CN106232832B - 基于纸的合成基因网络 - Google Patents

Abstract

本文公开的是在固体支持物上冻干的基于合成基因网络和/或无细胞体系的耐储存的组合物。所述组合物可以很容易地运输和储存一段时间，并可以通过简单地加入水而得以活化。本文还公开了使用方法，包括但不限于传感和各种逻辑功能。本发明使得能够将基于合成生物学的技术简单、无菌和非生物地配置至临床设置、食品加工和工业、军用和消费产品。

Description

基于纸的合成基因网络

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年12月6日递交的美国临时申请No.61/913,110和2014年10月22日递交的美国临时申请No.62/066,966的权益，以引用的方式将其各自的内容整体并入本文。

技术领域

本公开内容大体上涉及用于传感和执行基于合成基因网络的逻辑功能的耐储存的组合物和方法。

背景技术

合成生物学领域旨在再设计天然系统的组件以解决全球性的挑战，例如降低药物生产或绿色能源和化学的成本。在这样做时，合成生物学家正在创造全细胞生物传感器、合成的益生菌以及药物和绿色能源和新型化学的新的来源。这些技术的核心是控制负责制造的细胞工厂的合成基因网络(Lu等，Nat.Biotechnol.2009，27，1139-1150)。在活细胞中容纳这些工程化途径初步意味着合成生物学已经被限制至实验室和大型商业化运作。

正在进行的研究已经试图将合成基因网络移至活细胞以外。例如，已探索脂质体以容纳合成基因网络(Shin和Noireaux，ACS Synth.Biol.2012，1，29-41)。然而，活细胞和合成脂质体都在实践问题如存储和运输方面存在严重的缺点，从而限制了基于合成基因网络的设备的配置及它们的应用。特别是，不可能将这些设备用于按需应用。

考虑到合成基因网络的潜力和本领域熟练技术人员所面临的挑战，需要新的组合物和/或方法来促进基于合成基因网络的设备的容易配置和存储。

发明内容

本发明的多个方面涉及如下发现：当将冻干的合成基因网络和/或包含足够用于模板导向(template-directed)的合成反应的组件的无细胞体系在室温下存放一段时间时，能够保持其生物活性。本发明的一个方面涉及包含无细胞体系的耐储存的组合物，所述无细胞体系包含用于模板导向的合成反应的组件，其中，所述无细胞体系被冻干在固体支持物上。一旦复水，无细胞体系可以变成对模板导向的合成反应来说是活化的。

在一种实施方式中，耐储存的组合物进一步包含合成基因网络。在一种实施方式中，合成基因网络包含一种或多种核酸。核酸可以包括例如DNA、RNA、人工核酸类似物或它们的组合。

在一种实施方式中，模板导向的合成反应是转录反应，并且足够用于转录反应的组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸和缓冲系统。

在一种实施方式中，模板导向的合成反应是翻译反应，并且足够用于翻译反应的组件包括：核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。所述组件还可以包括：氨基酸、或者氨基酸和氨酰tRNA合成酶。

在一种实施方式中，模板导向的合成反应是偶联的转录和翻译反应，并且足够用于偶联的转录和翻译反应的组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸、核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。所述组件还可以包括：氨基酸、或者氨基酸和氨酰tRNA合成酶。

在一种实施方式中，固体支持物是多孔基底，并且耐储存的组合物部分或完全嵌入在多孔基底中。

在一种实施方式中，多孔基底包括纸。

在一种实施方式中，多孔基底包括石英微纤维、纤维素的混合酯、多孔氧化铝或图案化的表面。

在一种实施方式中，用牛血清白蛋白、聚乙二醇、吐温20、Triton-X、奶粉、酪蛋白、鱼明胶或上述中的一种或多种的组合对固体支持物进行预处理。

在一种实施方式中，无细胞体系包含全细胞提取物或重组的蛋白转录/翻译系统。

在一种实施方式中，全细胞提取物选自于由兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物、大肠杆菌(E.coli)提取物和人细胞提取物所组成的组。

在一种实施方式中，重组的蛋白转录/翻译系统使得蛋白合成能够使用重组元件(recombinant elements)(PURE)或

(New England Biolabs,Ipswich,MA)(参见Shimizu和Ueda，“Pure Technology，”Cell-Free Protein Production:Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology，Endo等(编)，Humana 2010；和Shimizu等，“Cell-free translation reconstituted with purified components，”NatureBiotechnology2001，19，751-755)。

在一种实施方式中，合成基因网络作为传感器发挥功能。

在一种实施方式中，传感器可以检测水性试样中的分析物。

在一种实施方式中，分析物的检测可以产生光信号或电子信号。

在一种实施方式中，合成基因网络包含逻辑电路。

在一种实施方式中，逻辑电路包含与门(AND gate)、非门(NOT gate)、或门(ORgate)、或非门(NOR gate)、与非门(NAND gate)、异或门(XOR gate)、异与门(XAND gate)或它们的组合。

在一种实施方式中，在与水和任选的包含触发物的组合物接触时，逻辑电路被激活。

在一种实施方式中，触发物选自于由化学元素、小分子、肽、蛋白、核酸、提取物和它们的组合所组成的组。

在一种实施方式中，耐储存的组合物耐储存至少2周。

本发明的相关方面关注的是包含无细胞体系、合成基因网络和固体支持物的耐储存的组合物，该无细胞体系包含足够用于模板导向的合成反应的组件，其中，所述耐储存的组合物基本上没有水，并且其中，一旦复水，所述无细胞体系对所述模板导向的合成反应来说是活化的。

本发明的另一方面关注的是通过如下处理方法产生的耐储存的组合物，所述处理方法包括：用包含无细胞体系和合成基因网络的水性溶液接触固体支持物，以及冻干所述固体支持物。

本发明的另一方面关注的是检测分析物的方法，所述方法包括：提供本文所述的耐储存的组合物，其中，所述组合物包含基于核酸的传感器；在使得能够转录和/或翻译的条件下，在水的存在下，使所述组合物与分析物接触；以及检测信号，其中，检测到信号指示分析物的存在。

在一种实施方式中，所述方法进一步包括如下步骤：在接触步骤之后，使所述组合物与水分蒸发的屏障(barrier)接触、或将所述组合物封装入封装物(enclosure)中。

在一种实施方式中，所述方法可以提供对分析物的量进行的测量。

在一种实施方式中，基于核酸的传感器包含报告基因。

在一种实施方式中，报告基因编码荧光蛋白、酶或抗原。

在一种实施方式中，基于核酸的传感器包含催化核酸。

在一种实施方式中，所述方法进一步包括提供荧光团，其中，藉此所述荧光团可以偶联至核酸，从而在荧光方面产生变化。

在一种实施方式中，分析物选自于由核酸、病原体、病原体提取物、代谢物、抗生素药物、爆炸性化学品、毒性化学品和工业化学品所组成的组。

在一种实施方式中，毒性化学品是重金属或杀虫剂残留。

在一种实施方式中，信号是冷光(luminescence)。

在一种实施方式中，信号是荧光。

在一种实施方式中，信号是可见的颜色。

在一种实施方式中，信号是电子信号。

在一种实施方式中，分析物处于水性溶液中。

本发明的另一方面关注的是激活冻干在固体支持物上的合成基因网络的方法，所述方法包括：提供本文所述的耐储存的组合物，其中，所述组合物包含合成基因网络；以及使组合物与水接触。

本发明的相关方面关注的是激活冻干的合成基因网络的方法，所述方法包括：提供包含足够用于模板导向的合成反应的组件的冻干的无细胞体系；以及在水的存在下，使冻干的合成基因网络与冻干的无细胞体系接触。

本发明的另一方面涉及包含本文所述的耐储存的组合物及其包装材料的试剂盒。

在一种实施方式中，试剂盒进一步包含封装物，其中，在模板导向的合成反应期间，所述封装物封装组合物以减缓或防止水分蒸发。

定义

为了方便起见，将在说明书、实施例和附加的权利要求书中的本文所使用的一些术语汇集于此。除非另有说明或在上下文中暗示，下列术语和短语包括下面所提供的含义。除非另有明确定义，或从上下文中来看是显而易见的，下述术语和短语并未排除本发明所属技术领域中所获知的术语或短语的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方式，并且不打算限制所请求保护的发明，因为本发明的范围仅仅受到权利要求书的限制。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通本领域技术人员所通常理解的相同的含义。

本文所使用的术语“包含”或“包括”用于指对于实施方式有用的组合物、方法或其相应的组件，然而对于包含未指定的要素是开性的(无论有用与否)。

除非上下文另有明确指示，单数术语“一(a、an)”和“该/所述(the)”包括复数的指示对象。类似地，除非上下文另有明确指示，单词“或”旨在包括“和”。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文exempli gratia，并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“举例来说/诸如”同义。

本文所使用的术语“耐储存的”是指在室温(即，约20℃至24℃)和相对湿度不超过10％的条件下储藏2周，本文所述的组合物的生物活性(例如，一旦复水时的生物合成活性、酶活性或基因表达水平)变化不超过30％。换言之，如果耐储存的组合物在它被冻干的当天复水的生物活性(本文称为第一天的生物活性)被设定为100％，那么储存两周后，所述组合物的生物活性不低于70％。耐储存的组合物还也可以意味着在储存约3个月后可以重新获得第一天的生物活性的至少3％的组合物，优选重新获得第一天的生物活性的至少5％、至少10％、至少12％、至少15％、至少18％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。

耐储存的组合物被存储在相对湿度最大为60％的环境中。优选地，耐储存的组合物被存储在相对湿度小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％或小于0.1％的环境中。在一种实施方式中，耐储存的组合物被储存在控制湿度的环境中(例如含有干燥剂的干燥器或容器)。优选地，耐储存的组合物被储存在含有氮气的环境中，所述氮气以体积计大于79％、以体积计大于85％、以体积计大于90％、或以体积计大于95％。

在一种实施方式中，耐储存的组合物被储存在阻断自然光的容器中。被阻断的光的百分比可以多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、或多于90％。

本文所使用的术语“基本上无水”是指组合物中的水含量不超过5wt％。所述术语涵盖例如不超过4wt％、不超过3wt％、不超过2wt％、不超过1wt％、不超过0.5wt％、或不超过0.1wt％的水含量。

本文所使用的术语“无细胞体系”是指在没有细胞的情况下，可以在体外提供或支持生物合成反应(例如转录反应、翻译反应、或转录反应和翻译反应)的一组试剂。例如，为了提供转录反应，无细胞体系包含：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸和缓冲系统。无细胞体系可以使用酶、辅酶和其它从真核细胞或原核细胞(包括重组细胞)分离或纯化的其它亚细胞组件来制备，或可作为此类细胞的提取物或一部分来制备。无细胞体系可以衍生自多种来源，包括但不限于真核细胞和原核细胞，例如：细菌，包括但不限于大肠杆菌、嗜热菌等；小麦胚芽；兔网织红细胞；小鼠L细胞；Ehrlich腹水癌细胞；HeLa细胞；CHO细胞和芽殖酵母等。

本文所使用的术语“生物合成反应”是指产生一个或多个生物化合物(例如DNA、RNA、蛋白、单糖、多糖等)的合成的任何反应。例如，转录反应是生物合成反应，因为产生RNA。生物合成反应的其它实例包括但不限于：翻译反应、偶联的转录和翻译的反应、DNA合成和聚合酶链式反应。

本文所使用的术语“体外”是指发生在生物体外的活动。在一些实施方式中，“体外”是指在没有细胞的情况下发生的活动。如本文所使用的，在没有活细胞的多孔固体基底上发生的反应是体外反应。

本文所使用的术语“多孔基底”是指包含孔或空隙的基底，经由孔或空隙流体组合物可以渗透入基底表面。纸是多孔基底的一个实例。

本文所使用的术语“合成生物电路”是指任何工程化的生物电路，其中，生物组件被设计成执行逻辑功能。一般地，需要输入来激活合成生物电路，随后作为输入的函数而产生输出。在一些实施方式中，合成生物电路包含至少一种核酸材料或构建体。在一些实施方式中，合成生物电路基本上不含核酸。合成基因网络是一种合成生物电路。合成生物电路的其它实例包括但不限于：工程化的信号通路，例如通过激酶活性放大输入的通路。

“合成基因网络”或“合成基因电路”在本文中可以互换使用，是指工程化的组合物，所述组合物包含至少一种核酸材料或构建体，并可以执行包括但不限于如下功能：传感、逻辑功能和调节功能。核酸材料或构建体可以是自然发生的或合成的。核酸物质或构建体可以包含DNA、RNA或它们的人工核酸类似物。在包含至少2种核酸材料或构建体的合成基因网络的一些实施方式中，所述核酸材料或构建体可以直接或间接地相互作用。间接的相互作用是指在相互作用中需要其它分子或在相互作用中其它分子进行介导。合成基因网络的一些实例包括可操作地连接至启动子的核酸。

本文所使用的术语“可操作地连接”是指相对于该启动子调节的核酸序列(以控制该序列的转录起始和/或表达)，启动子处于正确的功能定位和/或取向。

本文所使用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用，一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，并包括未修饰的RNA、未修饰的DNA、修饰的RNA和修饰的DNA。多核苷酸包括但不限于：单链和双链DNA和RNA多核苷酸。术语“核酸”包括多核苷酸的化学上、酶学上或代谢学上的修饰形式以及病毒和细胞中发现或表征的DNA和RNA的天然存在的化学形式，所述细胞包括例如简单(原核)细胞和复杂(真核)细胞。如本文所述的核酸的多核苷酸或寡核苷酸保留与其同源的互补链杂交的能力。寡核苷酸并不必须是物理学上衍生自任何现有的或天然的序列，而是能够以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、DNA扩增、体外转录、逆转录或它们的任意组合。

本文所使用的“启动子”是指核酸序列的控制区域，在该处，所述核酸序列的剩余部分的转录的起始和速率受到控制。启动子还可以包含亚区域，在该处，调节蛋白和分子例如RNA聚合酶和其它转录因子可以结合。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、可激活启动子、可阻遏启动子、组织特异性启动子或它们的任意组合。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或转录。

除非上下文另有规定，本文所使用的术语“信号通路”是指信号通路的组件。因此，提及冻干在固体支持物上的“信号通路”是指冻干在固体支持物上的对于感兴趣的信号通路而言必要的组件。类似地，提及冻干在固体支持物上的“基因网络”是指冻干在该支持物上的此类网络的组件。

本文所使用的术语“模板导向的合成反应”是指核酸模板引导添加至核酸或多肽聚合物的核酸或氨基酸的式样的合成反应。DNA复制和转录是模板导向的合成反应，分别使用DNA模板产生DNA或RNA产物。逆转录利用RNA模板产生DNA产物。翻译是模板导向的合成反应，使用RNA模板产生多肽或蛋白。

术语“活化”或“激活”在本文可以互换使用，用于指本文所述的耐储存的组合物或其部分准备就绪来执行固有功能或任务。冻干在固体支持物上的反应组件通过添加水或水性试样被“激活”，重新获得转录和/或翻译活性。在一些实施方式中，所述组合物或其部分在被活化或激活时执行所述功能或任务。在其它实施方式中，所述组合物或其部分在被活化或激活时不执行所述功能或任务，但在提供外部因子(分析物或触发物作为非限制性的实例)时准备好执行所述功能或任务。至少，一旦复水，冻干的反应/组件的混合物重新获得其原始活性的至少3％被认为是“活化的”。优选地，所述混合物重新获得其原始活性(即，临冻干之前的活性)的至少10％、至少12％、至少15％、至少18％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。当两者之间的差异不超过20％时，重新获得的活性可与原始活性相比。

本发明所使用的术语“试样”是指包含一个或多个分析物或被测试一个或多个分析物的存在的任何试样。此类试样包括但不限于衍生自或包含如下的试样：细胞；生物体(细菌、病毒)；裂解细胞或裂解生物体；细胞提取物；核提取物；细胞或生物体的组分；细胞外液；细胞或生物体在其中进行体外培养的培养基；血液；血浆；血清；胃肠分泌物；腹水；组织或肿瘤的匀浆；关节液；粪便；唾液；痰液；囊液；羊水；脑脊液；腹膜液；肺灌洗液；精液；淋巴液；眼泪；胸膜液；乳头抽吸物；乳汁；皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物以及前列腺液。试样可以是：病毒试验或细菌试样；从环境来源获得的试样，如被污染的水体、空气试样或土壤试样；以及食品工业试样。试样可以是生物试样，生物试样是指它衍生自活的生物体或从活的生物体获得的事实。生物体可以是在体内(例如整个生物体)或可以是在体外(例如生长在培养基中的细胞或器官)。试样可以是生物制品。在一种实施方式中，“生物试样”还涉及来自受试者的细胞或细胞群、或一定量的组织或液体。通常，“生物试样”包含来自受试者的细胞，但所述术语还可以指非细胞生物材料，例如血液、唾液或尿液的非细胞部分，所述非细胞生物材料可以例如在复水时用于测量分析物或酶活性水平。生物试样还包括外植体以及衍生自患者组织的原代的细胞培养物和/或转化的细胞培养物。生物试样可以通过从受试者中移除细胞试样而被提供，但还可以通过使用以前分离的细胞或细胞提取物(例如由另一人、在另一时间和/或为了另一目的分离)来完成。还可以使用存档的组织(archival tissues)，例如具有治疗或结果历史的存档的组织。生物试样包括但不限于：组织活检物、刮取物(例如颊部刮取物)、尿液或细胞培养物。生物试样还包括组织活检物、细胞培养物。术语“试样”还包括未处理或经预处理(或预加工)的试样。例如，试样可以被预处理以提高分析物浓度。

本文所使用的术语“触发物”是指能够激活合成基因网络的组合物、分子或化合物。

本文所使用的术语“分析物”是指在试样(例如生物流体或工业流体)中可以使用本文所述的传感器进行分析(例如检测和定量)和监测的物质或化学成分。分析物的实例包括但不限于：小的无机分子或有机分子、离子、核酸(例如DNA、RNA)、多肽、肽、单糖、多糖、代谢产物、激素、抗原、抗体、生物细胞、病毒和脂质体。

本文所使用的术语“小分子”是指：分子量小于约5kD的天然或合成的分子；分子量小于约5kD、小于约2kD或小于约1kD的有机或无机化合物。

本文所使用的术语“便携的”是指可以由普通力量的人用一只手或双手拿起而不需要任何专门的运载体的设备。便携的设备可以被配置为在实验室设置的外部使用。在一些实施方式中，便携的设备由例如电池供电。

除非另有限定，与本申请有关使用的科学术语和技术术语具有本公开所属技术领域的普通技术人员所通常理解的含义。应该理解的是，本发明不限于本文所述的特定的方法学、方案和试剂等，并且本文所述的特定的方法学、方案和试剂等可以变化。本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式的目的，而并不打算限制本发明的范围，本发明的范围仅通过权利要求书进行定义。

附图说明

图1A-图1B显示出冷冻干燥的无细胞体系可以保持生物活性并可以储存一段时间。图1A显示出使用新鲜和冷冻干燥的转录和翻译反应从DNA模板进行组成型GFP表达的时程实验。冷冻干燥的反应具有可与新鲜的反应相比的表达活性。图1B显示出在具有干燥剂包和富氮环境的室温下存储的提取物表现出维持稳定的转录和翻译活性(至少120天)。使用基于T7RNA聚合酶的体系从DNA模板进行GFP表达。

图2A-图2B显示出冷冻干燥的全细菌细胞提取物支持从基于大肠杆菌RNA聚合酶(RNAP)的构建体进行诱导型表达。此处使用抗生素强力霉素的化学类似物(例如脱水四环素，aTc)从TetO启动子诱导GFP(图2A)和mCherry(图2B)表达。

图3A-图3C显示出与大肠杆菌中T7介导的表达(图3A)或基于T7的新鲜反应(图3B)相比，冷冻干燥的T7无细胞表达体系(图3C)具有可比的表达特性。冷冻干燥的T7全提取物或重组无细胞体系可以支持从质粒DNA、线性dsDNA和ssRNA模板进行的诱导型表达。此处GFP表达通过短的触发物RNA从支点(Toe-hold)开关(核糖开关)诱导。

图4显示出疏水环可以用于在纸基底上创建反应区域。将疏水性油墨施加至纸，简单地加热以移除水并保证油墨完全贯穿纸的厚度。使用潮湿的腔室，将各种表达构建体以0.5μl、1.5μl和3μl的加样体积进行测试。

图5A-图5C显示出在石英微纤维或滤纸片(均使用50mg/ml BSA进行预处理)上，嵌入的冷冻干燥的无细胞表达体系支持转录和翻译反应。图5A显示出使用11μM aTc从基于pTetO的DNA模板进行GFP或mCherry的诱导型表达。反应被嵌入石英微纤维。图5B显示出使用嵌入纸片的冷冻干燥的基于T7的表达体系从支点开关进行荧光报告蛋白的诱导型表达。在正确的RNA触发物的存在下，表达被诱导。图5C显示出使用嵌入纸的冷冻干燥的无细胞表达体系，在正确的RNA触发物的存在下，GFP的表达受到支点阻遏物的阻遏。

图6是如何可将4个荧光报告基因涂覆到较大张的纸上的图示，将采用基于蜡的激光打印机或者其它印刷或光刻方法印刷的疏水性屏障用来分隔反应空间。使用触发物RNA，从四个支点开关(56、69、96、117)进行的蛋白表达可以被交替地激活或不激活。

图7A-图7H是使用冷冻干燥的基于T7的无细胞反应(7μl体积、无纸)从如下的8个支点开关进行的GFP表达的时程数据：56(图7A)、69(图7B)、96(图7C)、117(图7D)、PA(图7E)、PB(图7F)、PC(图7G)、PD(图7H)。时程数据显示出与转录-翻译反应(从DNA；虚线)相比，只有翻译的反应(从RNA；实线)被更快地诱导。时间的节省来自于预转录RNA核糖开关，从而使得在存在触发物RNA的情况下立即发生翻译。在冷冻干燥体系中，核糖开关的RNA拷贝不如DNA拷贝稳定。

图8A-图8B显示出在标准的细胞提取物和冷冻干燥前掺杂tetR的细胞提取物之间的基于TetO的诱导的比较。通过在冷冻干燥前添加tetR，使tetO启动子的泄露表达(leakyexpression)最小化，产生更大的倍数变化和基因表达的控制。

图9是基于几丁质酶表达的比色报告系统。在这一情况中，来自tetO_GFP的荧光报告蛋白基因被移除并用几丁质酶置换。在加入aTC诱导物后，几丁质酶的表达被激活。该酶裂解无色的4-硝基苯基-N,N'-二乙酰基-β-D-壳二糖苷底物以生成黄色的对硝基苯酚产物。

图10A-图10C显示出支点开关机理和基于支点开关的传感器。图10A是支点开关机理的示意图。由触发物RNA激活支点开关引起报告基因的表达，报告基因可以为例如荧光报告蛋白、酶或其它功能蛋白。在比色反应的情况中，在一个实例中，酶LacZ被表达，并裂解黄色的氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)底物以产生紫色的氯酚红产物。图10B显示出使用这种基于LacZ的比色输出在纸片上显色，可以看到约25分钟开始显色。最上一行的纸片是用ddH₂O复水的对照；底下一行的纸片用ddH₂O和触发物RNA进行复水。图10C是在有和没有RNA触发物诱导的情况下，来自支点开关56、69和96的比色数据的图像。来自2mm纸片上的冷冻干燥的制品。

图11A-11B显示出当纸或石英被预处理时，基于纸或石英的反应进行的更好。图11A显示出当加入反应前，纸已被预处理、漂洗并随后干燥时，基于纸的反应进行的更好(不希望受到理论的束缚，认为预处理降低了反应组件对纤维素纤维的吸附)。用BSA(列2)、PEG(列3)、Triton X-100(列1)、脱脂牛奶和吐温20(列4)对纸测试最好的处理剂。列5是对照。最后，确定最佳执行者是5％BSA。图11B显示出当加入反应前，石英已被预处理、漂洗并随后干燥时，基于石英的反应进行的更好(不希望受到理论的束缚，认为预处理降低了反应组件对石英纤维的吸附)。用BSA(列1)、PEG(列2)、Triton X-100(列3)、脱脂牛奶和吐温20(列4)对石英微纤维测试最好的处理剂。列5是对照。

图12A-图12B显示出mRNA传感器的示范。(图12A)在超折叠(super-folder)GFP(sfGFP)mRNA的存在下，GFP mRNA传感器被激活并表达mCherry(GFP也从靶GFP mRNA表达)。(图12B)在mCherry mRNA的存在下，mCherry mRNA传感器被激活并表达GFP(mCherry也从靶mCherry mRNA表达)。这被用作传感活性的全长mRNA的构思的证据。

图13A-图13B显示出mRNA传感器可用于抗生素抗性基因。(图13A)冷冻干燥的反应支持处于溶液中的mRNA抗性基因的检测，使用培养板读取器测量GFP输出。(图13B)冷冻干燥的反应支持在纸片上的mRNA抗性基因的检测，利用LacZ酶介导的比色输出。

图14A-图14D显示出如何可将微流体用来递送试样至装置中的多于一个的传感器以及控制蒸发。图14A是显示出通过微流控通道连接的两个传感器的图示。图14B是如何可将塑料膜用于创建将试样递送至多于一个的纸片的微流体的示范。图14C是显示出图14A的设计的横截面的图示。图14D是显示出通过微流体通道连接的四个传感器的图示。

图15显示出以含有用于支点RNA传感器的DNA模板和互补的RNA触发物的无细胞体系水合的几丁质珠。

图16A是基于纸的合成基因网络的示意图。转录、翻译、或转录和翻译所必需的酶被工程化的基因电路结合，随后被嵌入并冷冻干燥至纸内，以创建细胞环境以外的稳定的便携的合成基因网络。这些网络可以包括例如：具有触发物、调节转换器和输出元件的基因学上的编码工具。

图16B是显示出来自新鲜和冷冻干燥的PT7无细胞反应的溶液相中的GFP表达的曲线。

图16C是显示出PT7无细胞表达体系的冷冻干燥的粒状物稳定数月而在复水时产生GFP表达的曲线。

图16D是用于纸上的组成型GFP表达构建体的示意图。

图16E是在孵育的第一个90分钟期间，来自冷冻干燥的S30、S30T7和PT7无细胞体系的组成型的基于纸的GFP表达的一组图像和倍数变化测量。

图16F是GFP或mCherry的TetO调节的示意图。

图16G是来自冷冻干燥的S30反应的TetO启动子、+/-aTc诱导物的GFP和mCherry的一组图像和倍数变化测量。使用11μM的aTc浓度。

图17A-图17C示出在纸上的冷冻干燥的RNA驱使的基因电路。

图17A是从PT7无细胞体系中的8个支点开关(A-H)、+/-互补触发物RNA进行的基于纸的GFP表达的一组图像。

图17B是显示出在孵育的第一个90分钟期间，从支点开关A-H进行的GFP表达的最大倍数变化测量的一组柱图。

图17C是显示出从纸片和石英微纤维片上的支点开关H进行的GFP、venus、mCherry和cerulean荧光蛋白的RNA驱使表达的一组图像。

图17D是在使用384孔板中排列的基于纸的反应的支点开关和触发物RNA之间的正交筛选的一组明视野图像和荧光图像。

图17E是显示出来自含有开关G(底部箭头)的纸片的随时间的荧光定量的曲线。所有数据生成自嵌入至具有其各自的基因电路的纸中的冷冻干燥的无细胞试剂。用于激活支点开关的触发物RNA的浓度为5μM。

图18A-图18I显示出来自基于纸的合成基因网络的比色输出。

图18A是用于产生比色输出的经修改的LacZ表达支点开关的示意图。

图18B是来自支点开关A-H、+/-互补RNA触发物的比色输出的基于纸的一组图像。

图18C是显示在孵育的第一个90分钟期间，来自LacZ支点开关A-H的最大倍数变化测量的一组柱图。诱导倍数(fold induction)基于来自LacZ支点开关的颜色变化的比率。

图18D是显示出来自LacZ支点开关D的超过60分钟的基于纸的显色的一组图像。

图18E是将来自图18D的颜色强度转换为蓝和黄(红+绿)通道并随时间描计的曲线。

图18F是描述使用印刷阵列在纸上排布合成基因网络的工艺的示意图。

图18G是25个反应印刷阵列的图像，阳性反应和对照反应分布在棋盘形图案内。

图18H是开发用于读取来自基于纸的合成基因网络的比色输出的低成本的电子光学读取器的示意图。基于纸的反应保持在LED光源(570nm)和电子传感器之间的芯片内。

图18I是在0nM、30nM、300nM和3000nM触发物RNA的存在下，来自支点开关G的电子光学读取器的时程数据的曲线。所有数据均产生自嵌入至具有各自的基因电路的纸中的冷冻干燥的无细胞试剂。

图19A是基于支点开关的基于纸的mRNA传感器的示意图。

图19B展示出在全长的靶mRNA的存在和不存在下，基于纸的mCherry mRNA传感器的图像和倍数变化测量。GFP响应于mCherry mRNA的检测而产生。

图19C展示出在全长的靶mRNA的存在和不存在下，基于纸的GFP mRNA传感器的图像和倍数变化测量。mCherry响应于GFP mRNA的检测而产生。

图19D是显示出来自编码大观霉素、氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素抗生素抗性的mRNA的传感器的LacZ介导的颜色输出率的倍数变化的柱图。

图19E是显示出相对于mRNA浓度的滴定(titration)的使用为特定目的建造的电子光学读取器的来自氨苄青霉素抗性传感器的颜色输出率的倍数变化的柱图。

图19F展示出来自冷冻干燥的HeLa细胞提取物的组成型的基于纸的GFP表达的图像和倍数变化测量。

图19G是用于葡萄糖纳米传感器中的基于FRET机理的示意图。

图19H是显示出响应于在纸上表达的结合至基于FRET的葡萄糖纳米传感器的葡萄糖的528nm荧光减少的曲线。所有数据产生自嵌入至具有其各自的基因电路的纸中的冷冻干燥的无细胞反应。

图20A-图20B是显示出来自冷冻干燥的粒状物的溶液相反应的曲线。(图20A)来自S30细胞提取物的GFP表达。(图20B)来自S30T7细胞提取物的GFP表达。

图21A-图21F显示出随时间变化的mCherry和GFP的TetO调节的基于纸的表达。

图21A-图21B是显示出TetO调节的mCherry和GFP的时程表达的曲线。

图21C-图21D是显示出作为最大荧光的一部分而绘制的荧光表达率的曲线，其中，最大值＝1。

图21E-图21F是显示出相对于未诱导的对照，来自aTc诱导TetO mCherry和GFP的荧光输出的倍数变化的曲线。RFU，相对荧光单位。误差棒代表标准差。

图22A-图22B显示出用于TetO调节的S30提取物的tetR补充改善了倍数变化测量。误差棒代表标准差。RFU，相对荧光单位。

图22A是显示出在冷冻干燥前，存在或不存在tetR补充时的TetO GFP的aTc诱导的柱图。

图22B是在冷冻干燥前，存在或不存在tetR补充时的TetO mCherry的aTc诱导的柱图。误差棒代表标准差。

图23是显示出从支点开关A-H进行的GFP表达的基于纸的调节的一组曲线。红点指示出采取图17B中报告的最大倍数变化计算的时间点。RNA触发物浓度5μM；RFU，相对荧光单位。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图24是显示出来自支点开关A-H的基于纸的GFP表达率的一组曲线。将荧光表达率绘制为最大荧光的一部分，其中，最大值＝1。红点指示采取图17B中报告的倍数变化计算的时间点。RNA触发物浓度5μM。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图25是显示出相对于未诱导的对照，来自RNA诱导的支点开关的荧光输出的倍数变化的一组曲线。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图26是显示出用于液相反应中的支点开关D的RNA触发物的滴定的曲线。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图27是显示出大肠杆菌中的支点开关诱导和来自冷冻干燥的基于纸的反应的支点开关诱导的比较的一组曲线。

图28A-图28B显示来自支点开关H的4个荧光报告蛋白的基于纸的调节。

图28A是显示出通过支点开关H进行的GFP、venus、mCherry和cerulean荧光蛋白的基于纸的调节随时程变化的一组曲线。

图28B是各自嵌入3个支点开关(开关H_GFP、开关A_cerulean和开关C_mCherry)的石英微纤维片的一组图像。将荷载这些开关的4个纤维片复水，并与水或H、A或C的触发物RNA一起孵育。这些开关的单独的激活使用绿色、蓝色和红色荧光通道反映。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图29A-图29C是显示出来自支点开关H的颜色输出的倍数变化和时程数据的实验数据。

图29A是显示出在孵育的第一个90分钟期间来自支点开关H的venus、mCherry和cerulean表达的最大倍数变化测量的一组柱图。

图29B是显示出绘制为最大荧光的一部分的荧光表达比率的一组曲线，其中，最大值＝1。红点指示采取图29A中报告的倍数变化的时间点。

图29C是显示出相对于未诱导的对照，来自RNA诱导的支点开关H的荧光输出的倍数变化的一组曲线。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图30是显示出来自支点开关A-H的LacZ比色响应的基于纸的调节随时间变化的一组曲线。将比色响应量化为在570nm处的吸光度的测量值。红点指示采取图18C中报告的倍数变化的时间点。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图31是显示出来自LacZ支点开关A-H的颜色变化率随时间变化的一组曲线。将比色响应量化为在570nm处的吸光度的测量值。红点指示采取图18C中报告的倍数变化的时间点。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图32A是相对于未诱导的对照，来自支点开关的基于纸的LacZ比色响应的基于比率的倍数变化一组曲线。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图32B是排列在384孔板中的纸片上的LacZ比色支点开关反应的正交筛选的复合图像。

图33A-图33D显示出替代的在纸上的基于几丁质酶的比色输出。

图33A是显示出在420分钟的比色的TetO_几丁质酶输出的最大倍数变化的柱图。

图33B是嵌入纸中的TetO_几丁质酶系统的一组明视野图像和410nm吸光度图像，+/-aTc诱导。几丁质酶的表达引起无色前体裂解生成黄色产物，通过监测在410nm处的吸光度进行量化。

图33C是通过410nm吸光度测量的基于纸的比色反应的时程演变的曲线。

图33D是绘制为410nm最大吸光度的一部分的比色反应率的曲线，其中，最大值＝1。

图33E是相对于未诱导的对照，来自aTc诱导的TetO几丁质酶的吸光度输出的倍数变化的曲线。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图34A-图34D是显示出用于基于纸的具有LacZ输出的抗生素抗性基因mRNA传感器的全长的靶mRNA滴定的实验数据。汇总了(图34A)卡那霉素、(图34B)大观霉素、(图34C)氯霉素和(图34D)氨苄青霉素抗性基因的LacZ mRNA传感器的基于比率的倍数变化(培养板读取器，Abs 570nm)。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。误差棒代表标准差。

图35A是来自低成本的电子光学读取器的氨苄青霉素抗性传感器的时程的曲线。所示出的值是3重复或4重复数据的平均值。

图35B是显示出通过具有LacZ输出的基于纸的氨苄青霉素抗性基因mRNA传感器进行的LacZ比率的倍数变化测量随时间变化的曲线。

图36是在存在和不存在10mM葡萄糖的条件下，基于FRET的葡萄糖传感器的荧光光谱的曲线。如先前报道，在葡萄糖的存在下，使用冷冻干燥、在Hela细胞提取物中的无细胞表达，纳米传感器的528nm荧光峰受到阻抑。RFU，相对荧光单位。

图37A-图37D是显示出封闭纸和石英微纤维改善了GFP表达的效率的一组图像。(图37A)在2mm纸片上的支点开关H_GFP反应，该纸片使用5％BSA、5％Triton X-100、5％PEG8k、5％吐温20进行封闭或用清水进行漂洗。(图37B)在经如上处理的纸片上的支点开关B_GFP，(图37C)在经如上处理的2mm石英微纤维片上的支点开关H_GFP以及(图37D)在经如上处理的石英微纤维片上的支点开关B_GFP。

图38A-图38B显示出用于光学电子读取器的制造的组件。(图38A)通过2个多路复用器将570nm LED光源和光度传感器配合至Arduino Micro。(图38B)用于使用激光打印机从黑色丙烯酸树脂切割读取器外壳的线图。

图39A-图39E表示用于来自埃博拉病毒的Sudan株和Zaire株的序列的基于纸的RNA传感器的快速原型开发。

图39A是生成埃博拉RNA传感器的示意图。将具有相同字母的传感器靶向至它们各自的菌株的埃博拉核蛋白mRNA的相同窗口。

图39B是显示出基于24个支点开关的RNA传感器被构建并在12h的时间段内进行测试的柱图。对于病毒的Sudan株和Zaire株，基于RNA区段窗口(A-L)，报告了在37℃下于第一个90分钟的期间内的最大倍数变化。倍数变化率从570nm处的吸光度随时间变化的斜率确定(-对照，+3000nM RNA触发物)。

图39C为用于测试24个传感器的240个基于纸的反应的复合图像。对照和未触发的支点传感器保持黄色，而激活的支点传感器已经变成紫色。

图39D是显示出对来自原始组的24个传感器的4个Sudan传感器和4个Zaire传感器的序列特异性进行测试的柱图。靶向Sudan序列的4个传感器中的每一个用3000nM来自互补的Zaire RNA序列的脱靶RNA序列进行处理，反之亦然。

图39E是显示出相对于RNA浓度滴定的传感器SD和ZH的颜色输出率的倍数变化的一组柱图。

图40A-图40D示出基于纸的汇聚的转录级联。

图40A是将从大肠杆菌RNAP进行的转录转变为从T3RNAP和/或T7RNAP进行的转录的遗传学上编码的组件的示意图。这些新的RNAP的表达驱动具有T3或T7启动子、支点开关和触发物对的先前休眠的GFP构建体分别在T7和T3调节下的转录。

图40B展示出在有和没有T3级联模块下的基于纸的T3GFP表达的图像和倍数变化的测量。

图40C展示出在有和没有T7级联模块下的基于纸的T7GFP表达的图像和倍数变化的测量。

图40D展示出在有和没有T3和T7级联模块下的基于纸的T3/T7依赖性GFP表达的图像和倍数变化的测量。所有数据均产生自具有它们各自的GFP表达构建体的嵌入纸中的冷冻干燥的无细胞反应；在复水时，加入级联模块作为DNA组件。在过夜孵育后收集数据。

具体实施方式

本文所述的技术的方面与下述发现有关，当在室温下存储一段时间后，包含足够用于模板导向的合成反应的组件的冻干的合成基因网络和/或无细胞体系可以保持其生物活性。一旦加入水，合成基因网络和/或无细胞体系可以变成活化的，并能够以与容纳在活细胞体系中的对应物相比相同或类似的方式运行。例如，如图1A所示，绿色荧光蛋白(GFP)可以在冷冻干燥的无细胞体系被激活后产生；并且GFP可以发射绿色荧光，表明所述蛋白适当折叠且是活化的。这个出乎预料的发现提供了用于基于合成基因网络的新设备的安全部署、无菌和非生物的运输和/或存储的到当前为止未获得的方法。这一发现为合成生物学应用开辟了新的有意义的途径。在体外诊断领域，这转化为基于合成基因网络的传感器和逻辑处理的开发。在研究和教育领域，这转化为用于研究或教育目的的合成基因网络的安全配置。

为了利用这一发现，开发了本文所述的设备和方法，并可以广泛适用于多个领域，包括但不限于：即时诊断、临床和工业设置以及消费品。

因此，本文所述的技术的一个方面关注的是使包含足够用于模板导向的合成反应的组件的合成基因网络和/或无细胞体系稳定的方法，所述方法包括冻干合成基因网络和/或无细胞体系。在一种实施方式中，冻干步骤在固体支持物上完成。一旦复水，合成基因网络或无细胞体系重新获得生物活性。在一种实施方式中，生物活性是生物合成活性。

本文所述的技术的相关方面关注的是包含无细胞体系的耐储存的组合物，所述无细胞体系包含用于模板导向的合成反应的组件，其中，无细胞体系被冻干在固体支持物上。一旦复水，所述无细胞体系可以变成对于模板导向的合成反应来说是活化的。

在一种实施方式中，模板导向的合成反应是转录反应，并且足够用于转录反应的组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸和缓冲系统。RNA聚合酶的实例包括但不限于：T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。

在一种实施方式中，模板导向的合成反应是翻译反应，并且足够用于翻译反应的组件包括：核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。翻译因子的组件被披露于：Shimizu和Ueda，“Pure Technology”，Cell-Free Protein Production:Methods and Protocols，Methods in Molecular Biology，Endo等(编)，Humana 2010；以及Shimizu等，“Cell-freetranslation reconstituted with purified components”，Nature Biotechnology2001，19，751-755。例如，在大肠杆菌中，负责蛋白的生物合成的翻译因子是三种起始因子(IF1、IF2和IF3)、三种延伸因子(EF-G、EF-Tu和EF-Ts)和三种释放因子(RF1、RF2和RF3)以及用于终止的RRF。用于蛋白合成的示例性的无细胞体系披露于US6780607、US8445232、US20090317862、US20130053267、WO2013067523、WO2014122231，以引用的方式将其各自的内容整体并入本文。

在一种实施方式中，模板导向的合成反应是偶联的转录和翻译反应，并且足够用于偶联的转录和翻译反应的组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸、核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。在偶联的转录和翻译反应中，DNA被转录为mRNA，且mRNA随后被翻译成蛋白质，如同Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编著，Wiley Interscience，2002)中的描述，以引用的方式将该文献并入本文。

在一种实施方式中，模板导向的合成反应是DNA合成，并且足够用于DNA合成的组件包括：DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸和缓冲系统。所述DNA聚合酶可以是但并非必须是耐热DNA聚合酶。

在一种实施方式中，模板导向的合成反应是聚合酶链式反应(PCR)，并且足够用于PCR的组件包括：DNA模板、引物、耐热聚合酶、脱氧核苷三磷酸和缓冲系统。

在一种实施方式中，无细胞体系包括全细胞提取物。所述全细胞提取物可以是来自任何生物体的任何细胞类型的提取物。例如全细胞提取物可以是兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物、小麦胚芽提取物、大肠杆菌提取物、哺乳动物细胞提取物(例如人细胞提取物)。当所产生的蛋白被糖基化、磷酸化或其它修饰时，真核生物提取物或裂解物可为优选的，因为很多此类修饰只在真核系统中可行。商业化的全细胞提取物可通过下述供应商广泛提供，例如：Thermo Scientific、Life Technologies、New England Biolabs Inc.、Sigma Aldrich和Promega。膜提取物，例如含有微粒体膜的犬胰腺提取物也是可得到的，将其用于翻译分泌蛋白。还将纯化的翻译因子的混合物、以及补充有纯化的翻译因子如起始因子1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因子T(EF-Tu)或终止因子的裂解物或者裂解物的组合成功地用于将mRNA翻译为蛋白。

在一种实施方式中，无细胞体系包含重组的蛋白转录/翻译系统。在一种实施方式中，所述重组的蛋白转录/翻译系统使得能够使用重组元件(PURE)或

(NewEngland Biolabs，Ipswich,MA)无细胞转录/翻译系统合成蛋白。

是从经纯化的大肠杆菌翻译必需的组件重构成的无细胞转录/翻译系统。

在一种实施方式中，一旦复水，无细胞体系可以简单地起始模板导向的合成反应(例如图1A)。

在另一实施方式中，一旦复水，无细胞体系变成对模板导向的合成反应而言是活化的，但需要输入物(input)以起始反应。

在一种实施方式中，无细胞体系被部分或完全嵌入在固体支持物中。在一种实施方式中，无细胞体系处于固体支持物的表面。

固体支持物可处于任何形式，包括但不限于：孔、管、平面基底(例如芯片或培养板)、球、多孔基底(例如网格或泡沫)、3D支架、图案化表面(例如纳米图案或微图案或同时为两者)、多孔珠或实心珠、水凝胶、通道(例如微流体通道)、光滑表面和粗糙表面。在优选的实施方式中，固体支持物是亲水性的并且优选是多孔的。

图案化表面可以是物理图案化或化学图案化或同时为两者。物理图案化表面是织构化的(textured)，并且可以包括纳米图案、微图案或同时为两者。化学图案化表面通常包含以期望的图案附着至表面的疏水性分子和/或亲水性分子。例如，疏水性表面可以与亲水性分子形成图案，以使一些区域具有亲水性。生产物理图案化表面或化学图案化表面的方法在本领域是已知的。

在优选的实施方式中，固体支持物包括可以具有高的毛细作用的基质。高的毛细作用使小体积的液体能够均匀分布于大的表面积，而不使用泵。优选地，具有高的毛细作用的基质是多孔且亲水性的。

在优选的实施方式中，固体支持物包括纸。可以用于本文所述的技术的纸可以包括但不限于：印刷纸、包装纸、书写纸、绘图纸、特种纸(例如色谱纸；滤纸，如Whatman^TM滤纸)、手工纸或吸墨纸。使用纸赋予了多个优点：低成本、重量轻和薄的截面。此外，白纸可以充当显示光信号(例如荧光、冷光(luminescence)或可见的颜色)的表面。

在一种实施方式中，纸是亲水性，并优选是多孔的。

在一种实施方式中，纸是疏水性的。例如疏水性的纸可以在用激光处理后变成亲水性的(Chitnis等，Lab Chip 2011，11，1161)，因此，可以通过选择性的激光扫描在疏水性的纸上创建亲水区。

在一种实施方式中，固体支持物包括石英微纤维、纤维素的混合酯、醋酸纤维素、丝、多孔氧化铝(例如Anopore膜)或再生膜。

在一种实施方式中，耐储存的组合物被冻干在管/微腔室内，然后在复水时转移至高毛细作用的材料。

在一种实施方式中，固体支持物包含粘性组件，从而使耐储存的组合物保留在表面。

在一种实施方式中，固体支持物包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个或更多个空间上不同的反应区，无细胞体系被限制在其中。包含无细胞体系的区域在本文中被称为“反应区”。举例来说，反应区可以通过化学工艺、例如使用处于一张纸上的疏水性屏障来创建(图4或图18F)。疏水性屏障具有最低的水可渗透性。当包含无细胞体系的水溶液被加入至反应区时，由于疏水性屏障的存在，溶液被限制在反应区域内。疏水性屏障可以包含疏水性材料，例如疏水性聚合物或蜡。疏水性屏障可以通过任何现有的图案化方法(例如微接触印刷、蘸笔光刻、光刻、电子束光刻、激光打印、喷墨打印或微阵列仪)进行图案化。在纸上创造疏水性图案的方法在本领域是已知的；参见例如WO2009121041和WO2008/049083，以引用的方式将其各自的内容并入本文用于疏水性图案化方法。

所述反应区可以按照随机或预定的图案(例如线性图案、周期性图案或准周期性图案)安排。所述反应区可以使用图案化装置(例如激光打印机、喷墨打印机或微阵列仪)在固体支持物上进行图案化。所述反应区还可以通过物理工艺、例如在固体支持物上打孔来创建。

在一种实施方式中，固体支持物可使用蛋白源(例如牛血清白蛋白、奶粉、酪蛋白或鱼明胶)、聚乙二醇、表面活性剂(例如聚山梨酯20或Triton-X)或它们的组合进行前处理。不希望受到理论的束缚，这一前处理步骤可以通过限制反应组件的非特异性结合和/或不可逆结合来增加荧光信号的信噪比。例如参见图37。

在一种实施方式中，固体支持物包含将反应区连接至用于添加水性试样的区域的一个或多个流体通道(例如微流体通道)。在这一实施方式中，当水性试样被添加至所述区域时，所述流体被吸收至反应区，从而多个反应区可以被相同的试样激活(例如参见图14A-图14D)。

在一种实施方式中，固体支持物可以进一步包含电极，从而使固体支持物能够与电子设备连接。例如，电极可以使用下述方法进行图案化，包括但不限于：光刻、电子束光刻和掩膜蒸发(masked evaporation)。例如纸上的电极图案化的方法可见于WO2009121041。

在一种实施方式中，固体支持物是反应芯片。反应芯片可包含试样容纳层、光阻挡层、水合层、透明层、湿度保持层和水蒸气渗透层。水合层可以包含在孵育和/或测量期间提供湿度的水合的材料或腔室。湿度保持层可以是不透水的。水蒸气渗透层可以对试样调节湿度。

在一种实施方式中，耐储存的组合物进一步包含合成基因网络。合成基因网络过去在很大程度上局限于研究实验室，因为其依赖于活细胞系统并且缺乏长期储存的手段。本发明人的发现克服了这些挑战，并提供了简单而高效的解决方案，用于存储和运输基于合成基因网络的设备。此外，本文所述的耐储存的组合物可按需使用，这在过去是不可能实现的。

从合成生物学开始，各种各样的合成基因网络已经被证明，并且任何合成基因网络可以适用于本文所述的技术，包括但不限于：传感器、开关、计数器、定时器、变换器、触发器、逻辑门(例如与门、非门、或门、或非门、与非门、异或门、异与门、同或门(XNOR)、A蕴含B(A IMPLY B)、A NIMPLY B、B蕴含A、B NIMPLY A、或它们的组合)或存储设备(例如易失性的或非易失性的)。合成基因网络的实例可见于US6737269、US20100175141、US20120003630、US20130009799、US20130034907和WO2014093852，以引用的方式将其各自的内容整体并入本文。例如，WO2014093852描述了基于合成基因网络的16个逻辑门：与门、或门、非A门、非B门、或非门、与非门、异或门、同或门、A蕴含B、B蕴含A、A NIMPLY B、B NIMPLY A、A、B、假(FALSE)和真(TRUE)。构建合成基因网络的方法也被披露在例如Synthetic GeneNetworks，Weber和Fussenegger(编著)2012，Humana Press中，以引用的方式将其内容整体并入本文。合成基因网络也被冻干在固体支持物上，并驻留在同一反应区作为无细胞体系。类似于无细胞体系，一旦复水，合成基因网络变成活化的。

不希望受到理论的束缚，耐储存的组合物中的不同组件之间的关系可以从信息流的角度来理解。在简单的情况中，来自环境的输入物(例如分析物、触发物或组合)对加工信息的合成基因网络提供了上游信息，并把它传递给无细胞体系。无细胞体系进行基于信息的模板导向的合成反应，然后以对环境而言的输出物(例如光信号、电信号或组合)的形式生成下游信息。

在一种实施方式中，合成基因网络包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核酸。核酸包括：DNA、RNA、人工核酸类似物或它们的组合。

在一个方面，合成基因网络作为传感器发挥功能。在一种实施方式中，所述传感器可以检测分析物。当分析物在水的存在下接触耐储存的组合物时，所述分析物激活传感器，所述传感器产生信号，指示分析物的检测。在一些实施方式中，信号是光信号。并不加以限制的是，光信号可以是荧光、冷光、给定波长的吸收或反射、紫外、可见的颜色或红外。在一些实施方式中，信号是电子信号(例如电导率变化或电容变化)。

在一种实施方式中，传感器包含报告子组件。报告子组件的功能是当检测到分析物时产生可检测的信号。在一种实施方式中，报告子组件可用于量化被本发明的组合物接收的输入物的浓度、强度或活性。在一种实施方式中，报告子组件包括报告基因。编码任何荧光蛋白的报告基因可适用于本发明。荧光蛋白包括但不限于，例如GFP、mCherry、Venus和Cerulean。可以根据本文所述的组合物和方法使用的基因编码的荧光蛋白的实例包括但不限于由美国专利申请No.2012/0003630提供的蛋白(参见表59)，以引用的方式并入本文。

类似地，编码任何酶的报告基因也可以适用。产生有色底物的酶(“比色酶”)也可用于可视化和/或定量。酶产品可以使用分光光度计或包含培养板读取器的可以进行吸光度测量其它仪器进行量化(例如参见图26)。可根据本文所述的组合物和方法使用的编码比色酶的基因的实例包括但不限于：lacZα片段、lacZ(编码β-半乳糖苷酶，全长)和xylE。酶(例如葡萄糖氧化酶)还可以改变反应容积(reaction volume)的电导率，使得能够进行电学或电子读取(Malitesta等，Anal Chem 1990，62，2735-2740)。在另一实例中，核酸酶可以切割核酸序列，从而生成电子信号和光信号。在又一实例中，酶可以分离荧光共振能量转移(FRET)对或淬灭对，以诱导荧光方面的变化。

可应用编码任何抗原的报告基因是可用的，针对该抗原的特异性抗体是可用的或可以被制造。举例来说，由于抗原通过报告基因表达，所述抗原结合至包被有互补抗体的电极结合，产生电子信号。相反，报告基因可以编码抗体，在表达时，抗体与包被有互补抗原的电极结合。报告基因的非限制性的实例参见Reporter Genes:A Practical Guide，D.Anson(编著)2007，Humana Press，以引用的方式将其内容并入本文用于关于报告基因的实例。

编码荧光素酶的报告基因也可以用于本文所述的技术。荧光素酶产生冷光，使用培养板读取器仪或冷光计量器可以容易地进行量化。可根据本文所述的组合物和方法使用的基因编码的荧光素酶的实例包括但不限于：dmMyD88-linker-Rluc、dmMyD88-linker-Rluc-linker-PEST191和萤火虫荧光素酶(来自Photinus pyralis)。

在一种实施方式中，报告子组件包含催化核酸，包括但不限于：核酶、切割RNA的脱氧核酶、组I核酶、RNase P、丁型肝炎核酶和DNA酶。将催化核酸用作为报告子在WO1996027026中描述。

在一种实施方式中，报告子组件包含荧光团、代谢产物或蛋白，其中，荧光团、代谢产物或蛋白可偶联至核酸以产生荧光方面的变化。例如，RNA-荧光团复合物已被报道，并可用于本文所述的组合物和方法中(参见例如Paige等，Science 2011，333，642-646)。结合至代谢物或蛋白的RNA也可以导致荧光方面的变化(参见例如Strack等，Nature Protocols2014，待刊登)。在一种实施方式中，核酸可以是分析物。在另一实施方式中，由于分析物的检测，核酸可以被转录。

在一种实施方式中，传感器或网络包含编码治疗肽、蛋白、抗生素或其它治疗剂的基因，所述基因响应于特定组的条件(例如病原的存在)而产生。例如，传感器或网络可以通过嵌入伤口敷料/急救绷带用于感染监测以及比色输出预警和/或产生治疗剂。

在一种实施方式中，传感器是RNA传感器。RNA传感器可以检测全长RNA或其片段。在一种实施方式中，RNA传感器可以检测信使RNA(mRNA)。

在一种实施方式中，RNA传感器基于支点开关(toe-hold switches)的原理创建(图10A)。支点开关的合理的可编程性来自支点开关的设计。核糖核酸调节子(riboregulators)由两个同源RNA组成：编码系统的输出信号的转换器(transducer)RNA(例如GFP mRNA)和调制输出信号的触发物RNA。常规的核糖核酸调节子历来通过隔离发夹内的转换器RNA的核糖体结合位点(RBS)阻遏翻译。该发夹在结合同源的触发物RNA时不缠绕，暴露RBS并使下游蛋白能够翻译。然而，这一设计将潜在的触发物RNA限制至包含RBS序列的触发物RNA。支点开关通过移动RBS至发夹的环区而移除这一约束，使得触发物RNA结合位点采用事实上的任何序列。支点开关的转换器或“开关”RNA还包含已知为支点的5’端的单链结构域。这一支点结构域首先在体外分子编程研究中被开发(Yurke,B.等，Nature2000，406，605-608)，提供了用于在触发物RNA与开关RNA之间结合的最初的反应位点，并极大地改善了开关的ON/OFF比。基于支点开关的RNA传感器的实例可见于例如WO2014074648，以引用的方式将其内容整体并入本文。

本发明人展示了大范围的基于冷冻干燥的合成基因网络的荧光或比色传感器。在RNA传感器的一个实例中，报告子组件包含编码LacZ酶的基因。被检测的分析物是特定的RNA分子，在包含用于翻译的组件的无细胞体系存在时，可激活LacZ的翻译。LacZ在本领域是已知的，用于裂解黄色的氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)底物以产生紫色的氯酚红产物。由于RNA传感器还包含黄色的氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)底物，从黄色到紫色的颜色变化可以指示RNA的检测(图10C)。在RNA传感器的另一实例中，几丁质酶被用作替代的比色报告酶，该酶裂解无色的4-硝基苯基-N,N'-二乙酰基-β-D-壳二糖苷底物成为黄色的对硝基苯酚产物(图9)。

RNA传感器可用于检测试样中的感兴趣的RNA，并且任选地定量RNA水平。感兴趣的RNA包括但不限于：抗生素抗性基因和编码感兴趣的蛋白的mRNA。

在一种实施方式中，反应区容纳相同的传感器，并因此可以对多个试样测试相同的分析物。

在一种实施方式中，反应区域容纳不同的传感器，并因此在相同的支持物或基底上可以检测多个分析物。

在一种实施方式中，相同的反应区域可以容纳一个或多个不同的传感器。

分析物可以是气体分子、小分子、核酸、蛋白、肽、病原体、病原体提取物、代谢物、抗生素药物、爆炸性化学品、毒性化学品或工业化学品。工业化学品可以是工艺的副产品(例如纤维二糖)、燃料生产中的中间体或生物反应器产品(例如维生素)。分析物可以是固体、液体或气体。在一种实施方式中，分析物是重金属。在一种实施方式中，分析物是杀虫剂残留。分析物可以来自多种试样，包括但不限于：生物试样、环境试样、培养物试样、工业试样(例如生物燃料产品)。

在产生荧光信号的传感器的一些实施方式中，对本领域技术人员来说显而易见的是，可将任何可检测荧光的商业化或自制的设备或系统用于检测信号的目的，包括但不限于：显微镜、荧光酶标仪和荧光分光光度计。

在产生比色信号的传感器的一些实施方式中，人眼可以在从约390nm至700nm的可见光谱范围内检测到信号。还可以使用可检测比色信号的商业化或自制的设备，包括但不限于：照相机和显微镜。

在产生电子信号的传感器的一些实施方式中，对本领域技术人员来说显而易见的是，可测量电子信号的任何商业化或自制的设备或系统可以用于检测信号的目的。示例性的设备或系统包括：万用表、欧姆表、电压表、电流表和示波器。

对于信号检测，自动设备或系统可以使得能够连续监测，并显著提高检测通量。

在一种实施方式中，传感器可检测温度、压力、湿度、光强度、光谱或它们的组合。

在另一方面，合成基因网络包含逻辑电路(logic circuit)，并因此可以在激活时执行一种或多种逻辑功能。在合成生物学领域，在设计和组装生物组件成为可以模仿或甚至优于电子电路的逻辑电路方面已经取得了显著进展，引起各种各样的逻辑电路的创建。例如参见WO2014093852。

在一种实施方式中，可以通过逻辑电路与水接触来激活逻辑电路。

在一种实施方式中，可以通过使逻辑电路与水和包含一个或多个触发物的组合物接触来激活逻辑电路。举例来说，与门是最基本的逻辑电路之一，要求同时存在2个适当的触发物，以便与门打开。如果仅触发物中的一个存在，与门就不会打开。

触发物可包括温度、压力、湿度、光强度、光谱、电流、电压、化学元素、离子、小分子、肽、蛋白、核酸、提取物或它们的组合。

在一种实施方式中，通过本文所述的传感器产生的信号可以充当逻辑电路中的组件。

在一种实施方式中，冻干入反应区中的蛋白或通过模板导向的合成反应表达的蛋白可以形成逻辑函数或逻辑函数的一部分。

蛋白掺杂可以是调整无细胞应用的调节和酶环境的有效途径。耐储存的组合物可以掺杂各种蛋白。在一种实施方式中，耐储存的组合物进一步包含阻遏蛋白。不希望受到理论的束缚，阻遏蛋白可以改善一些合成基因网络的性能。例如，阻遏蛋白可防止在不存在分析物时报告子组件产生信号的可能性或者降低在不存在分析物时报告子组件产生信号的可能性。在一种实施方式中，阻遏蛋白是转录阻遏物。

在一些实施方式中，耐储存的组合物进一步包含扩增系统。扩增系统包含例如一组足够用于核酸(例如RNA或DNA)扩增的试剂。例如，靶RNA可以在其检测之前被扩增，从而产生更好的信噪比。在一种实施方式中，扩增是等温扩增(参见例如Yan等，MolecularBioSystems，2014，10，970-1003)。在一种实施方式中，扩增系统包含DNA聚合酶Phi 29。关于使用Phi 29用于扩增的信息被披露于例如Dean等，Genome Research，2001，11，1095-1099中。

冻干，又称为冷冻干燥，是涉及冷冻材料并随后降低周围压力以使水升华的脱水过程。对于不同的冻干过程，参数例如冷冻温度、温度变化率和压力是变化的。因此，在本文的方法和组合物中使用的冻干过程并不限于特定组的参数。优选的冻干过程会产生具有长保质期的耐储存的组合物，这对本领域的熟练技术人员来说应当是显而易见的。一旦合成基因网络和/或无细胞体系被冷冻，它们应当保持冷冻(即防止解冻)，直到施加低压(例如真空)。当需要时间来运输低容积的冷冻的合成基因网络和/或无细胞体系至冷冻干燥机时，这可存在挑战。这可以例如通过如下解决：在运输至冷冻干燥机的过程中，放置冷且密实的材料(例如已在-80℃下或在液氮中冷冻的金属或丙烯酸树脂)与合成基因网络和/或无细胞体系接触以充当冷源。所述材料可具有大的热容。在一种实施方式中，冷冻的合成基因网络和/或无细胞体系在冷冻干燥期间基本上是避光的。这对于保护对光敏感的组件特别有用。

执行冷冻干燥的仪器是可通过供应商例如Cole-Parmer和Millrock Technology商购的。在一种实施方式中，耐储存的组合物通过下述工艺制造，该工艺包括：用包含无细胞体系和合成基因网络的水性溶液接触固体支持物；以及冻干所述固体支持物。

在一些实施方式中，当存储在室温(即，约20℃至24℃)和相对湿度不超过10％时，所述组合物具有至少2周、至少1个月、至少2个月或至少6个月的保质期。

在一种实施方式中，本文所述的组合物可以在室温下发挥作用。为了增加组合物的反应效率，在一种实施方式中，所述组合物发挥功能的温度是约37℃。耐热酶的使用使得能够利用高于37℃的温度。

在一种实施方式中，本文所述的组合物可以在到达一定温度阈值时发挥作用。在一种实施方式中，温度阈值是约37℃。耐热酶的使用使得能够利用高于37℃的温度。

应当指出的是，本文所披露的技术旨在还涵盖任意类型的冻干的合成生物电路，例如基本上无模板核酸的合成生物电路。例如工程化的信号通路可以被冻干在固体支持物上；包含激酶的溶液可以被用于激活所述通路并扩增输入物。存在两种主要类型的工程化的信号通路：将现有的信号转导通路重新布线的工程化的信号通路、以及创建人工信号模块的工程化的信号通路。有关工程化的信号通路的更多的细节可见于例如Kiel等，Cell2010，140，33-47以及Grubelnik等，Biophysical Chemistry2009，143，132-138，以引用的方式将其各自的内容整体并入本文。

本文所述的方法和组合物的相关方面涉及包含冻干的合成基因网络的耐储存的组合物。在一种实施方式中，耐储存的组合物是可以装在任何种类的容器中的粉末。例如，冻干的合成基因网络可以装在下述容器中，例如：管、瓶或小瓶。在一种实施方式中，包含冻干的合成基因网络的耐储存的组合物可以被复水以形成溶液。

本文披露的技术还旨在涵盖在冻干过程中产生的任何中间产品。例如，本文披露的技术涵盖可以在解冻时变成为活化的冷冻的无细胞体系和/或合成生物电路(例如合成基因网络)。

本文所披露的技术的其它方面涉及本文所述的耐储存的组合物的各种应用。更具体地说，一方面关注的是检测分析物的方法，该方法包括：提供本文所述的耐储存的组合物，其中，所述组合物包含本文所述的传感器；在水的存在下，使组合物与分析物接触；并检测信号，其中，信号的检测指示分析物的存在。在一种实施方式中，所述方法进一步包括防止或减缓水分蒸发的步骤。在一种实施方式中，所述步骤包括将组合物与水分蒸发的屏障接触。屏障是物理屏障，包括但不限于：条带、膜、载玻片、盖以及与水不混溶的溶液(例如油)。在一种实施方式中，所述步骤包括将所述组合物封装入封装物中，该封装物限制水分的蒸发。

为了产生可检测的信号，合成基因网络和无细胞体系通常需要孵育期。在给定的温度(通常例如37℃)下的孵育可以进行大约数秒、数分钟或数小时，取决于确切的系统。正如在本文的实施例中所看到的，在一些实施方式中，反应随着持续孵育而持续产生产品或信号，从而使得能够生成信号积累的反应曲线。

在一种实施方式中，所述方法产生定性输出(例如正输出或负输出)。例如，正输出意味着分析物被检测到，而负输出意味着分析物未被检测到。

在一种实施方式中，所述方法产生定量的输出。本文所使用的术语“定量”还涵盖了半定量。在一种实施方式中，可以通过如下进行量化：针对阴性对照比较通过传感器产生的信号；并随后相对于时间对信号强度进行量化。在一些实施方式中，具有不同的已知量的分析物的对照反应或一组对照反应可以用于提供未知试样中的分析物的定量。在RNA传感器的一种实施方式中，非活性RNA(inert RNA)可以用来限定RNA传感器的阈值。

本发明披露的技术的另一方面关注的是激活冻干在固体支持物上的合成基因网络的方法，该方法包括：提供本文所述的耐储存的组合物，其中，所述组合物包含合成基因网络；以及使所述组合物与水或水性试样接触。

本文披露的技术的相关方面关注的是激活冻干的合成基因网络的方法，该方法包括：提供包含足够用于模板导向的合成反应的组件的冻干的无细胞体系；以及在水的存在下使冻干的合成基因网络与冻干的无细胞体系接触。

本文披露的技术的又一方面涉及包含本文所述的耐储存的组合物及其包装材料的试剂盒。在一种实施方式中，所述试剂盒进一步包含封装物，其中，在模板导向的合成反应过程中，所述封装物封装所述组合物以减缓或防止水分蒸发。

在一种实施方式中，本文所述的是在读取器或检测装置中的基于纸的合成基因网络，其中，所述读取器或检测装置检测通过合成基因网络产生的信号。在一种实施方式中，在检测过程中，基于纸的合成基因网络被设置在支持物上。

应用领域

体外诊断

为了应用于体外诊断领域，基于纸的转录和/或翻译反应可用于容纳(host)基于核酸的传感器程序。在组合中，这些组件被用来构建设备，该设备可以检测例如病原体和环境污染物的存在，并测量患者生理、化学环境和来自环境的生物信号的其它参数。

合成生物学

如本文所述，通过依靠其恰当的折叠结构而发出荧光的荧光蛋白(例如GFP、mCherry、Cerulean或Venus)证明了，使用本文所述的组合物合成的蛋白是恰当折叠的。此外，本文所述的实例表明，可以使用本文所述的组合物合成具有酶活性(例如，β-半乳糖苷酶或几丁质酶)的蛋白，并且可以生产出足够量的此类蛋白以修饰底物(例如CPRG或几丁质)。本文所述的实例还表明，可以使用本文所述的组合物合成能够执行任务的分子工具(例如RNA支点开关或基于FRET的纳米传感器)。

因此，总的来说，本文所述的组合物和方法也为合成生物学提供了新的领域。除了体外诊断，本文所述的组合物和方法提供了急需的媒介用于合成生物学的商业化。这种方法可以使得能够将基于合成生物学的技术简单、无菌且非生物地配置至临床设置、食品加工以及工业、军事和消费产品。这可以涵盖将传感器、计数器、定时器和其它合成基因网络嵌入产品以及用于分子制造的工具中。后者的实例包括按需制造、原位制造：药物、治疗蛋白以及其它生物分子或生物材料。与3D印刷技术类似，这些应用可以产生对具有冻干的试剂和“分子程序”库任一者而言可行的可扩展的分子合成。使用本文所述的组合物和/或方法的分子制造能够以应用于实验室内和实验室外的便携方式完成，而不需要冷链。

在分子制造的一种实施方式中，可以使用本文所述的组合物和/或方法合成病毒。优选地，病毒是无包膜病毒。无包膜病毒可来自如下的科，包括但不限于：腺病毒科(例如腺病毒、传染性犬肝炎病毒)；乳多空病毒科(例如乳头状瘤病毒、多瘤病毒属、猿猴空泡病毒)；细小病毒科(例如细小病毒B19、犬细小病毒)；指环病毒科(例如细环病毒)；花椰菜花叶病毒科(例如花椰菜花叶病毒)；肌病毒科；藻类脱氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)；盖病毒科；环病毒科；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、轮状病毒)；小核糖核酸病毒科(例如肠道病毒、鼻病毒、肝病毒、心病毒、口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒、双埃可病毒、马鼻病毒、嵴病毒、捷申病毒、柯萨奇病毒)；杯状病毒科(例如诺瓦克病毒)；星状病毒科(例如星状病毒)、肝炎病毒科(例如戊型肝炎病毒)；双核糖核酸病毒科(例如鸡腺胃坏死病毒)和马铃薯Y病毒科。

对于病毒合成，可以使用含有无细胞体系和编码感兴趣的病毒的一组合适的蛋白(例如衣壳)的一组核酸的冷冻干燥的组合物。当冷冻干燥的组合物例如通过加入水被激活时，蛋白可以在体外合成，然后自组装形成病毒。当掺入伤口敷料、局部制剂或者可植入装置或制品时，病毒将在应用位点处被组装。这可以允许例如在需要的位点生产病毒载体或简单地以按需方式在个体中生产病毒载体。用于病毒合成的冷冻干燥的组合物和方法可在治疗学上使用，例如对于瞬时基因治疗，如递送腺病毒。对于通过本文所述的方法和组合物生产病毒载体，核酸可以编码携带感兴趣的治疗性或荷载性编码序列的病毒基因组构建体的自组装/包装所需的病毒蛋白组件。一旦组装，基因组构建体被包装，并将在感染时被递送至宿主细胞。在一些实施方式中，所组装的病毒颗粒可能不是感染性的，例如可以用作疫苗抗原、纳米粒子或生物材料。

用于病毒合成的冷冻干燥的组合物和方法可用于研究设计，例如用于向哺乳动物细胞递送病毒表达构建体。能够以这种方式生产许多小等分的病毒，用于高通量筛选。用于病毒合成的冷冻干燥的组合物和方法也可用于病毒或其它微生物制剂如轮状病毒的疫苗生产。或者，病毒蛋白可以简单地表达为不形成衣壳的抗原，其中，如在DTaP(白喉、破伤风和百日咳)和HPV(人乳头状瘤病毒)的疫苗中。

在病毒制造的一种实施方式中，病毒是噬菌体。用于噬菌体合成的冷冻干燥的组合物和方法可用于研究设计，例如用于将基因递送至细菌细胞。用于噬菌体合成的冷冻干燥的组合物和方法也可以用于治疗应用，例如噬菌体疗法。用于噬菌体合成的冷冻干燥的组合物和方法也可以用于诊断应用，例如用于检测病原体。

在分子制造的一种实施方式中，治疗蛋白可以使用本文所述的组合物和/或方法合成。可以使用含有无细胞体系和编码感兴趣的蛋白的核酸的冷冻干燥的组合物。冷冻干燥的组合物可以进一步包含合成基因网络，所述合成基因网络可以响应于输入物或刺激(例如病原体、癌蛋白、细胞因子、激素等)进行蛋白合成。治疗蛋白的实例包括但不限于：人胰淀素；胰岛素；生长激素(GH)；美卡舍明(mecasermin)；促红细胞生成素；达依泊汀α；粒细胞集落刺激因子；乙二醇化非格司亭；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；人促卵泡激素；人绒毛膜促性腺激素；促黄体素α；细胞因子(例如，干扰素如干扰素alfacon 1、干扰素α2a)；阿地白介素；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；HPV蛋白疫苗；OspA和抗微生物肽。根据本文所述的方法可以在遗传学上表达或产生治疗蛋白的更多实例参见Leader等，Nature 2008，7，21-39。

在一种实施方式中，治疗蛋白是抗体或其抗原结合片段。治疗抗体的非限制性实例包括但不限于：贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗、曲妥单抗、阿巴西普、英夫利昔单抗、恩夫韦地、抗响尾蛇毒素(crotalidae)和兰尼单抗。所述抗体或其片段可连接至用于靶向递送的药物(例如化疗药物)。生产抗体或其片段也可用于研究设计。

在一种实施方式中，治疗蛋白是酶，例如用于治疗苯丙酮尿症的苯丙氨酸羟化酶。

在分子制造的一种实施方式中，可以使用本文所述的组合物和/或方法来合成用于药物合成途径的组件。在一种实施方式中，药物合成途径的组件可以将无活性的生物前体前药转换为生物活性形式。事实上，甚至可以将通过本文所述的蛋白的按需制造允许的以空间或时间上限制的方式进行的单一酶的表达用来将前药以用户调节的方式转换为活性药物。前药的一个实例是肽附加疗法(peptide-appended therapeutics)，可以通过肽部分的蛋白裂解被激活。在这种情况中，治疗剂可以通过表达的蛋白酶从伤口敷料的工程化材料中释放。在一种实施方式中，药物合成途径可以是将稳定、廉价的前体转化为药物的路径，例如，将胆固醇转化为类固醇、或将紫穗槐二烯转化为用于治疗疟疾的青蒿素。

在分子制造的一种实施方式中，可以使用本文所述的组合物和/或方法来合成纳米粒子。可以使用包含无细胞体系和编码金属结合蛋白的核酸的冷冻干燥的组合物。金属结合蛋白可促进感兴趣的纳米粒子的合成。参见例如Lee等，ACS Nano 2012，6，6998-7008。纳米粒子的实例包括但不限于：量子点(quantum dots)；金属纳米粒子，例如金纳米粒子或铁纳米粒子。

在分子制造的一种实施方式中，可以使用本文所述的组合物和/或方法来合成寡核苷酸。优选地，所合成的寡核苷酸进行折叠和/或自组装以形成DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)折纸构建体。在体内给予时，DNA本身通常是不稳定的。然而，为了其在治疗方面的用途，DNA折纸构建体和增加此类构建体在体内的稳定性的新策略正在被开发。参见例如Douglas等，Science 2012，335，831-834。

对于本文所述的任何分子制造方面，在考虑之列的是，通过在设计中集成充当传感器的合成基因网络，期望产物的表达可以被制成对另一分子或试剂的存在敏感。在此类情况中，仅当分子或试剂存在时，产生期望的基因产物，并且所述试剂可以是例如：分别给予的病原体、代谢物、蛋白或者甚至是小分子。

分子编程/计算

本文所公开的技术可以提供用于基于DNA/RNA的计算和逻辑反应的出色的平台。作为其的一部分，开发了可以传感计算输出和嵌入的生物传感器的响应的纸/电子接口。这可以允许自动化以及允许反应的多路复用阵列。在一些实施方式中，转录反应可以表达RNA，然后与可用于信号扩增的催化核酸的网络相互作用。

普通分子生物学

这项技术的更广泛的应用包括其在用于组装以及新基因构建体和基因网络的测试的基础研究中的用途。在此类用法中，基于纸的转录和翻译反应将充当模拟细胞(mockcell)，使得线性PCR产物能够直接筛选功能而无需纯化、测序或组装成环状质粒。与目前的纯化/测序方法相比，这种方法显著廉价，并允许研究人员确定他们的最佳实施设计在约一小时内，而不是必须等待过夜。

用于提供转录和翻译工具的细胞提取物也为分子生物学家提供了处理难以培养的生物体的独特机会。通过从突变细胞系、病原体或其它专门的生物体(例如极端微生物、共生体)产生细胞提取物，使其它无法接近的系统的生物对更广泛的研究群体来说可行。此类可接近性(accessibility)可以极大地增加治疗的进展以及在工程中的生物学的应用。

不同于商业上可提供的基于抗体的快速诊断测试(RDT)，基于核酸的传感器可被设计为直接检测一个或多个正交的种特异性的RNA。这种基于序列的检测方法意味着可以合理地设计工具，降低开发成本，并允许短的生产周期的设计。基于序列的传感器还允许获得其它相关临床信息，例如耐药基因或其它的病因指标(例如生物膜特异性RNA)的存在。基于核酸的传感器的阈值也允许半定量诊断，对于不可用RDT的大部分而言是很必要的特征(Michael S.Cordray和Rebecca R.Richards-Kortum，Am.J.Trop.Med.Hyg.，2012，87，223-230)。在一种实施方式中，可以进行量化而无阈值化。例如参见图26，其中，对0-2μΜ的范围内的RNA浓度而言存在线性关系。

与目前可用的大部分的标准的照管选项(care options)相比，本文所述的传感器也较廉价。目前，使用商业无细胞体系，本文所述的每个传感器的成本约为35美分-60美分之间。然而，这些系统可以很容易地在内部生产，降低成本少至每个传感器4美分(http://www.openwetware.org/wiki/Biomolecular_Breadboards:Protocols:c ost_estimate)。与之相比，单次RDT反应为0.45美元-1.40美元，PCR为1.50美元-4.00美元(仅试剂)(Michael S.Cordray和Rebecca R.Richards-Kortum，Am.J.Trop.Med.Hyg.2012，87，223-230)。关于花费多长时间进行阳性识别方面，本文所述的组合物和方法也具有竞争力。取决于传感器的形式，本文所述的传感器可以在短至25分钟产生阳性结果，而大多数传感器运作的反应时间为低于1小时。与之相比，RDT在约20分钟内可检测单一抗原，而PCR可能花费1.5至2小时且主要受限于实验室设置。

本发明的一些实施方式在如下的编号段落中列出：

段落1.包含无细胞体系的耐储存的组合物，所述无细胞体系包含足够用于模板导向的合成反应的组件，其中，所述无细胞体系被冻干在多孔基底上并且基本上没有水，并且其中，一旦复水，所述无细胞体系对所述模板导向的合成反应来说是活化的。

段落2.如段落1所述的耐储存的组合物，所述耐储存的组合物进一步包含合成基因网络。

段落3.如段落2所述的耐储存的组合物，其中，所述合成基因网络包含核酸。

段落4.如段落3所述的耐储存的组合物，其中，所述核酸包括DNA、RNA、人工核酸类似物或它们的组合。

段落5.如段落1至4中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述模板导向的合成反应是转录反应。

段落6.如段落1至4中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述模板导向的合成反应是翻译反应。

段落7.如段落1至4中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述模板导向的合成反应是偶联的转录和翻译反应。

段落8.如段落1所述的耐储存的组合物，其中，所述组件足够用于转录反应，并且所述组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸和缓冲系统。

段落9.如段落1所述的耐储存的组合物，其中，所述组件足够用于翻译反应，并且所述组件包括：核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。

段落10.如段落1所述的耐储存的组合物，其中，所述组件足够用于偶联的转录和翻译反应，并且所述组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸、核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。

段落11.如段落1至10中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述多孔基底包括纸、石英微纤维、纤维素的混合酯、多孔氧化铝或图案化的表面。

段落12.如段落1至11中任一段所述的耐储存的组合物，其中，将所述多孔基底用如下进行预处理：牛血清白蛋白、聚乙二醇、吐温20、Triton-X、奶粉、酪蛋白、鱼明胶或它们的组合。

段落13.如段落1至12中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述无细胞体系包含全细胞提取物或重组的蛋白转录/翻译系统。

段落14.如段落13所述的耐储存的组合物，其中，所述全细胞提取物选自于由兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物、大肠杆菌提取物和人细胞提取物所组成的组。

段落15.如段落13所述的耐储存的组合物，其中，所述重组的蛋白转录/翻译系统从经纯化的大肠杆菌翻译所必需的组件重构成。

段落16.如段落2至15中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述合成基因网络作为传感器发挥功能。

段落17.如段落16所述的耐储存的组合物，其中，所述传感器可以检测水性试样中的分析物的存在。

段落18.如段落17所述的耐储存的组合物，其中，所述分析物的检测产生光信号。

段落19.如段落17所述的耐储存的组合物，其中，所述分析物的检测产生电子信号。

段落20.如段落2至15中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述合成基因网络包含逻辑电路。

段落21.如段落20所述的耐储存的组合物，其中，所述逻辑电路包含：与门、非门、或门、或非门、与非门、异或门、异与门或它们的组合。

段落22.如段落20或21所述的耐储存的组合物，其中，在使所述耐储存的组合物与水以及包含触发物的组合物接触时，所述逻辑电路被激活。

段落23.如段落22所述的耐储存的组合物，其中，所述触发物选自于由化学元素、小分子、肽、蛋白、核酸、提取物和它们的组合所组成的组。

段落24.如段落1至23中任一段所述的耐储存的组合物，其特征在于，所述耐储存的组合物耐储存至少2周。

段落25.包含无细胞体系、合成基因网络和固体支持物的耐储存的组合物，所述无细胞体系包含足够用于模板导向的合成反应的组件，其中，所述耐储存的组合物基本上没有水，并且其中，一旦复水，所述无细胞体系对所述模板导向的合成反应来说是活化的。

段落26.如段落25所述的耐储存的组合物，其中，所述合成基因网络包含核酸。

段落27.如段落26所述的耐储存的组合物，其中，所述核酸包括DNA、RNA、人工核酸类似物或它们的组合。

段落28.如段落25至27中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述模板导向的合成反应是转录反应。

段落29.如段落25至27中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述模板导向的合成反应是翻译反应。

段落30.如段落25至27中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述模板导向的合成反应是偶联的转录和翻译反应。

段落31.如段落25所述的耐储存的组合物，其中，所述组件足够用于转录反应，并且所述组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸和缓冲系统。

段落32.如段落25所述的耐储存的组合物，其中，所述组件足够用于翻译反应，并且所述组件包括：核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。

段落33.如段落25所述的耐储存的组合物，其中，所述组件足够用于偶联的转录和翻译反应，并且所述组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸、核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。

段落34.如段落25至33中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述固体支持物包括纸、石英微纤维、纤维素的混合酯、多孔氧化铝、图案化的表面、管、孔或芯片。

段落35.如段落25至34中任一段所述的耐储存的组合物，其中，将所述固体支持物用如下进行预处理：牛血清白蛋白、聚乙二醇、吐温20、Triton-X、奶粉、酪蛋白、鱼明胶或它们的组合。

段落36.如段落25至35中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述无细胞体系包含全细胞提取物或重组的蛋白转录/翻译系统。

段落37.如段落36所述的耐储存的组合物，其中，所述全细胞提取物选自于由兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物、大肠杆菌提取物和人细胞提取物所组成的组。

段落38.如段落36所述的耐储存的组合物，其中，所述重组的蛋白转录/翻译系统从经纯化的大肠杆菌翻译所必需的组件重构成。

段落39.如段落25至38中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述合成基因网络作为传感器发挥功能。

段落40.如段落39所述的耐储存的组合物，其中，所述传感器可以检测水性试样中的分析物的存在。

段落41.如段落40所述的耐储存的组合物，其中，所述分析物的检测产生光信号。

段落42.如段落40所述的耐储存的组合物，其中，所述分析物的检测产生电子信号。

段落43.如段落25至38中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述合成基因网络包含逻辑电路。

段落44.如段落43所述的耐储存的组合物，其中，所述逻辑电路包含：与门、非门、或门、或非门、与非门、异或门、异与门或它们的组合。

段落45.如段落43或44所述的耐储存的组合物，其中，在使所述耐储存的组合物与水以及包含触发物的组合物接触时，所述逻辑电路被激活。

段落46.如段落45所述的耐储存的组合物，其中，所述触发物选自于由化学元素、小分子、肽、蛋白、核酸、提取物和它们的组合所组成的组。

段落47.如段落25至46中任一段所述的耐储存的组合物，其特征在于，所述耐储存的组合物耐储存至少2周。

段落48.通过如下生产的耐储存的组合物：使固体支持物与包含无细胞体系和合成基因网络的水性溶液接触，以及冻干所述固体支持物。

段落49.一种检测分析物的方法，所述方法包括：

(i)提供段落1至47中任一段所述的组合物，其中，所述组合物包含基于核酸的传感器；

(ii)在水的存在下，使所述组合物与所述分析物接触；以及

(iii)检测信号，其中，检测到所述信号表明所述分析物的存在。

段落50.如段落49所述的方法，所述方法进一步包括如下步骤：在步骤(ii)之后，使所述组合物与水分蒸发的屏障接触、或将所述组合物封装入封装物中。

段落51.如段落49或50所述的方法，其中，所述方法提供对所述分析物的量进行的测量。

段落52.如段落49至51中任一段所述的方法，其中，所述核酸包括DNA、RNA、人工核酸类似物或它们的组合。

段落53.如段落49至52中任一段所述的方法，其中，所述基于核酸的传感器包含报告基因。

段落54.如段落53所述的方法，其中，所述报告基因编码荧光蛋白、酶或抗原。

段落55.如段落49至52中任一段所述的方法，其中，所述基于核酸的传感器包含催化核酸。

段落56.如段落49至52中任一段所述的方法，所述方法进一步包括提供荧光团，藉此所述荧光团可以偶联至核酸，从而在荧光方面产生变化。

段落57.如段落49至56中任一段所述的方法，其中，所述分析物选自于由核酸、病原体、病原体提取物、代谢物、抗生素药物、爆炸性化学品、毒性化学品和工业化学品所组成的组。

段落58.如段落57所述的方法，其中，所述毒性化学品是重金属或杀虫剂残留。

段落59.如段落49至58中任一段所述所述的方法，其中，所述信号是光信号。

段落60.如段落59所述的方法，其中，所述光信号是冷光。

段落61.如段落59所述的方法，其中，所述光信号是荧光。

段落62.如段落59所述的方法，其中，所述光信号是可见的颜色。

段落63.如段落49至58中任一段所述的方法，其中，所述信号是电子信号。

段落64.如段落49到63中任一段所述的方法，其中，所述分析物处于水性溶液中。

段落65.包含段落1至47中任一段所述的耐储存的组合物及其包装材料的试剂盒。

段落66.如段落65所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含封装物，其中，在模板导向的合成反应期间，所述封装物封装所述组合物以减缓或防止水分蒸发。

段落67.一种激活冻干在多孔基底上的合成基因网络的方法，所述方法包括：

(i)提供段落1至47中任一段所述的耐储存的组合物，其中，所述组合物包含所述合成基因网络；以及

(ii)使所述组合物与含有水的溶液接触。

段落68.如段落67所述的方法，其中，所述合成基因网络作为传感器发挥功能，并且其中，所述溶液进一步包含能够激活所述传感器的分析物。

段落69.如段落68所述的方法，其中，所述分析物选自于由核酸、病原体、病原体提取物、代谢物、抗生素药物、爆炸性化学品、毒性化学品和工业化学品所组成的组。

段落70.如段落67所述的方法，其中，所述合成基因网络包含逻辑电路，并且其中，所述溶液进一步包含能够激活所述逻辑电路的触发物。

段落71.如段落70所述的方法，其中，所述触发物选自于由化学元素、小分子、肽、蛋白、核酸、提取物和它们的组合所组成的组。

段落72.一种激活冻干的合成基因网络的方法，所述方法包括：

(i)提供包含足够用于模板导向的合成反应的组件的冻干的无细胞体系；以及

(ii)在水的存在下，使所述冻干的合成基因网络与所述冻干的无细胞体系接触。

段落73.一种使合成基因网络稳定的方法，所述方法包括冻干所述合成基因网络。

段落74.如段落73所述的方法，其中，在冻干过程中，所述合成基因网络处于固体支持物上。

段落75.如段落74所述的方法，其中，所述固体支持物是纸。

段落76.段落1至47中任一段所述的耐储存的组合物和读取器，其中，所述读取器可以测量来自所述耐储存的组合物的信号。

段落77.包含冻干的合成生物电路的耐储存的组合物。

段落78.如段落77所述的耐储存的组合物，其中，将所述合成生物电路在多孔基底上冻干。

段落79.如段落77或78所述的耐储存的组合物，其中，所述合成生物电路是合成基因网络。

段落80.如段落79所述的耐储存的组合物，所述耐储存的组合物进一步包含无细胞体系。

段落81.如段落77或78所述的耐储存的组合物，其中，所述合成生物电路是工程化的信号通路。

如本文以及权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，单数形式包括复数的指示对象，反之亦然。除了在操作实例中或另有指示的情况下，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应被理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。

虽然在本文中已详细描写和描述优选的实施方式，但是对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的精神下，可以作出各种修饰、增加、替换等，并因此这些都被认为是在后附的权利要求书所限定的本发明的范围之内。此外，在未指明的程度上，本领域普通技术人员将理解，本文所描述或示出的各种实施方式的任何一个均可以被进一步修饰，以并入本文所公开的其它实施方式中的任一者中的特征。

除非本文另有明确定义，与本申请相关使用的科学术语和技术术语应具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。

应理解的是，本发明不限于本文所述的特定的方法学、方案和试剂等，并且这些可能会变化。本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且不打算限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书所定义。

除了在操作实例中或另有指示的情况下，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。术语“约”在用于描述本发明时，在与百分率相连时表示±1％或±5％。例如，约100表示从95到105。

在一个方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组件，对于本发明来说必要的是，对于包含未指定的必要或非必要的要素而言是开放性的(“包含/包括”)。在一些实施方式中，待包含在组合物、方法或其各自的组件的描述中的其它要素被限定为不会实质上影响本发明的基础和新特征的要素(“基本上包含”)。这同样适用于所描述方法中的步骤以及组合物和其中的组件。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法及其相应的组件旨在排除任何不被认为是组件、组合物或方法的基本要素的任何要素(“由…组成”)。

出于描述和公开的目的，将所识别的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式明确并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本发明关联使用的方法。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面没有任何内容应被视作承认本发明人没有资格借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类的公开提前。所有关于这些文件的日期的声明或关于这些文件的内容的表述是基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

实施例

实施例1：包含合成基因网络和无细胞体系的冻干的传感器

首次表明，通过基于大肠杆菌RNA聚合酶或T7RNA聚合酶的启动子，冷冻干燥的细胞提取物可以支持GFP的组成型表达(图1A)。通过冷冻干燥基于重组蛋白的系统，也可支持后来的基于T7的表达。这些结果基本上反映了在新鲜的无细胞反应和在大肠杆菌中观察到的表达水平。冷冻干燥的无细胞体系随时间稳定，在室温储存数个月后，转录和翻译保持高活性(图1B)。

可诱导的表达体系被用于合成基因网络。采用经典的诱导型tetO启动子，由抗生素强力霉素或化学类似物诱导，GFP的表达易于被诱导。值得注意的是，在体外的严格调节控制需要细胞提取物补充tet阻遏物(tetR)蛋白，以防止在来自基因电路中的组成型tetR元件的阻遏物表达之前的报告子泄漏(图8A)。冷冻干燥之前的无细胞体系的这一成功的tetR增补表明，蛋白掺杂可以是调整无细胞应用的调节和酶环境的有效途径。对于强力的T7启动子的可诱导的调节，选择了新一代RNA可诱导核糖开关，被称为支点开关。这些强大的开关提供了严格的、几乎完全的T7转录物的调节，GFP仅在正确的RNA触发物的存在下产生(图10A-图10C)。

为了容纳这些冷冻干燥的应用，无细胞体系和合成基因网络被嵌入纸和其它多孔材料中。纸以前用于基于化学的诊断中(Martinez等，Angew.Chem.Int.Ed.，2007，46，1318-1320)，充当均匀分布小体积反应的高毛细作用的基质，并提供了用于显示基因电路输出的表面。发现，首先用BSA或其它类似的封闭剂处理纸显著改善了表达构建体的输出(图11A)。将小的2mm滤纸片与无细胞体系进行冷冻干燥，以从基于大肠杆菌RNA聚合酶或T7聚合酶的表达质粒产生GFP。如同在溶液相中，来自任一启动子的组成型表达产生一致的荧光和可诱导的表达行为，其动力学可与体内和溶液相体外反应相比。纤维素纤维携带有GFP的发射光谱附近的固有的自体荧光，并因此也已构建成具有交替发射光谱的荧光蛋白输出的可诱导系统。随着这些交替的报告子，同样的纸片可以用来容纳多个传感器(图5B)。已示出了来自嵌入石英微纤维和纸片的传感器的多个输出。使用由印刷光刻而不是纸片分割的纸(具有分离各自的反应空间的疏水性屏障)，此类多样性的输出也可以被显示(图4)。

产生基因电路输出所需的时间是另一重要因素。针对这一点报告的结果产生自基于DNA(质粒或线性dsDNA)的电路。然而，用基于ssRNA的支点开关，通过使用预转录为线性RNA的基因电路，反应速率可被加快。对于这些仅翻译的反应，在溶液中最早检测输出的时间可以从35分钟降低至25分钟(图7A-图7H)。反过来，运行使用荧光的菠菜RNA适配体的仅转录的传感器(Paige等，Science 2011，333，642-646)作为输出，检测时间可以类似地缩短。

设计的简单性和输入的低成本意味着这些传感器可以很容易地以25美分-60美分之间的成本生产，取决于特定的传感器。虽然商业上可用的无细胞体系被用于本文所述的实验中，但是用于制作这些为特定目的而构建的系统的方案已经被完善地建立，并将降低传感器的成本低至4美分。

冻干的传感器可被设计用于产生裸眼可见的比色输出。为此，将GFP用β-半乳糖苷酶或LacZ取代以响应于合成触发物RNA的存在而产生显著的颜色变化的系统。在这一反应中，LacZ的表达导致酶裂解黄色的氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷底物成为紫红色的氯酚红。此外，作为将被简单讨论的，使用酶介导的报告子将额外的信号扩增步骤引入系统。使用PA支点开关，在记载纸上反应的时间序列中，可见所述反应的响应时间开始于25分钟的时间点(图7E)。对于支点LacZ开关的整个家族，观察到类似的结果。作为另一比色报告酶的几丁质酶也被并入用于来自含有野生型LacZ的细胞的细胞提取物。如同用tetO_几丁质酶开关所表明的，aTc诱导物的存在导致几丁质酶的表达，几丁质酶裂解无色的4-硝基苯基-N,N'-二乙酰基-β-D-壳二糖苷底物成为黄色的对硝基苯酚产物(图9)。

冻干的传感器可以被设计用来在作为诊断平台的关键特征的全长的活性mRNA靶点内检测序列。第一目标是检测GFP和mCherry mRNA。使用预测RNA二级结构的算法，建立传感器以靶向可能被接近的序列，并且当进行测试时，分别在GFP(60倍)和mCherry(14倍)mRNA的存在下产生荧光诱导(图12A-图12B)。作为潜在的基于纸的合成基因网络作为体外诊断平台的示范，接下来开发了用于抗生素抗性基因的mRNA传感器。采用溶液中的冷冻干燥的无细胞反应，在它们的各自mRNA的存在下，用于氨苄青霉素(15倍)、卡那霉素(6倍)、氯霉素(20倍)和大观霉素(32倍)的mRNA传感器产生显著的GFP倍数变化(图13A)。这些传感器被修饰以产生LacZ，在来自各自的抗生素抗性基因的mRNA的存在下，将传感器输出转换为可见的比色模式(图13B)。

实施例2：基于纸的合成基因网络

细菌和哺乳动物组件可以被冷冻干燥在纸和其它多孔基底上，以创建在室温下长期储存稳定的静止的合成基因网络，并可以通过复水而激活。所产生的工程化材料具有细胞的转录和翻译特性，并且可以使用例如可商购的无细胞转录和翻译系统容纳遗传学上编码的工具。本文示出的是具有小分子和基因开关的RNA驱使(actuation)的技术、用于葡萄糖和mRNA(包括抗生素抗性基因)的基于纸的传感器的构建、以及新的基因电路的特性。为了更大的实际用途，可以用比色输出(用于通过裸眼进行的检测)、以及通过低成本的制造、用于量化和可能的自动化反应的电子光接口增强基因电路。这些低成本的基于纸的合成基因网络具有将基于生物的传感器、计数器、定时器以及简单的逻辑用于可便携的设备的潜力。

结果

进行测试以确定转录和翻译所需的酶活性是否可以从冷冻干燥的无细胞表达体系重构成，这通常需要存储在-80℃下。引人注目地，通过冷冻干燥的由核糖体和35个重组表达和纯化的细菌蛋白组装的商业可用的表达体系(PT7)的复水后证实，来自冷冻反应的GFP表达可与新鲜的相比(图16B；Shimizu Y等，Nat Biotechnol.2001年8月，19(8):751-5；Shimizu Y，Ueda T.Methods Mol Biol.2010，607:11-21)。这种方法随后被扩展至基于全细胞提取物的具有更大的分子复杂性的系统。使用依赖于大肠杆菌RNA聚合酶(S30)或T7(S30T7)RNA聚合酶(RNAP)的表达构建体，在开始于冷冻干燥的颗粒的小的溶液相反应中支持GFP的组成型表达(图20A-图20B)。重要的是，使用PT7系统作为模型，这些冷冻干燥的无细胞体系是随时间稳定的，在室温储存数个月后保持高的转录和翻译活性(图16C)。

虽然冷冻干燥制剂为储存静止的合成生物学工具提供了巨大的潜力，但是处理溶液相反应对实验室之外的应用来说是尴尬的。为了解决这个问题，无细胞体系和合成基因网络被嵌在纸和其它多孔材料上(图16A)。纸对小体积分子和生化反应提供了高毛细作用的基质。从一开始，进行测试以确定在嵌入纸的纤维素基质时是否可以支持简单的无细胞表达。

将小的2mm的滤纸片与含有大肠杆菌(S30)或T7RNAP(S30T7、PT7)和相应的GFP表达质粒的细菌无细胞体系(1.8μl)冷冻干燥(图16D)。在复水并在37℃下孵育时，在各RNAP的调节下，这些基于纸的反应产生了一致的GFP荧光。纸片的荧光成像证实了GFP表达，并且通过将纸片放置在用于在37℃培养板读取器中孵育的黑色透明底384孔板的底部来监测反应动力学(图16E)。

接着对诱导型表达体系进行测试，以确定更复杂的合成基因网络是否可以由冷冻干燥的基于纸的反应支持(图16A)。使用了经典的合成生物学开关TetO调节的表达。这一系统的调节通过结合至TetO启动子的阻止转录的tet阻遏物(terR)介导(图16F，Lutz R、Bujard H.，Nucleic Acids Res.1997，25:1203-10)。此类调节在体外进行，要求组成型tetR表达也被编码在合成基因网络中。然后，通过添加干扰tetR结合至启动子的抗生素强力霉素或化学类似物(aTc)诱导表达，使得调节基因能够转录。

用含有S30大肠杆菌细胞提取物、预翻译的tetR和编码tetR和TetO调节的GFP或mCherry的组成型表达的网络元件的无细胞体系制备冷冻干燥的片。不同的只是aTc的存在，将该片复水并在37℃下孵育2小时。aTc诱导的片产生分别为5倍和32倍的GFP和mCherry的表达(图16G；图21)。为了优化性能，发现如果在冷冻干燥前，细胞提取物补充tetR以在编码的tetR表达之前控制启动子泄漏，来自TetO启动子的调节控制可以被加固(图22)。在冷冻干燥之前的无细胞体系的这一成功的tetR增补表面，对于定制和增强无细胞应用的调节和酶环境，蛋白掺杂可以是有用的方式。

合成生物学的重要趋势是利用RNA驱使的基因电路(Callura，J.M.等，Proc NatlAcad Sci USA 2012，109，5850-5855)。与基于通过可用的独特识别结构域的数目限制的基于小分子的调节的电路不同，基于RNA的开关可以被合理编程用于识别序列特异性触发物，并因此具有提供基本上无限制的信号空间的潜力(Callura，J.M.等，Proc Natl Acad SciUSA2010，107，15898-15903；Isaacs，F.J.等，Nat Biotechnol 2004，22，841-847；Lucks，J.B.等，roc Natl Acad Sci USA 2011，108，8617-8622)。此处，新一代的核糖核酸调节子被测试，称为支点开关(Green等，2014)。这些强大的生物分子开关提供了转录物的严格的、几乎完全的翻译调节，并表现出出色的正交性。此外，通过控制选择性的RNA聚合酶(例如T3RNAP)的表达，支点开关也可以触发额外的开关RNA的合成，允许级联和更复杂的合成电路。

支点构建。使用常规的分子生物学技术构建支点开关质粒。将合成的DNA模板(Integrated DNA Technologies Inc.)使用PCR扩增，使用具有30bp重叠区域Gibsonassembly(Gibson等，Nat.Methods 2009，6，343-345)插入质粒，并随后成功构建质粒，并使用DNA测序确认。所有质粒均来自pET system parent plasmids(EMD Millipore)，并且组成型表达lacI和抗生素抗性基因。支点开关质粒及其序列的另外的说明在Green等中提供(Green等，Cell 2014)。

在8种不同的支点开关控制下的GFP表达的调节在纸基质上被证实。通过将重组PT7表达体系冷冻干燥在纸片上以及通过线性DNA编码特定开关RNA进行实验。干燥后24小时，在有或没有互补RNA触发物的条件下将纸片复水，并在37℃下于潮湿腔室内孵育2小时。正如预期的，接受触发物RNA的纸片表现出强的GFP表达，而对照纸片表现出几乎没有任何表达(图17A)。

为测量反应动力学进行了平行实验。在37℃孵育的90分钟内，最大ON/OFF比介于10倍和140倍之间，在短至20分钟内检测到统计学显著的信号(图17B、图23、图25)。最大的表达率出现在60分钟和120分钟之间，并且反应输出一般在200分钟达到平台(图23、图24)。利用PT7重组系统的无核酸酶性质的优势，将RNA直接滴定至反应，并发现对低的纳摩和微摩浓度之间的RNA浓度的线性响应(图26)。在示出的反应中，5μΜ触发物RNA的浓度被选择得以最大响应。还值得注意的是，冷冻干燥的裂解物中的开关行为密切重现了大肠杆菌中的体内支点开关的行为(图27；Green等，2014)。重要的是，在大肠杆菌的RNA富集环境中的支点开关的明确的靶依赖性诱导有助于示出这些RNA组件的序列特异性。

全细胞提取物和纤维素纤维携带GFP的发射光谱附近的固有的自体荧光(Schmidt，JA.2010，Lignin and Lignans:Advances in Chemistry，Chapter 3：Electronic spectroscopy of lignans，Cyril Heitner、Don Dimmel、John Schmidt编著，CRC Press，Boca Raton，Fl.USA)，所以还构建了输出具有交替的发射光谱的荧光蛋白的基因电路用于纸和石英片(图17C、图28A、图29)。具有这些不同的输出，单个纸片也可以用来容纳多个支点开关，各自可以独立激活和测量(图28B)。作为更低成本的备选，S30T7大肠杆菌细胞提取物中的支点开关也使用环状DNA质粒作为模板成功地测试了支点开关和触发物RNA(数据未显示)。

通过将纸片排列到384孔板中，多路复用反应可以容易地随时间量化和测量。此处，通过使8个支点发夹中的每一个与各触发物RNA结合，测试了支点开关的正交性。可以看出，支点开关的活化基本局限于对角线，仅在开关E和触发物H之间有一个弱的脱靶相互作用，(图17D)。这种正交性体现在细菌细胞的体内环境中的上述示出的特异性活化(图27)。这种排列的方法还强调了本文所述的在体外的基于纸的系统的另一重要优势。为收集在体内的类似数据，需要81个单独的转化、在培养板上的过夜培养物和随后在多孔板中的培养，这可能需要多天的时间。使用在体外的基于纸的反应，这一实验花费90分钟准备，并在孵育后，在短至20分钟内，检测到来自激活开关的信号(图17E)。

在一些实施方式中，设计基于纸的系统以产生裸眼可见的比色输出。例如用β-半乳糖苷酶(LacZ)代替GFP以产生如下系统，该系统响应于对合成基因网络的条件性输入而产生显著性的酶介导的颜色变化(图18A)。LacZ裂解嵌入冷冻干燥的纸片中的黄色基质氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷产生紫红色的氯酚红产物。

这些基于颜色的反应可以通过监测570nm的LacZ产物的最大吸光度在标准的培养板读取器上测量。由于具有来自8个GFP支点开关的荧光输出，每个触发的LacZ开关产生独特的动力学响应，具有的最大表达比率出现在50分钟和120分钟之间，并且反应动力学是开关依赖性的(图18B、图18C、图30)。一些支点开关迅速达到它们的最大输出，而其它支点开关则在过夜实验中一直产生相对线性的输出。为了使早期检测和灵敏度最大化，将随时间的570nm吸光度的斜率确定的酶促反应速率用来计算LacZ支点开关家族的倍数变化(图18C、图31、图32)。如同荧光反应一样，可将具有比色输出的基于纸的反应排列用于大规模的定量实验(图32)。

利用开关D来示出显色，反应的检测可以在约25分钟开始，并在约1小时饱和(图18D)。这些反应的量化也可以通过测量来自包括在手机中广泛使用的相机在内的大多数相机产生的图像的红色、绿色和蓝色颜色通道的强度很容易地进行。通过跟踪相对于黄色(红+绿)的蓝色信号的产生，，可跟踪活化的冷冻干燥的支点反应的进程(图18E)。对于支点开关的整个家族观察到类似的结果(图18B)。

另一比色报告酶几丁质酶也被并入用于基于来自含有LacZ背景的细胞的提取物的系统的合成基因网络。如同通过teto_几丁质酶开关显示的，atc诱导物的存在使得几丁质酶表达，几丁质酶裂解无色的底物(4-硝基苯基-N,N'-二乙酰基-β-D-壳二糖苷)称为黄色的对硝基苯酚产物。比色输出是裸眼可见的，并可以使用培养板读取器利用吸光度(410nm；图33)进行量化。从在约60分钟的可检测的输出开始直到在800分钟实验结束，用该系统显色是线性的，在420分钟具有38倍的最大诱导。

合成基因网络的基于纸的分布的重要优势是它们的低成本和简单的制造方法。作为原理论证的示范，采用来自材料科学的技术，使用标准的计算机打印机和色谱纸来创建稳定的合成基因网络的印刷阵列。使可商购的蜡基油墨充当疏水性屏障分离各自的反应空间，以创建定制的阵列和布局。作为技术的示范，5×5阵列被印刷以容纳lacZ表达支点开关(图18G)。

为了实际应用，构建了低成本的电子光学读取器以使得能够量化，并最终使得基于纸的反应能够自动化。此类装置还可以赋予这些分子装置以易于使用和方便家庭血糖监测。纸片上的基于LacZ的支点开关被放置在LED光源(570nm)和电子传感器之间(图18H)。在阳性反应事件中，通过产生紫色的LacZ裂解产物，光的传输逐渐被阻断。LED和传感器通过连接至控制读取模式和速度参数的Arduino的多路复用器加以协调。电子硬件使用从丙烯酸树脂激光切割的电脑设计的零件安置，以制造少于100美元的设备(图18H)。将冷冻干燥的纸片放入芯片上的孔中，复水，在设备内于37℃下孵育并通过连接的笔记本电脑实时监测。作为概念证明，对G_LacZ支点开关进行了测试，观察到来自不同浓度的RNA触发物的一致且显著的读取(图18I)。

接着，开发了可以检测到全长的活性mRNA靶点的支点开关传感器，用于诊断平台的期望特征。第一目标是检测GFP和mCherry mRNA。使用预测RNA二级结构的算法，针对可能易于结合的靶序列构建传感器(Green等，2014)，并且在进行测试时，在GFP(60倍)mRNA和mCherry(13倍)mRNA分别存在的情况下产生荧光诱导(图19B-图19C)。

作为基于纸的合成基因网络用作体外诊断平台的潜力的示范，接着开发了用于抗生素抗性基因的比色mRNA传感器(图19A)。在冷冻干燥的基于纸的反应中，在各自的mRNA(3000nM，图19D和图34)的存在下，用于大观霉素(5倍)、氯霉素(7.5倍)、卡那霉素(24倍)和氨苄青霉素(30倍)抗性基因的mRNA传感器产生了显著的LacZ诱导。然后,在电子光学读取器中测试了氨苄青霉素抗性mRNA传感器，并发现靶转录物的显著检测低至3nM(图19E和图35)。此外，来自按照特定目的构建的设备的信号比起等效量的触发物RNA浓度下的培养板读取器更大约三倍(图19D-图19E、图34D)。随时间跟踪读取的倍数变化，可以看出浓度依赖性反应速率如何影响阳性信号的出现和持续时间(图35B)。

除了上面示出的按照特定目的构建的合成基因网络，这种在体外的基于纸的方法也具有用于容纳其它基因电路(包括已经在文献中作为合成生物学工具的基因电路)的巨大潜力。此外，虽然上述工作聚焦于细菌组件，但是可以很容易地扩展至基于哺乳动物的系统。作为确认，对使用冷冻干燥的HeLa细胞提取物的基于纸的系统进行了测试，并发现在表达质粒的存在下的GFP的强烈表达(图19F)。为了表明预先存在的分子工具的使用，使用最初设计用于测量哺乳动物细胞中的葡萄糖的基于FRET的纳米传感器构建了便携的处于纸上的体外葡萄糖传感器(图19G；Takanaga H，Frommer WB，FASEB J 2010，24:2849-58)。将用于纳米传感器的DNA构建体与HeLa细胞提取物一起冷冻干燥至纸上，并在葡萄糖存在或不存在的条件下将纸片复水。一旦复水，在生理相关的葡萄糖浓度范围(0mM、5mM、10mM；图19H，图36)内观察葡萄糖相关的迁移。重要的是，在这一背景下，纳米传感器的从头翻译看起来对于功能而言是至关重要的；预翻译蛋白的冷冻干燥制剂并未显示出荧光方面的特征性迁移。

制造的低成本(4-65美分/传感器)是用于诊断的基于纸的平台的重要特征。然而，对于这项技术的采用和潜在影响而言也许甚至更重要的是开发新的传感器的时间和成本。为了测试可以多快开发新的传感器，构建了用于病毒病原体埃博拉的mRNA传感器。目标是在少于一天中构建和测试可以区分病毒的Sudan株和Zaire株的24个传感器。使用算法，传感器被设计为靶向来自埃博拉核蛋白基因的ORF的12个区域(A-L)的mRNA，在Sudan株和Zaire株之间在长度上只有3个核苷酸的差异(图39A)。构建从承载支点开关传感器盒的合成的135-nt DNA寡聚物的PCR扩增开始，随后将模块连接至LacZ报告基因框架。然后通过PCR对连接产物进行扩增。接着只经过柱纯化，在含有冷冻干燥的PT7无细胞体系的纸片上测试传感器，用于测试36-nt触发物RNA的存在和不存在。由于使用全长的材料的潜在挑战，使用短的触发物RNA而不是全长mRNA来测试传感器。虽然将归因于RNA二级结构的可访问性放在心上是重要的，从此前的mRNA传感器进行的工作表明，短的RNA触发物提供了传感器功能的具有代表性的指示。

240个反应的比色动力学使用培养板读取器捕获，并可以被眼睛跟踪(图39B-图39C)。24个传感器中的每一个在它们的靶标(3000nM)的存在下被触发，在第一个90分钟期间内的最大诱导在4倍至77倍之间。值得注意的是，这一筛选阶段在少于12小时内完成。然后，选择Sudan传感器和Zaire传感器的4个相匹配的组(D、E、G、H)以测试特异性，并发现高度的株特异性识别(图39D)，以及对两株的灵敏度降低至30nM触发物RNA的浓度(图39E)。

作为基于纸的系统用于更复杂的合成基因电路的原型开发和测试的能力的示范，将汇聚的转录级联组装入T3RNAP和/或T7RNAP，可以转换细胞提取物中的天然大肠杆菌RNAP的转录活性(图40A)。对于这一点，基于纸的系统已经使用超过45个支点开关进行了验证，每一个具有输入和可测量的输出的独特的组合。此处，组装支点开关以创建一系列的引起新的转录工具的生产的分子反应。在编码支点开关的DNA和用于T3模块的触发物的存在下，T3RNAP被转录和翻译，激活T3介导的转录以及来自另一被动组件(passive component)的GFP的翻译(图40B)。或者，在编码支点开关的DNA和用于T7模块的触发物的存在下，T7RNAP被转录、翻译，并且类似地引起来自T7介导的构建体的GFP的表达(图40C)。如果T3和T7支点开关模块被组合，大肠杆菌RNAP产生T3RNAP和T7RNAP。这种汇聚的转录活性产生它们各自的触发物和支点开关RNA，产生第3条途径表达GFP(图40D)。这项工作表明，该平台可以维持多轮的转录和翻译，并可别用来以模块化的方式构建、测试和调试复杂的电路。

方法

基于TetR的诱导型合成基因电路。通过将GFP或mCherry插入在pZE11中的TetR阻遏的pLtetO启动子的下游，构建了基于TetR的GFP和mCherry表达电路(Lutz和Bujard1997)。为了提供组成型tetR表达，tetR被克隆至组成型PlacIQ启动子的下游，并且使用XhoI和AatII将这一表达盒插入pZE11-gfp和pZE11-mcherry中。

基质材料的制备。虽然基于纸的反应是成功的，在无细胞体系的组件与纸的纤维素基质之间的非特异性相互作用可能阻碍反应的活性。纤维素具有pH依赖性电荷(Budd，J.和Herrington，T.M.，Colloids and Surfaces，36卷，3期，1989，273-288页)，并因此看起来来自复杂的生物分子系统的组件将会吸附到纤维素纤维的高的表面积，降低反应效率。测试了通过抑制与纸的这些非特异性相互作用以改善性能的方法。在一种方法中，用牛血清白蛋白(BSA)和/或其它阻断试剂处理滤纸。发现来自经处理的纸的荧光输出方面的整体改善，用5％BSA产生最多的增高(图37A-图37B)。对于另一底物石英微纤维，用表面活性剂吐温-20进行阻断的性能增强甚至更为明显(图37C-图37D)。

无细胞反应。无细胞反应一般按照各自的制造商的说明书中的描述进行组装(4℃)。简言之，对于S30和S30T7反应(Promega，L1020和L1110)，将含有氨基酸的预混物和细胞提取物分别按照0.33和0.51的比例进行组合。然后，向该体积加入RNase抑制剂(Roche；0.005)、包含基因电路和无核酸酶ddH₂O的质粒DNA构建体。对于基于TetO的基因电路，对反应补充表达组成型tetR的预运行的无细胞反应(0.05)以减少启动子泄漏。对于PT7无细胞体系(NEB，E6800L)，将溶液A(0.4)和溶液B(0.3)组合在一起，且剩余的体积由RNase抑制剂(Roche；0.005)、线性DNA构建体和无核酸酶ddH₂O组成。HeLa细胞的无细胞体系(ThermoScientific，88881)通过组合HeLa细胞裂解物(0.5)、辅助蛋白(0.1)和具有RNase抑制剂的反应混合物(0.2)(Roche；0.005)、包含基因电路和无核酸酶ddH₂O的质粒DNA构建体进行组装。在氮气和硅胶干燥剂包装的情况下进行冷冻干燥的颗粒的长期储存。

基因电路的浓度如下：图16B和图16C：T7_GFP质粒DNA 5ng/μl(pBR939b_T7_GFP，Anderson，2007)；图16E：PN25-GFP质粒DNA30ng/μl和T7_GFP质粒DNA 30ng/μl；图1G：Tet-OGFP和TetO-mCherry质粒DNA 30ng/μ1；图17：线性DNA 33nM、RNA触发物5μΜ；图18：线性DNA33nM、RNA触发物5μΜ或如所指定的；图19B和图19C：mCherry和GFP mRNA传感器线性DNA33nM、各自的mRNA 2.5μΜ；图16D和图16E：用于大观霉素、氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素线性DNA 33nM的抗生素抗性基因mRNA传感器，各自的mRNA 3μΜ或如所指定的；图19F：pT7CFE1_GFP质粒DNA(Thermo Scientific)30ng/μ1、pcDNA3.1FLIPglu-30uDelta13V质粒DNA(Takanaga 2010，addgene：18015)30ng/μ1；图39：PCR产物并非是凝胶纯化的，并因此使用150ng/μl的5×线性DNA浓度以确保足够的传感器产物，各自的触发物RNA为3μΜ或如所指定的；图40：T3和T7级联模块质粒DNA 30ng/μl(大肠杆菌RNAP_触发物_1、大肠杆菌RNAP_开关_l_T3RNAP、大肠杆菌RNAP_触发物_2、大肠杆菌RNAP_开关_2_T7RNAP)、T3_GFP和T7_GFP质粒DNA 40ng/μl、T3RNAP_触发物_3和T7RNAP_开关_3_GFP质粒DNA 40ng/μl。

反应和孵育的准备。将组装的无细胞反应物(1.8μl/片)施加至2mm纸片(Whatman，1442-042)，纸片随后在液氮中急速冷冻并冷冻干燥过夜。使用2mm活检打孔器将纸片切下。同样，石英微纤维(Spectrum，884-66171)被切下，并在冷冻干燥之前用无细胞反应物处理(3μl/片)。冷冻干燥的溶液相反应物(7μl)类似地进行急速冷冻并置于冻干器上。24小时后，用无核酸酶ddH₂O或诱导剂(激活的开关)以指定的浓度使反应物复水。还包含没有合成基因网络的无细胞反应物以提供背景信号，用于从对照和处理反应中减去背景信号。使用置于组织培养孵育器内的按照特定目的构建的电子光学读取器或培养板读取器(BioTekNEO HTS)在37℃下孵育复水的反应物。对于培养板读取器，将纸片放入黑色透明底的384孔板中，而对于按照特定目的构建的读取器，纸片被放置入切入移动的丙烯酸树脂芯片的2mm孔中(图18H、图38B)。

显微术与图像处理。在潮湿的玻璃腔室中或通过透明底384孔板的底部用AxioCamMRm将纸片的图像采集在Zeiss Axio Zoom V16Macroscope(7×倍率)上。将采集的图像随后使用Zeiss Zen软件拼接在一起成为大的复合图像，用于在ImageJ中进行进一步的处理。安排实验以便将对照和处理的基于纸的反应的图像收集到一起，从而可以将参数调整同时用于所有试样。优化时，单个纸片的图像被获取，并排列成图形(figures)。对于示出高水平的自发荧光的S30无细胞体系中的GFP表达，使用Nuance相机以在500和620nm之间收集多光谱图像。然后，使用Perkin Elmer Nuance 3.0.2软件分解来自细胞提取物的GFP的光谱特征。将类似的方法用于对具有对硝基苯酚(4-硝基苯基-N,N'-二乙酰基-β-D-壳二糖苷的几丁质酶裂解产物)的图像纸片创建410nm吸光度特征(420nm至720nm)。将用Nuance相机采集的图像使用双线性变换进行度量。对于一些复合图像，纸片周围的区域被掩蔽以消除多余的光。

印刷阵列。用于印刷阵列的图案使用Adobe Illustrator生成，然后使用Xerox8570打印机打印到色谱纸(Whatman，3001-861)上(Carrilho等，Anal Chem.2009，81(16):7091-5)。一旦打印，使用热平板(120℃)将蜡回流，从而使蜡贯穿纸的整个厚度存在，创建疏水性屏障以囊括各反应。

电子光学读取器。便携设备由安置在激光切割的丙烯酸树脂盒的4个层构成(图18H)。顶层具有12个LED(Digi-Key，365-1190-ND)，所述LED具有非常狭窄的视角和570nm的发射光以匹配LacZ反应的产物的吸光度最大值。所述LED被放置在接近中间层中的芯片，中间层在2mm孔内具有12张纸片。所述孔防止杂散光的传输，并与顶层中的LED和下面的第三层中的12个TSL2561传感器(Adafruit，439)的阵列同轴。底层包含Arduino Micro和相关的电子设备，如多路复用器(Sparkfun，BOB-09056)、电路试验板、电阻器和连接器。为了防止读取之间的串扰，通过依次激活各LED和传感器对而连续地读取反应。读取器的读取频率和模式可以通过修饰和上传备选的草案至Arduino Micro而容易地调整。对各时间点计算原始数据和使用每片的公式(per disc formula)处理的数据：100-(100×(电流/最大))；并发送到笔记本电脑。电路的图解和激光切割零件的概述可见于补充的图中(图38A-图38B)。

倍数变化的计算。首先对来自培养板读取器的荧光或吸光度数据使用时间点的移动三点平均值和读取前后的数据进行了第一次平滑化(smoothed)，以减少测量噪声。使用仅包含相关的无细胞体系的空白对照反应的平均值从各孔减去背景信号。然后，调整各孔的最小值为零。对于荧光数据，通过将在各时间点的孔除以来自相应的未诱导的对照孔的平均信号来进行倍数变化计算。对于吸光度测量，倍数变化的值反映出诱导和未诱导的孔之间的颜色变化率方面的差异。这通过使用斜率计算变化率而进行，因此，对于每10分钟的时间点，根据如下计算比率：斜率＝(T2-T1)/10，其中，T是在时间点T1和10分钟后时间点T2的归一化数据。然后，如同用荧光数据一样计算倍数变化。实验以三重复或四重复运行。由于S30反应的高的自体荧光，少数实验显示出高的变化性，并因此接受经改良的ThompsonTau检验以识别待弃去的离群值(Anbarasi等，Outlier Detection for MultidimensionalMedical Data International Journal of Computer Science and InformationTechnologies，2011，2(1)卷，512-516；Byrd等，Remote Sensing of Environment 2014，149:166-180)。简单地说，Tau检验通过计算测量值(重复)和组的平均值之间的差异(δ)进行。利用4重复数据的经改良的Thompson Tau值(1.4250)，通过将组的标准差乘以这一Tau值进行检验。如果所得的数值小于针对测量值计算的δ，所述重复被认为是离群的且不包含在分析中。

讨论

已经开发了用于如下的方法：将合成基因网络嵌入纸和其它材料中，创建用于将合成生物学移出实验室并移至现场的急需的途径。此处，已经构建了许多按照特定目的构建的合成基因网络用于这一方法，该合成基因网络响应于合成的RNA、mRNA和小分子。这包括通常生成具有大于20倍和高至350倍诱导的网络的基于纸的支点开关(图17B、图18C、图29A)。正如用葡萄糖传感器所示出的，这一基于纸的方法也有希望容易地将现有的对基础研究和生物技术设计的构建体转换为便携且易于访问的分子工具(图19G-图19H)。

这些反应的体外性质提供了其它好处。例如，不必致力于通过细胞分裂传代维持质粒，可以组装复杂的遗传学上编码的网络而不需要协调选择性的抗生素压力。此外，基于纸的反应物也可以充当模拟细胞，使得能够按照功能直接筛选线性PCR产物而不进行测序、组装成环状质粒或可能甚至是片段的纯化。这些特征在本文所述的纸片阵列中利用，本文所述的纸片阵列着眼于支点的正交性以及埃博拉传感器的原型开发和复杂的电路检测(图17E-图17F、图32、图39、图40)，这使我们能够快速筛选基因电路性能。

基于纸的细胞提取物也为分子生物学家处理难于培养的生物体提供了独特的机会。通过从工程化的细胞系、病原体或其它专门的生物体(例如极端微生物、共生体)产生细胞提取物，这些反应可以充当生物的代用品，否则该生物无法进入广泛的研究领域。类似地，将人细胞提取物纳入基于纸的方案是令人兴奋的功能，产生了基于数以千计的人和哺乳动物转录因子的诊断和合成生物学应用的前景(Hughes，2011)，例如具有复杂而微妙的调节功能(包括小分子响应调节)的核受体(Pardee等，2009)。

利用本文所述的技术，可将合成生物学的合理的设计用于体外诊断和传感。可以作为平台的一部分实施的现有技术的实例包括靶RNA输入物的基于等温核酸序列的扩增(Yan等，Mol Biosyst.，2014，10:970-1003)或者通过一般的调理素介导的捕获的病原体集中(Cooper等，Lab Chip.，2014，14:182-8；Kang等，Nature Medicine 2014)。此外，谈不上与技术上的要求和昂贵的基于实验室的技术(如ELISA、PCR和质谱)进行竞争，基于纸的系统使得能够创建一代新的低成本的传感器，该传感器可以无所不在地嵌入日常生活(包括服装)中。重要的是，支点开关反应可以运行于各种多孔材料中(包括布、实验室膜和多孔氧化铝)。

不同于基于抗体的诊断，支点开关mRNA传感器提供了基于序列的检测方法，意味着研究和临床工具可以被合理设计、降低开发成本并使得能够显著缩短设计到生产的周期。在此展示了新的mRNA传感器，包含在少于12小时内构建的24个埃博拉传感器。埃博拉系列的DNA输入成本为21美元/传感器。这些特征高度优于定制的商业化抗体生产，商业化抗体生产的开发时间通常为2到6个月，而开发成本范围为从4,000美元至30,000美元。此外，传感器可以从序列信息单独设计，这对于新兴病原体(图39)、以及获得其它相关的临床信息如耐药基因的存在(图19D-图19E)或发病机理的其它指标如生物膜特异性RNA(

等，PLoS One.，2012，7(2):e31092)来说都是理想的。被偶联至电子读取器，这些基于纸的系统还提供了用于定量诊断的潜力(图18I、图19E)，定量诊断是对于不可用RDT的大部分来说的急需的功能(Cordary，Am.J.Trop.Med.Hyg.，2012，87，223-230)。此外，可以考虑所设计的基因电路的硬件放大的为特定目的构建的电子读取器的增加的敏感性(2.5-3.5倍)(图19E、图34D)。

与目前可用的大多数照管选项的标准相比，基于纸的合成基因网络也有可能廉价制造。目前，使用商业化的无细胞表达体系，1μl基于纸的传感器的成本将在35美分-65美分之间。然而，这些系统可以很容易地在内部生产，降低成本低至每个传感器2美分-4美分(http://www.openwetware.org/wiki/Biomolecular_Breadboards:Protocols:c ost_estimate)。与此相比，单个RDT反应为0.45美元-1.40美元，而PCR为1.50美元-4.00美元(仅试剂)(Cordary，Am.J.Trop.Med.Hyg.2012，87，223-230)。就检测的时间来说，基于转录和翻译的检测也有竞争力。作为实例，检测来自氨苄青霉素抗性基因的mRNA被记录为：对于高浓度mRNA来说早至20分钟，而对于3nM处理物来说约为40分钟(图19E、图35)。这比较起来优于RDT或PCR，RDT可在约20分钟内检测单个抗原，PCR可能花费1.5至2小时并且主要局限于实验室设计(Cordary，Am.J.Trop.Med.Hyg.，2012，87，223-230)。

在冷冻干燥的纸片上的汇聚的转录级联的构建和测试(图40)进一步强调了这种方法容纳用于实验室和现场应用的复杂网络反应的潜力。虽然也许不是第一明显的，对于产生GFP的各三转录级联反应来说(图39B-图39D)，系统必须基本上通过中心法则的两个循环运转。第一循环将级联模块的DNA转换为RNA，并随后转换为蛋白(RNAP)，RNAP引起第二循环将休眠的报告子的DNA转换为RNA，并随后转换为蛋白(GFP)。因此，尽管他们的尺寸小，纸片具有复杂任务所需的转录和翻译能力。对于合成生物学应用，此类转录级联可以用于建立更复杂的网络，该网络具有除非被产生正确的RNAP的电路触发否则保持无活性的输出物层。此外，如同正交性(图17D、图32)和埃博拉筛选所示出的(图39)，基于纸的系统对于增加在可以构建和测试遗传学上编码的工具处的节奏具有巨大潜力。考虑到这点，这一技术可以被扩展至工程化的代谢途径和其它复杂的基因电路的原型开发，作为在移动至细胞宿主前的快速诊疗组合设计的方式。因此，随时可用的基于纸的系统不仅可以使目前仅在实验室可用的工具容易地可现场制造，而且还改善了新工具的开发和这些分子工具用于下一代执业医师的教育计划的可接近性。

基于纸的合成基因网络可以显著扩大合成生物学在临床、全球卫生、工业、研究和教育中的作用。

Claims (15)

1.一种耐储存的组合物，所述组合物包含：

(i)合成基因网络，所述合成基因网络包含核酸，所述合成基因网络作为传感器发挥功能，所述传感器包含用于产生可检测的信号的报告基因；以及

(ii)无细胞体系，所述无细胞体系包含足够用于偶联的转录和翻译反应的组件，其中，所述无细胞体系被冻干在亲水性的多孔基底上并且基本上没有水，并且其中，一旦复水，所述无细胞体系对所述偶联的转录和翻译反应来说是活化的；所述多孔基底包括纸、石英微纤维、醋酸纤维素、丝或多孔氧化铝；所述合成基因网络被冻干在亲水性的多孔基底上，并且所述无细胞体系和所述合成基因网络被嵌入所述多孔基底中。

2.如权利要求1所述的耐储存的组合物，其中，所述组件足够用于偶联的转录和翻译反应，并且所述组件包括：含有启动子的DNA、RNA聚合酶、核糖核苷酸、核糖体、氨酰转移RNA、翻译因子和缓冲系统。

3.如权利要求1所述的耐储存的组合物，其中，将所述多孔基底用如下进行预处理：牛血清白蛋白、聚乙二醇、吐温20、Triton-X、奶粉、酪蛋白、鱼明胶或它们的组合。

4.如权利要求1所述的耐储存的组合物，其中，所述无细胞体系包含全细胞提取物或重组的蛋白转录/翻译系统。

5.如权利要求1至4中任一项所述的耐储存的组合物，其中，所述合成基因网络包含逻辑电路。

6.生产权利要求1至5中任一项所述的耐储存的组合物的方法，包括：使固体支持物与包含无细胞体系和合成基因网络的水性溶液接触，以及冻干所述固体支持物，所述固体支持物包括亲水性的多孔基底，所述多孔基底包括纸、石英微纤维、醋酸纤维素、丝或多孔氧化铝；所述无细胞体系包含足够用于偶联的转录和翻译反应的组件；并且所述合成基因网络包含核酸，所述合成基因网络作为传感器发挥功能，所述传感器包含用于产生可检测的信号的报告基因。

7.权利要求1至5中任一项所述的耐储存的组合物在制备用于检测分析物的试剂中的用途，其中，所述组合物包含基于核酸的传感器，并且所述传感器包含当检测到分析物时用于产生可检测的信号的报告基因；

在水的存在下，使所述组合物与待用于对所述分析物进行分析的样品接触；以及

检测所述信号，其中，检测到所述信号表明所述分析物在所述样品中的存在。

8.如权利要求7所述的用途，所述用途进一步包括：在使所述组合物与所述样品接触之后，使所述组合物与水分蒸发的屏障接触、或将所述组合物封装入封装物中。

9.如权利要求7或8所述的用途，其中，所述用途提供对所述分析物的量进行的测量。

10.如权利要求7或8所述的用途，其中，所述分析物选自于由核酸、病原体、病原体提取物、代谢物、抗生素药物、爆炸性化学品、毒性化学品和工业化学品所组成的组。

11.如权利要求7或8所述的用途，其中，所述信号是光信号或电子信号。

12.包含权利要求1至5中任一项所述的耐储存的组合物及用于其的包装材料的试剂盒。

13.一种激活冻干在亲水性的多孔基底上的合成基因网络的方法，所述方法包括：

(i)提供权利要求1至5中任一项所述的耐储存的组合物，其中，所述组合物包含所述合成基因网络；以及

(ii)使所述组合物与含有水的溶液接触。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述合成基因网络作为传感器发挥功能，并且其中，所述溶液进一步包含能够激活所述传感器的分析物。

15.一种激活冻干在亲水性的多孔基底上的合成基因网络的方法，所述合成基因网络包含核酸，所述合成基因网络作为传感器发挥功能，所述传感器包含用于产生可检测的信号的报告基因，所述方法包括：

(i)提供包含足够用于偶联的转录和翻译反应的组件的冻干的无细胞体系，所述无细胞体系被冻干在亲水性的多孔基底上；以及

(ii)在水的存在下，使冻干的所述合成基因网络与所述冻干的无细胞体系接触；

其中，所述多孔基底包括纸、石英微纤维、醋酸纤维素、丝或多孔氧化铝；并且所述无细胞体系和所述合成基因网络被嵌入所述多孔基底中。

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