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CN106397582B - Hpv16e7蛋白纳米抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Hpv16e7蛋白纳米抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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CN106397582B
CN106397582B CN201611092668.9A CN201611092668A CN106397582B CN 106397582 B CN106397582 B CN 106397582B CN 201611092668 A CN201611092668 A CN 201611092668A CN 106397582 B CN106397582 B CN 106397582B
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Abstract

本发明公开了一种HPV16E7蛋白纳米抗体及其制备方法与应用，本发明利用原核表达的HPV16E7抗原免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因库。然后将HPV16E7蛋白包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库，从而获得HPV16E7特异性的纳米抗体基因，再将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

Description

HPV16E7蛋白纳米抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于HPV检测技术领域，具体涉及一种HPVl6感染相关疾病的免疫学检测方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)为对称二十面体，是微小无包膜的环状双链DNA病毒，大小约8kb。流行病学调查证实了HPV感染与宫颈癌的发生有极密切的相关性，检测结果表明宫颈癌病例中HPV病毒基因组的阳性率大于99％，其中70％的病例由高危型病毒HPV16和HPV18的感染引起。HPV16是最常见的与宫颈癌相关的高危型病毒。
HPV基因组按功能不同分为3个区：非编码区，为基因转录复制调控区；早期区，含6个开放读码框架(El，E2，E4，E5，E6，E7)，编码的蛋白参与病毒的复制与转录；晚期区，含L1和L2两个开放读码框架，编码病毒两个衣壳蛋白，即主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白，共同组成病毒的外壳。HPV16的E6和E7是主要的致癌基因，在宫颈癌SiHa细胞系中，当HPV16E6/E7表达沉默时，SiHa细胞的增殖及迁移能力就会明显受到抑制。
1993年比利时的Hamers Casterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条H链和2条L链构成的常规抗体，还存在缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody，hcAb)这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variable domain of the heavy chain ofHCAbs,VHH)形成，尽管天然缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。VHH纳米抗体分子量为15kDa，仅为常规抗体的1/10。纳米抗体具有易表达，水溶性好，稳定性强，免疫原性弱，组织穿透性好等优点，这些特点使得纳米抗体在基础研究、药物开发等领域有重要的应用价值。
而传统抗体稳定性差、生产成本高，限制了对于乳头瘤病毒的检测。因此应用纳米抗体技术研发乳头瘤病毒的检测试剂具有广阔的前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种HPV16E7蛋白纳米抗体。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述HPV16E7蛋白纳米抗体的制备方法。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述HPV16E7蛋白纳米抗体在检测HPV16E7蛋白中的应用。
HPV16E7蛋白纳米抗体，所述HPV16E7蛋白纳米抗体的包括框架区和互补决定区：
其中，
所述框架区包括如下序列：如SEQ ID NO.1所示的FR1，如SEQ ID NO.2所示的FR2，如SEQ ID NO.3所示的FR3，如SEQ ID NO.4所示的FR4；所述互补决定区包括如下序列如SEQID NO.5所示的CDR1，如SEQ ID NO.6所示的CDR2，如SEQ ID NO.7所示的CDR3；
或者，
所述框架区包括如下序列：如SEQ ID NO.8所示的FR1，如SEQ ID NO.9所示的FR2，如SEQ ID NO.10所示的FR3，如SEQ ID NO.11所示的FR4；所述互补决定区包括如下序列如SEQ ID NO.12所示的CDR1，如SEQ ID NO.13所示的CDR2，如SEQ ID NO.14所示的CDR3。
HPV16E7蛋白纳米抗体，所述HPV16E7蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.15或SEQ ID NO.16所示。
编码HPV16E7蛋白纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17或SEQ IDNO.18所示。
一种重组质粒，该质粒包含SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的序列。
一种重组细胞，该重组细胞包含SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的序列。
上述HPV16E7蛋白纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
将SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，再将得到的重组质粒转化宿主细胞，培养，得到HPV16E7蛋白纳米抗体。
其中，所述表达质粒为pET28a。
其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
上述HPV16E7蛋白纳米抗体在检测HPV16E7蛋白中的应用在本发明的保护范围之内。
有益效果：
本发明的优点如下：本发明利用原核表达的HPV16E7抗原免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因库。然后将HPV16E7蛋白包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库，从而获得HPV16E7特异性的纳米抗体基因，再将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
附图说明
图1是pSUMO-HPVl6 E7蛋白原核表达SDS-PAGE电泳图：M为蛋白分子标准；1为未诱导全菌；2为IPTG诱导全菌。
图2是pSUMO-HPVl6 E7蛋白镍柱亲和层析纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳图：1为蛋白分子标准；2为目的蛋白。
图3是nest-PCR1产物琼脂糖凝胶电泳图：M为DNA分子标准；1为nest-PCR1产物。
图4是nest-PCR2产物琼脂糖凝胶电泳图：M为DNA分子标准；1为nest-PCR2产物即扩增所得的VHH片段。
图5是HPVl6 E7蛋白纳米抗体文库的多样性鉴定图：M为DNA分子标准；1-17是HPVl6 E7蛋白纳米抗体文库中随机挑选的单克隆噬菌体PCR产物。
图6.HPVl6 E7蛋白纳米抗体1诱导表达纯化的SDS-PAGE电泳图：M为蛋白分子标准；1为未诱导全菌；2为IPTG诱导全菌；3为超声破碎沉淀；4为超声破碎上清；5-6为流穿液；7，8为纯化所得的HPVl6 E7蛋白纳米抗体。
图7.HPVl6 E7蛋白纳米抗体的免疫印迹亲和性分析.l：pSUMO空质粒表达蛋白对照，2：HPVl6E7
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：HPVl6 E7蛋白的诱导表达及纯化
(1)HPVl6E7蛋白的诱导表达
首先将成功构建好的pSUMO-HPVl6E7载体转化到BL21(DE3)中，获得pSUMO-HPVl6E7重组菌，挑选单克隆于卡那霉素液体LB中，培养过夜；然后以1：100接种于含卡那霉素液体LB中，培养1.5-2h，当菌液OD600为0.6～0.8时，用23℃，16h，0.1mmol/L IPTG进行诱导表达。
图1SDS-PAGE电泳检测结果显示，诱导后的HPVl6 E7蛋白表达菌在35KD处有一条带，符合目的蛋白的预期分子量。
(2)HPVl6 E7蛋白的纯化
通过Ni-IDA亲和层析的方法获得纯化的HPVl6E7蛋白。
层析柱首先用菌体缓冲液清洗，加入Ni-IDA填充层析柱；将上述菌体超声上清加入镍柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床体积的清洗缓冲液(40mmol/L咪唑，菌体缓冲液)洗掉杂蛋白；用等体积的洗脱缓冲液(250mmol/L咪唑，菌体缓冲液)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。
图2SDS-PAGE电泳检测结果显示，经镍柱纯化的HPVl6 E7蛋白，蛋白纯度高达90％以上。
实施例2：HPVl6 E7蛋白纳米抗体文库的构建
(1)HPVl6 E7蛋白免疫新疆双峰骆驼
将1mg的HPVl6 E7蛋白与等体积的弗氏佐剂混合均匀，免疫新疆双峰骆驼(皮下注射3-5点)，共免疫注射7次(首次用完全弗氏佐剂，其余用不完全弗氏佐剂)；免疫结束后，取免疫后骆驼的外周血200ml,分离获得外周血淋巴细胞。
(2)外周血淋巴细胞的分离及其总RNA的提取
首先采用Percoll密度梯度离心分离纯化骆驼外周血淋巴细胞。将淋巴细胞用生理盐水清洗几次后，加入Trizol,室温静置10min；然后加入氯仿剧烈震荡，室温静置15min；离心后，收集上层水相加入异丙醇混匀，室温静置10min；离心去上清，75％乙醇清洗RNA，并用DEPC水溶解。
(3)逆转录PCR
I.采用invitrogen公司的SuperScript III First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR试剂盒，将外周血淋巴细胞总RNA逆转录成cDNA，通过nest-PCR扩增得到骆驼重链抗体的VHH片段。
表1nest-PCR引物名称及序列
引物 引物序列
nest-PCR1up 5'>GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG<3'
nest-PCR1down 5'>GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC<3'
nest-PCR2up 5'>CCGGAATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG<3'
nest-PCR2down 5'>GCCCAAGCTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT<3'
II.nest-PCR1 25ul体系
以上述所得的cDNA为模板，nest-PCR1up和nest-PCR1down为引物，进行PCR扩增反应。
PCR反应体系：
Figure BDA0001168929240000051
PCR条件：
Figure BDA0001168929240000052
PCR反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，图3凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在700bp处有特异性条带。切胶回收目的条带。
III.nest-PCR2 25ul体系
以nest PCR1DNA回收产物为模板，nest-PCR2up和nest-PCR2down为引物，进行PCR扩增反应。
PCR反应体系：
Figure BDA0001168929240000061
PCR条件：
Figure BDA0001168929240000062
PCR反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，图4凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在500bp处有特异性条带。切胶回收目的条带，即为VHH片段。
(4)VHH片段的双酶切
使用TAKARA公司的EcoR I和HindⅢ内切酶进行双酶切，反应体系如下：
Figure BDA0001168929240000071
37℃水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收。
(5)T7噬菌体抗体库的构建
选用Novagen公司的T7Select10试剂盒构建纳米抗体库。依据其说明书进行VHH片段和T7载体的连接以及T7噬菌体的包装。通过噬菌斑滴度测定，构建的HPVl6 E7蛋白纳米抗体库滴度大约为1×107pfu/ml。
(6)T7噬菌体抗体库的扩增
选用液体裂解法对T7噬菌体抗体库进行扩增。在50mlTB培养基中加入1ml培养过夜的宿主BLT5403菌液，37℃，200r培养至OD600为0.6～1.0；加入⑸中所得的T7噬菌体抗体库，37℃，200r培养至有白色絮状沉淀出现时，停止培养；13000rpm,10min离心，上清为扩增的T7噬菌体抗体库；对其进行噬菌斑滴度测定，其滴度为1×1010pfu/ml。
(7)检测HPVl6 E7蛋白纳米抗体文库的多样性
随机挑⑸中的噬菌斑于50ul 10mM EDTA中,剧烈震荡混匀，65℃水浴15min，13000rpm离心10min，上清为粗提的噬菌体DNA；以其为模板，按照Novagen公司的T7Select10试剂盒说明书，进行PCR反应，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(见图5)，图5电泳结果显示，构建的HPVl6 E7蛋白纳米抗体文库的重组阳性率为100％。然后对其测序，分析HPVl6 E7蛋白纳米抗体文库的多样性。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001168929240000081
PCR条件如下：
Figure BDA0001168929240000082
测序结果显示，17个单克隆噬菌斑，有15种核酸序列，并且这些序列翻译成的氨基酸序列也不相同，说明构建的HPVl6 E7蛋白纳米抗体文库有很好的多样性。
实施例3：运用镍离子金属螯合亲和层析介质Ni-NTA淘选HPV16E7纳米抗体。
(1)Ni-NTA介质的清洗：
取100ulNi-NTA介质于1.5mlEP管中，加1ml灭菌水，涡旋震荡仪混匀；3000rpm，30s离心，弃上清；共洗5次，最后一次用0.05％TBST代替灭菌水。
(2)封闭：
洗好的Ni-NTA介质加入1ml封闭液(0.5％BSA)，翻转摇匀1h；封闭结束后，1mlTBST洗4次。
(3)负筛去除非特异结合的噬菌体：
HPVl6E7的VHH-T7噬菌体库用TBST稀释至1ml，加入到封闭后的Ni-NTA介质中，置于翻转摇匀仪上，室温结合30min；离心，上清即为负筛后的T7噬菌体库。
(4)与HPVl6E7特异结合的噬菌体的筛选：
负筛后的HPVl6E7噬菌体库加入20ug HPVl6E7蛋白(1ug/ul)，室温结合30min。然后将混合物加入到封闭好的Ni-NTA介质中，室温结合30min；离心，弃上清。1mlTBST洗获得的沉淀，共洗5次；离心，弃上清；加入400ul TB培养基混匀，平均分为两份，一份用来测定筛选后的噬菌体的滴度，一份用来扩增筛选后的噬菌体。
(5)筛选后的噬菌体的扩增：
将筛选后的噬菌体加入到50ml OD600＝0.6的BLT5403宿主菌中，37℃震荡培养，培养至有白色絮状沉淀出现时，停止培养；离心，上清即为扩增的第一轮筛选后的噬菌体，置于4℃保存，并用于下一轮的筛选；按相同筛选步骤，筛选3-4轮。
实施例4：ELISA鉴定特异性的HPVl6 E7蛋白VHH-T7阳性克隆。
上述最后一轮筛选所得的噬菌体，在150mm的TB固体培养基上培养，并挑选70个单克隆噬菌斑于3ml OD600＝0.6的BLT5403宿主菌中进行液体裂解法扩增，离心，上清于4℃保存，即为单克隆噬菌体；
ELISA板每孔加入2ug HPVl6 E7蛋白包被，置于4℃过夜，第二天0.5％BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆噬菌体，对照组加入等量的野生型T7噬菌体，室温孵育1-2h；200ul TBST洗去未结合的噬菌体，共洗5次，然后加入兔抗T7噬菌体10A抗体，室温孵育1-2h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入HRP标记的羊抗兔抗体，室温孵育1h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入显色液，避光反应10min，ELISA板置于酶标仪上，测吸光值，当实验孔与对照孔吸光值比值大于2时，判定其为阳性克隆；提取阳性克隆噬菌体的DNA进行测序。
ELISA鉴定结果显示，获得30个阳性克隆。然后对其进行DNA测序，获得2种核苷酸序列；对其氨基酸序列进行分析，这两种序列均具有典型的纳米抗体结构，由框架区(FR1，FR2，FR4，FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这两株单克隆噬菌体的核苷酸序列，氨基酸序列如下：
HPVl6 E7的VHH 1：
核苷酸序列(SEQ ID NO.17)：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTACACCAGCAGTAGCTGCAGCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAACTATTTTTGCGGATGGTAGGACACGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTAACACGGATGCACATGGCTCTTATAGTGACTATGACTGTGTGAATTGGAATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
氨基酸序列(SEQ ID NO.15)：
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTSSSCSMGWYRQAPGKERELVATIFADGRTRYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCNTDAHGSYSDYDCVNWNNYWGQGTQVTVSS
框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：
FR1(SEQ ID NO.1)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAAS
CDR1(SEQ ID NO.5)：GYTSSSCSMG
FR2(SEQ ID NO.2)：WYRQAPGKERELVAT
CDR2(SEQ ID NO.6)：IFADGRTR
FR3(SEQ ID NO.3)：YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYC
CDR3(SEQ ID NO.7)：NTDAHGSYSDYDCVNWNNY
FR4(SEQ ID NO.4)：WGQGTQVTVSS
HPVl6 E7的VHH 2：
核苷酸序列(SEQ ID NO.18)：
GATGTGCAGCTGGTCAATACCATGAGTAACGAGAAGCTGGATGTAGAAGGCGTTACCAGCAAGTATGGGGTACGCCCAGATCAGATTATCGATTATTTAATGCTGATTGGCGACACTTCGGACAATATTCCCGGCGTTCCCAAGGTGGGGCCCAAGACGGCCGCCAAGTGGTTGGGCGAATATGGCAGTCTGGATGAACTGTTGCAGCATGCCGACAAAATCAAGGGGGTGGCCGGCCAGAATCTGGCCGGCAGCAGCTCCAACTTTGAAATGACGCGCAAACTGGTCACCGTCTCCTCA
氨基酸序列(SEQ ID NO.16)：
DVQLVNTMSNEKLDVEGVTSKYGVRPDQIIDYLMLIGDTSDNIPGVPKVGPKTAAKWLGEYGSLDELLQHADKIKGVAGQNLAGSSSNFEMTRKLVTVSS
框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：
FR1(SEQ ID NO.8)：DVQLVNTMSNEKLDVEGVTSKYGVR
CDR1(SEQ ID NO.12)：PDQIIDYLML
FR2(SEQ ID NO.9)：IGDTSDNIPGVPKVG
CDR2(SEQ ID NO.13)：PKTAAKWL
FR3(SEQ ID NO.10)：GEYGSLDELLQHADKIKGVAGQ
CDR3(SEQ ID NO.14)：NLAGSSSNF
FR4(SEQ ID NO.11)：EMTRKLVTVSS
实施例5：HPVl6 E7蛋白纳米抗体的诱导表达和纯化
(1)HPVl6 E7蛋白纳米抗体的诱导表达
首先将HPVl6 E7蛋白纳米抗体的基因序列用TAKARA公司的EcoR I和HindⅢ内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物，分别将其插入到pET28a中，成功构建HPVl6 E7蛋白纳米抗体的表达载体；将HPVl6 E7蛋白纳米抗体的表达载体转化到BL21(DE3)中，涂卡那霉素抗性LB平板培养基，挑单克隆菌株，培养过夜。以1:100的比例将HPVl6E7蛋白纳米抗体表达菌加入到培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8时，IPTG诱导表达。离心菌液获得菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬，置于冰盒内超声破碎，离心收集上清。
(2)HPVl6 E7蛋白纳米抗体的纯化
通过Ni-IDA亲和层析的方法获得纯化的HPVl6 E7蛋白纳米抗体。层析柱首先用菌体缓冲液清洗，加入Ni-IDA填充层析柱；将上述HPVl6 E7蛋白纳米抗体表达菌菌体超声上清加入镍柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床体积的清洗缓冲液(40mmol/L咪唑)洗掉杂蛋白；用等体积的洗脱缓冲液(250mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。然后用15％SDS-PAGE电泳检测HPVl6 E7纳米抗体的表达纯化情况。(见图6)。
SDS-PAGE电泳检测结果：图6结果显示，诱导后的HPVl6 E7蛋白纳米抗体1表达菌与其未诱导的表达菌相比较，在20KD处有一条带，且符合目的蛋白的预期分子量；通过灰度分析，纯化所得的HPVl6 E7蛋白纳米抗体的纯度大于90％。
实施例6:HPVl6 E7蛋白纳米抗体的免疫印迹亲和性分析
对pSUMO-HPVl6E7质粒表达得到的HPV16E7蛋白及对照空质粒表达蛋白进行Western Blot鉴定，结果表明HPVl6 E7蛋白纳米抗体与HPVl6 E7蛋白具有较好的结合能力，与空载体表达的蛋白不能结合，DAB显色后在大约35kDa位置有清晰的目标条带(图7)。
实施例7:HPVl6 E7蛋白纳米抗体的ELISA法亲和性分析
以HPVl6 E7蛋白和pSUMO空质粒表达蛋白包被酶标板，包被浓度10ug/ml，ELISA板每孔加200ul，4℃包被过夜。TBST洗ELISA板3次，加入0.5％BSA封闭液，室温封闭一小时。丢弃封闭液并用TBST洗3次，加入HPVl6 E7纳米抗体，或对照wasabi纳米抗体，室温孵育一小时。TBST洗板3次后，加入1:1000稀释的兔抗HA单克隆抗体，200μl/孔，室温孵育一小时。TBST洗板3次，加入1:2000稀释的HRP标记羊抗兔二抗，200μl/孔，室温孵育一小时。TBST洗板3次，每孔加入100ul的TMB显色液，ELISA板置于酶标仪上，测450nm吸光值。结果见表2，ELISA检测结果显示：HPVl6 E7纳米抗体对HPVl6 E7的结合活性远远高于wasabi纳米抗体对照组及pSUMO空质粒表达蛋白组.。
表2ELISA检测HPVl6 E7纳米抗体的亲和性
Figure BDA0001168929240000121
SEQUENCE LISTING
<110> 东南大学
<120> HPV16E7蛋白纳米抗体及其制备方法与应用
<130> SG20161130001
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> VHH1的FR1序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> VHH 1的FR2序列
<400> 2
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Thr
1 5 10 15
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> VHH1的FR3序列
<400> 3
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> VHH1的FR4序列
<400> 4
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> VHH1的CDR1序列
<400> 5
Gly Tyr Thr Ser Ser Ser Cys Ser Met Gly
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> VHH1的CDR2序列
<400> 6
Ile Phe Ala Asp Gly Arg Thr Arg
1 5
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> VHH1的CDR3序列
<400> 7
Asn Thr Asp Ala His Gly Ser Tyr Ser Asp Tyr Asp Cys Val Asn Trp
1 5 10 15
Asn Asn Tyr
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> VHH2的FR1序列
<400> 8
Asp Val Gln Leu Val Asn Thr Met Ser Asn Glu Lys Leu Asp Val Glu
1 5 10 15
Gly Val Thr Ser Lys Tyr Gly Val Arg
20 25
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> VHH2的FR2序列
<400> 9
Ile Gly Asp Thr Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val Pro Lys Val Gly
1 5 10 15
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> VHH2的FR3序列
<400> 10
Gly Glu Tyr Gly Ser Leu Asp Glu Leu Leu Gln His Ala Asp Lys Ile
1 5 10 15
Lys Gly Val Ala Gly Gln
20
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> VHH2的FR4序列
<400> 11
Glu Met Thr Arg Lys Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> VHH2的CDR1序列
<400> 12
Pro Asp Gln Ile Ile Asp Tyr Leu Met Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> VHH2的CDR2序列
<400> 13
Pro Lys Thr Ala Ala Lys Trp Leu
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> VHH2的CDR3序列
<400> 14
Asn Leu Ala Gly Ser Ser Ser Asn Phe
1 5
<210> 15
<211> 125
<212> PRT
<213> VHH1的氨基酸序列
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Ser Ser Cys
20 25 30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Phe Ala Asp Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Asp Ala His Gly Ser Tyr Ser Asp Tyr Asp Cys Val Asn Trp Asn
100 105 110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 16
<211> 100
<212> PRT
<213> VHH2的氨基酸序列
<400> 16
Asp Val Gln Leu Val Asn Thr Met Ser Asn Glu Lys Leu Asp Val Glu
1 5 10 15
Gly Val Thr Ser Lys Tyr Gly Val Arg Pro Asp Gln Ile Ile Asp Tyr
20 25 30
Leu Met Leu Ile Gly Asp Thr Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val Pro Lys
35 40 45
Val Gly Pro Lys Thr Ala Ala Lys Trp Leu Gly Glu Tyr Gly Ser Leu
50 55 60
Asp Glu Leu Leu Gln His Ala Asp Lys Ile Lys Gly Val Ala Gly Gln
65 70 75 80
Asn Leu Ala Gly Ser Ser Ser Asn Phe Glu Met Thr Arg Lys Leu Val
85 90 95
Thr Val Ser Ser
100
<210> 17
<211> 375
<212> DNA
<213> VHH1的核苷酸序列
<400> 17
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggta caccagcagt agctgcagca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgagtt ggtcgcaact atttttgcgg atggtaggac acgctatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccatgtatt actgtaacac ggatgcacat 300
ggctcttata gtgactatga ctgtgtgaat tggaataact actggggcca ggggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 18
<211> 300
<212> PRT
<213> VHH2的核苷酸序列
<400> 18
Gly Ala Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala
1 5 10 15
Ala Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Cys Gly Ala
20 25 30
Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Thr Ala Gly Ala Ala
35 40 45
Gly Gly Cys Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Thr
50 55 60
Ala Thr Gly Gly Gly Gly Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala
65 70 75 80
Thr Cys Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr
85 90 95
Thr Thr Ala Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Gly
100 105 110
Ala Cys Ala Cys Thr Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Ala Thr
115 120 125
Thr Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Gly Gly
145 150 155 160
Cys Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Gly
165 170 175
Cys Gly Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly
180 185 190
Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys
195 200 205
Ala Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly
225 230 235 240
Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala
245 250 255
Gly Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr
260 265 270
Gly Ala Cys Gly Cys Gly Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys
275 280 285
Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala
290 295 300

Claims (8)

1.HPV16E7蛋白纳米抗体，其特征在于，所述HPV16E7蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQID NO .15或SEQ ID NO .16所示。
2.编码HPV16E7蛋白纳米抗体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO .17或SEQ ID NO .18所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，该质粒包含SEQ ID NO .17或SEQ ID NO .18所示的序列。
4.一种重组细胞，其特征在于，该重组细胞包含SEQ ID NO .17或SEQ ID NO .18所示的序列。
5.权利要求1所述HPV16E7蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQ ID NO .17或SEQ ID NO .18所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，再将得到的重组质粒转化宿主细胞，培养，得到HPV16E7蛋白纳米抗体。
6.根据权利要求5所述HPV16E7蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述表达质粒为pET28a。
7.根据权利要求5所述HPV16E7蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
8.权利要求1所述HPV16E7蛋白纳米抗体在制备检测HPV16E7蛋白试剂中的应用。
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