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CN106248934B - 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽的应用 - Google Patents

结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽的应用 Download PDF

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CN106248934B CN201610729305.5A CN201610729305A CN106248934B CN 106248934 B CN106248934 B CN 106248934B CN 201610729305 A CN201610729305 A CN 201610729305A CN 106248934 B CN106248934 B CN 106248934B
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tuberculosis
rv0446c
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protein
mycobacterium tuberculosis
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National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
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Abstract

本发明涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽在制备结核病检测试剂、疫苗和药物中的应用，所述抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑5所示。本发明利用结核分枝杆菌Rv0446c蛋白抗原及其T细胞表位肽作为刺激物用于结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应，与以往采用完全抗原相比，能够降低由于抗原不纯造成的假阳性。由所述Rv0446c蛋白抗原及其表位肽制备的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域，Rv0446c蛋白抗原及其表位肽制备的结核疫苗和抗结核药物可用于结核病的预防和治疗。

Description

结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽在结核病检测试剂、疫苗和药物制备中的应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，调查结果显示全世界有三分之一的人口处于潜伏感染，且有5％～10％在未来的生活中将可能发展为活动性结核病。自1993年世界卫生组织宣布结核病成为全球危机后，结核病的发病率和死亡率一直居高不下，据WHO报告，每年新增结核病人约800万，每年约有200～300万人死于结核病。我国在22个结核高负担国家中位居第2位，全国第5次流行病学抽样检查结果显示：全国130万人发病，占全球发病率的14.3％，我国也是全球27个耐药结核病高负担国家之一，耐多药结核病患病人数占据全球第一。每个未经治疗的活动性肺结核病人能够传染10～15人。结核病已经成为全球重要的卫生问题，需引起人们的高度重视。
结核的早期诊断和预防治疗对结核病的控制至关重要，研究者应致力于开发高效、敏感、特异的结核诊断检测方法。临床上肺结核症状表现为咳嗽、咳痰、高热等，容易与慢性支气管炎、支气管扩张、肺炎、感冒等混淆，需要借助影像学、细菌学、免疫学等诊断方法方可确诊。临床上常用的是细菌学方法痰涂片镜检和痰培养，痰涂片镜检是世界范围内结核病检查中使用最广泛的技术，由于此法设备简便，适合在经济不发达的地区使用。但是由于对样本中的菌含量要求高，因此该方法灵敏度不高，导致大量涂阴患者不被发现从而转阳，且涂阴患者具有传染性，不容忽视，该方法无种特异性，灵敏度差，受痰液标本和病情的影响。痰培养作为结核病诊断的金标准，但是存在培养时间过长，现在已有BACTECMGIT960系统等快速培养系统可在2周内分离培养结核分枝杆菌，但由于其配制的培养基、营养添加剂、杂菌抑制剂价格昂贵，无法在发展中国家广泛推广，并且快速培养与改良L-J培养相比污染率显著增高，导致假阳性结果出现。常用的用于人群筛查的检测方法是皮肤结核菌素实验，使用的是结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有许多分枝杆菌种类(致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD诊断结核病的特异性较差，不能有效区分结核分枝杆菌感染与卡介苗接种，结核的影像学检查如常规的X线检查、CT检查、MRI检查、超声检查等价格昂贵，且对身体造成一定伤害，特异性低，不适合用于常规的检查诊断。
结核分枝杆菌侵入人体后寄居在巨噬细胞内，人体对结核分枝杆菌主要的免疫反应是细胞免疫应答，主要参与的细胞是CD4+和CD8+T细胞。CD8+T细胞可以通过穿孔素、颗粒酶等途径将被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞或树突状细胞杀死从而达到清除结核分枝杆菌的目的。其中MHC-I类分子存在于所有有核细胞的表面，而MHC-Ⅱ类分子仅存在于专职抗原递呈细胞如巨噬细胞、树突状细胞等，因此CD8+T细胞表位在结核的诊断和疫苗构建中具有更广泛的用途。
目前以T细胞为基础的检测方法T-SPOT是利用IFN-γ特异性抗体捕获经结核抗原刺激的外周血淋巴细胞培养后产生的IFN-γ，并以酶联免疫斑点显色的方式表现出来，从斑点的数量来确定细胞分泌细胞因子的情况，从单细胞水平评价细胞免疫功能。以T细胞为基础的体外γ干扰素的检测被用于结核病的辅助诊断，该检测方法不仅能筛选出活动性结核病人，同时也能检测出潜伏期病人，从而能更好的预防和控制潜伏期结核，目前已有以结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽为刺激物的商品化的IGRA检测试剂盒，如QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT，均呈现较高的灵敏性和特异性。而Rv0446c(GI：15607587)是结核分枝杆菌H37Rv基因组编码的保守膜蛋白，含256个氨基酸，可在H37Rv的培养上清中检测出的分泌蛋白，主要参与细胞壁的加工过程，是可能的结核毒力相关蛋白。Rv0446c是结核分枝杆菌保守膜蛋白，在结核分枝杆菌培养上清中能检测到的分泌蛋白，主要参与细胞膜和细胞的加工过程，利用生物信息学软件对其进行抗原表位预测分析，发现Rv0446c蛋白存在较多的T细胞表位，具有潜在的诊断效能。
本发明建立在反向疫苗学的基础上，利用计算机筛选出结核分枝杆菌可能的免疫原性抗原库，然后利用生物信息学软件TE predict和IEDB预测结核抗原MHC-I类T细胞表位，通过固态合成法合成这些多肽，先利用人群免疫筛选试验对结核新抗原进行筛选，筛选出免疫优势抗原然后，再通过动物实验对其免疫原性进行验证，最后经验证得到的免疫优势抗原及其表位可一方面用于结核诊断，另一方面可用于卡介苗的改造。
发明内容
本发明的目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c的应用。
本发明的另一目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c T细胞表位肽及其应用。
本发明基于以下构思：Rv0446c是结核分枝杆菌上的保守膜蛋白，基于T细胞IFN-γ释放技术，利用生物信息学软件TE predict和IEDB对Rv0446c编码基因上T细胞抗原表位进行预测，利用固态合成法合成T细胞表位肽，再通过T-SPOT(T细胞斑点试验)对结核病人、肺部其他疾病患者、健康人体内的特异性T淋巴细胞进行检测，从而评价该抗原用于结核检测的灵敏度和特异性，同时通过人群免疫学实验筛选出Rv0446c抗原蛋白上的免疫优势表位肽，再通过动物实验，确定免疫优势T细胞表位肽的免疫原性。
为了实现本发明目的，本发明提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
本发明还提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c T细胞表位肽，所述表位肽选自P120、P121、P122和P123，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示。
本发明还提供由所述T细胞表位肽衍生的表位肽或其类似物。
本发明还提供编码所述表位肽的DNA分子。
本发明还提供含有编码所述表位肽的DNA分子的表达盒及表达载体。
本发明还提供含有编码所述表位肽的DNA分子的转基因细胞系。
本发明还提供含有编码所述表位肽的DNA分子的重组菌及其表达纯化的重组蛋白。
本发明还提供所述表位肽、编码所述表位肽的DNA分子、所述转基因细胞系或所述重组菌及其表达纯化的重组蛋白在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用。
本发明还提供一种结核检测试剂，所述检测试剂中含有结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c，或编码所述抗原蛋白Rv0446c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
所述表位肽、编码所述表位肽的DNA分子和/或所述重组蛋白。
本发明还提供含有上述检测试剂的结核T-SPOT检测试剂盒。所述试剂盒还包括以下材料或试剂：
①一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体。
②酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体。
③标准品：
培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原(如PHA等)，本底对照含有PBS或基底液。
④其他T-SPOT检测所需的试剂及耗材。
优选地，一抗固定在上述微孔反应板上。
本发明是基于双抗体夹心原理，采用T-SPOT法检测抗原，实验过程为：PVDF膜上包被的一抗作为捕获抗体能够结合细胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶标二抗捕获、显色。两种抗体为识别IFN-γ不同抗原表位的单克隆抗体。
本发明还提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c和/或所述表位肽、编码所述表位肽的DNA分子、所述转基因细胞系或所述重组菌及其表达纯化的重组蛋白在制备结核疫苗和抗结核药物中的应用。
本发明还提供一种结核疫苗，其有效成分为结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c，或编码所述抗原蛋白Rv0446c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
所述表位肽、编码所述表位肽的DNA分子和/或所述重组蛋白。
本发明还提供一种抗结核药物，其有效成分包括以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c和/或所述表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备的多克隆抗体，或者以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c和/或所述表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备的识别所述结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽抗原的人源化单克隆抗体。
本发明进一步提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c和/或所述T细胞表位肽及其衍生的表位肽或其类似物在检测结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应中的应用。其是将人或动物的淋巴细胞经所述结核分枝杆菌Rv0446c蛋白抗原、其T细胞表位肽及其衍生的表位肽或其类似物抗原或它们的组合物刺激后，检测T细胞或B细胞分泌的细胞因子。
其中，结核特异性T细胞分泌的细胞因子包括：γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。B细胞分泌的细胞因子包括抗体。
针对结核特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法包括酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫胶体金试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验等。B细胞分泌的细胞因子的检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
所述淋巴细胞来自人或动物的外周血、静脉血、脑脊液、胸腔积液或胸水等。
本发明具有以下优点：
(一)本发明利用结核分枝杆菌Rv0446c蛋白抗原及其T细胞表位肽作为刺激物用于结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应，与以往采用完全抗原相比，能够降低由于抗原不纯造成的假阳性。
(二)研究证明，本发明提供的抗原表位均能够刺激机体产生较强的T细胞免疫反应，因此当使用上述表位肽作为刺激物进行体外T细胞γ干扰素释放实验时，灵敏度显著提高。
(三)采用固相合成的方法合成T细胞表位肽，有利于质量控制，且成本较低，纯度高，适合大规模商业化生产。
(四)本发明的抗原蛋白Rv0446c是结核毒力相关因子，动物实验中细胞免疫反应和体液免疫反应显示该抗原具有较强的免疫原性，可用作新型结核疫苗候选抗原。
(五)本发明的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域。
附图说明
图1显示本发明实施例6中抗原蛋白Rv0446c的两条T细胞表位肽P120和P123可有效刺激机体产生IFN-γ(A)、IL-4(B)和IL-10(C)。
实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 结核分枝杆菌抗原基因Rv0446c的克隆及蛋白的表达纯化
Rv0446c(GI:15607587)是结核分枝杆菌H37Rv基因组编码的保守膜蛋白，含256个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。根据其编码基因序列，设计引物，利用原核表达系统(如大肠杆菌)表达并纯化获得抗原蛋白Rv0446c。
实施例2 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c T细胞表位肽的合成
基于T细胞IFN-γ释放技术，利用生物信息学软件TE predict和IEDB对Rv0446c编码基因上T细胞抗原表位进行预测，利用固态合成法合成T细胞表位肽，再通过T-SPOT法对结核病人、肺部其他疾病患者、健康人体内的特异性T淋巴细胞进行检测，从而评价该抗原用于结核检测的灵敏度和特异性。
本实施例提供的结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c T细胞表位肽选自P120、P121、P122和P123，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示。
实施例3 结核T-SPOT检测试剂盒的制备
所述试剂盒基本组成如下：
①实施例1制备的蛋白抗原Rv0446c和/或实施例2合成的表位肽抗原：所述表位肽选自P120、P121、P122和P123中的至少一种。
②一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体。
酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体。
③标准品：
培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原(如PHA等)，本底对照含有PBS或基底液。
④其他T-SPOT检测所需的试剂及耗材。
将一抗固定在上述微孔反应板上。
该试剂盒是基于双抗体夹心原理设计的，采用T-SPOT法检测抗原，实验过程为：PVDF膜上包被的一抗作为捕获抗体能够结合细胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶标二抗捕获、显色。两种抗体为识别IFN-γ不同抗原表位的单克隆抗体。
实施例4 抗原表位肽用于结核感染的临床检测
1.外周血淋巴细胞的分离
1.1受试对象
①志愿者病例的筛选标准：
临床表现症状、体征及胸部影像学检查诊断为肺结核的，且痰培养为阳性的肺结核患者。
②肺部疾病患者的筛选标准：
痰培养和痰涂片为阴性的肺部其他疾病，如尘肺、慢阻肺等肺部疾病患者。
③健康志愿者的筛选标准：
无结核临床症状、无结核病人密切接触史、无其他疾病或感染。
入选的结核病患者和志愿者年龄在15-80岁之间，从到结核病室就诊的连续时间样本中随机选取。共采集了50例结核病志愿者、39例肺部疾病患者及55例健康志愿者血液样本，采血时使用无内毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周静脉血，每名志愿者采血约5ml～10ml。
1)样品于4小时内用Ficoll-Hypaque分离液分离PBMCs。
2)先将全血用RPMI-1640培养基1:1稀释混匀，在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰，分离液、抗凝未经稀释全血、RPMI 1640培养基体积为1:1:1，室温(18～26℃)，800g离心20分钟。
3)离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆层，血浆层与分离液层之间是白色云雾状的单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层。用吸管吸取白色云雾状细胞层并转移至15ml无菌离心管中，加入RPMI 1640培养基至10ml，室温条件下800g离心10分钟。
4)弃去上清，重悬后加入7ml RPMI 1640培养基，700g离心10分钟。
5)弃去上清加0.5ml AIM-V培养基重悬沉淀。
6)利用自动细胞计数仪对细胞计数，用AIM-V培养基配制500μL细胞浓度为2.5×106/ml的细胞悬液。
2.抗原表位肽的准备
将实施例2中固相合成法制备的抗原表位肽用DMSO溶解，各条表位肽分别用含10％胎牛血清RPIM1640培养基稀释至一定浓度后使用。
3. T-SPOT检测抗原表位肽特异性T细胞
采用实施例3的试剂盒，向预包被一抗的微孔板中加入以下试剂，每个病人分别设6个检测孔：阳性对照孔(加100μL浓度为15μg/ml的植物血凝素PHA作为阳性刺激物)、阴性对照孔(加100μL PBS作为阴性对照)、4个检测孔(4个孔中分别加入100μL浓度为20μg/ml的4条表位肽P120、P121、P122、P123中的一条)，每个孔中加入100μL上述稀释好的PBMC，使每孔中PBMC的数量达25万个，将抗原与PBMC细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中培养20小时。
4. T-SPOT洗板及结果判定
洗去PBMC细胞和抗原刺激物，加100μL一抗室温下孵育1小时，用PBS洗5遍，加二抗室温孵育1小时，再用PBS洗5遍，加底物避光显色7分钟后，用纯化水终止显色，将培养板放在通风口处晾干观察板上的斑点数。
结果判定(表1)：空白对照孔斑点数＝N、检测孔斑点数＝T、阳性质控孔斑点数＝P。
表1 T-SPOT结果判断标准
其中四条T细胞表位肽检测50例结核病人、39例肺部其他疾病患者和55个健康人的结果统计见表2。
表2 Rv0446c蛋白抗原四条T细胞表位肽检测灵敏度和特异度统计
表位肽 灵敏度(％) 特异度(％)
P120 30 96.81
P121 18 98.94
P122 6 100
P123 22 96.81
4条多肽联合 50 93.62
检测灵敏度＝(结核病患者检测阳性数/结核病患者总数)×100％
检测特异度＝1-(肺结核病患者检测阳性数+健康志愿者检测阳性数)/(肺部疾病患者总数+健康志愿者总数)
按照单条多肽检测出阳性即为阳性的原则，经计算得出Rv0446c蛋白抗原P120、P121、P122、P123四条表位肽联合检测出结核病人的灵敏度为50％，特异度为93.62％。单条T细胞表位肽检测灵敏度可达30％。
实施例5 Rv0446c T细胞表位肽的免疫原性检测
1、为了验证Rv0446c T细胞表位肽的免疫原性，考虑到裸肽易降解且不易被抗原递呈细胞识别的特性，将合成的裸肽与血蓝蛋白(KLH)进行偶联，将偶联得到的T细胞表位肽进行免疫BALB/c小鼠。
2、免疫小鼠
筛选6周龄的雌性BALB/c小鼠48只，分为8组，PBS阴性对照组(PBS)，佐剂对照组血蓝蛋白(KLH)对照组，结核分枝杆菌抗原蛋白Ag85B 20μg低剂量组(Ag85b-L)、Ag85B 50μg高剂量组(Ag85B-H)、Rv0446c P120多肽50μg低剂量组(P120-L)、Rv0446c P120多肽100μg高剂量组(P120-H)、Rv0446c P123多肽50μg低剂量组(P123-L)、Rv0446c P123多肽100μg高剂量组(P123-H)。将每组抗原与相应的佐剂--多聚肌苷酸poly(I:C)50μL和双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)100μL充分乳化后采用皮下接种的方式免疫小鼠，每隔3周免疫一次，共免疫三次，末次免疫4周后进行检测。
3、小鼠血清的分离
小鼠眼球采血500μL，将血液置于37℃温箱中2小时，然后转入4℃冰箱中过夜。次日，将血液3000rpm离心5分钟后吸取上清。
4、血清抗体滴度检测
1)配制抗原包被液，将抗原蛋白Rv0446c的两条表位多肽P120和P123以及Ag85B分别用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)稀释后，得到5μg/ml的Rv0446c表位肽P120和P123包被液以及2μg/ml的Ag85B抗原包被液，酶标板分别用两种包被液于4℃过夜包被，次日，用PBST洗涤5遍。
2)用含2％BSA的PBS液37℃封闭2小时，用PBST洗涤5遍。
3)用PBS将各组血清从1:10开始进行倍比稀释，每孔中加入100μL稀释后的血清，37℃孵育1小时后，用PBST洗5遍。
4)分别加入5000倍稀释的HRP标记的IgG、IgG1、IgG2a抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时后，用PBST洗5遍。
5)加入TMB 37℃显色15分钟后，每孔中加入50μL 2M硫酸终止终止显色。
6)酶标仪检测波长450nm的吸管光度值。
7)判断标准：OD≥2.1×OD(阴性对照)的判定为阳性。
8)结果分析：各组血清的特异性抗体滴度见表3。
表3小鼠血清中特异性抗体滴度
IgG IgG1 IgG2a
PBS组 1 1 1
KLH组 1 1 1
Ag85B-L 8063489 142543.8 452548
Ag85B-H 1015936 285087.6 640000
P120-L 126.99 80 22.45
P120-H 226.27 113.14 31.75
P123-L 253.98 142.54 31.75
P123-H 403.17 142.57 40
结果显示，在空白对照组PBS组和阴性对照组KLH组中未检测到P120和P123特异性抗体。在P120和P123多肽高低剂量免疫组中均能检测到IgG、IgG1和IgG2a抗体，其中P120多肽IgG抗体高剂量组滴度高于低剂量组，而P123多肽高低剂量组抗体滴度无差别。采用上述方法分别对Rv0446c T细胞表位肽P121和P122进行免疫原性检测，在P120和P123免疫组中均能够检测到P120和P123特异性抗体。
实施例6 Rv0446c T细胞表位肽的细胞免疫原性检测
1、将实施例5中免疫的小鼠处死后，在75％酒精中浸泡5分钟，将小鼠固定在超净台中的泡沫板上，剪开腹膜，分离出脾脏，将其置于装有1640的平皿中。
2、在200目的尼龙网上，用注射器内芯轻轻研磨小鼠脾脏，将研磨的细胞通过滤网过滤。1000r/min离心5分钟弃上清，收集细胞沉淀。
3、将细胞沉淀轻轻振荡使其松动，按照2mL/只加入红细胞裂解液，混匀后，置于37℃温箱中孵育10分钟后，加入相当于红细胞裂解液2倍体积的1640培养基终止反应，1000r/min离心5分钟弃上清，收集脾细胞沉淀。
4、用1640培养基2ml/只重悬脾细胞，1000r/min离心5分钟弃上清，收集脾细胞沉淀。用细胞计数仪测定细胞浓度。
5、用含有10％FBS的1640培养基稀释脾细胞，使其浓度为2×106/mL。每组取500μL脾细胞液置于24孔培养板中，PBS组和DP佐剂组脾细胞分别用Ag85B蛋白(5μg/mL)、Rv0446c的T细胞表位肽P120(5μg/mL未偶联KLH蛋白的裸肽)、P123(5μg/mL未偶联KLH蛋白的裸肽)与脾细胞共同孵育，Ag85B-L和Ag85B-H组分别用500μL的Ag85B蛋白(5μg/mL)与脾细胞共同孵育，P120-L和P120-H组均用500μL P120多肽(5μg/mL未偶联KLH蛋白的裸肽)与脾细胞共同孵育，P123-L和P123-H组均用500μL的P123多肽(5μg/mL未偶联KLH蛋白的裸肽)与脾细胞共同孵育，每组加入500μL的无菌PBS和500μL植物血凝素(PHA)(5μg/mL)作为阴性对照和阳性对照，每个检测孔均做2个重复。将脾细胞与相应的刺激物在37℃，5％CO2培养箱中孵育72小时后，收集细胞上清，采用ELISA法检测上清中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。
6、将IFN-γ单抗、IL-2单抗、IL-4单抗等用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)，L-10单抗用碳酸盐缓冲液(pH＝6.5)按照1:500倍稀释后，按100μL/孔加入到96微孔板中，4℃包被过夜。
7、用PBTS洗涤3遍后，拍干，加入含10％FBS的PBS液室温封闭1小时。
8、用PBST洗涤5遍后，将IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的标准品按照对应的比例稀释成相应浓度，分别加入到各ELISA板上，作为标准曲线。其余加入100μL待检测的细胞上清，室温孵育2小时。
9、用PBST稀释5遍后，分别加入100μL IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10各自的检测抗体+HRP标记的二抗，室温孵育1小时。
10、用PBST洗涤7遍后，加入TMB显色液100μL，室温孵育30分钟后，加入终止液50μL终止反应。
11、酶标仪测定波长450nm的吸光值，同时检测波长570nm的吸光值作为对照。
12、结果分析：根据细胞因子标准品制作标准曲线，然后将检测孔的OD值代入公式，计算每组小鼠各种细胞因子的终浓度。结果如图1所示。
结果显示，与PBS组和KLH组相比，Rv0446c的T细胞表位肽P120能刺激小鼠产生较高浓度的IFN-γ(P＜0.001)、IL-4(P＜0.001)、IL-10(P＜0.001)，且P120高剂量组产生IFN-γ(P＜0.001)的量高于低剂量组，Rv0446c的T细胞表位肽P123能刺激小鼠产生IFN-γ(P＜0.001)，且P123高剂量组产生IFN-γ(P＜0.05)的量比低剂量组高。IFN-γ是Th1型细胞因子，可以通过激活巨噬细胞从而促进巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除。IL-4和IL-10是Th2型细胞因子，促进结核感染过程中的抗体产生。在结核感染中起到免疫调节作用。采用上述方法分别对Rv0446c T细胞表位肽P121和P122进行细胞免疫原性检测，结果表明，P120和P123也能够刺激小鼠产生相应的细胞因子。
可见，结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c的四条T细胞表位肽，均能刺激结核病人产生IFN-γ，能有效区分结核病人和肺部其他疾患病人和健康人群，且四条多肽联合诊断效率提高。Rv0446c及其T细胞表位肽均可作为一种检测试剂用于结核病的诊断。在动物实验中，Rv0446c的两条T细胞表位肽P120和P123能有效刺激机体产生IFN-γ(P＜0.001)、IL-4(P＜0.001)、IL-10(P＜0.001)，并能刺激小鼠产生特异性的抗体IgG、IgG1和IgG2a，由此证明Rv0446c及其T细胞表位肽具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答，是一种免疫优势抗原，可以考虑用作结核分枝杆菌疫苗的构建和制备。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c在制备结核检测试剂、结核疫苗或抗结核药物中的应用；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c T细胞表位肽，其特征在于，所述表位肽选自如SEQID NO:1-4所示氨基酸序列中的一种。
3.权利要求2所述表位肽在制备结核检测试剂中的应用。
4.一种结核检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c，或编码所述抗原蛋白Rv0446c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
权利要求2所述表位肽，或编码所述表位肽的DNA分子，或由含有编码所述表位肽的DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
5.含有权利要求4所述检测试剂的结核T-SPOT检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有：
①一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体；
②酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体；
③标准品：
培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原，本底对照含有PBS；
④其他T-SPOT检测所需的试剂及耗材；
其中，一抗固定在上述微孔反应板上。
7.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c和/或其T细胞表位肽在制备结核疫苗中的应用；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；其T细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或4所示。
8.一种结核疫苗，其特征在于，其有效成分为结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c，或编码所述抗原蛋白Rv0446c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c T细胞表位肽，或编码所述表位肽的DNA分子，或由含有编码所述表位肽的DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；
其中，所述结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c T细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或4所示。
9.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c和/或其T细胞表位肽在制备抗结核药物中的应用；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；其T细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或4所示。
10.一种抗结核药物，其特征在于，其有效成分包括以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c和/或其T细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备的多克隆抗体，或者以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c和/或其T细胞表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备的识别结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽抗原的人源化单克隆抗体；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；其T细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或4所示。
11.权利要求2所述表位肽在制备结核疫苗或抗结核药物中的应用，其中所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或4所示。
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