CN106344511B - 纳米六神丸溶液及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米六神丸溶液及制备方法，该纳米六神丸溶液是纳米化六神丸醇提物水包油制剂，包括高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂或低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂；本发明涉及的纳米六神丸溶液对化学毒物诱发的肝癌有较好的防治作用，纳米DEN组有4只（50％）小鼠的肝组织肉眼可见明显肿瘤结节，高剂量纳米六神丸组有3只（37.5％）小鼠的肝组织可见肿瘤结节，而低剂量纳米六神丸组小鼠肝组织肉眼未见明显肿瘤结节，且HE染色结果显示纳米DEN组中小鼠肝组织结构出现中度紊乱，而给予高、低剂量纳米六神丸溶液治疗的小鼠肝组织结构的紊乱程度较轻。

Description

纳米六神丸溶液及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种纳米六神丸溶液及制备方法。

背景技术

原发性肝癌死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌、食道癌而居第三位，且病情发展迅速，严重的危害人类的生命健康(Hepatocellular carcinoma.Recenti ProgMed，2016，107(7)：386-394)。多数肝癌患者不仅受恶性疾病的影响还要忍受慢性肝脏疾病的折磨，预后差，生活质量得不到提高(Nutrition and HepatocellularCancer.Gastrointest Tumors，2016，2(4)：188-94)。我国肝癌的发病率居世界首位，死亡人数每年约有38.3万，约占肝癌全球死亡总人数的51％(The global burden of liverdisease：the major impact of China.Hepatology，2014，60(6)：2099-108)。因此寻找防治肝癌的有效手段，一直是临床研究的关注重点。

治疗原发性肝癌有许多方面的因素需要考虑，例如肿瘤数目的多少、肿瘤体积的大小、有无肿瘤扩散，肝功能的储备能力如何，患者的年龄以及是否伴有并发症等等，现有的治疗手段可分为外科手术治疗、局部治疗和中医药治疗三种。目前临床对于原发性肝癌的首选治疗方案是手术切除，它能彻底切除病灶，但其适应症窄，对于中、晚期和肝功能差的患者不适用。肝移植是不能进行手术根治患者的唯一手段，尤其对于严重肝硬化患者有利，但患者选择标准严格，肝源短缺且又伴随着高复发和高转移的风险。局部治疗包括选择性肝动脉化疗栓塞(TACE)，局部消融治疗，放射治疗，生物治疗等方法，具有操作简便、并发症少以及重复性强等优点，但各有其局限性，选择性肝动脉化疗栓塞需要反复多次才能达到治疗目的；局部消融治疗适用范围较窄；放射疗法设备昂贵、治疗费用高；生物治疗目前看来效果好，十分有前景，但技术尚不成熟存在一些潜在的风险(原发性肝癌治疗研究新进展.实用医学杂志，2016，14：2275-2278.)。

传统中医药对于原发性肝癌的治疗“以攻补兼施、扶正祛邪为治则，以解毒化淤、滋补肝肾为治法”。虽然目前机制尚不明朗，但在提高患者的生活质量、延长患者生存期等方面许多中药制剂展示出了其潜在价值，如蟾蜍二烯羟酸内酯(Arenobufaginintercalates with DNA leading to G2 cell cycle arrest via ATM/ATR pathway，Oncotarget.2015，6(33)：34258-75)。现阶段中药制剂多是辅助临床，以中西医结合的方式来进行治疗，对于各个时期的病人均有所助益。

疼痛是一种因为组织损伤或者潜在的损伤而产生的痛苦的感觉。它是一种复杂的生理心理活动，是临床上许多疾病的常见症状之一。疼痛可作为机体的一种预警，引起机体的一系列防御性保护。但另一方面，疼痛作为报警也有其局限性(比如当癌症出现疼痛时，已为时已晚)。而某些长期的剧烈疼痛，对机体已成为一种难以忍受的折磨，患者生活质量差。目前临床上主要采用非甾体抗炎药和阿片类镇痛药治疗疼痛，虽然他们疗效显著，但是长期使用会有消化性溃疡和成瘾性等不良反应发生。因此，寻找更为高效、低毒的镇痛药已迫在眉睫。

在前期研究具有“清热解毒、软坚散结、祛瘀止痛”功能的经典方药六神丸时，发现它还具有良好的抗癌活性及镇痛作用(Involvement of substance P/neurokinin-1receptor in the analgesic and anticancer activities of minimally toxicfraction from the traditional Chinese medicine Liu-Shen-Wan in vitro.BiolPharm Bull.2014，37(3)：431-438；六神丸体外抗肝癌活性研究.中国医院药学杂志.2014，34(19)，1627-1630)。究其原因，认为六神丸的良好抗癌镇痛效果可归因于：牛黄清热解毒，消肿散结，麝香辛香行散，活血散结共为君药，以达到除癥瘕肿壅，散瘀血壅闭，疗痈痼疔毒，可解癌肿痰毒；以蟾酥解毒止痛，雄黄解毒，使得清消兼备，攻通俱施，可增消瘤解毒止痛之力为臣药；冰片、珍珠性寒，清热止痛共为方中佐使之药，使得温凉并用，镇透共行，可增强通络散滞除瘀之功。诸药合用，共奏化痰散结祛瘀，消肿通络止痛，清热解毒宁心，攻坚伐岩敛疮之功效。这些研究成果可为中药六神丸在抗肿瘤、镇痛的药理应用提供新思考和铺垫。

全球的纳米科技正在迅猛发展，纳米材料相比于传统的药物，具有更高的生物利用度、更好的溶解性、靶向性及缓控释性等，因此可以提高药效，降低不良反应，这使其在药物传输、基因治疗、癌症治疗等领域得到广泛应用(Codelivery of doxorubicin andcurcumin with lipid nanoparticles results in improved efficacy ofchemotherapy in liver cancer.International Journal of Nanomedicine，2015，10：257-270)。近年许多研究表明六神丸具有抗炎、镇痛、抗肿瘤等方面的作用(六神丸的药理研究.中国药物与临床，2011，11(8)：935-936；六神丸体外抗肝癌活性.中国医院药学，2014，34(19)：11-14)，因此设计将六神丸溶液纳米化，期望它在对于原发性肝癌治疗以及缓解疼痛方面能达到缓释、增效的作用。

发明内容

针对背景中现有技术手段治疗原发性肝癌适应症窄、风险高、治疗费用昂贵等问题，本发明提供了一种能够对化学毒物诱发的肝癌有较好的防治作用的纳米六神丸溶液及制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种纳米六神丸溶液，其特征在于：所述纳米六神丸溶液的溶质是六神丸醇提物冻干粉末。

作为优选，本发明所采用的纳米六神丸溶液是纳米化六神丸醇提物水包油制剂。

作为优选，本发明所采用的纳米六神丸溶液是高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂或低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂；所述高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中六神丸醇提物的含量不大于24.089mg·ml^-1；所述低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中六神丸醇提物的含量不大于4.818mg·ml^-1。

作为优选，本发明所采用的高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中六神丸醇提物的含量是12.045mg·ml^-1-24.089mg·ml^-1；所述低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中六神丸醇提物的含量是2.409mg·ml^-1-4.818mg·ml^-1。

一种用于制备如前所述的纳米六神丸溶液的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1)将六神丸醇提物冻干粉末以及蛋黄卵磷脂溶于麻油中，制备得到油相；所述蛋黄卵磷脂的终浓度是6％W/V；

2)将Tween 80以及甘油溶于超纯水中，制备得到水相；所述Tween 80的终浓度是1.25％V/V；所述甘油的终浓度是2.81％V/V；

3)在60℃恒温水浴的条件下，将步骤1)制备得到的油相滴入步骤2)制备得到的水相中，在1200r/min的条件下搅拌15min；所述油相与水相的体积比是1：4；

4)在10000rpm的条件下高剪切2min，最终得到粒径是100nm-200nm的乳化颗粒；

5)在1000bar的条件下高压均质6次即得到纳米化六神丸醇提物水包油制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1)研究结果表明纳米六神丸溶液对化学毒物诱发的肝癌有较好的防治作用。在实验第三十周时，模型组有50％小鼠的肝组织肉眼可见明显肿瘤结节，纳米六神丸溶液高剂量组有37.5％小鼠的肝组织可见肿瘤结节，而纳米六神丸溶液低剂量组小鼠肝组织肉眼未见明显肿瘤结节。本发明中纳米六神丸溶液防治原发性肝癌具有以下优势：①药物成本低；②药物稳定性强；③含服给药、使用方便、痛苦少；④可长期使用、效果明显、患者生活质量有所提高。

2)目前临床上治疗疼痛多是使用非甾体抗炎药和阿片受体激动剂，多以吞服或者注射的方式给药，且长期服用会产生消化性溃疡和成瘾性等副作用，效果常常不持久，患者生活质量差。实验研究表明纳米六神丸溶液能够缓解疼痛，在体内作用时间长，有缓释的作用，且副作用小，含服给药方便，患者生活质量得到很大的提高。

附图说明

图1为实施例1中纳米六神丸溶液防治肝癌实验过程中在第10、15、20、30周时各组小鼠体重变化示意图；

图2为实施例1中三十周时各组小鼠肝脏肉眼观照片；

图3为实施例1中三十周时各组小鼠肝脏HE染色图片；

图4a-图4c分别为实施例2中不同时间点注射0.6％V/V的醋酸后各组小鼠扭体次数统计图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。应理解，以下内容不应以任何方式对本发明的保护范围加以限制。

本发明的发明构思如下：

原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，发现时多处于中晚期，预后较差，目前认为与病毒性肝炎、肝硬化以及黄曲霉素、二乙基亚硝胺等化学致癌物质和环境因素有关。其病因和发病机制尚未明确，严重威胁人类的健康。治疗原发性肝癌的手段多为外科治疗、局部治疗和中医药治疗。外科治疗包括手术切除、肝移植；局部治疗包括选择性肝动脉化疗栓塞、局部消融、肝动脉介入、放射治疗、生物治疗等方法。外科或局部治疗各有其局限性，都会不可避免地对机体的正常功能产生损害，且原发性肝癌患者多有基础性肝病，随着疾病的发生发展，大多数患者在发现时已属中晚期，多伴有肝功能的异常，无法接受根治性手术治疗。中医对于肝癌的治疗强调整体调治、调节平衡、扶正祛邪，在改善症状、缓解痛苦、控制复发转移、延长生存期等方面都展现出潜在的价值，可以弥补西医的许多不足，因此越来越受到医生和患者的重视。

中医认为原发性肝癌属于“癥瘕、臌胀、积聚、积证、肥气、痃癖”等病范畴，是因为七情郁结、阴阳失调、脏腑受损等原因导致脾脏功能失调，津液气血运行失衡，产生痰凝、气滞、热毒、湿浊等病理变化，蕴结于脏腑，相互博弈，长期淤积而成的一类恶性疾病(中医药治疗原发性肝癌的研究进展.临床肝胆病杂志，2016，32(1)：174-177)。六神丸含有麝香、蟾酥、冰片、雄黄、珍珠、牛黄六味药，为经典的中药名方，具有清热解毒、消肿解散的功效，对咽喉肿痛、痈疽疮疖、无名肿毒等有较好的疗效。近年来研究表明六神丸还具有抗炎、镇痛、抗肿瘤等方面的作用。

本申请人前期研究证实，六神丸及其不同提取物与分离组分均能抑制HepG2细胞生存，其中醇提上清液为最佳有效部位，且醇提上清液对L02细胞的毒性小，表明六神丸在体外具有针对性地抑制癌细胞生存抗肝癌活性作用。同时前期实验证实六神丸醇提上清能减少缓激肽诱导的背根神经节DRG细胞中P物质的释放，表明六神丸具有镇痛的作用。因此后期对纳米六神丸防治原发性肝癌、缓解疼痛进行了大量的科学实验研究，通过建立原发性肝癌模型和疼痛模型，研究纳米六神丸对相应病症的治疗作用。研究结果表明给药后纳米六神丸既能对化学诱癌剂诱导的原发性肝癌有明显的治疗作用，又能缓解疼痛。

基于如上理论，本发明提供了一种纳米六神丸溶液，纳米六神丸溶液的溶质是六神丸醇提物冻干粉末，纳米六神丸溶液是纳米化六神丸醇提物水包油制剂；其中纳米化六神丸醇提物水包油制剂是高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂或低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂；高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中六神丸醇提物的含量是12.045mg·ml^-1-24.089mg·ml^-1；低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中六神丸醇提物的含量是2.409mg·ml^-1-4.818mg·ml^-1。其中，六神丸醇提物冻干粉末的制备方式是取六神丸颗粒(购于上海雷允上药业有限公司)120颗(0.375g)，研细后置15ml离心管中，加无水乙醇20ml，浸泡3h，超声处理30min，混匀器混匀10min，在4℃静置过夜，然后1000rpm离心15min，取上清液，得到的上清与超纯水按体积比1:1混合后，置于-86℃过夜，第二天冷冻干燥得到六神丸醇提物冻干粉末。

同时，本发明还提供了一种用于制备如前所述的纳米六神丸溶液的方法，该方法包括以下步骤：

1)将六神丸醇提物冻干粉末以及蛋黄卵磷脂溶于麻油中，制备得到油相；蛋黄卵磷脂的终浓度是6％W/V(g/ml)；

2)将Tween 80以及甘油溶于超纯水中，制备得到水相；Tween 80的终浓度是1.25％V/V；甘油的终浓度是2.81％V/V；

3)在60℃恒温水浴的条件下，将步骤1)制备得到的油相滴入步骤2)制备得到的水相中，在1200r/min的条件下搅拌15min；油相与水相的体积比是1：4；

4)在10000rpm的条件下高剪切2min，最终得到粒径是100nm-200nm的乳化颗粒；

5)在1000bar的条件下高压均质6次即得到纳米化六神丸醇提物水包油制剂。

下面将结合具体实施方式对本发明所提供的技术方案做进一步的详细说明：

将128只雄性昆明KM小鼠适应性喂养一周后，随机分为：正常组、DEN组(模型组)、纳米六神丸溶液低剂量组(给药剂量1.927mg/kg，给药体积4μl/10g)与纳米六神丸溶液高剂量组(给药剂量9.639mg/kg，给药体积4μl/10g)等四组，每组32只老鼠。除正常组外，其余三组小鼠每周按体重给予16.5mg/kg的DEN一次含服，连续二十周；同时纳米六神丸溶液低剂量组每周给予低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂两次含服，纳米六神丸溶液高剂量组每周给予高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂两次含服，连续三十周。研究纳米化六神丸醇提物水包油制剂对原发性肝癌的防治作用。

将90只雄性昆明KM小鼠适应性喂养一周后，按时间点随机分成三大组，1/3h组、1h组、6h组，每组30只；再将每个大组随机均分成五个小组，模型组、吗啡治疗组(药物浓度500μg/ml，给药剂量10mg/kg)、双氯酚酸钠治疗组(药物浓度1.5mg/ml，给药剂量15mg/kg)、纳米六神丸溶液低剂量组(给药剂量1.927mg/kg，给药体积4μl/10g)与纳米六神丸溶液高剂量组(给药剂量9.639mg/kg，给药体积4μl/10g)，每组6只。除模型组外，阳性对照组中吗啡治疗组腹腔注射吗啡，双氯芬酸钠组灌胃给予双氯酚酸钠，纳米六神丸低剂量组含服低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂，纳米六神丸溶液高剂量组含服高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂，分别于给药1/3h、1h、6h后腹腔注射0.6％V/V醋酸(10ml/kg)，观察各组小鼠30min内的扭体次数，研究纳米六神丸溶液对疼痛的缓解作用。

实施例1 纳米六神丸溶液防治小鼠原发性肝癌

动物：受试SPF级昆明KM雄性小鼠128只(由湖北省实验动物研究中心提供)，体重18-22g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。

纳米六神丸溶液的配制：将六神丸醇提物冻干粉末以及蛋黄卵磷脂溶于麻油中制备得到油相，蛋黄卵磷脂的终浓度是6％W/V。将Tween 80以及甘油溶于超纯水中制备得到水相，Tween 80的终浓度是1.25％V/V，甘油的终浓度是2.81％V/V。在60℃恒温水浴的条件下，将油相滴入水相中，在1200r/min的条件下搅拌15min，油相与水相的体积比是1：4。在10000rpm的条件下高剪切2min，最终得到粒径是100nm-200nm的乳化颗粒，在1000bar的条件下高压均质6次即得到纳米化六神丸醇提物水包油制剂。高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中的六神丸醇提物的含量不大于24.089mg·ml^-1；低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中六神丸醇提物的含量不大于4.818mg·ml^-1。

1、原发性肝癌模型的建立及纳米六神丸溶液给药

将128只雄性昆明小鼠适应性喂养一周后，随机分为：正常组、DEN组(模型组)、纳米六神丸溶液低剂量组(给药剂量1.927mg/kg，给药体积4μl/10g)与纳米六神丸溶液高剂量组(给药剂量9.639mg/kg，给药体积4μl/10g)等四组，每组32只老鼠。除正常组外，其余三组小鼠每周按体重给予16.5mg/kg的DEN一次含服，连续二十周；同时纳米六神丸溶液低剂量组每周给予低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂两次含服，纳米六神丸溶液高剂量组每周给予高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂两次含服，连续三十周，然后将各组剩余小鼠脱臼处死，打开腹腔，取出肝脏。

2、小鼠行为学及肝脏大体观

每天观察小鼠精神状态、被毛变化、饮食状况，并且每周称重记录。在实验第十周、十五周、二十周、三十周，每组各取8只小鼠处死，取肝组织样本，10％多聚甲醛溶液固定24h，常规石蜡包埋，切片机制成2μm连续石蜡切片；同步烤片，然后脱蜡，梯度酒精水化，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片；光镜下胞浆染为红色，细胞核染为蓝色。

3、实验结果

正常组小鼠活泼好动、反应灵活、皮毛光泽，与正常组相比，各组小鼠出现不同程度的毛色发黄、枯燥、无光泽、行动迟缓，各组小鼠体重变化，见图1。HE结果显示实验第十五周，模型组肝组织与正常组相比出现较多炎性细胞浸润灶，而给予六神丸治疗的各组炎性细胞浸润灶相对较少；实验第二十周，HE结果显示，模型组出现较多炎性细胞浸润灶，并部分伴有脂肪化和纤维化，肝组织结构出现轻、中度紊乱；纳米六神丸溶液低剂量组与纳米六神丸溶液高剂量组的肝组织仅出现炎性细胞浸润灶，无明显的脂肪化和纤维化；在实验第三十周，正常组小鼠肝组织未见肿瘤，见图2(a)；模型组有4只(50％)小鼠的肝组织肉眼可见明显肿瘤结节，见图2(b)；纳米六神丸溶液高剂量组中有3只(37.5％)小鼠肝组织可见肿瘤结节，见图2(d)；而纳米六神丸溶液低剂量组小鼠肝组织肉眼未见明显肿瘤结节见图2(c)。

图3中，a：正常组；b：模型组；c：纳米六神丸溶液低剂量组；d：纳米六神丸溶液高剂量组。标尺为100μm，右上角为黑框中所示局部图(100倍)的放大图(400倍)。光镜下观察，正常组小鼠肝细胞排列整齐，核大小一致，且分布均匀，肝细胞索围绕中央静脉，呈放射状分布，肝窦清晰，见图3(a)。模型组小鼠，明显可见具有被膜形成的结节灶，细胞大小、形态不一，细胞核形态不规则，可见瘤巨细胞，核分裂像明显，见图3(b)。而给予纳米六神丸治疗的两组小鼠肝组织镜检则可见肝细胞变性坏死、炎细胞浸润；肝索轻中度紊乱、肝窦扭曲，尚未见肿瘤形成，见图3(c、d)。

实施例2 纳米六神丸缓解疼痛

动物：受试SPF级昆明KM雄性小鼠128只(由湖北省实验动物研究中心提供)，体重18-22g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。

纳米六神丸溶液的配制：将六神丸醇提物冻干粉末以及蛋黄卵磷脂溶于麻油中制备得到油相，蛋黄卵磷脂的终浓度是6％W/V。将Tween 80以及甘油溶于超纯水中制备得到水相，Tween 80的终浓度是1.25％V/V，甘油的终浓度是2.81％V/V。在60℃恒温水浴的条件下，将油相滴入水相中，在1200r/min的条件下搅拌15min，油相与水相的体积比是1：4。在10000rpm的条件下高剪切2min，最终得到粒径是100nm-200nm的乳化颗粒，在1000bar的条件下高压均质6次即得到纳米化六神丸醇提物水包油制剂。高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中的六神丸醇提物的含量不大于24.089mg·ml^-1；低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂中六神丸醇提物的含量不大于4.818mg·ml^-1。

1、疼痛模型的建立及纳米六神丸溶液给药

将90只雄性昆明KM小鼠适应性喂养一周后，按时间点随机分成三大组，1/3h组、1h组、6h组，每组30只；再将每个大组随机均分成五个小组，模型组、吗啡治疗组(药物浓度500μg/ml，给药剂量10mg/kg)、双氯酚酸钠治疗组(药物浓度1.5mg/ml，给药剂量15mg/kg)、纳米六神丸溶液低剂量组(给药剂量1.927mg/kg，给药体积4μl/10g)以及纳米六神丸溶液高剂量组(给药剂量9.639mg/kg，给药体积4μl/10g)，每组6只。除模型组外，阳性对照组中吗啡治疗组腹腔注射吗啡溶液，双氯芬酸钠治疗组灌胃给予双氯酚酸钠，纳米六神丸溶液低剂量组含服低剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂；纳米六神丸溶液高剂量组含服高剂量纳米化六神丸醇提物水包油制剂。分别于给药1/3h、1h、6h后腹腔注射0.6％V/V醋酸(10ml/kg)，观察各组小鼠30min内的扭体次数。

2、小鼠行为学观察

观察在各个时间点注射0.6％醋酸后30min内的小鼠扭体情况，并计数。

3、实验结果

口服高剂量的纳米六神丸溶液、低剂量的纳米六神丸溶液，灌服双氯酚酸钠和腹腔注射吗啡，均可明显减少小鼠的扭体次数。随着给药时间的延长，吗啡和双氯酚酸钠的治疗效果减弱(20min时扭体次数分别为14±2、23±9次，而在第6h时扭体次数分别为39±9、44±11次)，而低剂量纳米六神丸溶液组的治疗效果逐渐增强(20min时扭体次数为45±3次，6h时扭体次数为33±8次)。参见图4，其中，图4a-图4c分别为实施例2中不同时间点注射0.6％V/V的醋酸后各组小鼠扭体次数统计图。这说明纳米六神丸溶液在体内作用时间持久，并且有缓释的作用，其中扭体次数以Mean±SEM方式计算。

Claims (1)

1.一种制备纳米六神丸溶液的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1）将六神丸醇提物冻干粉末以及蛋黄卵磷脂溶于麻油中，制备得到油相；所述蛋黄卵磷脂的终浓度是6%W/V；

2）将Tween 80以及甘油溶于超纯水中，制备得到水相；所述Tween 80的终浓度是1.25%V/V；所述甘油的终浓度是2.81%V/V；

3）在60℃恒温水浴的条件下，将步骤1）制备得到的油相滴入步骤2）制备得到的水相中，在1200 r/min的条件下搅拌15 min；所述油相与水相的体积比是1：4；

4）在10000 rpm的条件下高剪切2 min，最终得到粒径是100 nm-200 nm的乳化颗粒；

5）在1000 bar的条件下高压均质6次即得到纳米化六神丸醇提物水包油制剂；

所述纳米六神丸溶液是六神丸醇提物的含量是4.818 mg·ml^-1的纳米化六神丸醇提物水包油制剂。

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