CN106367380B - 可在体外制备肝芽的细胞共培养方法和肝芽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，包括以下步骤：(1)将肝样细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞分别消化、重悬于培养基中，按肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.5～1.5：0.3～1混合，得混合细胞悬液；所述肝样细胞为采用诱导性多能干细胞定向诱导分化而成；(2)将所述混合细胞悬液均匀种植在培养皿进行培养3～7天至肝芽形成。本发明尽可能模拟了细胞在体内的生存环境，并优化了培养体系，突破了常规细胞培养的缺陷与不足，最终由细胞产生了微小的三维结构，为组织工程领域开拓了新的研究领域，也为再生医学研究提供了新的思路和方法。

Description

可在体外制备肝芽的细胞共培养方法和肝芽

技术领域

本发明涉及细胞工程和组织工程领域，尤其是涉及一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法和肝芽。

背景技术

肝脏是机体最重要的器官之一，它在机体的代谢、胆汁生成、解毒、凝血、免疫、热量产生及水与电解质的调节中均起着非常重要的作用。终末期肝病是指各种原因导致的进行性不可逆的肝脏损害，经常规的内外科治疗无法治愈，症候险恶，预计在短期内(6-12个月)无法避免死亡，在各种炎症因子的作用下，肝脏大多数功能极度衰竭，并往往伴有多种高危并发症。据统计，全球有大约6亿人面临终末期肝病的威胁，其死亡率高达50％–80％。原位肝移植被认为是目前治疗终末期肝病最有效的手段，但是因为肝源稀缺，目前全球需要的病人中仅有25％能够获得所需要的肝源。

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，因其具有多向分化潜能和无限增殖能力，为终末期肝病的治疗提供了充足的细胞来源。研究发现，胚胎干细胞(embryonicstem cell，ESCs)或者诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)等可在特定的条件下诱导分化为具有一定功能的肝脏前体细胞，具有成熟肝细胞功能，如合成尿素、储存糖原、分泌白蛋白等。因此，干细胞治疗有望代替原位肝移植成为治疗终末期肝病的新途径。

但是细胞在常规培养的过程中，虽然处于模拟的体内环境，可该环境与真正的体内环境之间仍然存在很大差异，细胞在生长过程中可能会产生一些微观变化，并不能代表体内细胞的真实状态。而细胞共培养技术将不同种类、不同来源的细胞在同一个体系中进行培养、增殖，尽可能模拟自然条件下的细胞内环境，能使细胞间相互沟通信息并支持生长增殖。Lawrence于1978年首次通过大鼠卵巢颗粒细胞和小鼠心肌细胞的共培养实验，研究异种细胞之间的间隙连接通信。Feng，Wang等人应用自体骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养，研究软骨细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用，以及这两种细胞在修复关节软骨损伤中的作用。Wang等人通过共培养实验研究骨髓间充质干细胞对造血干细胞扩增的促进作用。Zhang等通过将人肝细胞系L02和骨髓间充质干细胞在体外共培养，将间充质干细胞诱导分化为肝细胞。目前，细胞共培养在其培养的细胞种类、条件和方法等方面均取得了很大的进展，并且一种由细胞共培养产生的芽器官引起了广泛的关注。2013年，Takebe等人利用人诱导性多功能干细胞来源的肝脏内胚层细胞与人脐静脉内皮细胞以及间充质干细胞在体外共培养产生了简单的人类肝脏(后称之为“肝芽”)，将其移植到小鼠体内后，这些肝脏成功血管化并正常行使功能。此后进一步证明细胞共培养同样可以适用于肠、肺、心、肾、脑等微器官的产生，为终末期肝病的治疗提供了新的思路。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法和肝芽。利用iPSCs来源的肝样细胞(hepatocyte-like cells，HPLCs)与内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)以及间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在体外按比例共培养制备肝芽。

具体技术方案如下：

一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，包括以下步骤：

(1)将肝样细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞分别消化、重悬于培养基中，按肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.5～1.5：0.3～1混合，得混合细胞悬液；所述肝样细胞为采用诱导性多能干细胞定向诱导分化而成；

(2)将所述混合细胞悬液均匀种植在培养皿进行培养3～7天至肝芽形成。

上述步骤(2)中的培养时间优选为3～5天。

在其中一些实施例中，所述混合细胞悬液中的混合细胞总数为5×10⁵～1×10⁶个/cm²。

在其中一些实施例中，在所述步骤(1)中，所述肝样细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为4.3×10⁵～1.7×10⁶个；所述内皮祖细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为3×10⁵～1.6×10⁶个；所述间充质干细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为1.6×10⁵～1.2×10⁶个。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)中的肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.8～1：0.4～0.6。

在其中一些实施例中，在所述步骤(1)中，所述肝样细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为5.8×10⁵～1.4×10⁶个；所述内皮祖细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为5×10⁵～1.3×10⁶个；所述间充质干细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为2.5×10⁵～7.5×10⁵个。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)中的培养基为添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)中的添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中胎牛血清的体积浓度为10％，地塞米松的浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。

在其中一些实施例中，在所述步骤(1)中，还包括使用Cellstain-CFSE(CFSE)对重悬后的所述肝样细胞进行染色，以及使用Rhodamine labeled Ulex EuropaeusAgglutinin I(UEA I)对重悬后的内皮祖细胞进行染色，均在避光条件下进行。上述步骤为对体外制备的肝芽进行鉴定及其组成的细胞进行动态观测。

上述培养皿是指底面积为2.89cm²的中央孔器官培养皿；培养条件是于37℃，5％CO₂的条件下。

在其中一些实施例中，在所述步骤(1)中的所述肝样细胞由诱导性多能干细胞定向诱导分化而成的具体步骤如下：

步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；

步骤S2，将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；

步骤S3，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；

步骤S4，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。

在上述步骤S1中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化为诱导性多能干细胞；所述诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。

在上述步骤S2中，使用所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基培养22～50小时后，更换使用所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基培养46～98小时，并且在后续培养过程中每22～26小时更换一次培养基。

所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中所述人活化素A的浓度为5-300ng/ml，所述Wnt3a的浓度为20-100ng/ml；所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基中所述人活化素A的浓度为10-200ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为0.2-2％。

在上述步骤S3中，使用所述添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基培养22～98小时后，再使用添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基培养118～170小时，并且在培养过程中，每隔22～26小时更换一次相应的培养基。

所述添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中所述角质细胞生长因子的浓度为15-100ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为2-3％。

所述添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基中所述血清替代物的体积浓度为20％，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-3mM，所述非必需氨基酸的质量浓度为0.1-15％，所述β-巯基乙醇的浓度为0.1-0.12mM，所述二甲基亚砜的体积浓度为0.2-2％。

在上述步骤S4中，培养周期为142～242小时，且每隔22～26小时更换一次培养基。

所述添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中所述胎牛血清的体积浓度为10％，所述肝细胞生长因子的浓度为10-300ng/ml，所述抑瘤素的浓度为1-150ng/ml，所述地塞米松的浓度为0.05-1.2μM，所述L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。

本发明还提供一种采用上述可在体外制备肝芽的细胞共培养方法制得的肝芽。

本发明相较现有技术的优点以及有益效果为：

本发明在诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝样细胞的基础上，将诱导性多能干细胞来源的肝样细胞与内皮祖细胞以及脐带间充质干细胞按照优选比例在体外共培养形成肝芽。本发明共培养方法尽可能模拟了细胞在体内的生存环境，并优化了培养体系，突破了常规细胞培养的缺陷与不足，最终由细胞产生了微小的三维结构，为组织工程领域开拓了新的研究领域，也为再生医学研究提供了新的思路和方法。

进一步地，可以在操作过程中通过对各种细胞进行染色，在体外随时观察各种细胞的分布情况，对肝芽的形成过程进行实时监测。

附图说明

图1为本发明实施例中iPSCs诱导形成过程中细胞形态变化示意图，其中，A：人胚胎成纤维细胞，B：病毒感染后第四天细胞形态，C：感染2周左右形成的非ES样克隆，D-F：人feeder上传代培养的典型的iPS克隆，F：iPSCs周边自发分化的克隆，A-D和F标尺为200μm，E标尺为50μm；

图2为本发明实施例iPSCs中的全能型相关基因表达检测示意图；

图3为本发明实施例iPSCs与ESCs来源的拟胚体(EB)不同分化时间点内、中、外三胚层代表基因表达示意图，其中，SOX17：内胚层，RUNX1：中胚层，PAX6：外胚层；

图4为本发明实施例iPSCs中端粒酶水平检测示意图；

图5为本发明实施例iPSCs的免疫组化分析示意图，其中，A：AKP染色，B：SSEA-3，C：SSEA-4，D：TRA-1-60，E：TRA-1-81，F：OCT4，A标尺为200μm，B-F标尺为100μm；

图6为本发明实施例iPSCs体外三胚层分化检测示意图，其中，A：B-tubulin/DAPI，B：SMA/DAPI，C：AFP/DAPI，畸胎瘤组织切片显示三胚层来源的细胞D：软骨(中胚层)；E：腺上皮细胞(内胚层)；F：色素细胞(外胚层)；

图7为本发明实施例各阶段iPSCs的形态变化情况，其中，Endoderm(内胚层)，Hepatic progenitors(肝祖细胞)，Fetal hepatocytes(胎肝样细胞)；

图8为本发明实施例AFP、ALB免疫荧光染色图；

图9为本发明实施例RT-QPCR的检测结果；

图10为本发明实施例ICG胞吞与胞吐实验；

图11为本发明实施例iPSCs来源的肝样细胞具有合成糖原的能力；

图12为本发明实施例iPSCs来源的肝样细胞具有摄取低密度脂蛋白能力；

图13为本发明实施例iPSCs来源的肝样细胞与内皮祖细胞和间充质干细胞共培养的后D0-D3天的镜检结果，其中，红色代表Rhodamine labeled Ulex EuropaeusAgglutinin I(UEA I)标记的内皮祖细胞，绿色代表Cellstain-CFSE(CFSE)标记的肝样细胞，其中，D0标尺为200μm，其他标尺均为100μm；

图14为本发明实施例iPSCs来源的肝样细胞与内皮祖细胞和间充质干细胞共培养产生的肝芽石蜡切片HE染色图，标尺为100μm；

图15为本发明实施例iPSCs来源的肝样细胞标记ALB、HNF4α的免疫荧光染色图，其中绿色标记的是ALB，定位在胞浆，红色标记的是HNF4α，定位在细胞核，标尺为50μm。

具体实施方式

以下主要结合附图及具体实施例对本发明中在体外制备肝芽的细胞共培养方法作进一步详细的说明。

一实施方式的在体外诱导肝芽的细胞共培养方法，包括如下步骤：

步骤S110，提供或制备诱导性多能干细胞。

在本实施方式中，诱导性多能干细胞优选采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，如导入至成纤维细胞等，诱导人类细胞分化为诱导性多能干细胞。其中，诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。成纤维细胞可以为离体的成人、婴儿或胎儿的皮肤成纤维细胞等。可理解，在其他实施方式中，诱导性多能干细胞不限于由人类皮肤成纤维细胞分化得到，也可以采用其他的人类细胞构建得到。

步骤S120，将诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基，使诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化。

在步骤S120中，使用添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基(即在RPMI-1640基础培养基的基础上添加人活化素A和Wnt3a，以下同理)培养22～50小时后，更换使用添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基培养46-98小时，并且在后续培养过程中每22-26小时更换一次培养基。在本实施方式中，添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中人活化素A的浓度为5-300ng/ml，优选100ng/ml，Wnt3a的浓度为20-100ng/ml，优选25ng/ml。添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基中人活化素A的浓度为10-200ng/ml，胎牛血清的体积浓度为0.2-2％。

进一步，在本实施方式中，在诱导性多能干细胞培养之前还包括对诱导性多能干细胞进行复苏和增殖扩大培养的步骤。其中，复苏的步骤包括：将诱导性多能干细胞从液氮罐中取出，立即于37℃恒温水浴箱中恒温解冻，离心弃上清去除二甲基亚砜，加入ES培养基重悬细胞沉淀，将其种植到准备好的小鼠胚胎成纤维饲养层细胞上，每天换液一次，每周传代一次。增殖扩大培养的步骤包括：在检测确定无支原体、细菌污染后，选取长势良好的诱导性多能干细胞克隆，手工切割传代至预先包被好Matrigel胶的培养皿中培养，在mTeSR培养体系中培养细胞约2-4天后，换用鼠成纤维细胞条件培养基培养一天后更换诱导培养基(即添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基)。

步骤S130，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化。

在步骤S130中，使用添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基培养22-98小时后，再使用添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基培养118-170小时，并且在培养过程中，每隔22-26小时更换一次相应的培养基。进一步，在本实施方式中，添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中角质细胞生长因子的浓度为15-100ng/ml，胎牛血清的体积浓度为2-3％。添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基中血清替代物的体积浓度为20％，L-谷氨酰胺的浓度为1-3mM，非必需氨基酸的质量浓度为0.1-15％，β-巯基乙醇的浓度为0.1-0.12mM，二甲基亚砜的体积浓度为0.2-2％。

步骤S140，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。

在步骤S140中，培养周期为142-242小时，且每隔22-26小时更换一次培养基。进一步，在本实施方式中，添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中胎牛血清的体积浓度为10％，肝细胞生长因子的浓度为10-300ng/ml，抑瘤素的浓度为1-150ng/ml，地塞米松的浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。

步骤S150，准备所需的诱导的肝样细胞(即上述步骤S140所得的肝样细胞)、内皮祖细胞和间充质干细胞，对诱导的肝样细胞和内皮祖细胞进行染色，并将三种细胞按比例混合。

在步骤S150中，用胰蛋白酶消化并收集肝样细胞，计数约4.3×10⁵～1.7×10⁶个细胞，用TrypLE酶消化并收集内皮祖细胞，计数约3×10⁵～1.6×10⁶个细胞，分别重悬于0.4ml添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，待用；用胰蛋白酶消化并收集间充质干细胞，计数约1.6×10⁵～1.2×10⁶个细胞，重悬于0.2ml添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，待用。使用Cellstain-CFSE(CFSE)对HPLCs进行染色，使用Rhodamine labeled Ulex Europaeus Agglutinin I(UEA I)对EPCs进行染色，均在避光条件下进行。将上述三种细胞悬液依照肝样细胞的细胞数量：内皮祖细胞的细胞数量：间充质干细胞的细胞数量＝1：0.5～1.5：0.3～1的比例轻柔混合，得混合细胞悬液，混合细胞悬液中混合细胞总数约为1.5×10⁶～3×10⁶个/ml，即5×10⁵～1×10⁶个/cm²。

优选地，在步骤S150中，用胰蛋白酶消化并收集肝样细胞，计数约5.8×10⁵～1.4×10⁶个细胞，用TrypLE酶消化并收集内皮祖细胞，计数约5×10⁵～1.3×10⁶个细胞，分别重悬于0.4ml添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，待用；用胰蛋白酶消化并收集间充质干细胞，计数约2.5×10⁵～7.5×10⁵个细胞，重悬于0.2ml添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，待用。将上述三种细胞悬液依照肝样细胞的细胞数量：内皮祖细胞的细胞数量：间充质干细胞的细胞数量＝1：0.8～1：0.4～0.6的比例轻柔混合，得混合细胞悬液，混合细胞悬液中混合细胞总数约为1.5×10⁶～3×10⁶个/ml，即5×10⁵～1×10⁶个/cm²。

在步骤S150中，添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中胎牛血清的体积浓度为10％，地塞米松的浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。

步骤S160，将步骤S150所得的混合细胞悬液均匀的种植在准备好的培养皿进行培养。体外观察在肝芽形成过程中各种细胞的分布情况，动态监测肝芽形成。

在步骤S160中，将步骤S150所得的混合细胞悬液均匀的种植在准备好的底面积为2.89cm²的中央孔器官培养皿，并于37℃，5％CO₂条件下培养，每24小时换液，观察。培养时间为3～7天。优选地，为3～5天。

本发明在诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝样细胞的基础上，将诱导性多能干细胞来源的肝样细胞与内皮祖细胞以及脐带间充质干细胞按比例共培养在体外形成肝芽。这种共培养方法尽可能地模拟了细胞在体内的生存环境，并且在操作过程中通过对各种细胞进行染色，在体外随时观察各种细胞的分布情况，对肝芽的形成过程进行实时监测。

以下为具体实施例部分：

一、所用到的试剂及其设备

1.iPSCs(诱导性多能干细胞)：选择人类干细胞国家工程研究中心建系的2系人类诱导多能干细胞。

2.EPCs(内皮祖细胞)：由人脐带血梯度离心获得EPCs，该实验样品来自于湘雅医院，本实施例的研究通过了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了婴儿亲属的同意。

3.MSCs(间充质干细胞)：由人脐带组织消化获得MSCs，该实验样品来自于湘雅医院，本实施例的研究通过了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了婴儿亲属的同意。

4.细胞培养试剂：

人活化素A(R&D，338-AC-050，即R&DSystems公司，货号338-AC-050，以下同理)，Wnt3a(R&D，1324-WN-010)，胎牛血清(Life，10099141)，角质细胞生长因子(KGF)(R&D，251-KG-050)，血清替代物(Life，N10828-028)，L-谷氨酰胺(Gibco，25030-081)，非必需氨基酸(Gibco，1140-050)，β-巯基乙醇(Gibco，21985023)，二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，D2650)，肝细胞生长因子(HGF)(R&D，294-HG-025)，抑瘤素(OSM)(R&D，295-OM-050)，地塞米松(Calbiochem，265005)，bFGF(Life，13256029)，mTeSR(Stem cell，05850)，RPMI-1640(Life，11875-085)，KO/DMEM(Life，10829-018)，L-15(Life，21083-027)，Matrigel胶(BD，354234)，EGM-2(lonza，cc-3162)，胰蛋白酶(Gibco，25300062)，TrypLE(Gibco，12605-028)，HistoGel(Thermo，HG-4000-012)，I型胶原酶(Sigma，C0130)，透明质酸酶(Sigma，H3506)，中性蛋白酶(Gibco，17105-041)，人纤维连接蛋白(MILLIPORE，FC010L)。

二、具体的制备及其鉴定过程

(一)iPSCs细胞系的建系

实验对象：分离得到的8～10周流产胎儿的皮肤成纤维细胞，该实验样品来自于湘雅医院，本实施例的研究通过了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了流产胎儿亲人的同意。可理解，在其他实施例中，该皮肤成纤维细胞或者其他人类细胞样本也可以取自一些样本冻存库或者治疗机构等。

采用慢病毒感染的方法将OCT4、SOX2、NANOG及Lin28四种诱导因子导入成纤维细胞获得iPSCs。具体过程如下：

将pOCT4、pSOX2、pNANOG、pLin28四个慢病毒质粒(质粒由湖南光琇高新生命科技有限公司克隆制备)分别与慢病毒包装质粒pCMV8.91、pCMV-VSVG混合，加入培养中的293T细胞中，48小时后收取细胞上清，上清中即含有可用于感染的慢病毒颗粒。

如图1所示，将上述4种慢病毒颗粒按照1:1:1:1比例混合后加入培养中的皮肤成纤维细胞中(图1A)，感染4天后开始有hESCs样细胞出现，但未形成克隆(图1B)，大约两周后有小克隆出现，部分克隆形态与hESCs克隆不同(图1C)，部分克隆呈现典型的hESCs样，传代扩增可维持hESCs克隆样的形态(图1D-F)。从1×10⁵的hEF中大约有大于30个典型hESCs样克隆生长。经重复实验检测iPSCs的形成效率约为10^-5～-4。在人feeder上培养的hESCs样的克隆，细胞紧密，核质比大，与ESCs相似(图1D-F)。培养过程中同时可观察到iPSCs克隆周边出现自发分化(图1F)。这些克隆与hESCs相似，即为iPSCs。从本株成纤维细胞共分离了16个iPSCs克隆，对其中iPSCs-#2及iPSCs-#5进行了细致的检测。检测到与人类胚胎干细胞特性相同的克隆即为iPSCs，可用于下一步实验。具体检测如下：

1.1多能性相关基因以及拟胚体(EB)分化基因的检测

收集未分化ESCs、iPSCs和EB分化不同时间点的细胞，抽提RNA进行全能性相关基因或分化基因的检测。方法如下：

1)RNA抽提：

收集相应的细胞，加1ml的TRIZOL，裂解细胞。每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿，在室温下孵育2-3分钟。在4℃下12，000g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层，RNA存在于水样层当中。将水样层转移到一干净的试管中。加入0.5ml异丙醇充分混合。将混合的样品在室温下孵育10分钟并在4℃下以不超过12，000g的离心力高速冷冻离心10分钟。移去上层悬液。用75v/v％(即乙醇的体积分数为75％，以下同理)的乙醇洗涤RNA沉淀一次，在2～8℃下以不超过7，500g的离心力高速冷冻离心5分钟。简单干燥RNA沉淀(空气干燥5-10分钟)。用无RNA酶的DEPC水溶解，完全溶解后紫外分光光度计检测RNA浓度。

2)逆转录(RT)合成cDNA：

采用A RevertAid^TM first strand cDNA synthesis kit(Fermentas LifeSciences)，参照说明书进行，具体步骤如下：取1μg总RNA，oligo(d T)primer 1μl，加入RNase-free水使终反应体积12μl于EP管中，70℃变性5分钟，冰上迅速冷却。然后依次加入5×逆转录反应缓冲液4μl，10mM dNTP 2μl，RNA酶抑制剂1μl，轻轻混匀，快速离心，25℃处理5分钟，加AMV逆转录酶1μl，终反应体积20μl，25℃10分钟；42℃60分钟，70℃10分钟，4℃冷却。所得cDNA放置-20℃保存或继续进行PCR扩增目的基因。

以RNA为模板，常用的β-actin引物进行PCR扩增，确定无gDNA的污染。

再以cDNA为模板进行RT-PCR，以检测其中多能性相关基因OCT3/4、NANOG、REX-1、SOX2、THY1、TDGF1、TERF1、LEFTB、DPPA2和FGF4的表达或三胚层分化代表基因(外胚层：Pax6，中胚层：Runx1，内胚层：Sox17)，β-actin为反应体系阳性对照。PCR反应条件：95℃1分30秒；30个循环(94℃40秒，54℃-64℃40秒，72℃40秒)；72℃延伸7分钟。

如图2A所示，RT-PCR显示iPSCs细胞表达很多未分化的ES细胞标记基因，如OCT3/4，SOX2，NANOG，reduced expression 1(REX1)，fibroblast growth factor 4(FGF4)，developmental pluripotency-associated 2(DPPA2)，and telomerase reversetranscriptase(hTERT)等，与hESCs表达水平相似。

如图2B所示，采用针对内外源OCT4、NANOG表达的引物检测显示iPSCs细胞中存在内源性的OCT4、NANOG的表达，可见iPSCs中总的OCT4、NANOG的表达水平与内源表达水平相当。

如图3所示，iPSCs体外自发分化实验显示，与ESCs一样，iPSCs体外自发分化而成的EB有内、中、外三个胚层的代表性基因表达，说明iPSCs与ESCs一样具有多能性。

1.2端粒酶分析

收集未分化iPSCs，使用TRAPeze Telomerase detection kit(Chemicon)试剂盒，按照说明进行端粒酶检测。多能性细胞中hTERT是高表达的，如图4所示，本实施例检测也发现人iPSCs也高表达端粒酶活性。

1.3AKP染色及免疫荧光染色

1)AKP染色：

采用Fast Red Substrate Pack(Zymed Laboratories)试剂盒和AKP试剂盒(invitrogen)按照相应的说明书进行AKP染色。

(1)将培养的ESCs尽量去除残余培养基；

(2)加入PBS洗涤两次，去除PBS；

(3)加入4℃预冷的4wt％(即质量浓度，以下同理)多聚甲醛固定ESCs克隆，置室温固定15～20分钟；

(4)取出固定细胞，采用双蒸水洗涤2次；

(5)按照试剂盒说明，新鲜配置的染液染色，加入染液染色；

(6)室温下一般染色10分钟；

(7)当染色满意时，用蒸馏水洗涤3次；

(8)显微镜下观察并摄像。

2)免疫荧光染色

多聚甲醛固定未分化的iPSCs克隆，作多能性干细胞抗原染色，包括：OCT4、SSEA-3、SSEA-4和TRA-1-60、TRA-1-81；多聚甲醛固定EB贴壁后的细胞进行三胚层特异性标记染色，包括：AFP(内胚层)、β-tubulin(外胚层)、SMA(中胚层)。具体方法如下：

免疫荧光染色步骤：

(1)加4wt％的多聚甲醛溶液室温下固定检测细胞15分钟，加PBS清洗3遍；

(2)胞内和核内染色用0.1v/v％的triton-X-100透膜10分钟(胞膜抗原染色省略此步)；

(3)加封闭液即10v/v％驴或山羊血清(与二抗来源一致)处理45分钟，加PBS清洗3遍；

(4)按比例加入相应一抗，4℃孵育过夜，加PBS清洗3遍；

(5)加荧光二抗室温避光孵育1小时，用PBS清洗3遍；

(6)加DAPI染核，室温避光孵育5分钟，用PBS清洗2遍；

(7)荧光显微镜下观察结果。

1.4iPSCs体内体外分化能力

为检测iPSCs的体外分化能力，本实施例采用悬浮培养法形成EB。体式镜下将iPSCs克隆切割至合适大小(比传代克隆团块稍大)，用TIP头轻轻将克隆团块铲下，将克隆块摇至培养皿中央，转移至加有4ml EB培养基的60mm的细菌培养皿(petri dish)中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。隔天换液。换液时用1ml的tip头对EB轻轻吹吸，去除EB表面的死细胞，将EB团块摇至皿中央，转移至加有新鲜EB培养基的细菌培养皿(Petri dish)中。悬浮培养10天后，将EBs转移至FBS包被的24孔板中。如图5所示，用相同的培养基继续贴壁培养1周后进行免疫细胞荧光染色，免疫细胞化学检测发现β-tubulin(外胚层)，SMA(中胚层)，AFP(内胚层)呈阳性。为检测iPSCs的体内分化能力，收集未分化iPSCs克隆，约1～2×10⁶细胞，注射入6～8周龄雄性SCID小鼠的后肢肌肉中，观察畸胎瘤的形成情况。如图6所示，8～12周后取出肿瘤，常规石腊包埋切片后，HE染色后可见内中外三胚层组织结构形成。

(二)iPSCs细胞来源的肝脏细胞定向分化培养

1.iPSCs细胞的复苏：从液氮罐取出细胞，立即于37℃恒温水浴箱中恒温解冻，离心弃上清去除二甲基亚砜，加入ES培养基重悬细胞沉淀，将其种植到准备好的小鼠胚胎成纤维饲养层细胞(feeder)上，每天换液一次，每周传代一次。

2.iPSCs细胞的培养：检测确定无支原体、细菌污染后，选取长势良好的iPSCs细胞克隆，手工切割传代至新的饲养层细胞上，传代后的细胞，每24h小时换液一次，每天观察细胞的生长状况。

3.iPSCs细胞的诱导分化：待iPSCs细胞在Feeder上处于生长状态最佳时，将细胞手工切割传代至预先包被好Matrigel胶的培养皿中培养。在mTeSR培养体系培养细胞2-4天，换用鼠成纤维细胞条件培养基培养一天之后更换诱导培养基。具体诱导过程如下：

第一阶段(共3-6天)为iPSCs细胞向限定性内胚层诱导：第1-2天的诱导培养基为向基础培养基RPMI-1640中添加人活化素A和Wnt3a，其中人活化素A和Wnt3a的使用浓度分别为5-300ng/ml和20-100ng/ml，优选浓度分别为100ng/ml和25ng/ml；第3-6天的诱导培养基为向基础培养基RPMI-1640中添加人活化素A和胎牛血清，每22～26小时更换一次培养基，添加有人活化素A和胎牛血清的RPTM-1640培养基中人活化素A的浓度为10-200ng/ml，胎牛血清的体积浓度为0.2-2％。诱导前几天的死细胞较多，为了避免死细胞影响诱导过程的进行，在进行更换培养基时尽量吸净培养基并且用RPIM-1640清洗一至两遍，再更换培养基。

第二阶段(共6-12天)为向肝系定向分化：第二阶段第1-4天所用的培养基为向基础培养基KO/DMEM中添加15-100ng/ml角质细胞生长因子和终浓度为2-3％的胎牛血清。在第二阶段的培养过程中，细胞数量较之前几天有较大的改变，此时应根据细胞的数量酌情添加培养基，以保证细胞的正常生长；此后5-7天的培养基为向基础培养基KO/DMEM添加血清替代物(SR)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜，每22～26小时更换一次培养基，其中血清替代物的终浓度为20％，L-谷氨酰胺的终浓度为1-3mM，非必需氨基酸的终浓度为0.1％-15％，β-巯基乙醇的终浓度为0.1-0.12mM，二甲基亚砜的终浓度为0.2-2％。

第三个阶段(共6-10天)为促进肝细胞成熟阶段：培养基为向基础培养基L-15中添加牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松、L-谷氨酰胺，每22～26小时更换一次培养基，其中胎牛血清的终浓度为10％，肝细胞生长因子的终浓度为10-300ng/ml，抑瘤素的终浓度为5-150ng/ml，地塞米松的终浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的终浓度为2-3mM。

整个诱导过程历时15-28天。

(三)肝样细胞的鉴定

1.细胞诱导过程分化情况的观察：从诱导的第一天开始，每天在显微镜下观察细胞的生长状态、贴壁情况、分化状况，如图7所示，iPS细胞核质比高，细胞排列紧密，呈不规则球形集落生长。诱导开始后细胞开始发生形态学改变，诱导第一阶段的细胞进入内胚层(Endoderm)阶段，细胞变得扁平呈卵圆形；进入第二阶段诱导后细胞开始进入肝细胞特化阶段，细胞逐渐变成边界明显的多角形，诱导成肝祖细胞(Hepatic progenitors)；第三阶段细胞开始进入肝脏细胞成熟阶段，细胞集落更加致密，细胞体积增大，呈立方体，胞浆丰富，具有一个或多个细胞核，核仁明显，呈胎肝样细胞(Fetal hepatocytes)，培养得到的细胞与肝实质细胞更为趋近。

2.免疫荧光检测AFP、ALB的表达:将细胞在室温下用4wt％(即质量浓度，以下同理)多聚甲醛固定15分钟，然后0.2v/v％的Triton-X 100渗透15分钟，用4v/v％正常山羊血清封闭1小时，一抗稀释于封闭液，在4℃下孵育一抗过夜。室温孵育二抗一小时。加入DAPI复染5分钟。于荧光显微镜下观察，发现AFP、ALB呈阳性，结果如图8所示。

3.RT-QPCR：收集每个诱导阶段最后一天的细胞进行检测，TRIZOL溶解抽提RNA。根据操作说明应用逆转录试剂盒进行逆转录，每个样品含有1μg的RNA。PCR反应体系包括0.2μl的cDNA，10μl的PCR Green Mix，7.8μl水，1μM的正反向引物各1μl，验证引物对的序列分别见SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24及SEQ ID NO.25-26。循环进行如下：95℃5分钟，然后45个循环的95℃10秒，58℃10秒，72℃10秒，结果如图9所示。

4.iPSCs细胞来源的肝样细胞吸收和释放ICG检测：将ICG溶解在二甲基亚砜中，浓度为5mg/ml，然后用分化培养基稀释至终浓度为1mg/ml。在细胞诱导的第20天，将细胞在含有ICG的培养基中常规培养90分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗后，通过显微镜观察记录细胞的ICG的吸收情况，发现细胞中明显含有靛青绿染料，然后换成普通培养基培养6个小时以上，检测ICG的释放情况，显微镜下观察细胞恢复无色状态，结果如图10所示。

5.高碘酸-雪夫氏反应检测糖原的合成：将诱导20天的肝样细胞用4wt％多聚甲醛和1v/v％的Triton X100处理，然后按照高碘酸-雪夫氏染色系统(Sigma-Aldrich公司，匹兹堡，USA)的说明书进行染色，观察可见大多数的细胞被染色为紫红色，其他细胞淡染或未染色，如图11所示，表明大多数细胞具有较强的糖原合成和存储能力。

6.低密度脂蛋白摄取实验：将肝样细胞在含10μg/ml Alexa-Flour 488-labeledLDL的无血清培养基中培养3至4个小时。然后用DAPI复染，荧光显微镜下观察荧光，可见多数细胞内可见标记荧光的LDL绿色颗粒，如图12所示。

(四)内皮祖细胞的制备

1.取新鲜脐带血6ml，加入等体积DPBS稀释；

2.在离心管底部加入淋巴细胞分离液10ml，再加入等体积的稀释血，水平离心机1500rpm离心(加减速度均为0)15分钟；

3.去掉上层血浆和DPBS层，抽取中间的白膜相层(单个核细胞层)，加入3倍体积的上述DPBS洗涤，充分混匀后，1800rpm(加减速度均为9)离心10分钟；

4.弃上清，加入等体积的DPBS洗涤，1200rpm(加减速度均为9)离心5分钟；

5.弃上清，用含有VEGF的EGM-2(lonza)培养液重悬细胞并计数；

6.吸取50μl细胞悬液，加950μl 4v/v％的醋酸，按5×10⁶/cm²的密度接种于准备好的培养皿(人纤维素连结素2ug/cm²于37℃铺皿30分钟)中，隔天换液，观察。

(五)间充质干细胞的制备

人脐带取自湘雅附三医院签署知情同意书的足月健康产妇。无菌条件下将脐带内的静脉和动脉剥离。将脐带剪成约2cm长的组织块，加入消化液(由I型胶原酶、透明质酸酶和中性蛋白酶混合而成)，消化过夜。终止消化后，弃未消化的组织块，收集细胞悬液，离心，生理盐水洗涤，将细胞重悬并培养在MSC培养体系(添加有10v/v％FBS与bFGF的D/F-12培养基)中，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

(六)共培养制备肝芽

1.准备诱导获得的肝样细胞：用胰蛋白酶消化诱导获得的肝样细胞，收集细胞后，计数5.8×10⁵～1.4×10⁶个细胞，重悬于0.4ml添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，待用。

2.准备内皮祖细胞：用TrypLE酶消化贴壁培养的EPCs，收集细胞后，计数5×10⁵～1.3×10⁶个细胞，重悬于0.4ml添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，待用。

3.准备脐带间充质干细胞：用胰蛋白酶消化MSCs，收集细胞后，计数2.5×10⁵～7.5×10⁵个细胞，重悬于0.2ml添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，待用。

1、2、3中所述添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中胎牛血清的体积浓度为10％，地塞米松的浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。

4.将上述诱导的肝细胞和内皮祖细胞进行染色，可体外观察在肝芽形成过程中各种细胞的分布情况，动态监测肝芽形成。

在上述过程中，采用Rhodamine labeled Ulex Europaeus Agglutinin I(UEA I)试剂(Vector laboratories)盒和Cellstain-CFSE(CFSE)试剂盒(Dojindo)并按照相应的说明书分别对EPCs和HPLCs进行染色。

1)利用Rhodamine labeled Ulex Europaeus Agglutinin I(UEA I)标记EPCs的方法：

(1)用TrypLE酶消化EPCs；

(2)用2ml DPBS将消化后的细胞洗涤一次；

(3)将收集的EPCs悬于Rhodamine labeled Ulex Europaeus Agglutinin I(UEAI)染液中(染液浓度为2.5μl/ml)；

(4)室温下避光染色30分钟后，用DPBS洗涤两次；

(5)将细胞重悬于培养基中。

2)利用Cellstain-CFSE(CFSE)标记HPLCs的方法：

(1)用胰蛋白酶消化HPLCs；

(2)用含有5％FBS的DPBS将消化后的细胞洗涤一次；

(3)将收集的HPLCs重悬于lml含有5％FBS的DPBS中；

(4)加入2ul Cellstain-CFSE(CFSE)，迅速加盖混匀，直立，室温静置5分钟；

(5)用10ml含有5％FBS的DPBS中和，1500rpm离心5分钟；

(6)弃上清，用10ml含有5％FBS的DPBS再洗一次；

(7)将细胞重悬于培养基中。

5.将收集到的三种细胞悬液HPLCs、EPCs和MSCs分别计数5.8×10⁵～1.4×10⁶、5×10⁵～1.3×10⁶、2.5×10⁵～7.5×10⁵(即按照肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量＝1：0.8～1：0.4～0.6)轻柔混合，得混合细胞悬液(混合细胞悬液中混合细胞总数约为1.5×10⁶～3×10⁶个/ml，即5×10⁵～1×10⁶个/cm²)，均匀的种植在准备好的底面积为2.89cm²的培养皿，于37℃，5％CO₂的饱和湿度条件下培养，每24小时换液，观察。

(七)肝芽的鉴定

1.观察肝芽形成过程中各种细胞的分布情况：从共培养的第一天开始，每天在显微镜下观察细胞的生长状态，通过Rhodamine labeled Ulex Europaeus Agglutinin I(UEA I)和Cellstain-CFSE(CFSE)对EPCs和HPLCs的标记，在体外观察肝芽形成过程中每种细胞的分布情况，很快可见三种细胞开始自主凝集成肉眼可见的立体细胞团。大约3-5天左右，可见培养皿中的细胞团自组装成微小的三维结构，D0-D3天的镜下观察结果如图13所示，其中绿色代表Cellstain-CFSE(CFSE)标记的肝样细胞，红色代表Rhodamine labeledUlex Europaeus Agglutinin I(UEA I)标记的内皮祖细胞，MERGE表示Cellstain-CFSE(CFSE)标记的肝样细胞及Rhodamine labeled Ulex Europaeus Agglutinin I(UEA I)标记的内皮祖细胞染色的叠加图。

2.HE染色：

将肝芽组织于4wt％多聚甲醛中固定，按常规方法进行石蜡包埋、切片，并进行HE染色，可见其中有肝细胞分布，结果如图14所示。

1)石蜡包埋步骤：

(1)固定：收集肝芽到1.5mL的EP管中，4wt％多聚甲醛固定1h，DPBS洗两次；

(2)预包埋：加入适量熔解(60℃的水浴)好的HistoGel(Thermo公司)重悬，并调整肝芽的位置，室温或4℃放置至HistoGel凝固，用2mL的装有70％乙醇的注射器，向EP管底部注入70％乙醇使胶块浮起来，取出胶块并转移至包埋夹盒中；

(3)脱水：样品在70％乙醇、80％乙醇和90％乙醇中各1小时，无水酒精I和无水乙醇II，各40分钟；

(4)透明：乙醇和二甲苯1：1(v/v)混合液中浸泡组织30分钟，二甲苯I中浸泡30分钟，二甲苯II中浸泡30分钟；

(5)浸蜡：62℃的石蜡和二甲苯1：1(v/v)混合液中浸泡1小时，石蜡I、石蜡II中各浸泡1小时；

(6)包埋：将浸好蜡的含有肝芽的HistoGel胶块放入预热的包埋盒中摆好位置，迅速倒入适量石蜡，做好标记。

2)组织切片步骤：

(1)用刀片刮掉蜡块边缘的蜡，放入-20℃冰箱30分钟；

(2)手术盒中倒入半盒双蒸水，温台中倒满双蒸水，打开开关，待其加热；

(3)将修好的蜡块装在切片机的夹物台上并固定，加酒精到手术台盒；

(4)开始切片，先切到最大面，调整精细玻片厚度为0.1μm，待切到组织最大面时，刀片换一个位置，并调节切片厚度为0.05μm，切片，轻吹成蜡带放入手术盒中，轻贴于玻片上，在转入温台的水中，待其延展，再次贴到玻片上；

(5)烤片：将贴好的切片在室温下稍微干燥后，放在40℃恒温烤箱中12小时，烤干备用。

3)HE染色步骤：

(1)脱蜡：依次将玻片在二甲苯I中浸泡20分钟，二甲苯II和二甲苯III中10分钟；

(2)复水：依次将玻片浸泡于无水乙醇I中10分钟，无水乙醇II、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、蒸馏水中各5分钟；

(3)染色：将玻片浸入苏木素染液中染色5分钟，自来水冲洗30s，移入0.5％的盐酸酒精中5s，流水冲洗1分钟，将切片浸入温水中2分钟，伊红染液中浸泡2分钟；

(4)脱水透明：依次将玻片浸泡于95％乙醇I、95％乙醇II、无水乙醇I、无水乙醇II中30s，二甲苯中浸泡5分钟；

封片：用中性树脂封片，晾干后显微镜下观察、拍照。

3.免疫荧光染色：

使用石蜡切片做免疫荧光，进行肝细胞特异性标记染色，包括ALB、HNF4α等，由此检测“肝芽”肝细胞相关标记的表达情况，免疫细胞化学检测发现ALB、HNF4α呈阳性，结果如图15所示(其中DAPI表示4',6-二脒基-2-苯基吲哚细胞核特异性染料，ALB表示血清白蛋白，HNF4α表示肝细胞核因子4α，MERGE表示ALB、HNF4α与DAPI荧光染色的叠加图)。具体方法如下：

(1)石蜡组织切片常规脱蜡，经梯度酒精入水(同HE染色步骤1、2)；

(2)1×PBS洗3次，每次5分钟；

(3)抗原修复：PH 6.0的柠檬酸缓冲液微波炉高温煮沸5分钟，放入玻片后高温煮沸25分钟，室温放置，待其冷却；

(4)1×PBS洗3次，每次5分钟；

(5)加封闭液即5％(v/v)牛血清白蛋白或山羊血清(与二抗来源一致)室温封闭1小时；

(6)弃掉封闭液，加入按比例稀释的相应一抗(封闭液稀释)，4℃孵育过夜(16-18小时)；

(7)1×PBS漂洗3次，每次10分钟；

(8)加入按比例稀释的相应荧光二抗(封闭液稀释)，室温孵育1小时；

(9)1×PBS漂洗3次，每次10分钟；

(10)加DAPI染核，室温避光孵育5分钟，用1×PBS清洗2遍；

(11)荧光显微镜下观察结果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将肝样细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞分别消化、重悬于培养基中，按肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.8～1：0.4～0.6混合，得混合细胞悬液；所述肝样细胞为采用诱导性多能干细胞定向诱导分化而成；

在所述步骤(1)中的所述肝样细胞由诱导性多能干细胞定向诱导分化而成的具体步骤如下：

步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；

步骤S2，将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；

步骤S3，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；

步骤S4，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟；

(2)将所述混合细胞悬液均匀种植在培养皿进行培养3～7天至肝芽形成。

2.根据权利要求1所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，所述混合细胞悬液中的混合细胞总数为5×10⁵～1×10⁶个/cm²。

3.根据权利要求1所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养基为添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基。

4.根据权利要求3所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中胎牛血清的体积浓度为10％，地塞米松的浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。

5.根据权利要求1～4任一项所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，还包括使用Cellstain-CFSE对重悬后的所述肝样细胞进行染色，以及使用Rhodamine labeled Ulex Europaeus Agglutinin I对重悬后的内皮祖细胞进行染色，均在避光条件下进行。

6.根据权利要求1所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，在所述步骤S1中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化为诱导性多能干细胞；所述诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。