O和3200g葡萄糖溶解于透析液中，加蒸馏水使总容积达到15升。用NaOH将pH调至7.4，通过0.22μ漏斗灭菌，然后转移到装有A部分的发酵罐。

三角烧瓶：加入1升A部分和25ml  B部分，用NaOH将pH调整至7.0-7.2。

70升发酵罐：加入41.8升A部分和900ml  B部分，用NaOH将pH调至7.0-7.2。

800升发酵罐：加入553升A部分和15.0升B部分，用NaOH将pH调至7.1-7.2。

b.收集和减活

发酵结束后，将苯酚加到分离器中，然后将细胞培养液转移到该分离器中，得到的最终苯酚浓度约为0.5%。在室温下缓慢搅拌，将材料保持到使培养物失活（约24小时）。

c.离心

在4℃下大约24小时后，将614.4升灭活培养液通过Sharples连续流动离心机离心。经苯酚处理后，细胞糊状物的重量达到3，875kg。此外，按以下所述，过滤收集苯酚致死发酵培养液。

B.OMPC的分离

步骤1：离心和过滤

将苯酚灭活的培养物离心至大约30升，在无菌蒸馏水中用0.2μm中空纤维漏斗（ENKA）过滤。

步骤2：提取

将等体积的2X  TED缓冲液（0.1M  TRIS，0.01M  EDTA缓冲液，用0.5%脱氧氯酸钠将pH调至8.5加到经过离心过滤的细胞中，然后将悬浮液转移到控温罐中，在56℃下搅拌30分钟提取OMPC。

在大约18000rpm的Sharples连续流动离心机中，于4℃下，离心提取液，流速约为80ml/分钟。然后收集粘筒的上清液，贮藏在4℃下。将提取过的细胞碎片按上述方法，再在TED缓冲液中提取，收集上清液，贮藏在4℃下。

步骤3：超滤浓缩

将收集到的提取液转移到控温罐（装有AG-Tech  0.1μm聚砚漏斗）。在整个浓缩过程中，罐中提取液的温度保持在25℃下。在跨膜平均压力为11-24psi下，样品浓缩到1/10。

步骤4：OMPC的收集和洗涤

在大约70℃下将步骤3的残留物置于大约160000xg（35000rpm）的连续流动离心机中离心，流速300-500ml/分钟，倒出上清液。

将OMPC碎片悬浮在TED缓冲液（190ml缓冲液，20ml/g碎片），重复2次步骤2和步骤4（省略步骤3）。

步骤5：OMPC产物的回收

用玻璃棒和Dounce均化器将步骤4经过洗涤的碎片悬浮在100ml蒸馏水中，确保完全悬浮。然后通过0.22μm漏半将OMPC悬浮液无菌过滤。用0.1μm中空纤维漏斗过滤无菌蒸馏水，并用该蒸馏水取代TED缓冲液。

实施例2：OMPC亚单位的纯化，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳由OMPC或重组细胞制备纯化的MIEP

使用丙烯酰胺/BIS（37.5∶1）凝胶，18×14cm，3mm厚。积层凝胶是4%聚丙烯酰胺，分离凝胶是12%聚丙烯酰胺。每种凝胶使用大约5μgOMPC蛋白或重组宿主细胞蛋白。将0.5ml试样缓冲液（4%丙三醇，300mMDTT，100mM  TRIS  0.001%溴苯配酚兰，pH7.0）加到1ml  OMPC中。该混合物在20分钟内加热到105℃，冷却至室温，然后装载到凝胶上。凝胶在200-400毫安和冷却条件下流动，直至溴苯酚兰到达凝胶的底部。垂直切下凝胶带（约1-2cm宽），用考马斯/乙酸铜（0.1%）染色。然后将凝胶带脱色至肉眼可看到MIEP（约38KD）。再将该凝胶带置于其原来的位置，用曲能剖刀从凝胶的残余部分切下MIEP部分。

将切下的部分切成立方体（约5mm），并用0.01M  TRIS缓冲液（pH8.1）洗脱，洗脱2个循环后，用SDS-PAGE测定洗脱液的纯度。将该洗脱液与一般收集的洗脱液合并，用60mM氨水-甲酸（pH10）透析48小时。另外，用50%乙酸水溶液透析洗脱蛋白。渗析后将洗脱的蛋白蒸发至干。材料通过PD10筛析柱（Pharmacia，Piscataioay，NJ）得到进一步纯化，然后在室温下贮藏。

实施例3：培养肺炎球菌亚型和分离Pn-Ps粗制品

Ⅰ培养肺炎球菌

培养肺炎球菌的方法已为本领域所公知（Chase，M.W.，Methods  of  Immunology  and  Immunochemistry  1，52，1967）。肺炎球菌亚型的分离物可从ATCC得到。细菌经鉴定确认为是包膜不活动的革兰氏阳性和矢状的双球菌，其在血-琼酯上为α-溶血双球菌。根据用特异性抗血清和荚膜膨胀反应，其亚型各不相同。原种培养物最好保持在冰冻状态或8℃以下。在一个优选培养方法中，培养用心浸剂培养基，将培养物铺在含有10%脱纤兔血液的心浸剂琼脂上，可以增加培养物。在37℃±2℃下大概需要培养18小时。

将在平板上生长的培养物再悬浮在心浸剂培养基上，然后将其以整分部分接种到100ml含10%脱纤免血液的心浸剂培养基中，在37℃±2℃固定温育培养约18小时。取100ml液体培养物（工作用种子）通过显微镜检查革兰氏染色的涂片和在心浸剂血琼脂板上生长的培养物检查其纯度。工作用种子在2-8℃下可贮藏最多至14天，也可立即使用。在2升的三角烧瓶或其他适当容器中，装有含葡萄糖（25g/l）的肺炎球菌接种培养基（YUF），并用工作种子接种，在37℃±2℃下固定温育约8-24小时。温育时间可根据所培养的肺炎链球菌的类型而可改变。用过磺酸加成的12%碳酸氢钠溶液调节发酵的pH值，使其保持在6.0-7.2，至光密度达到1.5-4.0。在660mm处监测光密度。培养物的样品可用显微镜检查，进行血清聚集反应可以检查纯度。将此阶段的生长培养物转移到装有40升肺炎球菌发酵培养基的种子发酵罐中，该培养基由蒸馏水、肺炎球菌种子培养基（YUF）干组分、酵母膏超滤液、UCON和葡萄糖（约25g/l）组成。培养物在37℃±2℃和缓慢搅拌下温育约2-12小时。加入过磺酸加成的氢氧化钠溶液，将pH控制在6.0-7.2。装有525升肺炎球菌发酵培养基（由蒸馏水、肺炎球菌生产培养基-YUF、酵母膏超滤液、UCON和每升约25g的葡萄糖组成）发酵罐用约50升2-12小时的种子培养物接种。在37℃±2℃和温和搅拌下，根据生长培养物的类型，温育6-30小时。加入过磺酸加成的氢氧化钠溶液，将pH控制在6.0-7.2。发酵后检查光密度。pH不再改变时，表示葡萄糖完全被利用，发酵终止。

在发酵终止后可直接将病原体致死，可用的方法是将苯酸加到大约1%的浓缩物中，在室温下杀菌可进行2-12小时。

Ⅱ.Pn-Ps粗制品的分离

将足够量的变性乙醇加到已杀死的培养物中，沉淀出的细胞碎屑和核酸通过离心除去，然后加入更多的变性醇，从上清液中沉淀出多糖粗制品。离心收集固体，倒去上清液。

将多糖溶解在中性水溶液中（例如1-5%乙酸钠），或将核酸酶和约0.01M氯化镁加到0.05M磷酸盐缓冲液中，从而可以减少核酸杂质。在36℃下，经过大约60-120分钟后，将pH调至8.0左右，并加入蛋白酶（例如胰蛋白酶），可消化蛋白质杂质。

去除其他杂质的方法是在乙酸钠中，用变性乙醇或异丙醇沉淀多糖，然后再溶于蒸馏水中。在约8℃下，加入十六烷基三甲基溴化铵，沉淀出的杂质用离心除去。加入乙酸钠和整份变性乙醇或异丙醇，可以除去其他杂质。加入或多加乙醇并且离心，可回收多糖。沉淀物用无水乙醇洗涤至得到白色粉末。通过过滤、无水乙醇和丙酮洗涤和真空干燥，得到Pn-Ps粉末粗制品。

实施例4：制备部分水解、纯化的Pn6B-Ps

（1）加热水解：在室温下，将每份3.0g的Pn6N-Ps粉末粗制品溶解于1200ml盐水（0.9%NaCl），搅拌约4小时，在4℃下放置过液。在100℃下该溶液在指形回流冷凝管中水解24小时，冷却至室温。将乙酸钠试剂（59.7g）加到最终浓度为3%（W/V）。

（2）血清学测定：以每份10ml样品进行异丙醇（IPA）分离示范研究和抗体终点散射浊度测定，结果证明：Pn6B-Ps在40-50%IPA时沉淀。

（3）每一次加入IPA：已经水解的样品（体积1210ml，取自上述步骤1）通过加入932ml  IPA（室温下搅拌滴加），使其IPA增至43.5%。将样品搅拌15-30分钟，然后以11000xg离心30分钟（Backman  JA-10转子，800rpm，20℃）。糊状碎片在250ml  Ominimix缸中用无水EtOH研制，然后在60ml烧结玻璃漏斗上收集。在漏斗上先后直接用无水EtOH和丙酮洗涤沉淀物，在室温下经氯化钙真空干燥，准备用于分析。

（4）第二次加入IPA和产品回收：在室温下搅拌滴加93.5ml的IPA，使43.5%的IPA上清液（体积：2020ml，取自上述步骤3）增至46.0%IPA。按步骤3所述方法，将样品熟化，离心。按上述步骤3的方法，研制、收集、洗涤和干燥碎片。得到的Pn6B-Ps重1650mg，Kd  0.62，磷含量3.3%。

实施例5：肺炎球菌6B-OMPC结合物Pn6B-Ps-OMPC

A.Dowex  50×2四丁铵树脂（Dowex  50（Bu4N±）1）的制备

将Dowex 50×2（200-400目）H⁺形（72g）置于水中制浆状。装载到柱上后依次用水、6N Hcl和水洗涤，至pH试纸测定为中性。用10%氢氧化四丁铵水溶液流经该柱，至测试呈强碱为止。最后用水流经该柱，至测定再呈中性止。

B.Pn6B（Bu4N+）

将经减小和分离过的Pn6B-Ps（600mg）（参见表ⅠPn6B-Ps第一组的物理性质）溶解于无菌蒸馏水（60ml）中，该溶液经磁搅拌至所有固体都转化为液体（1.5小时）。将多糖溶液涂在经过漂洗的树脂上，由于重力作用流过柱床（4.5小时）。柱用水洗涤（10-12ml），然后将流出物合并，冰冻干燥，得到640mg干的Pn6B-Ps四丁锓盐Pn6B（n-Bu4N+）。

C.Pn6B-BuA2

将Pn6B（n-Bu4N+）（640mg）溶解于二甲亚砜（DMSO）（24ml），磁搅拌30分钟后，所用固体都转化为溶液。将1，1′-羰基二酰亚胺吡咯（44.2mg）加到该混合物中，反应在室温下搅拌60分钟。在分离烧瓶中加入10N NaOH，使丁二胺二盐酸盐（BuA2·2HCl，1.002g）的水（16ml）溶液呈戌性（pH10.2）。用0.2μm无菌漏斗过滤溶液，在冰浴中冷却。将熟化的含有激活多糖的DMSO混合物缓慢稳定地连续加到冷却的BuA2·2HCl溶液中，生成的溶液在0℃下搅拌15分钟。将反应混合物加热至室温，再搅拌1小时。然后转移到渗析管中，在4℃下用以下所述进行渗析，即：（1）15升0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.0，6小时;（2）15升0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.0，12小时;（3）15升0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.0，9小时;（4）15升蒸馏水，1.75小时。将渗析管中的材料冰冻干燥，得到222g Pn6B-1，4-丁二胺（Pn6B-BuA2）。通过将Pn6B-Ps的丁二胺上的亚甲基和鼠李糖上的甲基质子的核磁共振作对比，则大约5mg这种材料的NMR（300MHz，D₂O）显示每100个Pn6B-Ps重复单体单位装载22个二胺残基。

Pn6B-BuA2-BrAc：

将Pn6B-BuA2（210mg）溶解在pH9.04的0.1M  Kolthoff硼酸盐-磷酸盐缓冲液（21ml）中，混合物经磁搅拌30分分钟后形成溶液。将由溴乙酸硝基苯酯（210ml）的乙腈（2.6ml）溶液组成的混合物加到上述水溶液中，反应搅拌过液（20小时，4℃）。将溶液转移到渗析管中对以下所述进行渗析（4℃）;（1）15升无菌蒸馏水（12.3小时）;（2）15升无菌蒸馏水（8.25小时）;（3）15升无菌蒸馏水（5.5小时）。为了进行测定（NMR和HPSEC-一般档定或分子大小的分析），从渗析袋中去除1.7ml，然后加入0.449g干燥的pH为8的磷酸缓冲盐（由将0.1M和pH为8的磷酸钠溶液冰冻干燥制取）。完全溶解后（30分钟），通过0.2μm无菌漏斗过滤溶液，得到pH8的Pn6B-BuA2-BrAc溶液。

Pn6B-OMPC：

将4个10ml离心管中的无菌OMPC（40ml，4.5mg/ml）通过超过速离心（4℃，43K rpm，2小时）粉碎成碎片。将每片碎片再悬浮在3ml经过无菌过滤的（0.22μm）硫醇化混合物中，该混合物由以下组成：N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯盐酸盐（164mg）、乙烯-二胺-四乙酸二钠盐（255mg）和二硫苏糖醇（53mg）于Na₂B₄O缓冲液（30ml，pH11.09）。在室温下将悬浮的碎片均匀化（Dounce）后，合并，容器排气和用氮气复盖，熟化过液（19小时）。将溶液分成3个超速离心管，用1M KH₂PO₄和粉碎蛋白（4℃，43K rpm，2小时）拔顶。然后将碎片悬浮在0.1M磷酸钠和pH为8的缓冲液（30ml）中，均匀化（Dounce）和再粉碎（4℃，43K rpm，2小时）。将无菌蛋白碎片悬浮在经过过滤的Pn6B-BuA-BrAc溶液中。直接进行Ellman测定后，得到SH滴定为34μmol。在室温下将反应混合物排气，用氮气复盖，熟化91小时。

加入1ml由N-乙基马来酰亚胺（75mg）和5ml  0.1M磷酸钠缓冲液（pH8.0）组成的溶液（经0.22μm无菌漏斗过滤），从而将蛋白质戴帽。在室温下，将该混合物熟化4小时，然后加入300μl  N-乙酰胱胺（经0.22μm无菌漏斗过滤），溶液再经19.5小时熟化。

将无菌戴帽的结合物分成4个离心管，用0.1M磷酸钠缓冲液（pH7）拔顶，超速离心粉碎（4℃，43K  rpm，2小时），然后悬浮和均匀化（Dounce）于无菌0.1M  NaPO4缓冲液（pH7，42ml）中。按如前所述，再进行离心，将碎片再悬浮在Dounce均匀器中，总量为50ml无菌蒸馏水。在4℃下熟化17小时后，用TJ-6离心机（TH4转子，1000rpm）离心结合物制剂3.5分钟，除去少量沉淀。测定最终结合产物悬浮液中的蛋白质（Lowry），Pn6B-多糖（苯酚/硫酸），未结合的多糖（筛析色谱法-速率散射浊度测定）和氨基酸（氨基酸分析）。测定结果如下：

Pn6B-多糖  0.33mg/ml

蛋白  2.2mg/ml

Pn6B-Ps/OMPC  0.15

游离Pn6B-Ps  ＜5面积%

S-羧甲基高半胱氨酸/赖氨酸  7.7%

S-羧甲基胱胺/赖氨酸  1.6%

实施例6：制备部分水解、纯化的Pn14-Ps

（1）用阴离子交换树脂处理：在室温下将每份2.81g的Pn14-Ps粉末搅拌溶解于1124ml蒸馏水中，约4小时后，在4℃贮藏过液。将该溶液加到60g  DE52（Whatman，二乙基氨工-乙基纤维素）中，该DE52在pH约5-6的蒸馏水中约经15小时的预溶胀。在室温下，浆料在台式摇动器上缓和摇动约15小时，然后于20℃下，在Beckman  JA-10离心机（5000rpm）中离心15分钟。通过烧结玻璃漏斗（150ml，中等孔径）进一步澄清上清液，并将其收集到2升支臂烧瓶中。

（2）超声水解：将经DE52处理过的Pn14-Ps（容积1100ml，取自上述步骤1）置于塑料杯中，在冰浴上用Branson超声发生器（1/2英寸探头，8个装置）进行超声处理2分钟。将样品冷却约15分钟，同时测定粘度，然后每隔1分钟处理1次。在最一次超声处理后，粘度终点达到1.096厘沲。将经过水解的样品升温至室温，加入乙酸钠试剂（18.0g），使最终浓度达到1%（W/V）。

（3）血清学测定：用10ml一份的样品进行异丙醇（IPA）分离小型研究和抗体终点的散射浊度测定，结果Pn14-Ps在35-45%IPA之间沉淀。

（4）第一次加入IPA：加入706ml  IPA（室温下搅拌滴加），使经水解过的样品（容积1090ml，得自上述步骤2）达到39.3%IPA。将样品搅拌15-30分钟，然后在11000xg离心30分钟（Beckman JA-10离心机：9000rpm，20℃），倒去上清液。在250ml Omnimixjar中用无水EtOH研制留下的碎片，再用60ml烧结玻璃漏斗收集。在漏斗上先后用无水EtOH和丙醇直接洗涤沉淀物，在室温下用CaCl₂真空干燥，可用于分析。

（5）第二次加入IPA和回收产物：在室温和搅拌下，滴加73.5ml  IPA，使原39.3%IPA上清液（容积1712ml，得自上述步骤4）达到41.8%IPA。按上述步骤4的方法，研制、收集、洗涤和干燥碎片。Pn14-Ps产品的重量为1.399mg。

（6）渗析和冰冻干燥：在室温下将由步骤5得到的1385.6mg一份的样品溶解于554ml蒸馏水中2-3小时。将溶液（2.5mg/ml）转移到渗析管中（1200MW断流45mm），用蒸馏水渗析27小时，再用蒸馏水更换2次。然后将经过渗析的样品冻冻干燥并中，在干冰-甲醇浴中密闭冰冻，并用Virtis（Freezemobil）冰冻干燥器冰冻干燥2-1/2天至干。回收1326.8mg最终产物Pn14-Ps，Kd为0.56。

由以上介绍，本领域专业人员显然知道，其他中性的Pn-Ps亚型，例如Pn7F-Ps，可按本申请公开的方法制备和结合，因为Pn14-Ps也属于中性多糖。

实施例7：外膜蛋白复合物与肺炎球菌14多糖的结合，Pn14-Ps-OMPC

a.Pn14-Ps的1，4-丁二胺衍生物的制备（14-BuA2）

410mg的Pn14-Ps在用P₂O₅真空贮藏3小时后，加26ml二甲亚砜（DMSO）搅拌0.75小时，溶解，加入62mg羰二亚酰胺吡咯，生成的溶液在室温下搅拌80分钟。

制备含有1.067g  1，4-丁二胺二盐酸盐（BuA2·2HCl）的水（38.5ml）溶液，并用2.5N  NaOH将其pH调至10.20。该溶液经Millex  0.2μm  GV漏斗过滤，在冰浴中冷却。

将熟化的MDSO溶液加到冷却的BuA2溶液中，在冰浴中再搅拌10分钟，在室温下熟化50分钟，然后将溶液装到2个12″长的Spectrapor  2渗析管上，从液体顶部切下1cm与以下所述渗析：（1）15升0.1M磷酸钠缓冲液（ph7.0，16.5小时）;（2）15升0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0，8小时）;（3）15升0.1M磷酸钠缓冲液（ph7.0，8小时）;（4）15升水（17.5小时）。然后冰冻干燥，得到Pn14-Ps的1，4-丁二胺衍生物（Pn14-BuA2）。

将丁二胺亚甲基和（Pn14-Ps）N-乙酰甲基核磁共振作对比，大约5mg样品的NMR能谱证明：每100个所限定的多糖的重复单位“装载”大约31个丁二胺残基。

b.Pn14-Ps的溴乙酰化丁二胺衍生物的制备（Pn14-BuA2-BrAc）

210mg的Pn14-BuA2加36ml  0.1M硼酸-磷酸盐缓冲液（pH9.0），搅拌2.5小时，生成溶液。然后加入195mg溴乙酸硝基苯酯溶解于4ml乙腈的溶液。生成的混合物在4℃下搅拌21小时，在Spectrapor的2个渗析管中对以下所述进行渗析：（1）15升蒸馏水（6小时）;（2）15升蒸馏水（14.5小时）;（3）15升水（6小时）。从渗析袋的渗析物中取出2.0ml进行测定，然后加入492mg干的磷酸缓冲盐（ph8.0）（由0.1M磷酸钠经冰冻干燥制取，pH8.0溶液）。溶液经2个0.2μm  Corning滤斗过滤，生成Pn14-BuA2-BrAc的水溶液（pH8.0，43ml）。

c.OMPC与Pn14-BuA2-BrAc-Ps的结合

将50ml的OMPC（浓度3.2mg/ml）装到5个10ml的离心管中，在4℃下于Beckman 80Ti离心机（4300rpm，43K）离心2小时。通过将350mg EDTA（乙烯二胺四乙酸二钠盐）和64mg/二硫苏糖醇（DTT）溶解于30ml的Na₂B₄O₇缓冲液（pH11.0）制备）硫醇化混合物。然后加入346mg N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯，该溶液经0.2μm Corning漏斗（杯形）过滤。

由上述离心得到的碎片各用3ml经过滤过的硫醇混合物（总量15ml）沉淀后，转移到Dounce均匀器中再悬浮，管子用5ml硫醇化溶液连续转移进行漂洗，再用5ml硫醇化溶液重复漂洗过程，将漂洗液合并后在Dounce均匀器中均匀化，然后将全部悬浮材料（25ml）转移到100ml圆底烧瓶中。

在采用Firestone阀进行隔膜密封和氮气取代空气后，反应混合物熟化21小时，然后将25ml反应混合物分装3个离心管，每个都用1M KH₂PO₄（水）拔顶，在43K rpm和4℃下离心2小时。除去上清液，将碎片悬浮在0.1M磷酸钠缓冲液（pH8.0）中（最终悬浮液的总容积为30ml）。

然后进行另一个超速离心（2小时，4℃，43K  rpm）。除去上清液后，按Dounce方法将碎片悬浮在如上所制备的经过过滤的Pn14-BuA2-ArAc溶液中，经Ellman方法测定，硫醇的总量约为23微摩尔。

需要注意：Pn14-BuA2-BrAc溶液的过滤是在悬浮硫醇蛋白之前。生成的反应（即Pn14-BuA2-BrAc与硫醇OMPC反应）在氮气箱中的氮气（排气）和室温下熟化114小时。

反应按如下所述方法戴帽（即使Pn14-Ps和OMPC的反应部分失活）：加入含75mg  N-马来酰亚胺（NEM）的磷酸钠缓冲液（5ml，pH8.0，0.1M）的溶液，混合物再熟化22.5小时。

将戴帽的反应混合物（35ml）分装在4个离心管中进行离心（43K，小时，4℃），碎片悬浮在40ml  TED缓冲液（0.1M  Tris，0.01M  EDTA，0.5%DOC，pH8.5），于室温下熟化19小时。然后将溶液离心（43K，2小时，4℃。碎片悬浮在40ml  0.1M4磷酸钠缓冲液（pH8）中，然后再离心（43K，2小时，4℃）。将这些碎片再悬浮在44ml水中，于4℃下熟化17小时。倒去少量碎片后进行低速离心（1000rpm，3.5小时）。除去上清液，生成43ml的大量结合物，其分析特征如下：

测定  结果

a.Ps含量  387mcg/ml

b.蛋白  1300mcg/ml

Ps/蛋白比（理论值）  0.30

c.游离Ps  ＜5面积%

d.氨基酸分析：

SCMHC/赖氨酸  9.8%

SCMC/赖氨酸  3.5%

实施例8：Pn23F-Ps中间体的制备

（1）超声水解：在室温下将3.0g  Pn23F-Ps粉末搅拌溶解于1200ml盐水（0.9%  NaCl）中约4小时。在塑料杯和冰浴中，用Branson超声发生器（1/2英寸探头，8个装置）超声处理溶液，每隔3分钟处理1次，总的处理时间为15分钟），每个间隔后检查粘度。15分钟后，再超声处理5分钟，得到的粘度终点为1，206厘沲。将水解过的样品升至室温，加入乙酸钠试剂（58.4g），使最终浓度达3%（W/V）。

（2）血清学测定：用每份10ml样品进行异丙醇（IPA）分离的小型研究和对抗体终点的散射浊度测定，结果证明：Pn23F-Ps在35-45%IPA沉淀。

（3）第一次加入IPA：加入810ml  IPA（室温下搅拌滴加），使水解样品（溶积1165ml，取自上述步骤1）增至41.0%IPA。将样品搅拌15-30分钟，然后在11000xg离心30分钟（Beckman  JA-10离心机，8000rpm，20℃）。废碎片在250ml  Omnimix  jar中用无水EtOH研制，然后在60ml烧结玻璃漏斗上收集。先后用无水EtOH和丙酮直接在漏斗上洗涤沉淀物，在室温下用CaCl真空干燥，准备用于分析。

（4）第二次加入IPA和回收产物：室温下搅拌滴加85.0ml  IPA，使41.0%  IPA上清液（容积1925ml，取自上述步骤3）增至43.5%  IPA。按上述步骤3，进行样品熟化和离心。按上述步骤3，研制、收集、洗涤和干燥碎片。Pn23F-Ps产物的重量为1.795mg。

（6）渗析和冰冻干燥：在室温下将由步骤4得到的1779mg一份的Pn-Ps样品溶解于712ml蒸馏水中3-4小时。将溶液（2.5mg/ml）转移到渗析管中（1200MW断流45mm），于4℃下用蒸馏水渗析27小时，再用蒸馏水更换2次。然后将经过渗析的样品冰冻干燥并中，在干冰-甲醇浴中密闭冰冻，并用Virtis（Freezemobil）冰冻干燥器冰冻干燥2-3天。回收1703mg最终产物Ps，Kd为0.60。

实施例9：外膜蛋白复合物与Pn23F-Ps中间体的结合

a.Dowex  50X2（200-400目）四丁铵型树脂（Dowex  50（Bu4N+））的制备

Dowex  50X2（200-400目）H+型（72g）在水中制成浆料（这些过程所用的水全部是无热原的无菌蒸馏水）后，装到柱上，并按下述步骤洗涤：（1）800ml水;（2）400ml  6N  HCl;（3）300ml水，洗至流出物在pH试纸上呈中性;（4）250g的10%氢氧化四丁铵水溶液，洗至流出物在pH试纸上呈强检性;（5）750ml水。

b.Pn23F-Ps四丁铵型（Pn23F（BU₄N⁺））的制备

用70ml水洗涤34ml的Dowex 50X2（BU₄N⁺）柱。450mg经筛过的Pn23F-Ps+50ml水，搅拌0.5小时。将该溶液施用于柱上，由于重力作用进行渗析（约2小时），柱底呈真空，在真空下再继续洗脱1小时。用25ml水洗柱，将流出液合并后冰冻干燥，得到0.5g Pn23F（Bu₄N⁺）盐。在真空干燥器中用P₂O₅贮藏约17小时。

c.Pn23F-Ps的1，4-丁二胺衍生物（Pn23F-BuA）的制备

取自上述步骤b的0.5g Pn23F（Bu₄N⁺）加25ml二甲亚砜（DMSO），搅拌15分钟后溶解。加入22mg羰二亚酰胺吡咯（CDI），生成的溶液在室温下搅拌0.5小时。

制备含507mg  1，4-丁二胺二盐酸盐（BuA·2HCl）的水（32ml）溶液，用2.5N  NaOH将其pH调至10.23。该溶液经Millex  0.2μm  GV漏斗过滤，在冰浴中冷却。

将熟化的DMSO溶液加到冷BuA溶液中，再在冰浴中搅拌1小时，在室温下熟化1小时。然后将该溶液装到2×12″Spectrapor渗析管中，从液体顶部切下1cm进行下述渗析：（1）15升0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0，16小时）;（2）15升0.01M磷酸钠缓冲液（pH7.0，10.5小时）;（3）15升0.01M磷酸钠缓冲液（pH7.0，12.5小时）;（4）15升水（10.5小时）。然后冰冻干燥，得到220mg  Pn23F-Ps的1，4-丁二胺衍生物（Pn23F-BuA）。

将丁二胺亚甲基与Pn23F的鼠李糖甲基的核磁共振对比，每100个限定的多糖的重复单位“装载”大约23.5丁二胺残基。

d.Pn23F-Ps的溴乙酰化丁二胺衍生物的制备（Pn23F-BuA2-BrAc）

214mg的Pn23F-BuA2加23ml  0.1M硼酸-磷酸盐缓冲液（pH9.0），搅拌30分钟，生成溶液。然后加入230mg溴乙酸硝基苯酯溶解于6ml乙腈的溶液。生成的混合物在4℃下搅拌23小时，在Spectrapor  2渗析管中对以下所述进行渗析：（1）15升水（8小时）;（2）15升水（12小时）;（3）15升水（6小时）。从渗析袋的渗析物中取出1.5ml进行测定，然后加入490mg干的磷酸缓冲盐（pH8.0）（由0.1M磷酸钠经冰冻干燥制取，pH8.0溶液）。大约需要15分钟溶解，然后溶液经0.2μm  Corning滤斗过滤，生成Pn23F-BuA2-BrAc的水溶液（pH8.0）。

e.OMPC与Pn23F-BuA2-BrAc-Ps的结合

将60ml的OMPC（3.1mg/ml）装到6个10ml的离心管中，在4℃下于Beckman 80Ti离心机（43000rpm，43K）离心2小时。通过将260mg EDTA（乙烯二胺四乙酸二钠盐）和52mg/二硫苏糖醇（DTT）溶解于30ml的Na₂B₄O₇硫代内酯制备）硫醇化混合物。然后加入346mg N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯，该溶液经0.2μm Corning漏斗（杯形）过滤。

由上述离心得到的碎片各用3ml经过滤过的硫醇混合物（总量20ml），转移到Dounce均匀器中再悬浮，管子用6ml硫醇化溶液连续转移进行漂洗，再用4ml硫醇化溶液重复漂洗过程，将漂洗液合并后在Dounce均匀器中均匀化，然后将全部悬浮材料（28ml）转移到100ml圆底烧瓶中。

在采用Firestone阀进行隔膜密封和氮气取代空气后，反应混合物熟化19小时，然后将28ml反应混合物分装3个离心管，每个都用1M KH₂PO₄（水）拔顶，在43K rpm和4℃下用Beckman 80Ti离心机离心2小时。除去上清液，将碎片悬浮在0.1M磷酸钠缓冲液（pH8.0）中（最终悬浮液的总容积为30ml）。

然后进行另一个超速离心（2小时，4℃，43K  rpm）。除去上清液后，按Dounce方法将碎片悬浮在7.I.C.3d部分制备的经过过滤的Pn23F-BuA2-ArAc溶液中，经Ellman方法测定，在生成的溶液中，硫醇的总量约为28微摩尔。

需要注意：Pn23F-BuA2-BrAc溶液的过滤是在悬浮硫醇蛋白之前。生成的反应（即Pn23F-BuA2-BrAc与硫醇OMPC反应）在氮气箱中的氮气（排气）和室温下熟化117小时。

反应按如下所述方法戴帽（即使Pn23F-Ps和OMPC的反应部分失活）：将含75mg  N-马来酰亚胺（NEM）的磷酸钠缓冲液（5ml，pH8.0，0.1M）的溶液，（经0.22μm漏斗过滤）加到反应物中，再熟化18小时。

戴帽的结合混合物（35ml）分装在4个离心管中进行离心（43K，小时，4℃），碎片悬浮在40ml  TED缓冲液（0.1M  Tris，0.01M  EDTA，0.5%DOC，pH8.5），于室温下熟化19小时。然后将溶液离心（43K，2小时，4℃。碎片悬浮在40ml  0.1M4磷酸钠缓冲液（pH8）中，然后再离心（43K，2小时，4℃）。将这些碎片再悬浮在44ml水中，于4℃下熟化17小时。倒去少量碎片后进行低速离心（1000rpm，3.5小时）。除去上清液，生成43ml的大量结合物，其分析特征如下：

测定  结果

a.Ps含量  387mcg/ml

b.蛋白  1300mcg/ml

Ps/蛋白比（理论值）  0.30

c.游离Ps  ＜5面积%

d.氨基酸分析：

SCMHC/赖氨酸  9.8%

SCMC/赖氨酸  3.5%

载帽结合混合物的总体积是38.5ml，加入1.5ml  pH8.0的0.1M磷酸钠缓冲液，使其总体积增至40ml。将35ml该溶液等量地加到4个10ml离心管中，每个都用0.1M的磷酸钠缓冲液（pH8）拔顶，然后离心（43Krpm，2小时，4℃）。除去上清液，各个离心管中的碎片都用8ml  TED缓冲液（1M  Tris，pH8.5，0.01M  EDTA，0.5%脱氧胆酸钠）沉积，并且转移到Dounce均匀器中。离心管再8ml  TED缓冲液连续漂洗，再将碎片悬浮（总体积40ml），并在室温下熟化20小时。熟化的材料按如上所述，在4个10ml离心管中离心（43K，2小时，4℃），每管中的碎片用8ml  TED缓冲液沉积，离心管用8ml   TED缓冲液连续漂洗，再按如上所述，进行再悬浮和离心。然后将这些碎片悬浮在总量为40ml的0.1M磷酸钠缓冲液（pH7）中，并按如上所述，再进行离心，将碎片悬浮在总量为44ml水中，在4℃下熟化17小时。通过低速离心（1000rpm，3.5分钟），除去少量不溶物，使产物在上清液中。

生成的上清液是一种药物即堆积结合疫苗。结合物具有下列分析特征：测定  结果

a.Ps含量  284mcg/ml

b.蛋白质  2025mcg/ml

Ps/蛋白比（理论值）  0.14

c.游离Ps  ＜5面积%

d.氨基酸分析

SCMHC/赖氨酸  6.7%

SCMC/赖氨酸  1.6%

实施例10：由Gaulin均匀化方法制备Pn-Ps

在4℃下将肺炎球菌粉末粗制品通过混合过液，溶解于水中，浓度为1.5mg/ml，也可制备10mg/ml浓度较高的Pn-Ps溶液。加入50mM CaCl₂可使粘度为10mg/ml的溶液降低到粘度为1.5mg/ml的溶液。将已经溶解的Pn-Ps通过Gaulin均化器中的一个压力装置（该均化器共有2000，5000，10000和15000Psi四个压力装置）。加入60%异丙醇（由2M原料制成50mM的CaCl₂溶液），收集切变的Pn-Ps。碎片在综合混合器中用100%乙醇洗涤，过滤回收沉淀的Pn-Ps。在漏斗上用丙酮洗涤Pn-Ps，然后用硫酸钙（燥石膏）干燥。整份切变Pn-Ps的大约1mg/ml悬浮，用HPSEC通用标定分析分子大小和多分散度，用速率散射浊度测定分析抗原性指数

Pn-Ps亚型  抗原性开始降低时的分子量  多分散度

6B  500000  1.19

14  300000  1.15

19F  350000  1.09

23F  250000  1.15

实施例11：小鼠T细胞刺激

进行此项测定是为了确定Pn-Ps结合物疫苗在小鼠中的T细胞依赖性和免疫性。由于2岁以下儿童通常对T依赖抗原的应答通常都很好，所以此模型非常适用。无胸腺小鼠具有不正常胸腺表皮，因此其对T依赖抗原的应答显著低于其正常的同类小鼠。

以0.5μg多糖剂量稀释的疫苗腹膜内注射到成年无胸腺小鼠（nu/nu）和同类对照小鼠（nu/+），注射时间在0，7和28天。一周后小鼠出血，用放射性免疫测定法（RIA）测定其血清的抗体应答。

在放射性免疫测定中，将每个小鼠血清与C标记Pn-Ps混合。加入饱和硫酸铵，沉淀出所形成的抗原-抗体复合物。用β计数管计算各已处理过的样品（1分钟）。按这种方法测定本发明的Pn6B-Ps-OMPC，Pn14-Ps-OMPC，Pn19F-Ps-OMPC，Pn23F-Ps-OMPC，Pn18C-Ps和Pn4-Ps结合物，发现在Nu/+小鼠可非常好地诱导T细胞刺激。

实施例12：婴猕猴中Pn-Ps结合物的免疫原性

此项测定是为了确定本体结合物或装满Pn-Ps-OMPC的容器或Pn-Ps-MIEP结合物疫苗在婴猴中的免疫原性。业已证明，婴猴模型对Pedvax  HIB结合物疫苗来说是一个极佳预测者（参阅Vella  et a.，Pediatrics，April  5  Suppl.，pp.668-675，1990），因此，被选作评估Pn-Ps结合物疫苗的模型。

将疫苗剂量肌内注射（0.25ml注射两个部位）2-3目令婴猴，注射时间：0天和28天。在0、28和42天时，婴猴出血。通常放射性免疫测定法（RIA）测定各血清的抗体应答。

在放射性免疫测定中，将各猕猴血清与C标记Pn-Ps混合，加入饱和硫酸铵，沉淀出所形成的抗原-抗体复合物。各处理过的样品用β计数管计数（1分钟）。在获得2个剂量疫苗后，结果至少50%试验动物具有至少1μg抗体应答，则对疫苗的免疫应答是令人满意的。

业已证明，Pn6B-Ps-OMPC，Pn23F-Ps-OMPC，Pn19F-Ps-OMPC，Pn18C-Ps-OMPC，Pn4-Ps-OMPC和Pn14-Ps-OMPC能够诱导强烈的抗类型特异性抗体应答。此外，包括Pn6B-Ps-OMPC，Pn23F-Ps-OMPC，Pn19F-PS-OMPC和Pn14-Ps-OMPC的四价组合物对4个血清型都具有良好的抗-Pn-Ps-抗体应答。

实施例13：肺炎球菌结合物在绒鼠体内的保护效果

将吸附在Al（OH）上的0，0.25，1.0，或4.0μg的Pn6B-Ps-OMPC通过皮下或肌内注射到各绒鼠内。在0，2，4，6和8周时，绒鼠出血。注射后8周，用肺炎链球菌6B攻击绒鼠，每隔1-3天用耳镜和鼓膜测定法检测。吸出中耳渗出液进行培养，攻击2周后杀死动物，将杀死的动物分析其中耳组织病理学。未施用结合物的动物，其死亡率达60%，施用最低剂时的动物，死亡率为0%。对化脓性中耳类的动物，未施用结合物的动物，其死亡率达60%，施用量低剂量的动物，死亡率为0%。对化脓性中耳炎的动物，未施用结合物没有保护作用，而施用结合物的，则所有剂量都获得60-100%的保护。

实施例14：2-5岁儿童的抗肺炎球菌的免疫应答

采用RIA和ELISA方法，对2-5岁儿童施用0.5或5μg  Pn6B-Ps后，测定其所产生的抗Pn6B-Ps抗体。结果证明，抗Pn6B-Ps抗体显著增加。

实施例15：肺炎球菌多糖的速率散射浊度测定

此项测定的目的在于采用速率散射浊度测定方法测定多糖含量和游离Pn-Ps和结合物制剂的抗原性指数。

由于每单位Pn-Ps质量的应答不同，不同Pn-Ps的速率散射浊度测定的标准曲线的范围也各有差异，而且对Pn-Ps抗原浓度构型的线性部分在不同的Pn-Ps中也各有不同。本文所给出的实施例特指Pn6B结合物，并未一定用于其他Pn-Ps类型的结合物。此外，吸附铝的样品及其各自的标准曲线都用3%柠檬酸钠而不是用0.9%  NaCl（详述于后）。结合物水制剂样品和标准曲线（即非吸附在铝上）则0.9%  NaCl稀释，并且稀释到标准曲线的限定范围内所期望的标准浓度。

（A）试剂：

盐溶液：0.9%  NaCl水溶液

抗Pn-Ps血清：抗血清（Health  Research，Inc.，Albang，NY）经盐溶液稀释30倍。

标准：由387μg/ml贮血溶液制备1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和4.0mcg/ml  Pn-Ps结合物标准样品，采用多糖的苯酚硫酸测定法测定其浓度。

试样：将柠檬酸钠制备制备成最终浓度为3%柠檬酸钠，并将试样稀释到1.0，2.0和3.0mcg  Pn-Ps/ml的理论浓度。

（B）方法：

使用Beckman  ICS速度散射浊度测定仪测定全部样品和标准，每份样品测定两份。由标准曲线测定样品浓度。计算方法是样品浓度稀释倍数，然后平均各试样的值。

应该注意的是：采用此方法得到的样品，结合的抗原性指数低于70%均被剔除，以保证所用Pn-Ps具有所需要的免疫特征。

实施例16：克隆编码MIEP的基因组DNA

将大约0.1g苯酚失活的脑膜炎双球菌细胞（见实施例1）置于干净试管中，然后将该细胞悬浮在567μl  TE缓冲液（10mM  TRIS-HCl，1mM  EDTA，pH8.0）中，将30μl  10%  SDS和3μl  20mg/ml蛋白酶K（Sigma）加到该悬浮细胞中。细胞混合后，在37℃下温育约1小时。然后加入100μl  5M  Na·Cl，充分混合。再加入80μl  1%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的0.7M  NaCl溶液，充分混合后在65℃下温育10分钟。加入等体积（约0.7至0.8ml）的氯仿/异戊醇（24∶1），充分混合后在约10000xg离心5分钟左右。将上部的水相转移到新的试管中，倒去有机相。将等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）加到水相中，充分混合，在10000xg离心约5分钟，将上层的水相转移到新的试管，加入0.6体积（约420μl）异丙醇，充分混合，沉淀出的DNA在1000xg离心10分钟，倒去上清液，碎片用70%乙醇洗涤。将DNA碎片干燥后悬浮在100μl  TE缓冲液中，得到脑膜炎双球菌基团组DNA。

合成2个DAN寡核苷酸，相当于MIPE基因的5′端和MIEP基因的3′端（Murakami，E.C.et  al.，1989，Infection  and  Immunity，57，pp.2318-23）。对MIPE基因的5′端和3′端具有特异性的DNA寡核苷酸的顺序分别是：5′-ACTAGTGCAATGAAAAAATCCCTG-3′和5′-GAATTCAGATTAGGAATTTGTT-3′。用10ng脑膜炎双球菌基因组DNA，使这些DNA寡核苷酸用作聚合酶链反应（PCR）扩增MIEP基因的引物。PCR扩增步骤可按制备商（Perkin  Elmer）提供的方法进行。经过扩增的MIEP  DNA用核酶内切限制酶SpeⅠ和EcoRⅠ消化，用1.5%琼脂凝胶电沪法分离和到含有完整的MIEP编码区的1.3仟硷基对（Kb）DNA片段，经电洗脱后从凝胶上回收该DNA片段（参阅Current  Protocols  in  Molecular  Biology，1989，Ausubel，R.M.，Brent，R.，Kingstion，R.E.，Moore，D.D.，Smith，J.A.，Seidman，J.G.and  Struhl，K.，eds.，Greene  Publishing  Assoc.）。

用SpeⅠ和EcoRⅠ消化质粒载体pUC-19。将经凝胶纯化的SpeI-EcoRI  MIEP  DNA连接到SpeI-EcoRI  pUC-19载体，并胜于转大肠杆菌DH5。含有1.3Kbp  MIEP  DNA的pUC-19载体的转化株经核酸内切限制酶图谱鉴定。MIEP  DNA编码顺序具有同一性。

实施例17：pCl/l：Gallop（B）ADHlt载体的构建

通过凝胶纯化经Sau3A和HindⅢ裂解后得到的0.5Kbp片段的方法，由质粒YEp52分离出Gal  10启动子（参阅：Broach，et  al.，1983，in  Experimental  Manipulation  of  Gene  Expression，Inouye，M（Ed）Academic  Press  pp.83-117）。通过凝胶纯化由HindⅢ和SpeⅠ裂解得到的0.35Kbp片段，由载体pGAP·tADH2分离出AMH1终止区（参阅：Kniskern，et  al.，1986，Gene，46，pp.135-141）。用T4  DNA连接酶将上述2个片段连接为凝胶纯化的pUC18△HingⅢ载体（通过用HindⅢ消化pUC18，用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的克诺夫片段使其成为钝端和用T4  DNA连接酶连接，除去了HindⅢ位点），该载体已用BamHⅠ和SphⅠ消化，制成亲代载体pG110-tADHI。在Gallop·ADHlt的连接处具有单-HindⅢ克隆位点。

通过用HindⅢ消化pGA110·tADHl，凝胶纯化切割DNA和用T4  DNA连接酶连接到下列HindⅢ-BamHⅠ联结子5′-AGCTCGGATCCG-3′，3′-GCCTAGGCTCGA-5′，将pGA110·tADH1的HindⅢ克隆位点改变为单一BamHⅠ克隆位点。

形成的质粒pGa110（B）tADH1已经缺失HindⅢ位点，形成了单一BamHⅠ克隆位点。

通过用SmaⅠ和SphⅠ消化，用T4 DNA聚合酶形成钝端和凝胶纯化，由pGa110（B）tADH1分离出Ga110p·tAHD1片段。用SphⅠ消化酶母往复性载体pC1/1聚合酶使之成为钝端和纯化（参阅Brake et al.，1984，Proc.Nat′l，Acad.Sci.USA，81，pp.4642-4646）。用T4 DNA连接酶将该片段与载体连接。连接反应混合物用于将大肠杆菌HB101细胞转化为氨苄西林抗性，通过与³²P-标记的HindⅢ-BamHⅠ联结子的单链杂交筛选转化株。新载体的构建体pC1/1·Ga110p（B）ADHlt经HindⅢ和BamHⅠ消化予以确证。

实施例18：用MIEP+前导DNA顺序构建酶母MIEP表达载体

通过用SpeⅠ和EcoRⅠ消化pUC19·MIEP＃7，凝胶纯化MIEP  DNA和用T4  DNA连接酶使之成为钝端，得到含有MIEP完整编码区的DNA片段。

用BamHⅠ（经牛肠硷性磷酸酶脱磷酸化处理）消化酵母内源表达载体pC1/1·Ga110p（B）ADHlt，并用T4  DNA聚合酶使之成为钝端，DNA经凝胶纯化后去除未切割的载体。

将MIEP的1.1Kbp钝端片段与钝端pC1/1·Ga110p（B）ADHlt载体连接，并将连接反应混合物用于转化对氨苄西林抗性感受的大肠杆菌DH5细胞。通过与³²P标记的DNA寡核苷酸5′…AAGCTCGGATCCTAGTTGCAATG…3′杂交，筛选转化株。所述寡核苷酸的顺序与重叠MIEP-载体连接片的顺序具有同源性。由正杂交转化株得到DNA制剂，并用KpnⅠ和SalⅠ消化，证实MIEP是在由Ga110启动子表达的正确方向上。通过由Ga110启动子至MIEP编码区的二脱氧顺序，可进一步证实DNA构建。

由转化株表达的MIEP可通过Western印迹分析进行检查。在转化株中产生的重组MIEP在聚丙酰胺凝胶上与由MOPC泡纯化的MIEP同时移动，并且与对MIEP有特异性的抗体进行免疫反应。

实施例19：用5′修饰的MIEP  DNA顺序构建酵母MIEP表达载体

采用聚合酶链反应（PCR）技术，制备含HindⅢ位点、保守的酵母5′未转译前导顺序（NTL）、蛋氨酸启始密码子（ATG）、成熟的MIEP的前89个密码子（在+20位上以Asp开始）和KpnⅠ位点（在+89位上）的DNA寡核苷酸。进行PVR可按制造商所述（Perkin  Elmer  Cetus）。用质粒pUC19  MIEP  42＃7作为模板和DNA寡聚体5′-CTAAGCTTAACAAATGGACGTTACCTTGTACGGTACAATT-3′和5′-ACGGTACCGAAGCCGCCTTTCAAG-3′作为引物。

为了去除MIEP克隆的5′区，用KpnⅠ和HindⅢ消化质粒pUC19  MIEP42＃7和用琼脂凝胶化3.4Kpb载体片段。T280  pb  PCR片段用KpnⅠ和HindⅢ消化，琼脂凝胶纯化和用3.4Kbp载体片段连接。通过DNA寡核苷酸杂交，筛选大肠杆菌HB101（BRL）转化株，通过限制性酶消化，分析由正转化株得到的DNA。为了保证在PCR步骤中不导入突变，将280pb  PCR产生的正转化转的DNA编排顺序。形成的质粒含有由酵母NTL、ATG密码子和在Asp密码子（氨基酸+20）位上开始的MIEP的整个开放读码（ORF）组成的HindⅢ-EcoRⅠ插入物。

酵母MIEP表达载体的构建如下：pGAL10/pC1/1t  pGAP/pC1/1载体（参阅Vlasuk，G.P.，et  al.，1989，J.B.C.，264，pp.12106-12112）用BamHⅠ消化、DNA聚合酶Ⅰ的克列诺夫片段使之成为平端和用牛肠硷性磷酸酶脱磷酸化。这些线性载体用经克列诺夫处理过的并经凝胶纯化过的HindⅢ-EcoRⅠ片段（含有酵母NTL），按以上所述进行连接，MIEP的ATG和ORF形成pGa110/pC1/1-MIEP和pGAP/pC1/1-MIEP。

用质粒pGa110/pC1/1-MIEP转化酿酒酵母株U9（ga110pga14-），分离出重组克隆和检查MIEP的表达。在37℃下，在含有2%葡萄糖（W/V）的合成培养基（leu-）中将克隆体摇动培养到O.D.660约为6.0。然后将半乳糖加到2%（W/V），诱导由Ga100启动子的MIEP的表达。再将该细胞培养45小时，然后用半乳糖诱导到O.D.600约为9.0。离心收集细胞，细胞碎片则用蒸馏水洗涤和冰冻。

重组MIEP的Western印迹分析：

为了测定酵母是否表达了MIEP，进行了Western印迹分析。使用了12%、1mm10-15穴Novex  Laemmli凝胶。在水中用玻璃珠破碎酵母细胞（在破碎过程中可用2%的十二烷基磺酸钠（SDS））。在100000xg离心1分钟，除去细胞碎屑。

如对聚丙酰胺凝胶纯化MIEP所述，上清液与样品移动缓冲液混合。用OMPC作对照样品在35mA移动至溴苯酚兰染料标记物显示凝胶。

使用NOVEX转移装置将蛋白转移到0.45μ孔么径的硝基纤维纸上，转移后用5%牛血清清蛋白的磷缓冲盐水终止基纤维纸，然后加入15ml  1∶1000的兔抗MIEP抗血清稀释液（用标准方法通过与凝胶纯化的MIEP免疫反应制取）。在室温温育过液后，加入15ml  1∶1000的与羊抗兔IgG结合的硷性磷酸酶。温育2小时后，用FEST  RE  TR  SALT（Sigma）和Nephthol-AS-MX磷酸盐（Sigma）使印迹显色。

实施例20：重组MIEP的细菌表达

含有1.3Kbp  MIEP基因插入物的质料pUC19-MIEP用核酸内切限制酶SpeⅠ和EcoRⅠ消化，分离出1.1Kbp片段，用本领域已知常规技术在琼酯凝胶上纯化。含有2个顺反子TAC启动子和1个单一EcoRⅠ位点的质粒pTACSD用EcoRⅠ消化。按制造商的说明，用T4 DNA聚合酶（Boehinger Mannheim）在1.3Kbp MIEP DNA和pTACSA载体上形成钝端。按制造商的说明，用T4 DNA连接酶（Boehringer Mannheim）将钝端的1.3Kbp MIEP DNA连接到钝端的载体。按制造商的说明，将已连接的DNA用于转化大肠杆菌DH5aⅠQMAX（BRL），将转化细胞置于含25μg卡那酶素/ml和50μg青霉素/ml的琼脂板上，在37℃下温育在约15小时。含有MIEP同源顺序折DNA寡核苷酸经³²P标记后，按常规DNA杂交技术，用于筛选含有由转化株板上得到的溶解变性菌落的硝基纤维滤纸。经杂交得到的阳性菌落用核酸内切限制酶绘图，测定MIEP基因的取向。

由转化株表达MIEP用Western印迹分析测定。在转化株中产生的重组MIEP在聚丙酰胺凝胶上与由OMPC泡纯化的MIEP一起移动，并且与对MIEP有特异性的抗体进行免疫反应。

实施例21：Pn-Ps与脑膜炎双球菌MIEP的结合

按美国专利4882317介绍的方法进行化学结合。

将10mg  MIEP溶于3ml  0.1M硼酸缓冲液（pH11.5），再与10mg乙烯二亚胺四乙酸二钠盐（EDTA，Sigma  Chemicals）和4mg二硫苏糖醇（Sigma  Chemicals）混合。蛋白溶液用氮充分冲液，将N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯（Aldrich  Chemicals）加以MIEP溶液中，混合物在室温下温育16小时，然后在室温和氮气下对含有4mM  EDTA的2升0.1M硼酸缓冲液（pH9.5）透析2次，24小时。采用Ellman试剂（Sigma  Chemicals）测定硫醇化蛋白中硫醇含量，并用Bradford试剂（Pierce  Chemicals）测定蛋白浓度。为了使MIEP与Pn-Ps结合，将1.5倍过量（Wt/Wt）硼乙酰化Pn-Ps加到MIEP溶液中，并用1N  NaOH将pH调至9-9.5。混合物在室温和氮气下温育6-8小时。反应结束时，将25μl  N-乙酰胱胺（ChemicalDynamics）加到该混合物中，在室温和氮气下静置18小时。用1N  HCl将结合物溶液酸化至pH3-4，在10000xg离心10分钟。将1ml上清液直接涂在FPLCSuprose  6B（1.6×50cm，Pharmacia）柱上，用PBS洗脱结合物。含有多糖-蛋白结合物（Pn-Ps-MIEP）的空体积峰值合并。结合物溶液经0.22μm滤斗无菌过滤。

实施例22：Pn-Ps-MIEP结合物免疫原性的测定

免疫作用：用2.5μg  Pn-Ps的0.5ml预制的明矾溶液使IP含有与MIEP共价结合的Pn-Ps，然后将该结合物使雄小鼠（Charles  River，Wilmington，MA）具有免疫力。对照小鼠用等量Pn-Ps以Pn-Ps-CRM、（Anderson，M.E.et  al.，1985，J.Pediatrics，107，pp.346-351）（2.5μg  Pn-Ps/6.25μg  CRM;人用剂量的1/4）：Pn-Ps-DT（2.5μg  Pn-Ps/1.8μg  DT;人用剂量1/10，使用恒定量Pn-Ps）和Pn-Ps-OMPC（2.5μg  Pn-Ps/35μg  OMPC;人用剂量的1/4），使其具有免疫力。

用吸附在明矾上的Pn-Ps-MIEP结合物使6-13.5周的婴猕猴免疫。每个猕猴在2个不同的注射部位施用0.25ml结合物，总剂量为0.5ml。在0，28和56天使猕猴免疫，每隔2-4周采集一次血样。采用ELISA方法测定抗体应答，其不同于免疫球蛋白的应答。表示抗Pn-Ps抗体总量的RIA也可用于评估猕猴的应答。

Pn-Ps-MIEP结合物能在小鼠体内产生由IgG抗Pn-Ps抗体和记忆应答组成的免疫应答。这与不能诱导可测量的抗Pn-Ps抗体的Pn-Ps-CRM和Pn-Ps-DT恰恰相反。因此，MIEP起着Pn-Ps免疫载体蛋白的作用，当其与Pn-Ps抗原共价结合时就能产生抗Pn-Ps抗体应答。于是，在制备细菌多糖结合物疫苗中，纯化的MIEP是一种能取代异源OMPC的有效的免疫载体蛋白。

实施例23：定量测定Pn-Ps制剂中C多糖的含量

以NMR、酶或色谱方法为基础，定量表示C多糖的系统已经有了发展。在这个实施例中，使用了将胆硷（C-Ps的组分）与水解Pn-Ps样品的色谱分离，并可将这些方法与其他方法进行对比。胆硷在与压缩导电检测相结合的阳离子交换柱上进行分离。

在45-65℃下，用36%氢氧酸处理Pn-Ps样品2小时，然后在100℃下，用2M三氟乙酸处理16小时，即可使Pn-Ps样品完全水解。水解后，将200-300μg样品注射到Dionex  Bil  LC色谱系统中，该系统具有Omnipac  PCX-500分析防护柱、离子Pac  CTC-1阳离子分离柱、CMMS-2微膜压缩器（用50mM四丁基氢氧化铵（10ml/分钟）产生）和1μ西门子灵敏度的导电检测器。用5%  200mM  HCl，5%20%乙腈，85%  MilliQ水，5%20mM二氨基丙酸同溶剂洗脱样品。洗脱后胆硷的顶峰约在10分钟后。

使用该方法分析纯化的C-Ps（由回家血清研究所提供）中的胆硷含量，结果得到5.4%胆硷（重量），这个值与公开报导的C-Ps的胆硷含量相一致。

通过将nm量的胆硷（由HPLC得到）转化为质量值，即可将上述方法用于计算各种Pn-Ps样品中的C-Ps浓度。将5.4%胆硷（重量）进行换算，就能计算C-Ps质量（重量）。剔除C-Ps浓度超过3%的样品，因为这对结合来说是不可接受的。下表给出此方法与NMR和酶方法的关系以及各种纯度的Pn-Ps制剂中典型的C-Ps的C-Ps杂质量：

样品  NMR  酶方法  HPLC

Pn6B-Ps  10%  未测  18.4%

Pn6B-Ps  1.6%  0.3-1.0%  1.2%

Pn23F-Ps  未测  2.8%  3.7%

Pn14-Ps  2.9%  2.4%  3.2%

Pn19F-Ps  2.7%  2.6%  2.6%

实施例24：部分水解、纯化的Pn18C-Ps的制备

（1）超声水解：在室温下将3.0g  Pn18C-Ps粉末搅拌溶解于1200ml盐水（0.9%NaCl）中约3-4小时。在4℃下涂复和贮藏过液。在塑料杯和冰浴中，用Branson超声发生器（1/2英寸探头，8个装置）超声处理溶液，间隔20分钟至40分钟（5分钟处理时间），每个间隔后检查粘度。40分钟后，再超声处理10分钟，得到的粘度终点为1，218厘沲。将水解过的样品（体积1188ml）升至室温，加入乙酸钠试剂（59.2g），使最终浓度达3%（W/V）。

（2）血清学测定：用每份10ml样品进行异丙醇（IPA）分离测定和对抗体终点的散射浊度测定，结果证明：Pn18C-Ps在40-50%IPA沉淀。

（3）第一次加入IPA：加入894ml  IPA（室温下搅拌滴加），使水解样品（溶积1200ml，取自上述步骤1）增至42.7%IPA。将样品搅拌15-30分钟，然后在11000xg离心30分钟（Beckman  JA-10离心机，8000rpm，20℃）。废碎片在250ml  Omnimix  jar中用无水EtOH研制，然后在60ml烧结玻璃漏斗上收集。先后用无水EtOH和丙酮直接在漏斗上洗涤沉淀物，在室温下用CaSO（干燥石）真空干燥，准备用于分析。

（4）第二次加入IPA和回收中间产物：室温下搅拌滴加92.0ml  IPA，使42.7%IPA上清液（容积2016ml，取自上述步骤3）增至45.2%  IPA。按上述步骤3，进行样品熟化和离心。按上述步骤3，研制、收集、洗涤和干燥碎片。Pn18C-Ps中间产物的重量为1.609mg。

（5）渗析和冰冻干燥：在室温下将由步骤4得到的1612.5mg一份的Pn-Ps样品溶解于645ml蒸馏水中2小时。将溶液（2.5mg/ml）转移到渗析管中（1200MW断流45mm），于4℃下用蒸馏水渗析30小时，再用蒸馏水更换2次。然后将样品转移到冰冻干燥并中，在干冰-甲醇浴中密闭冰冻，并用Virtis（Freezemobil）冰冻干燥器冰冻干燥2-3天。回收1703mg最终产物Ps，1487mg。

实施例25：肺炎链球菌18C-OMPC结合物Pn18C-Ps-OMPC中间体的结合

a.Dowex  50X2（200-400目）四丁铵型树脂（Dowex  50（Bu4N+））的制备

Dowex  50X2（200-400目）H+型（500g）在水中制成浆料后，装到柱上，并按下述步骤洗涤：（1）600ml水;（2）1000ml  6N  HCl;（3）400ml水，洗至流出物在pH试纸上呈中性;（4）72g的10%四丁基氢氧化铵水溶液，洗至流出物在pH试纸上呈强检性;（5）1000ml水至呈中性。

b.肺炎链球菌18C型多糖四丁铵型（Pn18C（BU  N））的制备

用250ml水洗涤60ml的Dowex  50X2（BU  N）柱。Pn18C多糖（分子量降低到650mg）与65ml水，搅拌1小时成为溶液。将该溶液施用于柱上，由于重力作用进行渗析（约2小时，然后在真空下1小时）。用150ml水洗柱，将流出液合并后冰冻干燥，得到655mg18C（Bu  N）盐。NMR分析除去25mg，剩下为所需物质。

c.19C（18C-BuA2）的1，4-丁二胺衍生物的制备

18C（Bu  N）630mg加143ml二甲亚砜（DMSO），搅拌3.25小时后固体溶解。取出1ml用于含水量的Karl  Fischer滴定，得到28.2mmoles水（总量4mmoles）加入165.1mg羰二亚酰胺吡咯（CDI），生成的溶液在室温下搅拌2.0小时。

制备含1.260g  1，4-丁二胺二盐酸盐（BuA·2HCl）的水（40ml）溶液，用2.5N  NaOH将其pH调至10.20。该溶液在冰浴中冷却。

将熟化的DMSO溶液缓慢加到冷BuA溶液中，再在冰浴中搅拌10小时，在室温下搅拌50分钟。然后将该溶液装到Spectrapor  2渗析管中，从液体顶部切下1/2″进行下述渗析：（1）15升0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0，13.0小时）;（2）15升0.01M磷酸钠缓冲液（pH7.0，11小时）;（3）15升0.01M磷酸钠缓冲液（pH7.0，10.8小时）;（4）15升水（9.5小时）。此时体积为190ml，取出7.5ml整份冰冻干燥用于NMR测定，残余182.5ml冰冻干燥至416g  18C（Pn18C-BuA2）的1，4-丁二胺衍生物。

将丁二胺亚甲基与18C的鼠李糖甲基的核磁共振对比，大约5mg  NMR能谱证明，每100个限定的多糖的重复单体单位“装载”大约10个丁二胺残基。

d.18C的溴乙酰化丁二胺衍生物的制备（Pn18C-BuA2-BrAc）

18C-BuA2（416mg）u加36ml  0.1M硼酸-磷酸盐缓冲液（pH9.4），搅拌30分钟，生成溶液。然后加入256mg溴乙酸硝基苯酯溶解于6ml乙腈的溶液。生成的混合物在4℃下搅拌20小时，在Spectrapor  2渗析管中对以下所述进行渗析：（1）15升水（6小时）;（2）15升水（16小时）;（3）15升水（6小时）。此时体积达60ml，从中取出1.7ml用于测定（NMR，Ouchterlony  and  Viscotek），然后加入2.42g干的磷酸缓冲盐（pH8.0）（由0.1M磷酸钠经冰冻干燥制取，pH8.0溶液）。溶解后，用0.2μm  CORNing漏斗过滤后，使18C-BuA2-BrAc水溶液的pH为8。过滤缓慢进行，并要求4个杯形漏斗。

e.OMPC（脑厝炎双球菌）与Pn18C-BuA2-BrAc的结合

将80ml的OMPC（脑膜炎双球菌）（浓度3.1mg/ml）装到4个25ml的离心管中，在4℃下于Beckman  60Ti离心机（43000rpm，43K）离心2小时。通过将680mg  EDTA（乙烯二胺四乙酸二钠盐）和120mg/二硫苏糖醇（DTT）溶解于40ml的Na  B  O缓冲液（pH11.09）制备）硫醇化混合物。然后加入326mg  N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯，该溶液经0.2μm  Corning漏斗（杯形）过滤。

由上述离心得到的碎片各用5ml经过滤过的硫醇混合物（总量20ml），转移到Dounce均匀器中再悬浮，管子用2/10ml硫醇化溶液连续转移进行漂洗，将漂洗液合并后在Dounce均匀器中均匀化，然后将全部悬浮材料（40ml）转移到100ml圆底烧瓶中。玻璃容器再用20ml硫醇化溶液漂洗后，加到反应瓶中。

在采用Fisestone阀将带隔膜的并密封和氮气取代空气后，反应混合物熟化18.5小时，然后将60ml反应混合物分装4个离心管，每个都用1M KH₂PO₄（水）拔顶，在43K rpm和4℃下离心2小时。除去上清液，将碎片悬浮在0.1M磷酸钠缓冲液（pH8.0）中（最终悬浮液的总容积为40ml）。将该溶液转移到2个25ml离心管（聚碳酸酯）中，玻璃容器（DOUNCE等）用大约10ml磷酸盐缓冲液（pH8）漂洗，并用于离心管。

然后进行另一个超速离心（2小时，4℃，43K）。将碎片悬浮在30ml的0.1M磷酸盐缓冲液（pH8）中，经Ellman方法测定，SH的总量约为24微摩尔或约100nmoles/mg  OMPC。将硫醇蛋白转移到100ml圆底烧瓶，并加经过滤过的Pn18C-BuA2-BrAc溶。生成的反应（即Pn18C-BuA2-BrAc与硫醇OMPC反应）在氮气箱中的氮气（排气）和室温下熟化89小时。

反应按如下所述方法戴帽：用0.22μm漏斗过滤含75mg  N-马来酰亚胺（NEM）的磷酸钠缓冲液（5ml，pH8.0，0.1M）的溶液，将2ml加到上述反应混合物中，熟化4小时。然后用0.22μm漏斗过滤0.5ml的N-乙酰胱胺的2.5ml盐酸盐缓冲液（0.1M，pH8），并将1.0ml该溶液加到反应中，熟化22.5小时。

将戴帽产生等量分装到4个25ml离心管中，用总量为8ml的0.1M磷酸盐缓冲液（pH8.0）拔顶，于4℃下，在43K离心2小时。除去上清液后，将碎片悬浮在总量为40ml  TED缓冲液的DOUNCE均化器中。玻璃容器瑞用10ml  TED缓冲液漂洗，将溶液转移到2个25ml离心管中后，在室温下贮放15.25小时，然后在24℃下，于43Krpm离心2小时。将形成的碎片悬浮在总量为30ml  TED缓冲液的DOUNCE均化器中，然后转移到2个25ml离心管中，玻璃容器再用20ml  TED缓冲液漂洗。在4℃下，于43K离心2小时。将碎片悬浮在50ml磷酸盐缓冲液（pH7），再在4℃下，在43K第三次离心2小时。将碎片悬浮在82ml水中，以20.5ml等份转移到2个50ml无菌塑料（FALCON）离心管中，在4℃下熟化18小时。结合物制剂在1000rpm离心3.5分钟（TJ-6离心机，TH转子）。测定最终结合产物悬浮液中的蛋白（Lowry），18C多糖（苯酚/硫酸），未结合的多糖（筛析色谱法-速率散射浊度测定法）和氨基酸（SPINCO）：

多糖＝339μg/ml;

蛋白＝2.75mg/ml;

游离多糖：＜5%（经验误差的限制）：

S-羧甲基高半胱氨酸/赖氨酸＝0.025;

S-羧甲基胱胺/赖氨酸＝0.005。

实施例26：Pn4-Ps中间体的制备

（1）超声水解：在室温下将1.0g  Pn4-Ps粉末搅拌溶解于400ml盐水（0.9%  NaCl）中约4小时。在塑料杯和冰浴中，用Branson超声发生器（1/2英寸探头，8个装置）超声处理溶液，每隔10分钟处理1次，至总的处理时间为20分钟），每个间隔后检查粘度。20分钟后，得到的粘度终点为1，267厘沲。将水解过的样品升至室温，加入乙酸钠试剂（18.7g），使最终浓度达3%（W/V）。

（2）血清学测定：用每份10ml样品进行异丙醇（IPA）分离的小型研究和对抗体终点的散射浊度测定，结果证明：Pn4-Ps在45-55%IPA沉淀。

（3）第一次加入IPA：加入379ml  IPA（室温下搅拌滴加），使水解样品（溶积385ml，取自上述步骤1）增至49.7%IPA。将样品搅拌15-30分钟，然后在11000xg离心30分钟（Beckman  JA-10离心机，8000rpm，20℃）。废碎片在250ml  Omnimix  jar中用无水EtOH研制，然后在60ml烧结玻璃漏斗上收集。先后用无水EtOH和丙酮直接在漏斗上洗涤沉淀物，在室温下用CaCl真空干燥，准备用于分析。

（4）第二次加入IPA和回收产物：室温下搅拌滴加38ml  IPA，使49.7%IPA上清液（容积727ml，取自上述步骤3）增至52.2%IPA。按上述步骤3，进行样品熟化和离心。按上述步骤3，研制、收集、洗涤和干燥碎片。Pn4-Ps产物的重量为5116g。

（5）渗析和冰冻干燥：在室温下将由步骤4得到的500mg一份的Pn-Ps样品溶解于200ml蒸馏水中2-3小时。将溶液（2.5mg/ml）转移到渗析管中（1200MW断流45mm），于4℃下用蒸馏水渗析27小时，再用蒸馏水更换2次。然后将经过渗析的样品冰冻干燥并中，在干冰-甲醇浴中密闭冰冻，并用Virtis（Freezemobil）冰冻干燥器冰冻干燥2-3天。回收491mg最终产物的Kd为0.69。

从以上所述，本领域专业人员显然按本发明公开的方法，可制备含Pn-Ps，并且结合Pn4-Ps或Pn9V-Ps，它们也属于酸性多糖。

实施例27：肺炎双球菌4-OMP4型结合物Pn4-Ps-OMPC

a.Dowex  50X2（200-400目）四丁铵型树脂（Dowex  50（Bu4N+））的制备

Dowex  50X2（200-400目）H+型（500g）在水中制成浆料（CM-66），装到柱上，并按下述步骤洗涤：（1）600ml水;（2）1000ml  6N  HCl;（3）400ml水，洗至流出物在pH试纸上呈中性;（4）72g的10%四丁基氢氧化铵水溶液，洗至流出物在pH试纸上呈强检性;（5）1000ml，洗至中性。

b.肺炎双球菌4型多糖四丁铵型（Pn4（BU4N+））的制备

用520ml水洗涤65ml的Dowex  50X2（BU  N）柱。pN4多糖（分子量降低（400mg）和35ml水，搅拌20分钟，此时形成溶液（继续搅拌过液）。将该溶液施用于柱上，由于重力作用进行渗析用150ml水洗柱，将流出液合并后冰冻干燥，得到504g  Pn4（Bu  N）盐。

c.Pn4-Ps的1，4-丁二胺衍生物（Pn4-BuA）的制备

97mg  Pn4（Bu  N）加16ml二甲亚砜（DMSO），在52℃下搅拌15分钟后所有固体全部溶解。并将溶液冷却至室温。

将2mg羰基二亚酰胺吡咯（CDI）溶解于160μl  DMSO中的溶液加到上述溶液保，生成的溶液在室温下搅拌1.0小时。制备含0.500g  1，4-丁二胺二盐酸盐（BuA·2HCl）的水（5ml）溶液，用5.0N  NaOH将其pH调至10.20。该溶液在冰浴中冷却。

将熟化的DMSO溶液缓慢加到冷BuA溶液中，再在冰浴中搅拌5分钟，在冰浴中搅拌5分钟。然后在室浊罡搅拌1小时。溶液装到Spectrapor  2渗析管中，从液体顶部切下1/2″进行下述渗析：（1）4升0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0，15.0小时）;（2）4升0.01M磷酸钠缓冲液（pH7.0，9小时）;（3）4升0.01M磷酸钠缓冲液（pH7.0，21小时）;（4）4升水（20小时）。然后冰冻干燥，至70mg  Pn4（Pn4-BuA2）的1，4-丁二胺衍生物（Pn23F-BuA）。

将丁二胺亚甲基与N-乙酰甲基的核磁共振对比，每100个限定的多糖的重复单体单位“装载”大约22丁二胺残基。

d.Pn4溴乙酰化丁二胺衍生物（Pn4-BuA2-BrAc）的制备

Pn4-BuA2（54g）加5.5ml的1M缓冲液（pH9.04，Kolthoff硼酸-磷酸盐），搅拌形成溶液。加入55mg硼乙酸硝基苯酯的乙腈（1.0ml）溶液，生成的混合物在4℃下搅拌17小时。按如下所述在SPECTRAPOR  2渗析管中进行渗析：（1）16升水，24小时;（2）16升水，8小时;（3）16升水，23小时。此时总体积为12.5ml，从中取出1.0ml用于测量（NMR，Oucht-erlony和Viscothek）。然后加入275mg干的磷酸缓冲盐（pH8，通过将0.1M的pH8的磷酸钠溶液冰冻干燥制取）。溶解后，用0.2μm  CORNING漏斗过滤，使之成为ph8的Pn4-A2-BrAc的溶液。

e.OMPC（肺炎双球菌）与Pn4-BuA2-BrAc的结合

在4℃下，外膜蛋白复合物（肺炎双球菌，OMPC，4.34mg/ml）（5ml）在80Ti离心机（43000rpm，43K）中离心2小时。将85mg的EDTA（乙烯二胺四乙酸二钠盐）和15mg二硫苏糖醇（DTT）溶解于10ml的Na₂B₄O₇缓冲液（pH11.09）中，制取硫醇化混合物。加入50mg N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯，溶液经0.2μm漏斗过滤。由上述离心得到的碎片用5ml经过滤的硫醇化混合物沉积，然后转移到DOUNCE均化器中并悬浮。将悬浮液转移到离心管中，采用FIRESTONE阀将带隔膜的并密封和用氮气取代空气后，瓜混合物熟化19小时，并转移到离心管中，用1M KH₂PO₄（水）拔顶，在4℃下，在54K离心2小时，除去上清液，碎片悬浮在10ml的0.1M磷酸钠缓冲液（pH8）中。将该溶液转移到离心管中，进行第二次超超离心（2小时，4℃，43K）。碎片悬浮在11.5ml的按D部分制备的Pn4-BuA2-BrAc溶液中。根据Ellman测定方法，总量为3.44μmoles S或约158nmoles SH/mg OMPC。在4℃下，生成的反应物（即Pn4-BuA2-BrAc与硫醇化OMPC反应）在氮气箱的氮气（放气）下熟化66小时。

反应按如下所述戴帽：含5mg  N-乙基马来酰亚胺（NEM）的磷酸钠缓冲液（1ml，pH8，0.1M）的溶液经0.22μm漏斗过滤后，加到上述反应混合物中，溶液熟化5小时。将0.1ml的N-乙酰胱胺溶解于0.4ml的1M磷酸盐缓冲液（pH8）中，经0.22μm漏斗过滤后，将该溶液加到反应中，熟化14.5小时。

在4℃下，反应混合物在43K离心2小时，碎片悬浮在8ml  1×TED缓冲液中，该溶液在室温下熟化过液，在4℃下和43K上离心2小时。将碎片再悬浮在8ml  TED缓冲液中，在4℃下和43K上离心2小时。然后将碎片悬浮在10ml的0.1M磷酸盐缓冲溶液（pH7）中，在4℃下和43K上再离心2小时。在4℃下再将这最终碎片悬浮在7.5ml水中。在4℃熟化过液后，悬浮液在1000rpm离心3分钟，移去作为最终结合物的上清液。

测定结果：

Lowry蛋白：0.920mg/ml;

苯酚硫酸：0.122mg/ml;

Ps/Pro＝0.23;

SCMHC/LYS：0.031;

SCMC/lys＝0.022。

给小鼠或非洲绿猴施用上述结合物时，经Pn4-Ps特异性的测定，由其产生的抗-Pn4-Ps抗体的滴定度较高。

实施例28：Pn9V-Ps中间体的制备

（1）超声水解：在室温下将1.0g  Pn9V-Ps粉末搅拌溶解于400ml盐水（0.9%  NaCl）中约4小时。在塑料杯和冰浴中，用Branson超声发生器（1/2英寸探头，8个装置）超声处理溶液，每隔3分钟处理1次，每个间隔后检查粘度。13分钟后，再超声处理1分钟，得到的粘度终点为1117厘沲。将水解过的样品升至室温，加入乙酸钠试剂（19.5g），使最终浓度达3%（W/V）。

（2）血清学测定：用每份10ml样品进行异丙醇（IPA）分离的小型研究和对抗体终点的散射浊度测定，结果证明：Pn9V-Ps在40-45%IPA沉淀。

（3）第一次加入IPA：加入281ml  IPA（室温下搅拌滴加），使水解样品（溶积391ml，取自上述步骤1）增至41.8%  IPA。将样品搅拌15-30分钟，然后在11000xg离心30分钟（Beckman  JA-10离心机，8000rpm，20℃）。废碎片在250ml  Omnimix  jar中用无水EtOH研制，然后在60ml烧结玻璃漏斗上收集。先后用无水EtOH和丙酮直接在漏斗上洗涤沉淀物，在室温下用CaCl真空干燥，准备用于分析。

（4）第二次加入IPA和回收产物：室温下搅拌滴加28.6ml  IPA，使41.8%  IPA上清液（容积637ml，取自上述步骤3）增至44.3%  IPA。按上述步骤3，进行样品熟化和离心。按上述步骤3，研制、收集、洗涤和干燥碎片。Pn9V-Ps产物的重量为342.2mg。

（5）渗析和冰冻干燥：在室温下将由步骤4得到的347mg一份的Pn-Ps样品溶解于139ml蒸馏水中4-5小时。将溶液（2.5mg/ml）转移到渗析管中（1200MW断流45mm），于4℃下用蒸馏水渗析25小时，再用蒸馏水更换2次。然后将经过渗析的样品冰冻干燥并中，在干冰-甲醇浴中密闭冰冻，并用Virtis（Freezemobil）冰冻干燥器冰冻干燥2-3天。回收303.5mg最终产物Ps，Kd为0.60。

（6）第三次加入IPA和回收产物：室温下搅拌滴加30.8ml  IPA，使44.3%  IPA上清液（容积655ml，取自上述步骤4）增至46.8%  IPA。按上述步骤3，进行样品熟化和离心。按上述步骤3，研制、收集、洗涤和干燥碎片。Pn9V-Ps产物的重量为410.8mg。

（7）渗析和冰冻干燥：在室温下将由步骤4得到的420.4mg一份的Pn-Ps样品溶解于168ml蒸馏水中4-5小时。将溶液（2.5mg/ml）转移到渗析管中（1200MW断流45mm），于4℃下用蒸馏水渗析25小时，再用蒸馏水更换2次。然后将经过渗析的样品冰冻干燥并中，在干冰-甲醇浴中密闭冰冻，并用Virtis（Freezemobil）冰冻干燥器冰冻干燥2-3天。回收342.5mg最终产物Ps，Kd为0.65。

（8）本领域的专业人员显然很清楚，步骤4和6的产物由于IPA的加入量较大，所以可以一起收集，然后作为单个产物进行渗析和冰冻干燥，作为单个产物，它具有各个部分特征的加权平均的分析特征。本领域专业人员还可以很明显地知道，Pn1-Ps或Pn5-Ps可以与本文公开的Pn9V-Ps或Pn4-Ps相同的方法处理。

实施例29：Pn9V-Ps与OMPC的结合

按实施例28制备的Pn9V-Ps可与实施例27所述Pn4-Ps相同方法结合。

实施例30：乙酸盐在Pn9V/18C-Ps和丙酮酸在Pn4-Ps中的定量测定

在处理肺炎球菌荚膜多糖过程中，定量地分析0-丙酮酸盐在Pn4-Ps和0-乙酸盐在Pn9V-Ps和Pn18C-Ps的方法在已发展。0-乙酰基或0-丙酮酸盐首先是通过水解释放的，然后用与压缩导电率结合的高效阴离子交换色谱方法鉴别和定量分析Pn-Ps水解产物中的乙酸盐和丙酮酸盐。

采用该方法分析未处理过的和处理过的Pn4、Pn9V和Pn18C的样品。初步结果证明：丙酮酸盐与未处理过的和筛析过的Pn4的每个Ps重复单位的摩尔比分别约为1∶1和0.8∶1。未处理过的或筛选过的乙酸盐与Pn18C-Ps中每个Ps重复单位的摩尔比分别为1.7∶和1.5∶1。还分析了Pn18C-Ps-OMPC结合物含水量样品的0-乙酸盐与每个Ps重复单位的摩尔比约为0.5∶1。

根据文献报导，丙酮酸盐是4型荚膜多糖中重要的免疫决定因素，将其去除会使免疫特异性发生显著变化[Heidelberger，M.，Dudman，W.F.，and  Nimmich，W.，′Immunochemical  relationships  of  certain  capsular  polysaccharides  of  Klebsiella，pneumococci，and  Rhizobia.′J.Immunol.，104：1321-1328，（1970）;Higginbotham，J.D.，Heidelberger，M.，and  Gotschlich，E.，′Degradation  of  a  pneumococcal  type-specific  polysaccharide  with  exposure  of  group-specificity.′Proc.Natl.Acad.Sci.USA，67：138-142，（1970）].如果去除pn18C-Ps型多糖中的0-乙酸盐，则会使其失去免疫特异性[Estrada-Parra，S.，and  Heidelberger，M.，′The  specific  polysaccharide  of  type  ⅩⅧ  pneumococcus.′Biochemistry，2：1288-1294，（1963）].因此必须发展定量分析方法，测定Pn18C-Ps和Pn4中的乙酸盐和丙酮酸盐。由于经速率散射浊率法已经测定脱-0-乙酰化Pn9V没有抗原反应性，所以在Pn9V的免疫结构中，Pn9V中0-乙酰基也可以超重要作用。

我们发现，在4℃和碱性条件下（pH11），0-乙酸盐很容易从Pn9V中释放出来，而0-丙酮酸盐在65℃下加热则很容易从Pn4中释放出来。我们发现，流速1ml/分钟，以0.98mM NaOH和2% MeOH作为流动相，用OmniPac PAX 500柱，则乙酸盐和丙酮酸盐能够从水解的Pn-Ps样品中分离出来。在流速为10ml/分钟，用25mM H₂SO₄作为再生剂，通过压缩导电率的检测则也可以检测。在这个实施例中，介绍了HPLC定量分析Pn18C-Ps中0-乙酸盐和0-丙酮酸盐的最佳水解条件。

仪器设备：

Dionex  Bio  LC配置有OmniPac  PAX-500防护和分析柱（4.6×250mm）。用25mN硫酸作为再生剂，则可进行压缩导电率的检测。Dionex自动装置的流速为10ml/分钟。分离水解Pn-Ps样品中的乙酸盐和丙酮酸盐的移动相和梯度程序。详列于下表：

缓冲液1：1mM氢氧化钠

缓冲液2：100%甲醛

缓冲液3：200mM氢氧化钠

缓冲液4：水

时间  %缓冲液1  %缓冲液2  %缓冲液3  %缓冲液4  流速

0  98  2  0  0  1

12.5  98  2  0  0  1

12.6  58  2  0  40  1.5

20.0  58  2  0  40  1.5

20.1  98  2  0  0  1.5

30.0  98  2  0  0  1.5

30.1  98  2  0  0  1

50.0  98  2  0  0  1

使用上述条和3μ西门子的检测仪的灵敏度在保留时间约为5.2-9.3分钟时洗脱，则4nmoles的乙酸盐和丙酮酸盐很容易被检测。

样品的制备

由Merck制造部提供的纯化的Pn-Ps样品，采用Aquaster  V3000体积湿度滴定仪和Karl-Fisher滴定方法，可测定残余水的含量，然后浓度以每ml  1.0mg干重溶解于Milli-Q水中。样品（100μg/ml）在室温下用2Mn  NaOH处理16小时，从Pn9V-Ps和Pn18C-Ps样品中除去0-乙酸盐。在65℃下和在1mM  HCl中，水解Pn4-Ps样品16小时，可除Pn4去中的0-丙酮酸盐。经过筛析的Pn9V和Pn18C-Ps和Pn18C-Ps-OMPC结合物含水量也可使用高pH阴离子交换色谱法和脉冲电流检测仪进行单糖组份分析。进行单糖组份分析可得到Pn-Ps在经过筛析和液体结合物样品中的准确浓度。

乙酸盐、丙酮酸盐和N-乙酰甘露糖胺以200nmole/ml浓度溶解于Milli-Q水中。

样品的水解和标准

通过处理Pn18C-Ps发现了Pn18C-Ps的脱-0-乙酰化作用发生在4个NaOH浓度（1，2，5和50mM）、不同的温度（4，25，45和65℃）和不同的时间（3，5和16小时）。乙酸盐、丙酮酸盐和N-乙酰甘露糖胺的标准溶液也包括测定的研究，如果脱-0-乙酰化作用所必需的条件还会导致乙酸盐/丙酮酸盐的降解或N-乙酰基的丧失。

关于从Pn4去除丙酮酸盐还研究了以下处理：对不同浓度（1，10，100mM）、时间（3，5和16小时）和温度（65，85和100℃）情况下，或用氢氧化钠（50mM/100℃/16小时）处理，或用盐酸处理。

速率散射浊度测定

在脱-0-乙酰化作用或脱-0-丙酮酸化作用前和后测定Pn9V-Ps，Pn18C-Ps和Pn4-Ps的速率散射浊度的活性。样品稀释至1，1.5，2和2.5μg/ml。高效筛析色谱测定（HPSEC）

在脱-0-乙酰化作用或脱-0-丙酮酸化作用前和后，测定Pn9V-Ps，Pn18C-Ps和Pn4的HPSEC。装有流速限制器的7.5×600mm  TSK  G6000PV柱在800-1000psi下加热至50℃，在0.3ml/分钟下用0.2M乙酸钠平衡。将60μg样品（1mg/ml）注射到柱上，在0.3ml/分钟用流动相流脱。柱洗脱剂在流速为0.5ml/分钟与柱后加的0.5M  NaOH混合，用Dionex脉冲电流检测器检测和测量Kd。

灵敏度和线性度的测定

确定在3μ西门子为丙酮酸盐和乙酸盐的检测器的线性度和灵敏度。瑞酮酸盐和乙酸盐在0.125nmol的下限可被检测到。2个组份的检测反应的线性度为2nmole，丙酮酸盐和乙酸盐的相关系数分别为0.9999和0.9992。

从Pn18C-Ps去除0-乙酸盐的最佳条件

关于水解Pn18C-Ps时间的初步研究证明，0-乙酰基在低温时对硷性水解不稳定。在4℃时，温育16小时后，2mM氢氧化钠足以对Pn18C-Ps完成脱-0-乙化。较高温度时（＞25℃），处理可从N-乙酰甘露糖醇中释放N-乙酸盐，前者则会干扰Pn9V0-乙酸盐的测量。为了得到从Pn-Ps去除0-乙酸盐的最佳水解条件，则为4℃下16小时。在室温下，用2mM  NaOH处理N-乙酰甘露糖醇16小时，则乙酸盐低于1%。

从Pn4中脱除0-丙酮酸酯的最佳方法

最初，Pn4水解研究是用氢氧化钠水解进行的。很快发现，当使用氢氧化钠时丙酮酸酯收率很低。起始对照研究表明，丙酮酸酯在100℃水中从Pn4裂解掉。由此信息便决定实施例采用高温HCl解法从Pn4中释放出0-丙酮酸酯的最佳方法。某些丙酮酸酯的降解是在较高温度下出现的，这可得到与Pn4相同条件水解了的丙酮酸标准物的样品的说明。当在1mM盐酸中于65℃水解16小时时得到最高收率的丙酮酸酯。

在Pn-Ps样品中0-乙酸酯和0-丙酮酸酯的分析

对代表着起始Pn-Ps、分级的Pn-Ps和一个Pn18C-Ps-OMPC共轭体的不同样品分析0-乙酸酯/丙酮酸酯，采用上述HPLC法，在室温2mM  NaOH中水解这后释放出Pn9V-Ps/18C中的0-乙酸酯或在65℃  1mM  HCl中水解之后释放出0-丙酮酸酯。该项研究结果归纳如下：

样品  丙酮酸酯/乙酸酯与各Ps重复单元之比

Pn4，sample  1  1.0  \\

Pn4，sample  2  0.8  \\

Pn9V，sample  1  1.7  \\

Pn9V，sample  2  1.5  \\

Pn18C-Ps，sample  1  1.0  \\

Pn18C-Ps，sample  2  0.8  \\

Pn18C-Ps-OMPC  aqueous  bulk  0.5  \\

结果表明，在分级的Pn-Ps中侧基保留率：对于Pn9V-Ps约90%，对于Pn4和18C为80%。经实测，在Pn18C-Ps-OMPC共轭含水整体中0-乙酸酯的保留率约50%。Pn18C-Ps和Pn4的理论值为每摩尔Ps重复单元1摩尔乙酸酯或丙酮酸酯，而对于Pn9V，该比值为2∶1。

[Jansson，P-E.，Lindberg，B.，and  Lindquist，U.′Structural  studies  of  the  capsular  polysaccharides  from  Streptococcus  pneumoniae  Type  4.′Carbohyd.Res.，95：73-80，（1981）.Lugrowski，C.and  Jennings，H.J.′Structural  determination  of  the  capsular  polysaccharide  of  Streptococcus  pneumoniae  Type  18C.′Carbohyd.Res.131：119-129，（1984）.Perry，M.B.，Daoust，V.，and  Carlos，D.J.′The  specific  capsular  polysaccharide  of  Streptococcus  pneumoniae  Type  9V.′Can.J.Biochem.59：524-533，（1981）].

预计在Pn18C-Ps-OMPC共轭体中发现的0-乙酸酯有较低的保留率，因为0-乙酰基水解对低温碱性条件比较敏感。

测定Pn4，Pn9V和Pn18C-Ps样品和脱-0-丙酮酸化和脱-0-乙酰化样品的比浊度活性。

结果表明，在这些侧基脱除之后，浊度活性完全丧失掉，即使未处理的样品的Kd亦如此。通过上述HPSEC方法得到Kd值。但是，弱酸水解脱-0-丙酮酸化后的Pn4的Kd值从0.60提高到0.68，且外观接近盐体积。Pn4和Pn18C-Ps的抗原性数据支持了其它研究人员有关这些测基在肺炎球菌多糖免疫学活性中的重要性的工作。Pn9V的结果表明，除了丙酮酸之外，该分子的0-乙酰基也是重要的免疫学决定因素。

因此按照这上方法，已开发出定量测定Pn4的0-丙酮酸缩醛和Pn9V-P中的0-乙酸醌的快速、敏锐的工序。该工序在确定Pn4、Pn9V和Pn18C-Ps的分级和共轭以便保持这些多糖的抗原结构的校正方法是还有价值的。

实施例31

Pn6B-Ps-MIEP共轭体的分离：

1.将两种共轭的反应混合物样品（一个代表另一个的H  O渗析样品）贮存在3-8℃，直至使用。

2.将0.2  MOPS  pH7.2的缓冲剂加到样品中，以得到最终浓度约7mM。将固体GuHCl加到样品中以得到最终浓度4.2M（注：应加入1.42g  GuHCl/ml样品，以补偿因加入固体GuHCl而造成的体积的增大。类似地，应控制缓冲剂的加入以考虑体积的增大，由此使样品组成接近于柱洗脱剂组成。另外，也可以在层析前将样品对层析注进行渗析）。

3.以0.6ml/min的流速，将2.8ml样品（以低级蛋白质）注入到一个平衡在10  mM  mops  pH7.2，6m  GuHCl（中的Sephacryl  S-1000的柱（2.6×96mm）中。在280nM连续监测柱流出物（Perkin  Elmer  LC  235二极管分析监控器）并收集3ml部分。

4.蛋白质分布基于A280（以及光谱），Pn6B-Ps分布基于Pn6B-Ps特异沉降（ria）分析。以单独的Pn6B-Ps-Br-Ac和未活化的MIEP物理混合物洗提部位为基准，制备含PS和蛋白质的级分的池，并把那些与Pn6B-Ps-Br-Ac观察到的部位明显不同的洗脱物认定为Pn6B-Ps-MIEP共轭体。

5.采用YM-30膜超滤并用Miui-Q  H  O渗滤来浓缩泄。用定量组成研究的方法估计蛋白质和Pn6B-Ps含量。氨基酸分析检测到存存SCMHC。

实施例32

肺炎球菌多糖Pn  18C-PS直接RIA分析法

本分析法是用于定量肺炎球菌多糖型18C。它是一种多层夹芯的RIA分析法。将免的抗-Pn-18C-Ps抗体涂布到聚苯乙烯球粒上。将球粒在含有Pn  18C-Ps的样品液中保温。保温后，洗涤球粒，并再于含小鼠抗体Pn18C-OMPC的第二种溶液中保温。保温后，洗涤球粒，再在含有Ⅰ-山羊的抗小鼠IgG溶液中第三次保温。再一次洗涤该板，之后，将珠粒转移到计数用塑料管中。使未知样品Pn180C-Ps与定量用的标准曲线进行比较。

设备

1.RIA药盒：Abbot  Labs，Diagnostic  Div.，目录号6171-10。

2.Qwik洗系：Abbot  Labs，Diagnostic  Div。

3.可调节的吸管和易处理的吸管尖（ex.Eppendorf  digital）。

4.γ＝计数器（ex.Abbott  Autologic）。

5.镜状面层的1/4“聚苯乙烯球粒：Precision  Plastic  Ball公司，300N，Cicero  Ave.，Chicago，Illinois  60641。

试剂

1.纽约州立健康服务公司的抗-Pn  180C-Ps抗体Lot  R18-44或等价物。

2.小鼠抗-Pn  180C-Ps  OMPC抗血清（库11260-235或等价物）。

3.山羊的抗-小鼠IgG  Ⅰ-标记抗血清：NEX  159，New  England  Nulear，549  Albang  Street，Boston，MA02118。

4.保温缓冲剂：RCM8，含：

10%BSA  Sigma  A2153

0.1%叠氮化物  Sigma  S2002

5.稀释剂

8份牛胎血清  Sigma  F3885

1份山羊血清  Sigma  G6767

1份兔血清  Sigma  R4505

0.05%TWEEN20  Sigma  P1379

0.1%叠氮化物  Sigma  S2002

3.将试剂1-抗Pn18C-Ps抗体涂布的珠粒加到含样品或标准物的板的各孔中并将板轻微搅拌以确保所有珠粒完全覆盖上缓冲剂。

4.用配有RIA药盒的粘合面板盖上该板并在室温下温育该板6小时。

5.用Qwik洗涤设备和去离子水洗涤该板。

6.在稀释剂中以1∶1000稀释小鼠的抗-180C抗体。

7.将200/μl该溶液加到含珠粒的各孔中。

8.盖上该板并在室温保温过夜。

9.用Qwik洗涤设备和去离子水洗涤该板。

10.在稀释剂中，将Ⅰ-标记的山羊抗小鼠抗体稀释到15000（pm/10μl（-1∶160稀释度）。

11.含珠粒的各孔中加入20μl该溶液。

12.盖上该板并于37℃保温2小时。

13.用Qwik洗涤设备和去离子水洗涤该板。

14.将珠粒转移到配有RIA药盒的塑料管中并用合适的γ-计数器计数。

计算

1.把两次测定值合并，得到各样品、标准物和保温缓冲剂对照的平均值。从所有标准物和样品中减去保温缓冲剂对照。

2.使用统计计算用的计算器，输入数据制成标准曲线，并计算相关系数和曲线的斜率。

3.用合适的标准曲线（游离的供游离用，共轭的供共轭用），计算样品的响应性，并进行稀释校正。

上述同样工序在替换各类特定试剂之后可应用到任何其它Pn-Ps物质上。

Claims (10)

1、一种含有与由一种或多种肺炎链球菌(streptococcus pneumo-niae)亚型产生的多糖共价连接的免疫蛋白的结合物，所述多糖的每个分子均具有大约1200重复单位，分子量约为1×10⁵至1×10⁶，多分散度为1.0至1.4，由肺炎球菌族特异性C-多糖造成的污染低于3.0%类型特异性多糖。

2、根据权利要求1的结合物，其中所述多糖的抗原性指数为0.7至1.1，特性粘度为0.6至3.0dL/g。

3、根据权利要求2的结合物，其中所述多糖是由选自肺炎链球菌1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19F，19A，20，22F，23F和33F中任何一种亚型产生的。

4、根据权利要求3的结合物，其中所述多糖的粒度多分散度为1.0至1.4，C-多糖的污染量相当于低于3%的类型特异性多糖，该多糖产生于：

（1）肺炎链球菌6B，所述多糖具有：

（a）MN约为3×10⁵至6×10⁵;

（b）Kd（峰值）约为0.60±0.05;

（c）MW约为3×10⁵至7×10⁶;

（d）特性粘度在0.1M磷酸钠（pH7.2）中为1.0至2.0，

（e）平均每个分子约低于1000重复单位;

（2）肺炎链球菌14，所述多糖具有：

（a）MN约为3×10⁵至8×10⁵;

（b）Kd（峰值）约为0.60±0.05;

（c）Mw约为4×10⁵至1×10⁶;

（d）特性粘度在0.1M磷酸钠（pH7.2）中为0.6至1.6;

（e）平均每个分子约低于1200重复单位;

（3）肺炎链球菌19F，所述多糖具有

（a）MN约为2×10⁵至6×10⁵;

（b）Kd（峰值）约为0.65±0.05;

（c）Mw约为2×10⁵至6×10⁵;

（d）特性粘度在0.1M磷酸钠（pH7.2）中为1.0至2.0，

（e）平均每个分子约低于1000单体重复单位;

（4）肺炎链球菌23F，所述多糖具有：

（a）MN约为2×10⁵至6×10⁵;

（b）Kd（峰值）约为0.54±0.05;

（c）Mw约为4×10⁵至8×10⁵;

（d）特性粘度在0.1M磷酸钠（pH7.2）中为1.5至3.0;

（e）平均每个分子约低于1000单体重复单位;

（5）肺炎链球菌4，所述多糖具有

（a）MN约为2×10⁵至4×10⁵;

（b）Kd（峰值）约为0.65±0.05;

（c）Mw约为2×10⁵至5×10⁵;

（d）特性粘度在0.1M磷酸钠（pH7.2）中为1.0至3.0，

（e）平均每个分子约低于600单体重复单位;

（6）肺炎链球菌9V，所述多糖具有：

（a）MN约为3×10⁵至6×10⁵;

（b）Kd（峰值）约为0.65±0.05;

（c）Mw约为3×10⁵至7×10⁵;

（d）特性粘度在0.1M磷酸钠（pH7.2）中为1.0至2.0;

（e）平均每个分子约低于800单体重复单位;

（7）肺炎链球菌18C，所述多糖具有

（a）MN约为2×10⁵至6×10⁵;

（b）Kd（峰值）约为0.65±0.05;

（c）Mw约为2×10⁵至6×10⁵;

（d）特性粘度在0.1M磷酸钠（pH7.2）中为1.5至3.0，

（e）平均每个分子约低于700单体重复单位;

或上述任何一种多糖的混合物，其中所述多糖与脑膜炎双球菌（Neisse-ria  meningitidis）b的外膜蛋白复合物（OMPC）或其MIEP亚单位相结合。

5、根据权利要求4的共价结合物，其中OMPC或MIED和Pn-Ps在由多糖水解键合时，通过下式间隔因连接

或在多糖具有羧酸基因时，通过下式间隔因连接

式中PRO代表OMPC或MIEP，Pn-Ps代表肺炎球菌多糖，该结合物的Pn-Ps：OMPCP或Pn-Ps：MIEP质量比约为0.05至0.5，通过水解和氨基酸分析，得到的SCMHC/Lys比为0.01至0.15。

6、由下述方法生产的肺炎球菌多糖-免疫蛋白结合物：

（a）培养肺炎球菌，分离Pn-Ps粗制品或加溶肺炎球菌多糖粉末;

（b）将步骤（a）的多糖纯化和部分水解至预定的终点，产生适合于结合的多糖，其与步骤（a）的多糖粗制品相比，还原多糖的类型特异性抗原性不高于30%;

（c）将步骤（b）的产物与免疫蛋白结合，其中在步骤（a）中培养的肺炎球菌选自4、6B、9V、14、18C、19F和23F中一种或多种亚型，其中用抗Pn-Ps类型特异性抗体经平板双向免疫扩散法或速度散射浊度测定法测定，Pn-Ps仍保持其抗原完整性，所述Pn-Ps在结合前，在压力约为2000至15000PSI的Gaulin压力机中进行物理剪切，或在100℃下加热水解24小时或超声处理时，下列各Pn-Ps亚型在1mg/ml的0.9M氯化钠溶液中的粘度或Kd（峰值）终点如下：

Pn-Ps亚型  目标终点粘度（厘沲）  目标终点Kd（峰值）

Pn4-Ps  1.5-1.00  0.65±0.05

Pn6B-Ps  1.3-1.00  0.60±0.05

Pn9V-Ps  1.3-1.00  0.65±0.05

Pn14-Ps  1.1-0.95  0.60±0.05

Pn18C-Ps  1.5-1.00  0.65±0.05

Pn19F-Ps  1.3-1.00  0.65±0.05

Pn23F-Ps  1.5-1.00  0.54±0.05;

需要时通过色谱分离法或乙醇分离法选择多分散度1.4以下的物质。

7、制造Pn-Ps-PRO结合物的方法，该方法包括：

（a）分离肺炎球菌多糖Pn-Ps粗制品;

（b）ⅰ.需要时通过杂质的离子交换吸附法纯化Pn-Ps粗制品;

ⅱ.部分水解或机械剪切Pn-Ps粗制品;

（c）需要时，根据粒度和纯度分离部分水解的Pn-Ps;

（d）衍生由步骤（a）-（c）的一种或多种肺炎球菌亚型产生的经过分离的Pn-Ps，显示亲核部分或亲电子部分;

（e）分离脑膜炎双球菌b  OMPC或其亚单位;

（f）歙OMPC或其亚单位具有能反应的亲电子部分或亲核部分;

（g）将步骤（d）的多糖与步骤（f）的蛋白结合;

（h）封断结合物，除去残余的官能团;

（i）分离得到结合产物。

8、根据权利要求7的方法，其中步骤（b）和（c）包括：

（b）ⅰ.需要时将溶液pH值约为5的阴离子杂质吸附在Whatman  DE52滤纸上;

ⅱ.将Pn-Ps溶液水解到预定的终点粘度，通过下述步骤使与抗肺炎球菌类型特异性抗体结合的Pn-Ps减少不高于Pn-Ps粗制度的30%;

（1）在50-150℃下加热1至48小时;或

（2）超声处理，根据超声处理样品的动力调整，超声处理的时间5秒至5分钟，冷却后继续进行超声处理;或

（3）在压力约为2000至15000PSI的Gaulin压力机中剪切;

步骤（c）包括分离经水解的Pn-Ps，通过下述步骤选择具有1×10⁵至1×10⁶分子量的部分：

ⅰ.用预定浓度的异丙醇差示乙醇溶解度，沉淀出所需粒度的Pn-Ps，或

ⅱ.在能够包括和分离5×10⁴和1×10⁶粒度的多糖的粒度排阻液体色谱柱上进行分离，用1mg/ml的0.1M磷酸钠溶液（pH7.2）粘度测量方法测定水解或切变的终点，或根据亚型Pn-Ps终点色谱分离下表所列各多糖：

Pn-Ps亚型  目标终点粘度（厘沲）  目标终点Kd（峰值）

Pn4-Ps  1.5-1.00  0.65±0.05

Pn6B-Ps  1.3-1.00  0.60±0.05

Pn9V-Ps  1.3-1.00  0.65±0.05

Pn14-Ps  1.1-0.95  0.60±0.05

Pn18C-Ps  1.5-1.00  0.65±0.05

Pn19F-Ps  1.3-1.00  0.65±0.05

Pn23F-Ps  1.5-1.00  0.54±0.05。

9、使用权利要求1的结合物的方法，该方法包括给哺乳动物施用免疫有效量的所述结合物。

10、一种疫苗组合物，该组合物含有权利要求1的结合和惰性载体，需要时还可含有免疫有效量的助剂或免疫调整化合物或其他免疫原，其中所述惰性载体系氢氧化铝、磷酸铝和明矾，所述其他免疫原选自抗乙型肺炎、甲型肺炎、非A非B型肝炎、爱滋病、白喉-百日咳-破伤风、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、水痘、脊髓灰质炎和流感嗜血杆（Haemophilus  influenzae）b，所述结合物包括选自Pn4-Ps-OMPC、Pn6B-Ps-OMPC、Pn9V-Ps-OMPC、Pn14-Ps-OMPC、Pn18C-Ps-OMPC、Pn19F-Ps-OMPC、Pn23F-Ps-OMPC、Pn1-Ps-OMPC、Pn5-Ps-OMPC和Pn7F-Ps-OMPC中一种至全部的结合物。