CN106344575B

CN106344575B - 生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN106344575B
Application number: CN201610689511.8A
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 吴秀; 苏真真; 曹亮; 王振中; 丁岗; 胡晗绯
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2036-08-16
Also published as: CN106344575A

Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用。所述生物碱类化合物具体为乌苏里啶和乌苏里啶酮，可通过化学合成制备或从天然产物中分离纯化获得。通过实验证明生物碱类化合物对肠道病毒、单纯疱疹病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率、抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症。因此，可应用于制备治疗病毒性疾病的药物。所述治疗病毒性疾病包括所述生物碱类化合物，以及药学上可以接受的载体；所述治疗病毒性疾病临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药剂型。

Description

生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用。

背景技术

手足口病(HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播，以婴幼儿发病为主。手足口病主要由RNA病毒科肠道病毒属柯萨奇病毒A16型(CoxA 16)及肠道病毒71型(EV 71)感染引起，以71型病毒最为严重。HFMD主要表现为发热伴肌阵挛、口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹，严重可引起脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、急性迟缓性瘫痪等多种与神经系统相关的疾病，危害严重。目前，尽管针对EV71病毒的疫苗已经获批上市，但仍没有直接靶向病毒的药物，临床主要采取对症治疗的策略；而广谱抗病毒药物利巴韦林在应用于婴幼儿时有致畸和抑制生长发育的风险。

单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒属α疱疹病毒亚科，是一种有包膜的线状双链DNA病毒，经呼吸道、口腔、眼、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体内，具有宿主变化范围大、感染部位广泛，易破坏感染细胞和潜伏感染等特点。HSV主要包括疱疹病毒1型(HSV-1)和疱疹病毒2型(HSV-2)两型，HSV-1主要感染口、眼、唇的皮肤和粘膜以及中枢神经系统，会引起皮肤单纯疱疹、唇疱疹、严重的角膜感染(角膜炎)和中枢神经系统炎症(脑炎)，HSV-1导致的脑炎如果不及时治疗可能会危及生命。HSV-2一般与外生殖器感染和新生儿感染有关，可造成生殖器疱疹，孕妇感染HSV-2易流产或造成胎儿先天畸形和智力低下，新生儿在通过产道被HSV-2感染后出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变甚至死亡。医学界近年研究表明HSV-1和HSV-2可能分别与唇癌和宫颈癌发生有关，并且HSV-2外生殖器感染已成为仅次于艾滋病病毒感染的性传播疾病，故HSV又引起了医学界新的重视。

现在临床抗HSV的首选药物为无环鸟苷，以其高效低毒被誉为抗HSV药物发展史上的里程碑，但其抗病毒谱窄，易产生耐药性且价格昂贵，使其临床应用受到很大限制。此外，疱疹净、阿糖腺苷等药物治疗HSV感染时，常出现耐药现象，均难以清除病毒潜伏。还有一些化学类药物，大都因有较强的细胞毒性或不良反应而应用较少。由于HSV的基因为双链DNA，易与宿主DNA发生整合作用，或形成潜伏状态，限制了病毒疫苗的作用。

因此，寻找一种能有效拮抗柯萨奇病毒A16型、肠道病毒EV71型和/或疱疹病毒的药物，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用。

具体技术方案如下：

式(Ⅰ)所示生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用，

其中，R为-OH或＝O。

当R为-OH，此时该生物碱类化合物(Ⅰ)为乌苏里啶；当R为＝O，此时该生物碱类化合物(Ⅰ)为乌苏里啶酮。

优选的，所述病毒为肠道病毒和/或单纯疱疹病毒。

优选的，所述肠道病毒为肠道病毒EV71型。

优选的，所述肠道病毒为柯萨奇病毒。进一步的，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。

优选的，所述单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型和/或单纯疱疹病毒2型。

在一些实施方案中，所述病毒为肠道病毒，所述式(Ⅰ)所示生物碱类化合物的活性剂量为50-200mg/kg/d。

进一步的，在一些优选实施方案中，所述病毒为柯萨奇病毒A16型和/或肠道病毒EV71型，所述式(Ⅰ)所示生物碱类化合物的活性剂量为50-200mg/kg/d。

在一些实施方案中，所述病毒为单纯疱疹病毒，所述式(Ⅰ)所示生物碱类化合物的活性剂量为30-200mg/kg/d。

进一步的，在一些优选实施方案中，所述病毒为单纯疱疹病毒1型和/或单纯疱疹病毒2型，所述式(Ⅰ)所示生物碱类化合物的活性剂量为30-200mg/kg/d。

优选的，所述药物包括所述式(Ⅰ)所示生物碱类化合物和药学上可接受的载体。

优选的，所述药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药剂型。

优选的，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂

本发明提供式(Ⅰ)所示的生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用，通过实验证明了式(Ⅰ)所示的生物碱类化合物对肠道病毒、单纯疱疹病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率，抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为生物碱类化合物(Ⅰ)化学结构式。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了式(Ⅰ)所示的生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用，所述式(Ⅰ)所示的生物碱类化合物为乌苏里啶(Ussuriedine)和乌苏里啶酮(Ussuriedinone)。

在本发明的实施例中，采用中国药品生物制品检定所提供的乌苏里啶和乌苏里啶酮。

本发明提供了式(Ⅰ)所示的生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用。其中，所述病毒为肠道病毒和/或单纯疱疹病毒。优选的，所述肠道病毒为肠道病毒EV71型。

在本发明中，所述药物包括式(Ⅰ)所示生物碱类化合物和药学上可接受的载体。在本发明中，所述药学上可接受的载体优选包括淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油中的一种或几种

在本发明中，所述药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

优选的，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。

本发明对所述包含式(Ⅰ)所示生物碱类化合物的治疗病毒性疾病药物的制备方法没有特殊的限制，按照本领域技术人员常用的制药方法即可。

本发明采用体外比色法测定乌苏里啶对EV71和CoxA16病毒感染Vero细胞的保护作用，结果表明，乌苏里啶在体外对EV71和CoxA16病毒所致细胞病变具有明显抑制作用，其EC50分别为245.23μmol/L、217.22μmol/L，SI分别为3.40、3.83。

本发明以灌胃(口服)的方式进行了乌苏里啶对肠道病毒EV71型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，乌苏里啶在剂量50mg/kg/day、100mg/kg/day、200mg/kg/day时灌胃给药5天，小鼠的存活率分别为50％、60％和90％，死亡保护率分别为44.44％、55.56％和77.78％，阳性对照药利巴韦林的小鼠存活率为70％，死亡保护率66.67％。本发明以灌胃(口服)的方式进行了乌苏里啶对柯萨奇病毒A16型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，乌苏里啶在剂量50mg/kg/day、100mg/kg/day、200mg/kg/day时灌胃给药5天，小鼠的存活率分别为40％、60％和70％，死亡保护率分别为33.33％、55.56％和66.67％，阳性对照药利巴韦林的小鼠存活率为60％，死亡保护率55.56％；乌苏里啶与阳性对照药利巴韦林的抑制效果相似，能够不同程度地缓解病毒导致的小鼠死亡，延长小鼠存活时间，并能抑制病毒导致的炎症因子释放，缓解炎症等症状。

同时，本发明采用体外比色法测定乌苏里啶酮对人疱疹病毒HSV-1和HSV-2感染细胞的保护作用。结果表明，乌苏里啶酮在体外对I型、Ⅱ型人疱疹病毒所致细胞病变具有明显抑制作用，其EC50分别为15.74μmol/L、17.58μmol/L，SI分别为9.8、8.8。

本发明分别以灌胃(口服)和外用(皮肤)给药的方式测定了乌苏里啶酮对I型人疱疹病毒所致豚鼠皮肤感染的治疗效果，结果表明，乌苏里啶酮能够明显减缓豚鼠皮肤感染症状，缩短痊愈时间。本发明还分别以灌胃(口服)和粘膜(阴道)给药的方式测定了乌苏里啶酮对Ⅱ型人疱疹病毒引起的小鼠阴道炎的治疗作用，结果表明，乌苏里啶酮对小鼠阴道炎具有明显的治疗作用，并可明显提高小鼠的存活率和平均存活日，延长生命率。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的乌苏里啶和贝乌苏里啶酮在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。如无特殊说明，以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1乌苏里啶体外抗手足口病毒活性实验

1、实验材料

柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，购于美国ATCC细胞库，由江苏康缘现代中药研究院保存。

DMEM培养基，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20141024，细胞生长液中含10％胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素、100mg/L链霉素。细胞维持液中除含2％胎牛血清外，其它同细胞生长液。乌苏里啶，由江苏康缘药业股份有限公司自制，纯度98.04％。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml:0.1g，批号：140312。

M2e型酶标仪，Molecular Devices；移液器，eppendorf公司；生物安全柜，购自Heal Force公司，型号：HFsafe-1200；二氧化碳培养箱，购自Thermo Scientific公司，型号：FormaSteri-Cycle 371。

2、实验方法

Vero细胞用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×10⁴个/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养过夜形成细胞单层。弃上清后，用PBS将细胞洗涤1次，以洗去残留的胎牛血清，加入用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释至100TCID₅₀各株病毒(EV71和CoxA16)，每孔100μl，35℃孵育2h后，弃去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培养基将乌苏里啶配制成不同浓度，分别加入单层Vero细胞中，设3个复孔，Vero细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，每日观察细胞病变现象。48h后，弃上清后，加入100μl 10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)结晶紫染色15min，酶标仪570nm测定吸光度。实验共重复3次。计算乌苏里啶对两种病毒的CC₅₀(半数毒性浓度)、EC₅₀(半数有效浓度)、SI(选择指数)。

表1乌苏里啶体外抗EV71和CoxA16病毒活性测试结果

表1结果显示，乌苏里啶在体外对EV71和CoxA16病毒所致细胞病变具有抑制作用，其EC₅₀分别为245.23μM、217.22μM，SI分别为3.40、3.83。表明乌苏里啶具备应用于抗手足口病毒(EV71和CoxA16)病毒感染治疗的体外药效学基础。

实施例2乌苏里啶对肠道病毒EV 71感染的治疗作用

1、实验材料

肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

SPF级怀孕15～16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。

利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml:0.1g，批号：140312。

2、实验方法

3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林颗粒组200mg/kg/d、乌苏里啶低剂量组50mg/kg/d，乌苏里啶中剂量组100mg/kg/d，乌苏里啶高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射EV71病毒悬液(10⁷TCID₅₀)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率，并用SPSS软件进行统计分析。计算公式如下：

表2乌苏里啶对EV71感染乳鼠感染程度的影响(n＝10)

组别	剂量(mg/kg/d)	0分	1分	2分	3分	4分	5分	P
									正常组	-	10	0	0	0	0	0	-
模型组	-	0	0	0	0	1	9	-
									利巴韦林组	100	0	3	2	1	1	3	＜0.01
高剂量组	200	0	3	3	1	1	2	＜0.01
									中剂量组	100	0	2	1	1	1	5	＜0.01
低剂量组	50	0	1	1	1	2	5	＜0.05

注：P为与模型组比

表3乌苏里啶对EV71感染乳鼠的死亡保护作用(n＝10)

注：**表示P<0.01与模型组比较

表2结果显示，乌苏里啶各剂量组灌胃给药后，可以显著减缓EV71病毒感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异。表3结果显示，乌苏里啶高、中、低剂量的死亡保护率分别为77.78％、55.56％、44.44％，生命延长率分别为79.45％、64.28％、50.32％，表明乌苏里啶各剂量组均明显减少EV71病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示乌苏里啶对手足口病毒感染具有治疗作用。

实施例3乌苏里啶对柯萨奇病毒A16型感染的治疗作用

1、实验材料

柯萨奇病毒A16型(Cox A16)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

2、实验方法

3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林颗粒组200mg/kg/d、乌苏里啶低剂量组50mg/kg/d，乌苏里啶中剂量组100mg/kg/d，乌苏里啶高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射CoxA16病毒悬液(10⁷TCID₅₀)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。

表4乌苏里啶对CoxA16感染乳鼠感染程度的影响(n＝10)

注：P为与模型组比

表5乌苏里啶对CoxA16感染乳鼠死亡保护作用的影响(n＝10)

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01与模型组比较

表4结果显示，乌苏里啶各剂量组灌胃给药后，可以显著减缓CoxA16病毒感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异。表5结果显示，乌苏里啶高、中、低剂量的死亡保护率分别为55.56％、66.67％、33.33％，生命延长率分别为74.21％、65.28％、30.11％，表明乌苏里啶各剂量组感染程度均明显减少CoxA16病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示乌苏里啶对手足口病毒感染具有治疗作用。

实施例4乌苏里啶酮对人疱疹病毒HSV-1和HSV-2感染细胞的保护作用

1、实验材料

细胞与病毒：非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，购于美国ATCC细胞库，由江苏康缘现代中药研究院保存。疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)SM44株，疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)Sav株，由中国科学院武汉病毒研究所提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

试剂：阿昔洛韦，购自湖北科益药业股份有限公司。DMEM培养基，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20141024，细胞生长液中含10％胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素、100mg/L链霉素。细胞维持液中除含2％胎牛血清外，其它同细胞生长液。

2、实验方法

(1)乌苏里啶酮对Vero细胞的毒性测定

Vero细胞用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×10⁴个/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，置37℃5％CO2培养箱中培养过夜形成细胞单层。后弃生长液，每孔加入100μl系列递比稀释浓度的乌苏里啶酮(25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)及阳性对照药物阿昔洛韦(25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)的维持液(含2％小牛血清的DMEM培养液)，每个稀释度设4个复孔，同时设立正常细胞对照。置37℃5％CO2，每天观察细胞病变，3d后每孔加入20μlMTS，于37℃培养箱中培养2h，酶标仪测490nm处的OD值。按下式计算不同浓度药物对细胞的存活率，确定半数毒性浓度CC₅₀。

细胞存活率(％)＝(实验孔OD值/对照孔OD值)×100％

(2)乌苏里啶酮对人疱疹病毒HSV-1和HSV-2的抑制作用

Vero细胞用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×10⁴个/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养过夜形成细胞单层。弃上清后，用PBS将细胞洗涤1次，以洗去残留的胎牛血清，加入不含胎牛血清的DMEM培养基稀释至100TCID₅₀HSV-1/HSV-2病毒，每孔100μl，35℃孵育2h后，弃去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培养基将乌苏里啶酮和阳性对照药物阿昔洛韦配制成不同浓度，分别加入单层Vero细胞中，设3个复孔，Vero细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，每日观察细胞病变现象。48h后，弃上清后，加入100μl10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)结晶紫染色15min，酶标仪570nm测定吸光度。实验共重复3次。计算乌苏里啶酮对两种病毒的EC₅₀(半数有效浓度)、SI(选择指数)。

病毒抑制率(％)＝[试验孔(药物+病毒)平均A570值-病毒对照孔平均A570值]/(细胞对照孔平均A570值-病毒对照孔平均A570值)×100％

SI＝CC50/EC50

表6药物对HSV-1/HSV-2的抗病毒活性

表6结果显示：乌苏里啶酮在体外对人疱疹病毒HSV-1和HSV-2所致细胞病变具有明显抑制作用，其EC₅₀分别为15.74μM、17.58μM，SI分别为9.8、8.8。表明乌苏里啶酮具备应用于抗人疱疹病毒感染治疗的体外药效学基础。

实施例5乌苏里啶酮外用给药对豚鼠皮肤I型人疱疹病毒(HSV-1)感染的治疗作用

1、实验材料

试剂：阿昔洛韦乳膏，由江苏亚邦强生药业有限公司生产。动物：Dunkin-Harthey白毛豚鼠，购自卫生部武汉生物制品研究所

病毒：疱疹病毒1型(HSV-1)SM44株，由中国科学院武汉病毒研究所提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

2、实验方法

Dunkin-Harthey白毛豚鼠，重300-350g，雄性，每天喂3次青菜及饲料。实验共用12只豚鼠，每组3只，分为4组，分组分别为阿昔洛韦组，乌苏里啶酮高剂量组、乌苏里啶酮中剂量组、乌苏里啶酮低剂量组，每只根据情况选择6个皮区建模、给药，模型组组以等量的PBS溶液(含0.1％Tween-80)代替，戊巴比妥钠麻醉后，将豚鼠背部按常规方法脱毛，清洁，消毒，用标记笔把豚鼠背部脱去皮毛部分分成4个皮区。在每个皮区的中心皮内注射10⁷PFU/ml HSV-1株病毒，每次注射0.1ml。在麻醉期间，动物饲养在30℃保温箱中2h。阿昔洛韦组中4个皮区涂阿昔洛韦，另外2个皮区涂PBS溶液(模型组)。乌苏里啶酮高剂量组、乌苏里啶酮中剂量组、乌苏里啶酮低剂量组每组4个皮区涂不同剂量的乌苏里啶酮，另外2个皮区涂PBS溶液，每次涂抹药液均为30μl阿昔洛韦，等药物干燥为止，每天抹药2次，连续给药5d。逐日观察豚鼠病变部位痊愈情况。为了定量药物的作用，按Alenius和Oberg确立的记分系统(表2)，在给豚鼠接种HSV-1病毒后，接种的区域每天按症状记分1次。疱疹发生时的记分以阿拉伯数字显示，当疱疹开始干并结痂时，记分改用罗马数字，所有记分均双盲地进行，将感染过程中所有的阿拉伯及罗马(III/II/I分别代表3/2/1分)记分数字加在一起得到累积的记分。

表7豚鼠HSV感染的计分系统

表8乌苏里啶酮外用给药对豚鼠皮肤Ⅰ型人疱疹病毒感染的治疗作用

注：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05与模型组比较

表8结果显示，豚鼠皮肤接种感染HSV-1病毒后，与涂抹溶剂的皮区相比，涂抹乌苏里啶酮的皮区的HSV感染的计分显著降低，呈现剂量依赖关系，且具有统计学差异，但涂抹乌苏里啶酮豚鼠的痊愈时间并未有明显的变化。表明乌苏里啶酮对豚鼠皮肤的HSV-1感染具有治疗作用，可以减缓感染症状，但不能缩短痊愈时间。

实施例6乌苏里啶酮口服给药对豚鼠皮肤I型人疱疹病毒(HSV-1)感染的治疗作用

1、实验材料

试剂：阿昔洛韦，购自湖北科益药业股份有限公司。动物：Dunkin-Harthey白毛豚鼠，购自卫生部武汉生物制品研究所。

2、实验方法

Dunkin-Harthey白毛豚鼠，重300-350g，雄性，每天喂3次青菜及饲料。实验共用12只豚鼠，每组3只，分为4组，分组分别为阿昔洛韦组，乌苏里啶酮高、中、低剂量组，每只根据情况选择6个皮区建模、给药。戊巴比妥钠麻醉后，将豚鼠背部按常规方法脱毛，清洁，消毒，用标记笔把豚鼠背部脱去皮毛部分分成4个皮区。在每个皮区的中心皮内注射10⁷PFU/mlHSV-1HS-1株病毒，每次注射0.1ml。在麻醉期间，动物饲养在30℃保温箱中2h。造模结束后阿昔洛韦组及乌苏里啶酮高、中、低剂量组按照表4中所述剂量进行灌胃给药，每只每次0.2ml，模型组以等量的PBS溶液(含0.1％Tween-80)代替，连续给药5d。逐日观察豚鼠病变部位痊愈情况。为了定量药物的作用，按Alenius和Oberg确立的记分系统，在给豚鼠接种HSV-1病毒后，接种的区域每天按症状记分1次。疱疹发生时的记分以阿拉伯数字显示，当疱疹开始干并结痂时，记分改用罗马数字，所有记分均双盲地进行，将感染过程中所有的阿拉伯及罗马记分数字加在一起得到累积的记分。

表9乌苏里啶酮口服给药对豚鼠皮肤Ⅰ型人疱疹病毒感染的治疗作用

注：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05与模型组比较

表9结果显示，豚鼠皮肤接种感染HSV-1病毒后，与安慰剂组的皮区相比，口服阿昔洛韦组的HSV感染的计分和痊愈天数均显著降低；类似的，与安慰剂组的皮区相比，口服乌苏里啶酮组的HSV感染的计分和痊愈天数均显著降低，呈现剂量依赖关系，且具有统计学差异，表明乌苏里啶酮对豚鼠皮肤的HSV-1感染具有治疗作用，可以减缓感染症状，缩短痊愈时间。

实施例7乌苏里啶酮粘膜给药对小鼠阴道感染Ⅱ型人疱疹病毒(HSV-2)引起的阴道炎的治疗作用

1、实验材料

试剂：阿昔洛韦乳膏，由江苏亚邦强生药业有限公司生产。

动物：BALB/c小鼠，雌性，南京市江宁区青龙山动物繁殖场。

病毒：疱疹病毒2型(HSV-2)Sav株，由中国科学院武汉病毒研究所提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。

2、实验方法

BALB/c小鼠雌性50只，按体重平均随机分为6组，正常对照组、模型组、阿昔洛韦组和乌苏里啶酮高、中、低剂量组。除正常对照组，每组小鼠用眼科镊子将吸附有病毒液0.03ml(10LD50)的明胶海绵小块送入小鼠阴道，正常对照组换用无菌PBS溶液，小鼠感染2h后各给药组分别在阴道内及外阴部涂抹阿昔洛韦乳膏或者乌苏里啶酮高、中、低剂量乳膏治疗，给药天数为10天，模型组给于涂抹乳膏基质。观察小鼠死亡数，生活日数，计算小鼠存活率、平均生活日，延长生命率。

表10乌苏里啶酮粘膜给药对Balb/c小鼠HSV-2阴道炎的治疗效果(n＝10,x±s)

注：***P<0.001，*P<0.05与模型组比较

表10结果显示，小鼠阴道接种感染HSV-2病毒后，与对照组相比，涂抹乌苏里啶酮对小鼠阴道感染HSV-2病毒引起的阴道炎均有一定的治疗作用，且呈剂量依赖关系，各剂量组均可明显提高小鼠的存活率和平均存活日，延长生命率。

实施例8乌苏里啶酮口服给药对小鼠阴道感染Ⅱ型人疱疹病毒(HSV-2)引起的阴道炎的治疗作用

1、实验材料：

阿昔洛韦，购自湖北科益药业股份有限公司。

动物：BALB/c小鼠，雌性，南京市江宁区青龙山动物繁殖场。

2、实验方法：

BALB/c小鼠雌性50只，按体重平均随机分为6组，正常对照组、模型组、阿昔洛韦组和乌苏里啶酮高、中、低给药组。除正常对照组，每组小鼠用眼科镊子将吸附有病毒液0.03ml(10LD50)的明胶海绵小块送入小鼠阴道，正常对照组换用无菌PBS溶液，小鼠感染2h后各给药组分别灌胃给予阿昔洛韦及乌苏里啶酮高、中、低剂量，给药天数为10天，模型组灌胃给予生理盐水。观察小鼠死亡数，生活日数，计算小鼠存活率、平均生活日，延长生命率。

表11乌苏里啶酮口服给药对Balb/c小鼠HSV-2阴道炎的治疗效果(n＝10,x±s)

注：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05与模型组比较

表11结果显示，小鼠阴道接种感染HSV-2病毒后，与对照组相比，口服乌苏里啶酮对小鼠阴道感染HSV-2病毒引起的阴道炎均有治疗作用，且呈剂量依赖关系，各剂量组均可明显提高小鼠的存活率和平均存活日，延长生命率。

实施例9乌苏里啶酮在制备胶囊剂药物中的应用

将350g乌苏里啶酮和32g淀粉、6g低取代羟丙基纤维素、4.5g微粉硅胶、1.5g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到乌苏里啶酮的胶囊制剂1000粒。每日3次，每次1粒。

实施例10乌苏里啶在制备颗粒剂药物中的应用

将350g乌苏里啶和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常规方法制成1000包乌苏里啶颗粒剂。每日3次，每次1粒。

实施例11乌苏里啶酮在制备片剂药物中的应用

将350g乌苏里啶酮和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉钠、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆适混合，按照常规方法制成乌苏里啶酮片剂1000片。每日3次，每次1片。

实施例12乌苏里啶在制备丸剂药物中的应用

将350g乌苏里啶和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成乌苏里啶丸剂1000粒。每日3次，每次1粒。

实施例13乌苏里啶酮在制备注射剂药物中的应用

将200g乌苏里啶酮和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成乌苏里啶酮注射剂1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL5％葡萄糖注射液稀释后静脉滴注。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.式(Ⅰ)所示生物碱类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用，

其中，R为-OH或＝O；所述病毒性疾病为手足口病或单纯疱疹病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为肠道病毒和/或单纯疱疹病毒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠道病毒为肠道病毒EV71型。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠道病毒为柯萨奇病毒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为肠道病毒，所述式(Ⅰ)所示生物碱类化合物的活性剂量为50-200mg/kg/d。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为单纯疱疹病毒，所述式(Ⅰ)所示生物碱类化合物的活性剂量为30-200mg/kg/d。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述式(Ⅰ)所示生物碱类化合物和药学上可接受的载体；

所述药物的剂型为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药剂型。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、煎膏剂、悬浮剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。