CN106191172A - 胞嘧啶核苷类似物的酶法制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过使用核苷磷酸化酶尤其是嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPs)或嘌呤核苷磷酸化酶(PNPs)和PyNPs的混合物的胞嘧啶核苷类似物的新合成方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于胞嘧啶核苷类似物(Nucleoside Analogues，NAs)的制备，尤其是用于充当药学上相关的抗病毒和抗癌药物、中间体或其前药的胞嘧啶NAs活性物质的工业制备的新型酶方法。
发明背景
核苷类似物(NAs)是结构上与天然核苷相关的合成化合物。在其结构方面，核苷由三个关键元件构成：(i)羟甲基、(ii)杂环含氮碱基部分、和(iii)在多个实例中似乎起提供在正确取向上的羟甲基和碱基的间隔的作用的呋喃糖环。
NAs的特征在于高结构多样性，因为其展现出各种修饰的碳水化合物和/或糖苷配基片段。
NAs广泛用作抗病毒和抗肿瘤药剂。这些分子已经通过不同的化学方法常规合成，这通常需要耗时的多步过程，包括对杂环碱基和/或戊糖部分的保护-去保护反应以允许自然存在的核苷的修饰(Boryski J.2008.Reactions of transglycosylation in the nucleoside chemistry(核苷化学中的转糖基反应).Curr Org Chem 12：309-325)。这种耗时的多步过程通常导致低产量和增加的成本。实际上，化学方法通常增加得到具有正确的立体和区域选择性的产物的难度，产生作为杂质的副产物(Condezo，L.A.等人2007.Enzymatic synthesis of modified nucleosides(修饰的核苷的酶法合成)，p.401-423.Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries(制药和生物技术行业中的生物催化).CRC Press，Boca Raton，FL，Mikhailopulo，I.A.2007；Sinisterra，J.V.等人2010.Enzyme-catalyzedsynthesis of nonnatural or modified nucleosides(非天然或修饰的核苷的酶催化合成)，p.1-25.Encyclopedia of Industrial Biotechnology：Bioprocess，Bioseparation，and Cell Technology(工业生物技术百科：生物过程、生物分离、和细胞技术)，John Wiley&sons，M.C.Flickinger编，2010)。此外，化学方法包括使用昂贵且对环境有害的化学试剂和有机溶剂。
核苷的酶法合成包括使用催化杂环碱基和糖的缩合因此形成糖苷键的酶。一般而言，可以使用两种不同的酶：核苷磷酸化酶(NPs或NP)和N-2′-脱氧核糖基转移酶(NDTs或NDT)通过碱基互换(转糖基反应)来制备核苷类似物。根据它们的对戊呋喃糖供体和核碱基受体(nucleobaseacceptors)的底物特异性，NPs包括：嘧啶核苷磷酸化酶(E.C.2.4.2.1)、嘌呤核苷磷酸化酶(E.C.2.4.2.2)、尿苷核苷磷酸化酶(E.C.2.4.2.3)和胸苷核苷(E.C.2.4.2.4)。然而，胞嘧啶及其核苷(胞苷、2’-脱氧胞苷)或修饰的胞嘧啶类似物或衍生物及其相应的核苷不是这些NPs酶的底物(Mikhailopulo，I.A等人2010.New Trends in Nucleoside Biotechnology(核苷生物技术的新趋势)，Acta Naturae，2(5)，36-58)。
相反，N-2’-脱氧核糖基转移酶(E.C.2.4.2.6.)特异性地催化脱氧呋喃核糖基部分在核苷和受体碱基之间的转移而不中间成形2-磷酸脱氧呋喃核糖。NDTs底物特异性涉及对2-脱氧呋喃核糖部分的严格特异性，而不是就修饰的嘌呤而言的广泛耐受和作为2-脱氧-和2，3-二脱氧呋喃核糖残基的受体的胞嘧啶的良好底物活性(Mikhailopulo，I.A等人2010.New Trendsin Nucleoside Biotechnology(核苷生物技术的新趋势)，Acta Naturae，2(5)，36-58)。Fresco-Taboada等人(New insights on NDTs：a versatile Biocatalystfor one-pot one-step synthesis of nucleoside analogs(对NDTs的新见解：用于核苷类似物的一锅一步合成的多方面生物催化)，Appl.Microbiol.Biotechnol，2013，97，3773-3785)公开了在所有情况下胞嘧啶是2’-脱氧呋喃核糖部分的最佳受体。
因此，NPs或NDTs的选择取决于受体碱基和供体核苷的结构。彼此互补的NPs和NDTs允许天然核苷及其修饰的类似物的生物催化制备，它们中的大多数可用于许多抗癌和抗病毒药物的制备。
然而，NPs或NDTs都不允许胞嘧啶核糖核苷的制备，因为胞嘧啶不是NPs的受体碱基，同时呋喃核糖核苷供体不是NDTs的底物。因此，胞嘧啶核苷类似物的制备仍然是难题，不仅是因为上述底物特异性，而且还因为通常在生物催化剂制备中存在的某些酶，如胞嘧啶和胞苷脱氨酶或胞嘧啶和胞苷脱乙酰基酶降解底物或最终产物，得到用于工业目的非生产性的方法。
Araki等人(EP 1254959、US 7629457)公开了用于使用对胞嘧啶具有反应性的核苷磷酸化酶或具有所述酶活性的细菌由戊糖-1-磷酸和胞嘧啶或其衍生物制备胞嘧啶核苷化合物的方法。尤其是，发明人发现来自属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、本身应该催化包括嘌呤碱基作为底物代替吡啶碱基的反应的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)能够催化由胞嘧啶和戊糖-1-磷酸制备胞嘧啶核苷。然而，发现在其中公开的胞嘧啶或其衍生物与戊糖-1-磷酸在具有酶活性的细菌的存在下的反应几乎仅产生胞嘧啶或其衍生物的脱氨基产物，因此无法有效累积目标胞嘧啶核苷化合物。为了使脱氨基胞嘧啶副产物的产生最小化，所引用的专利另外公开了用于通过使酶制剂与有机溶剂接触并且在60℃至90℃的温度下将酶制剂加热有效的时间段来特异性降低降解底物或最终产物的脱氨酶活性的方法。
Araki等人(US 2005/0074857)公开了用于使用嘧啶碱基衍生物、使用被称为嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的来自微生物如大肠杆菌(E.coli)的酶来制备嘧啶核苷化合物和新型嘧啶核苷化合物的方法，所述酶还具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性。作者通过加热微生物的细菌细胞或处理过的酶或者与适合的有机溶剂接触放置克服了某些脱乙酰失活。
同一位作者公开了，在不应用复杂脱氨酶-失活处理的情况下，通过产生缺少胞嘧啶脱氨酶基因和胞苷脱氨酶基因二者的微生物(JP2004344029)或借助锌盐(JP2004024086)制备上述化合物的数种方法。
Ding Q.2010.Enzymatic synthesis of nucleosides by mucleosidephosphorylase co-expressed in Escherichia coli(借助在大肠杆菌中共表达的核苷磷酸化酶的核苷的酶法合成).J.Zheijiang Univ-Sci B(Biomed&Biotechnol)11(11)：880-888公开了许多类型核苷的合成。然而，公开内容无法制备胞嘧啶或阿糖苷核苷，因此避免使用用于合成这种特定类型的核苷的NPs。
Szeker，K.2012.Nucleoside phosphorylases from thermophiles(来自嗜热生物的核苷磷酸化酶)，Ph.D.学位论文，Berlin Institute of Biotechnology，Germany公开了，针对作为底物的胞苷确定没有GtPyNP(来自嗜热葡萄糖苷酶芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的NP)的磷酸解活性，仅确定低的TtPyNP(来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的MP)的活性(见上第84页)，并且通过PNPs和ApMTAP(来自敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)的5’-甲硫基腺苷磷酸化酶，见上第116页)较差地识别胞苷作为底物。
因此，胞嘧啶核苷类似物的生物催化合成仍然是难题，并且如以上所解释的，其以工业规模应用受到归因于生物催化剂制剂中存在的竞争性酶的产物降解的限制。
因为多种充当抗病毒或抗癌药剂的非天然核苷含有胞嘧啶作为核碱基部分，令人感兴趣的是开发可以克服之前提到的缺点并且改善这种类型的胞嘧啶核苷类似物的合成的新型且有效的工业酶方法。
卡培他滨(capecitabine)，一种具有胞嘧啶NA化学结构的公知的抗癌药，其在过去已经根据用于这种NA的多步化学合成的现有技术中描述的多种方法制备(F.Hoffmann-La Roche AG的发明人，Arasaki等人，EP0602454；Kamiya等人，EP0602478)。
以上方法遭遇某些缺点如：所使用的溶剂或试剂有毒、需要层析纯化步骤(不适用于大规模生成)、包括糖苷亚基上的羟基的保护和去保护阶段的多步复杂过程、以及卡培他滨合成的低至适中的总收率。在所有方法中保护和去保护工序增加了两个额外的步骤，则从商业生产观点来看，降低总收率并且增加了方法的时间和成本。
在WO 2011/104540中，公开了用于卡培他滨的制备的一步方法。该方法基于5-氟-5’-脱氧胞苷与戊氧基羰基化试剂的反应，这可以避免对事先形成的核苷5-氟-5’-脱氧胞苷的羟基的常规保护的需要。反应在有机溶剂中发生，利用化学催化剂(如碱或作为HCl气体的腐蚀性无机酸)、高温(在溶剂回流下，至多110℃)和长反应时间(通常9至10小时)，赋予卡培他滨适度的收率(50至67％)。
发明人已经证实，卡培他滨在高温下遭遇热不稳定性，并且在90℃下在10小时内在中性pH下加热产物之后，损失多至40％的产物。因此，WO 2011/104540中描述的方法遭遇最终产物的严重损失。
相反，本发明的酶方法在较温和的条件下进行，使用水作为溶剂并且提供高于70％的收率。
Kanan等人(WO 2010/061402)公开了在有机溶剂的存在下使用(CALB)Novozyme 435(来自南极假丝酵母(Candida antartica)的脂肪酶丙烯酸树脂)催化剂的方法。这种方法需要至少四个步骤以获得卡培他滨。
之后，根据与现有技术相关的以上缺点和卡培他滨在癌症治疗中的重要性，对开发用于制备这种活性主要成分(Active Principle Ingredient，API)的改进的方法存在很大需求，这种改进的方法不包括多个步骤，使用相对廉价的试剂，并且其会赋予核苷类似物产物高收率和纯度。
对于阿糖胞苷(cytarabine)合成结果相同。与卡培他滨一样，阿糖胞苷是另一种也享有胞嘧啶NA化学结构的公知的抗癌试剂。存在Merck名下(1964年的NL6511420或者Salt lake Institute of Biological Studies(盐湖城生物研究所)名下(1969年))的早期专利，其已经描述了所述活性化合物的化学合成，其中可能也会涉及卡培他滨所涉及的相同的缺点。
意外的是，发现可以避免前面引用的生物催化合成的缺点并且可以得到具有高于70％的转化率和高于95％的端基异构纯度的胞嘧啶NAs。通过应用基于核苷磷酸化酶(NPs)(嘌呤核苷磷酸化酶(PNPs)、或嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)、或嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的混合物)的使用的适合的酶方法，这是可能的。意外的是，所提到的酶能够适当地识别化学修饰的胞嘧啶并且能够对供体核苷类似物进行转糖基反应而没有任何脱氨基或脱乙酰杂质的证据。发明人已经证实，除使用未修饰的胞嘧啶作为核苷受体外相同的生物催化反应未得到预期的最终产物。对于本说明书来说，将要在本发明的方法中使用的优选的酶是嘧啶核苷磷酸化酶。本发明的另一个优选实施方案是使用嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的混合物，尤其是当使用嘌呤核苷或其衍生物或类似物作为起始化合物时。
与在现有技术中使用的用于这些NAs的化学合成的方法相比，以及此外相对于使用CALB Novozyme 435的酶法合成，作为实例的应用于作为胞嘧啶NAs的卡培他滨或阿糖胞苷的制备的本发明的方法具有多个优点，如：
(i)减少的步骤数，
(ii)较高的转化率和收率，
(iii)不需要对糖中的羟基的保护/去保护策略，
(iv)温和的反应条件：环保的技术(水或水性介质，中性pH)，
(v)在酶法步骤中避免有机溶剂，
(vi)极好的选择性：立体选择性、对映选择性、化学区域选择性，
(vii)无副反应：杂质分布(降低的副产物含量)，
(viii)总废物生成降低，
(ix)方法生产率
(x)整体上更低的制造成本
此外，与在现有技术中使用的化学方法相比，本发明的生物催化方法存在其他额外的优点。尤其是相关的是，在本发明的方法中不存在在Arasaki等人和Kamiya等人的化学方法中使用的有机溶剂，如吡啶、二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)、甲醇、四氢呋喃(THF)，或Kannan等人的酶方法中使用的有机溶剂(吡啶、二氯甲烷(DCM)等)。
尤其是相关的是，在本发明的方法中也不存在金属催化剂如氯化锡、有毒试剂如硅烷基化(sylilating)试剂等。所有那些过程有机溶剂和试剂必须在任何废物排放至环境之前移除或破坏。考虑到在现有技术中描述的方法包括多步骤的操作(包括保护和去保护步骤)，相对于本发明的较简单的酶方法，在现有技术中描述的方法相对于本发明的操作的额外的不方便之处是其复杂性。
发明描述
如在本文中所描述的使用PyNP或PyNP/PNP酶的发明方法概述如下：
方案1.胞嘧啶核苷类似物的酶法合成
申请人已经意外地发现，通过使用核苷磷酸化酶(来自细菌或古生菌的天然、重组或突变蛋白)，并且尤其是使用嘧啶核苷磷酸化酶(来自细菌或古生菌的天然、重组或突变蛋白)，适合的N4修饰的胞嘧啶或N4修饰的胞嘧啶衍生物允许胞嘧啶核苷类似物的高转化率(大于70％)的制备/制造，完全避免副反应，如在前面引用的现有技术中报道的脱氨基或脱乙酰。
在现有技术中未发现指出在胞嘧啶化学骨架中该位置或任何其他位置的化学修饰/取代/保护能够改变底物对核苷磷酸化酶的特异性的事实的证据。对于本说明书来说，术语N4修饰的胞嘧啶/胞嘧啶衍生物是分别是N4取代的胞嘧啶/胞嘧啶衍生物或N4保护的胞嘧啶/胞嘧啶衍生物的同义词。
对于本专利说明书来说，术语胞嘧啶或胞嘧啶衍生物、核苷、中间体、碱基或核碱基应该将它们全部理解为来自胞嘧啶骨架的化合物。对于本发明来说，尤其作为胞嘧啶或胞嘧啶衍生物的是由式II表示的：
作为本发明的目的的适合的化学修改提供了更方便、有效且更容易的用于核苷类似物合成的方法，其完全避免了与副反应相关的不稳定性问题。特别优选的N4修饰包括氨基甲酸酯(-NHCOO-)形式的氨基修饰，更具体地，与1至40个碳原子的烷基链、1至40个碳原子的烯基链或1至40个碳原子的炔基链(在每个情况中链是直链、支链、或被任何其他官能团取代)、芳基或和杂环连接的氨基甲酸酯。酰胺或相关的酰基衍生物(-NHCO-)形式的氨基的N4修饰也允许转糖基反应，尤其是当酰胺基与4至40个碳原子的烷基链、1至40个碳原子的烯基链或1至40个碳原子的炔基链(在每个情况中链是直链、支链、或被任何其他官能团取代)、芳基或和杂环连接时。意外的是，较长的烷基链比短烷基链(1至3个碳原子)更优选，因为根据所进行的实验，还在短烷基链中观察到脱乙酰副反应，这与US2005/0074857所教导的不同。根据本发明，具有1个碳原子的烷基的酰基不能防止脱乙酰。
根据本说明书，将更多的精确化学修饰在N4(在胞嘧啶杂环中的位置4处的氮原子)引入至胞嘧啶骨架。更具体地，在胞嘧啶骨架中进行的那些化学修饰是由式II中的R2和/或R3部分表示的化学修饰：
其中
R1是O、CH2、S、NH；
R2是氢、任选取代的C4-40烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的杂环、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR7、CN、SR6、SO2R6、SO2R6R7、CN、P(O)芳基、P(O)杂环、P(S)芳基、P(S)杂环、P(O)O2R8；
R3是氢、任选取代的C4-40烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的杂环、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR7、CN、SR6、SO2R6、SO2R6R7、CN、P(O)芳基、P(O)杂环、P(S)芳基、P(S)杂环、P(O)O2R8；R3和R2彼此独立；并且条件是R2或R3中的至少一个与氢不同。
R4是氢、OH、NH2、SH、卤素(优选F或I)；任选取代的烷基链；任选取代的烯基链；任选取代的炔基链、三卤代烷基、OR6、NR6R7、CN、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR6、OCONR6R7、OCO2R6、OC(S)OR6、NHCONR6R7、NHCO2R6、NHC(S)OR6、SO2NR6R7、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至Y的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至Y的任选取代的杂环、以及独立的R1、R2、R3、R4或R5的任何选自下列各项的任选取代的杂环或任选取代的芳基：
条件是Y是碳或硫原子，并且备选地，假如Y是氮原子，R4不存在；
其中
X是O、S、N-RB2、Se；RB1是H、OH、NH2、直链或支链C1-10烷基、F、Cl、Br、I、X-RB2、-C≡C-RB2、CO2RB2；RB2是H、OH、NH2、直链或支链C1-5烷基、苯基；
R5是氢、OH、NH2、SH、卤素(优选F或I)、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、三卤代烷基、OR6、NR6R7、CN、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR6、OCONR6R7、OCO2R6、OC(S)OR6、NHCONR6R7、NHCO2R6、NHC(S)OR6、SO2NR6R7；CH2-杂环、CN；
以及独立的R2、R3、R4或R5的任何选自下列各项的任选取代的杂环或任选取代的芳基：
其中
X是O、S、N-RB2、Se；RB1是H、OH、NH2、SH、直链或支链C1-10烷基、F、Cl、Br、I、X-RB2、-C≡C-RB2、CO2RB2；RB2是H、OH、NH2、直链或支链C1-5烷基、苯基；
R6和R7各自独立地为氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、杂环或任选取代的芳基；
R8是氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、任选取代的芳基、任选取代的杂环；
Y是C、N、S；
根据由申请人进行的并且在本说明书中示出的比较例，使用核苷磷酸化酶(天然、重组或突变酶)，尤其是使用嘧啶核苷磷酸化酶，在N4不含适合的修饰的胞嘧啶衍生物不经历转糖基反应，并且因此不能得到所需的核苷最终产物。
此外，未保护的胞嘧啶(碱基或相应的核苷)经历副反应(如脱氨基或脱乙酰)，一些作者试图通过常规方法如加热或使用有机溶剂(EP1254959和US2005/0074857)、加入锌盐(JP2004024086)或通过使用更复杂的方法如使用同时使胞嘧啶脱氨酶基因和胞苷脱氨酶基因二者缺失的微生物(JP2004344029)使该副反应失活。全部上述现有技术中公开的技术方案明显地降低了相应的合成方法的整体收率。本发明提供核苷类似物的合成方法，以完全地且确定地解决以上提及的与降低在本文中所描述的合成方法的整体收率的副反应相关的技术问题。
可以具体地根据每个制备的最终产物的化学结构任选地移除用于修饰/取代/保护得到的最终产物中的N4位置的官能团(最终产物的去保护)。然而，在某些情况下，如对于卡培他滨分子来说，不需要对修饰/取代/保护的胞嘧啶N4基团去保护，因为修饰仍然附着在最终产物(或API)中的氨基上。对于卡培他滨本身来说，本发明的酶方法大幅度地缩短了当使用化学常规制备方法时所需的时间。
因此，本发明通过缩短常规多步合成提供了可用作抗癌和/或抗病毒产品的核苷类似物的改进的备选合成方法，增加了整体收率，降低了副反应和副产物含量，并且因此提高了产物纯度和质量。
对于本说明书来说，如下进一步定义以下术语。
术语“核苷”是指所有在其中杂环碱基与糖共价偶联的化合物，并且核苷与糖的特别优选的偶联包括糖中的碳原子与杂环碱基中的碳或杂原子(通常为氮)的Cl’-(糖苷)键。因此，在本文的上下文中，术语“核苷”意指杂环碱基的糖苷。类似地，术语“核苷酸”是指其中磷酸基与糖偶联的核苷。
可以广义使用术语“核苷”以包括非自然存在的核苷、自然存在的核苷以及其他核苷类似物。核苷的说明性实例是包含核糖部分的核糖核苷以及包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。对于这种核苷的碱基来说，应理解的是其可以是任何自然存在的碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿嘧啶，以及它们的任何修饰的变体或任何可能的非天然碱基。
如在本文中所使用的术语“核苷类似物(analogue)”、“核苷类似物(analog)”、“NA”或“NAs”是指在其中糖优选不是呋喃核糖或呋喃阿拉伯糖和/或在其中杂环碱基不是自然存在的碱基(例如，A、G、C、T、I等)的所有核苷。
如在本文中进一步使用的，术语“糖”是指所有碳水化合物及其衍生物，其中特别预期的衍生物包括糖中化学基团或原子的缺失、置换或添加。例如，特别预期的缺失包括2’-脱氧、3’-脱氧、5’-脱氧和/或2’，3’-二脱氧-糖。特别预期的置换包括用硫或亚甲基替换环上的氧、或用卤素、叠氮基、氨基、氰基、巯基、或甲基替换羟基，并且特别预期的添加包括亚甲基膦酸酯基。进一步预期的糖还包括糖类似物(即，非自然存在的糖)，并且尤其是碳环体系。如在本文中所使用的术语“碳环体系”是指任何在其中多个碳原子形成环的分子，并且在特别预期的碳环体系中，环由3、4、5、或6个碳原子形成。
术语“化学酶法合成”是指通过化学和生物催化步骤的组合的化合物的合成方法。具体对于本发明来说，在本发明的一个优选实施方案中，反应阶段的顺序必须是：1)胞嘧啶碱基的化学修饰；2)使用NP酶的生物催化转糖基；3)任选的最终产物中胞嘧啶-N4的进一步去保护。
术语“酶法合成”是指借助仅包括由适当的酶(NPs)进行的生物催化步骤的过程的化合物的合成方法。因此，在本文中所描述的合成方法的其他优选实施方案是从胞嘧啶衍生物出发的完全生物催化方法，所述胞嘧啶衍生物如前面提到的由通式II表示的胞嘧啶衍生物，其已经制备或作为胞嘧啶衍生物本身可在市场上获得，尤其是在根据本发明的胞嘧啶杂环的N4位置显示出R2和/或R3的那些，并且因此省略了上述胞嘧啶骨架的化学修饰的步骤1。
术语“杂环”或“杂环碱基”或“碱基”或“核碱基”在本文中可互换地使用并且是指任何在其中多个原子通过多个共价键形成环的化合物，其中环包括至少一个除碳原子外的原子。特别预期的杂环碱基包括含有至少1至4个各自独立地选自作为非碳原子的氮、氧和硫的杂原子的5元和6元环(例如，咪唑、吡咯、三唑、二氢嘧啶)。进一步预期的杂环可以与另一个环或杂环稠合(即，共价结合)，并且因此被称为如在本文中所使用的“稠合杂环”或“稠合杂环碱基”。特别预期的稠合杂环包括与6元环稠合的5元环(例如，嘌呤、吡咯并[2，3-d]嘧啶)、和与另一个6元以上环稠合的6元环(例如，吡啶并[4，5-d]嘧啶、苯并二氮□)。以下给出这些和更优选的杂环碱基的实例。更进一步预期的杂环碱基可以是芳族的，或者可以包含一个或多个双键或三键。此外，预期的杂环碱基和稠合杂环还可以在一个或多个位置上被取代。并且被一个、两个或三个取代基任选取代的任何一个环各自独立地选自由下列各项组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、羧基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基、氨基、单或二C1-6烷基氨基、叠氮基、巯基、多卤代C1-6烷基、多卤代C1-6烷氧基、和C3-7环烷基。
术语“核碱基”涵盖自然存在的核碱基以及非自然存在的核碱基。对于本领域技术人员来说，应该清楚的是，随后已经在自然中发现了之前已经认为是“非自然存在的”的多个核碱基。因此，“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括杂环类似物(如N取代的杂环)及其互变异构体。核碱基的说明性实例是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、2-氯腺嘌呤、2-氟腺嘌呤、(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯、胞嘧啶N-烷基氨基甲酸酯、胞嘧啶N-烷基酯、5-氮杂胞嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、6-甲氧基-9H-嘌呤-2-胺和(R)-3，6，7，8-四氢咪唑[4，5-d][1，3]二氮□-8-醇。
术语“核碱基”意在涵盖每一个和全部这些实例以及它们的类似物和互变异构体、和区域异构体。为了将这些“核碱基”与还在本说明书中存在的其他杂环碱基区分，对于本说明书来说，术语“核碱基”主要是指由式II表示的胞嘧啶碱基。然而，同样对于本说明书来说，术语“碱基”主要涉及由式III表示的核苷中存在的碱基。
术语“互变异构体”或“互变形式”是指可通过低能垒互变的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也被称为质子异变互变异构体)包括借助质子迁移的互变，如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体包括借助一些成键电子的重排的互变。
就涉及其原子以不同的连接顺序结合的具有相同分子式的分子的意义而言，术语“区域异构体”是指结构异构体、或构成异构体。
术语“转化率”是指转化为产物(预期的最终产物、副产物、或甚至降解产物)的起始材料的百分率。
术语“收率”是合成的产物的分子的数量/起始分子的数量。在多步合成中，可以通过将所有单个步骤的收率相乘来计算收率。
术语“端基异构纯度”是指化合物的特定端基异构体的量除以混合物中存在的那种化合物的全部端基异构体的总量，再乘以100％。
术语“胞嘧啶修饰/置换/保护”是指在其中原始胞嘧啶骨架上的至少一个位置(除了在位置1的氮)被官能团，如被描述为基团R1、R2、R3、R4、R5、X和/或Y(这些基团中的每一个彼此独立)的那些取代的任何核苷类似物。
术语“在位置N4的胞嘧啶修饰/取代/保护”是指在其中在位置4的氨基的至少一个质子被官能团，如被描述为基团R2和/或R3的那些取代的具有胞嘧啶骨架的碱基，这些取代基中的每一个彼此独立，条件是上述取代基中的至少一个与氢不同。
术语“一个中间体”或“多个中间体”是指可以借助适合的额外化学反应转化为核苷结构的活性药物成分(API)的任何核苷类似物型化合物。因此，中间体是可以被认为是API前体的分子。对于本说明书来说，当应用于N4修饰的胞嘧啶或胞嘧啶衍生物或中间体时，术语“前体”意指式II的化合物，其中与N4结合的部分是除由R2或R3表示的那些外的化学基团。
如在整个本文中使用的术语“前药”意指药理学上可接受的衍生物如酯、酰胺、氨基甲酸酯和磷酸盐，从而所得到的衍生物的体内生物转化产物是如在式(I)的化合物中所定义的活性药物。Goodman和Gilman的概括性描述前药的参考文献(The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗的药理学基础)，第8版，McGraw-Hill，Int.Ed.1992，“Biotransformation ofDrugs(药物的生物转化)”，p 13-15)结合于此。前药优选具有优异的水溶解性、增加的生物利用度并且容易在体内代谢为活性抑制剂。以通过常规处理或在体内将修饰分裂为母体化合物的方式，通过修饰化合物中存在的官能团，可以制备本发明的化合物的前药。
优选的前药是可在体内水解并且来自式I的具有羟基或氨基的那些化合物的药用酯、酰胺和氨基甲酸酯。可在体内水解的酯、酰胺和氨基甲酸酯是在人或动物身体中水解以产生母体酸或醇的酯、酰胺或氨基甲酸酯基。氨基的适合的药用酯、酰胺和氨基甲酸酯包括可以在本发明的化合物中的任何羧基处形成的C1-6烷氧基甲基酯例如甲氧基甲基、C1-6烷酰氧基甲基酯例如新戊酰氧基甲基、酞基酯、C3-8环烷氧基羰基氧基C1-6烷基酯例如1-环己基羰基氧基乙基；1，3-二氧戊环-2-酮基甲基酯例如5-甲基-1，3-二氧戊环-2-酮基甲基；以及C1-6烷氧基羰基氧基乙基酯例如1-甲氧基羰基-氧乙基。
式(I)的含有羟基的化合物的可体内水解的酯包括无机酯如磷酸酯和α-酰氧基烷基醚以及有关的化合物，作为体内水解的结果，酯分解得到母体羟基。α-酰氧基烷基醚的实例包括乙酰氧基甲氧基和2，2-二甲基丙酰氧基-甲氧基。形成用于羟基的基团的可体内水解的酯的选择包括链烷酰基、苯甲酰基、苯乙酰基和取代的苯甲酰基和苯乙酰基、烷氧基羰基(得到烷基碳酸酯)、二烷基氨基甲酰基和N-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(得到氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。苯甲酰基上的取代基的实例包括从环氮原子经由亚甲基连接至苯甲酰基环的3-或4位置的吗啉基和哌嗪基。
用于治疗用途，式(I)的化合物的盐是其中抗衡离子药用的那些。然而，非药用的酸和碱的盐也可以发现用于例如药用化合物的制备或纯化。所有盐，无论是药用的或不是药用的，均包括在本发明的范围内的。
如上所述的药用酸和碱加成盐意在包括式(I)的化合物能够形成的治疗活性的无毒酸和碱加成盐的形式。可以通过用这种适合的酸处理碱形式方便地获得药用酸加成盐。适合的酸包含，例如，无机酸如氢卤酸，例如氢氯酸或氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等酸；或有机酸如，例如，乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸(即乙二酸)、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸(即羟基丁二酸)、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸等酸。
相反，可以通过用适合的碱处理将所述盐的形式转化为游离碱的形式。
还可以通过用适合的有机和无机碱处理将式(I)的含有酸性质子的化合物转化为它们的无毒金属或胺加成盐的形式。适合的碱盐的形式包括，例如，铵盐，碱和碱土金属盐例如锂、钠、钾、镁、钙盐等，具有有机碱的盐例如苄星(benzathine)、N-甲基-D-葡糖胺、海巴胺(hydrabamine)盐，以及具有氨基酸的盐如，例如，精氨酸、赖氨酸等。
如在上文使用的术语加成盐还包括式(I)的化合物及其盐能够形成的溶剂化物。此类溶剂化物是例如水合物、醇化物等。
如在上文中使用的术语“季胺”限定式(I)的化合物通过式(I)的化合物的碱性氮与适合的季铵化试剂之间的反应形成的季铵盐，所述季铵化试剂如，例如，任选取代的烷基卤化物、芳基卤化物、芳基烷基卤化物，例如甲基碘或苄基碘。也可以使用具有良好离去基团的其他反应物，如三氟甲磺酸烷基酯、甲磺酸烷基酯、和对甲苯磺酸烷基酯。季胺具有带正电的氮。药用抗衡离子包括氯、溴、碘、三氟乙酸根和乙酸根。可以使用离子交换树脂引入所选择的抗衡离子。
本发明化合物的N-氧化物形式意在包括式(I)的化合物，其中一个或者多个氮原子被氧化为所谓的N-氧化物。
应该理解的是，式(I)的化合物可以具有金属结合、螯合、复合物形成性质，并且因此可以作为金属复合物或金属螯合物存在。意在使式(I)的化合物的此类金属化的衍生物包括在本发明的范围内。
一些式(I)的化合物还可以以其互变异构形式存在。意在使虽然未在以上式中明确指出的此类形式包括在本发明的范围内。
如在本文中所使用的术语“烷基”，其实际上是指在其中所有碳-碳键均为单键的任何直链、支链或环状烃。
术语“烯基”和“未取代的烯基”在本文中可互换地使用并且是指具有至少一个碳碳双键的任何直链、支链或环状烷基。
此外，如在本文中所使用的术语“炔基”，其实际上是指具有至少一个碳-碳三键的任何直链、支链或环状烷基或烯基。
如在本文中所使用的术语“芳基”，其实际上是指任何芳族环状烯基或炔基，作为基团或基团的一部分的是苯基或萘基，其各自被一个、两个或三个选自下列各项的取代基任选取代：卤素、羟基、硝基、氰基、羧基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基、氨基、单或二C1-6烷基氨基、叠氮基、巯基、多卤代C1-6烷基、和多卤代C1-6烷氧基。在芳基与烷基、烯基、或炔基共价结合的情况下，采用术语“烷芳基”。
如在本文中所使用的术语“取代的”是指原子或化学基团(例如，H、NH2、或OH)被官能团、并且尤其是预期官能团的替换，所述预期的官能团包括亲核基团(例如，-NH2、-OH、-SH、-NC等)、亲电基团(例如，C(O)OR、C(X)OH等)、极性基团(例如，-OH)、非极性基团(例如，芳基、烷基、烯基、炔基等)、离子基团(例如，-NH3 +)、和卤素(例如，-F、-Cl)，以及它们的所有化学上合理的组合。因此，术语“官能团”和术语“取代基”在本文中可互换使用并且是指亲核基团(例如，-NH2、-OH、-SH、-NC、-CN等)、亲电基团(例如，C(O)OR、C(X)OH、C(卤素)OR等)、极性基团(例如，-OH)、非极性基团(例如，芳基、烷基、烯基、炔基等)、离子基团(例如，-NH3 +)、和卤素。
对于本说明书来说，术语“核苷磷酸化酶”或“NP”或“NPs”包括嘧啶核苷磷酸化酶或PyNP(PyNPs)酶或PyNPs与PNPs(嘌呤核苷磷酸化酶)的混合物。那些酶可以从自然存在的微生物(嗜温生物、嗜热生物、超嗜热生物或极端嗜热生物)中获得。对于本说明书来说，生物或NPs酶、嗜温生物或嗜温的是能够在范围为18至60℃的温度(最佳温度范围为40-55℃)下发挥或实现NP活性的那些。生物或NPs酶、嗜热生物或嗜热的是能够在超过60℃且高至80℃的温度下发挥或实现NP活性的那些。生物或NPs酶、超嗜热生物或超嗜热的是能够在超过80℃且高至100℃的温度(最佳温度范围为80-95℃)下发挥或实现NP活性的那些。此外，在本发明中使用的酶可以是通过遗传重组技术得到的、在用携带各个编码核酸序列的相应载体转化的宿主细胞中表达的克隆酶。
编码根据本发明的NP酶的核酸分子优选选自：SEQ ID NO.1、2、5、7、9或11；或
a)作为SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的互补体(complement)的核苷酸序列；或
b)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11简并的核苷酸序列；或
c)在高严格性条件下与下列各项杂交的核苷酸序列：SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11；SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的互补体；或来自SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的杂交探针；或它们的互补体；或
d)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；
e)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11具有至少59％序列同一性的核苷酸序列；
f)编码选自SEQ ID.NO：3、4、6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列。
从本发明的意义上来说，严格杂交的条件如由Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，冷泉港实验室出版社(1989)，1.1011.104中描述的那些所定义。据此，在严格条件下杂交意指在用1x SSC缓冲液和0.1％SDS在55℃、优选在62℃下并且最优选在68℃下洗涤一小时之后，尤其是在0.2x SSC缓冲液和0.1％SDS中在55℃下、优选在62℃下并且最优选在68℃下洗涤一小时之后，仍然观察到阳性杂交信号。
此外，从本说明书的意义上来说，本发明还涵盖核苷酸或氨基酸序列，其在核苷酸或氨基酸水平上分别具有与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO：2(核苷酸)或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO：4(氨基酸)中所示的核苷酸或氨基酸序列的至少59％、特别优选至少80％并且最优选至少90％的同一性。百分比同一性根据以下方程式确定：
I＝(n/L)x 100
其中I是百分比同一性，L是基础序列的长度并且n是核苷酸或氨基酸与基础序列的序列差异的数量。
表-1.嘌呤核苷磷酸化酶(deoD)[硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)]蛋白质序列与15.11.2013的GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中类似的PNP蛋白质的同一性。
表-2.尿苷磷酸化酶[敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)K1]蛋白质序列与15.11.2013的GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中类似的UDP蛋白质的同一性。
| 登录号 | 生物 | 同一性％ |
| NP_148386.2 | 敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)K1(SEQ ID NO：4) | 100％ |
| YP_008604720.1 | Aeropyrum camini SY1 | 93％ |
本发明的又一个主题是重组载体，所述重组载体包含与表达控制序列可操作地连接的至少一个拷贝的如以上所定义的核酸分子。载体可以是任何原核或真核载体。原核载体的实例是染色体载体如噬菌体(例如λ噬菌体)和染色体外载体如质粒(参见，例如，Sambrook等人，见上第1-4章)。载体也可以是真核载体，例如酵母载体或适用于更高级细胞的载体，例如质粒载体、病毒载体或植物载体。适合的真核载体由例如Sambrook等人描述，见上第16章。本发明此外涉及用如上所述的核酸或重组载体转化的重组细胞。所述细胞可以是任何细胞，例如原核或真核细胞。原核细胞，尤其是，大肠杆菌细胞是尤其优选的。
对于本说明书来说，本发明还涵盖SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12的变体、或直向同源物(orthologues)。
如在整个说明书中使用的术语“变体”应理解为意指分别改变一个或多个核苷酸或氨基酸的核酸的核苷酸序列或蛋白质或多肽的氨基酸序列。变体可以具有“保守性”变化，其中取代的核苷酸或氨基酸具有与被替换的核苷酸或氨基酸类似的结构或化学性质。变体还可以具有“非保守性”变化或一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失和/或插入。该术语在其范围内还包括对特定核酸或者蛋白质或多肽任何核苷酸或氨基酸的插入/缺失。“功能变体”应被理解为意指保持参考的核苷酸序列或蛋白质或多肽的功能的变体。
如在本文中所使用的术语“互补体”或“互补的”可以意指20个双链核酸如DNA和RNA的每条链与另一条链是互补的，原因在于，它们之间的碱基对是经由两个或三个氢键非共价连接的。对于DNA来说，腺嘌呤(A)碱基与胸腺嘧啶(T)碱基互补，并且反之亦然；鸟嘌呤(G)碱基与胞嘧啶(C)碱基互补，并且反之亦然。除了腺嘌呤(A)碱基与尿嘧啶(U)碱基而不是胸腺嘧啶(T)碱基互补之外，对于RNA来说是相同的。因为对于在DNA中和在RNA中发现的每种碱基来说仅存在一个25互补碱基，人们可以为任何单链重建互补链。
如在整个说明书中使用的术语“直向同源物”应被理解为在不同物种中发现的同源基因或miRNA序列。
“重组DNA分子”在本说明书中被理解为已经经过分子生物学处理的DNA分子。因此，术语“重组DNA”为非自然存在的DNA的形式，它是通过组合正常不会一起出现的DNA序列而创建的。
一旦引入至宿主细胞中，“重组DNA分子”即被宿主细胞复制。在本文中通过“重组蛋白或酶”意指由采用“重组DNA分子”的方法制备的蛋白质或酶，并且因此同样对于本说明书来说，术语重组酶或重组型酶应被理解为来自重组DNA的蛋白质或酶。
对于本说明书来说，突变酶意指任何显示出至少一个突变的酶，所述突变是自然存在的或者是通过包括遗传工程在内的人工处理诱导的。
相反，对于本说明书来说，全部作为同义词的天然的、自然的或自然存在的酶意指保留其以前氨基酸序列的酶，因为发现其在性质上通常是普遍的而没有突变。
通过本发明的酶的功能部分意指原始酶的任何序列片段、或编码其的DNA片段，其保留了完整酶序列的发挥其全部生物催化性能的能力。
对于本说明书来说，术语胞嘧啶核苷类似物意指胞嘧啶的核苷类似物或胞嘧啶衍生物的核苷类似物。同样地，受限于本专利说明书，术语胞嘧啶碱基意指碱基胞嘧啶或其衍生物。类似地，如在本说明书中所使用的，术语修饰的胞嘧啶碱基涵盖由式II表示的化合物，其中胞嘧啶碱基的骨架在位置4、5或6被取代。
本说明书公开了用于制备尤其可用作活性药物成分(APIs)的胞嘧啶核苷类似物、中间体或其前药的酶方法，那些APIs或其中间体是式I的核苷类似物(NAs)：
其中，
Z1是：O、CH2、S、NH；
Z2独立于Z1为：O、C(RS2RS5)、S(RS2RS5)、S(RS2)、S(RS5)，优选基团SO或SO2；N(RS2RS5)、N(RS2)、N(RS5)；
RS1是：氢、OH、其选自下列的醚或酯：
n是0或1，A是氧或氮，并且每个M独立地为氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链任选连接至P的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链任选连接至P的任选取代的杂环、或者药用抗衡离子如，但不限于，钠、钾、铵或烷基铵；
RS2是氢、OH或其醚或酯残基、卤素(优选F)、CN、NH2、SH、C≡CH、N3；
在NA来自2’-脱氧核糖核苷或阿糖核苷的情况下，RS3是氢，或者当NA来自核糖核苷时，RS3选自OH、NH2、卤素(优选F)、OCH3；
RS4是氢、OH或其醚或酯残基、NH2、卤素(优选F)、CN；
条件是当二者均为OH残基的醚或酯时，RS1和RS4是不同的；
当Z2与氧不同时，RS5是氢、OH或其醚或酯残基、NH2或卤素(优选F)；
R1是O、CH2、S、NH；
R2是氢、任选取代的烷基链(优选C4-40烷基链)、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的杂环、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR7、CN、SR6、SO2R6、SO2R6R7、CN、P(O)芳基、P(O)杂环、P(S)芳基、P(S)杂环、P(O)O2R8；
R3是氢、任选取代的烷基链(优选C4-40烷基链)、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的杂环、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR7、CN、SR6、SO2R6、SO2R6R7、CN、P(O)芳基、P(O)杂环、P(S)芳基、P(S)杂环、P(O)O2R8；R3和R2彼此独立；并且条件是R2或R3中的至少一个与氢不同。
R4是氢、OH、NH2、SH、卤素(优选F或I)；任选取代的烷基链；任选取代的烯基链；任选取代的炔基链、三卤代烷基、OR6、NR6R7、CN、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR6、OCONR6R7、OCO2R6、OC(S)OR6、NHCONR6R7、NHCO2R6、NHC(S)OR6、SO2NR6R7、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至Y的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至Y的任选取代的杂环、以及独立的R1、R2、R3、R4或R5的任何选自下列各项的任选取代的杂环或任选取代的芳基：
条件是Y是碳或硫原子，并且备选地，R4为不存在，条件是Y是氮原子；
其中
X是O、S、N-RB2、Se；RB1是H、OH、NH2、SH、直链或支链C1-10烷基、F、Cl、Br、I、X-RB2、-C≡C-RB2、CO2RB2；RB2是H、OH、NH2、直链或支链C1-5烷基、苯基；
R5是氢、OH、NH2、SH、卤素(优选F或I)、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、三卤代烷基、OR6、NR6R7、CN、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR6、OCONR6R7、OCO2R6、OC(S)OR6、NHCONR6R7、NHCO2R6、NHC(S)OR6、SO2NR6R7；CH2-杂环、CN；
以及独立的R1、R2、R3、R4或R5的任何选自下列各项的任选取代的杂环或任选取代的芳基：
其中
X是O、S、N-RB2、Se；RB1是H、OH、NH2、SH、直链或支链C1-10烷基、F、Cl、Br、I、X-RB2、-C≡C-RB2、CO2RB2；RB2是H、OH、NH2、直链或支链C1-5烷基、苯基；
R6和R7各自独立地为氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、杂环或任选取代的芳基；
R8是氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、任选取代的芳基、任选取代的杂环；
Y是C、N、S；
其中当采用本发明的方法的化学酶法优选实施方案时，所述用于制备胞嘧啶核苷类似物的方法包括以下步骤：
(i)使胞嘧啶碱基与用于修饰在胞嘧啶衍生物中的N4位置的氨基的适合的试剂进行化学反应，以便加入被描述为式II的中间化合物中的取代基R2和R3的适合的取代，所述中间化合物在步骤(i)的终点任选地通过常规纯化方法纯化；
备选地，本发明的方法可以直接从由式II(修饰的胞嘧啶碱基)表示的起始产物出发，所述起始产物可在市场上获得或者是之前合成的。
(ii)使上述修饰的胞嘧啶碱基与适合的核苷类似物起始材料反应，其中所述反应包括在适合的反应水性介质中和在适合的反应条件下将核苷磷酸化酶(NPs)，优选嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)，加入至包含式II的胞嘧啶衍生物和式III的核苷类似物的起始材料的混合物中
其中，
Z1是O、CH2、S、NH；
Z2独立于Z1为：O、C(RS2RS5)、S(RS2RS5)、S(RS2)、S(RS5)，优选基团SO或SO2；N(RS2RS5)、N(RS2)、N(RS5)；
RSi是氢、OH、其选自下列的醚或酯：
n是0或1，A是氧或氮，并且每个M独立地为氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链任选连接至P的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链任选连接至P的任选取代的杂环、或者药用抗衡离子如，但不限于，钠、钾、铵或烷基铵；
RS2是氢、OH或其醚或酯残基、卤素(优选F)、CN、NH2、SH、C≡CH、N3；
在NA来自2’-脱氧核糖核苷或阿糖核苷的情况下，RS3是氢，或者当NA来自核糖核苷时，RS3选自OH、NH2、卤素(优选F)、OCH3；
RS4是氢、OH或其醚或酯残基、NH2、卤素(优选F)、CN；
条件是当二者均为OH残基的醚或酯时，RS1和RS4是不同的；
在Z2与氧不同的情况下，RS5是氢、OH或其醚或酯残基、NH2或卤素(优选F)；
R1是O、CH2、S、NH；
R2是氢、任选取代的烷基链(优选C4-40烷基链)、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的杂环、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR7、CN、SR6、SO2R6、SO2R6R7、CN、P(O)芳基、P(O)杂环、P(S)芳基、P(S)杂环、P(O)O2R8；
R3是氢、任选取代的烷基链(优选C4-40烷基链)、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的杂环、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR7、CN、SR6、SO2R6、SO2R6R7、CN、P(O)芳基、P(O)杂环、P(S)芳基、P(S)杂环、P(O)O2R8；R3和R2彼此独立；并且条件是R2或R3中的至少一个与氢不同；
R4是氢、OH、NH2、SH、卤素(优选F或I)；任选取代的烷基链；任选取代的烯基链；任选取代的炔基链、三卤代烷基、OR6、NR6R7、CN、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR6、OCONR6R7、OCO2R6、OC(S)OR6、NHCONR6R7、NHCO2R6、NHC(S)OR6、SO2NR6R7、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至Y的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至Y的任选取代的杂环、以及独立的R2、R3、R4或R5的任何选自下列各项的任选取代的杂环或任选取代的芳基：
条件是Y是碳或硫原子，并且备选地，条件是Y是氮原子，R4为不存在；
其中
X是O、S、N-RB2、Se；RB1是H、OH、NH2、SH、直链或支链C1-10烷基、F、Cl、Br、I、X-RB2、-C≡C-RB2、CO2RB2；RB2是H、OH、NH2、直链或支链C1-5烷基、苯基；
R5是氢、OH、NH2、SH、卤素(优选F或I)、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、三卤代烷基、OR6、NR6R7、CN、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR6、OCONR6R7、OCO2R6、OC(S)OR6、NHCONR6R7、NHCO2R6、NHC(S)OR6、SO2NR6R7；CH2-杂环、CN；
以及独立的R2、R3、R4或R5的任何选自下列各项的任选取代的杂环或任选取代的芳基：
其中
X是O、S、N-RB2、Se；RB1是H、OH、NH2、SH、直链或支链C1-10烷基、F、Cl、Br、I、X-RB2、-C≡C-RB2、CO2RB2；RB2是H、OH、NH2、直链或支链C1-5烷基、苯基；
R6和R7各自独立地为氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、杂环或任选取代的芳基；
R8是氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、任选取代的芳基、任选取代的杂环；
Y是C、N、S；
(iii)任选地，将在胞嘧啶核苷类似物中的N4位的所述氨基去保护以便在通过常规纯化方法进一步纯化的所述式I的胞嘧啶核苷类似物上恢复所述游离的伯氨基N4。
优选地，构成起始材料的式III中的碱基的杂环选自：尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、硫尿嘧啶、硫鸟嘌呤、9-H-嘌呤-2-胺、7-甲基鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5，6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶以及它们的任何取代的衍生物。
此外，待修饰以便得到相应的式II的核碱基的游离胞嘧啶或胞嘧啶衍生物优选选自：
此外，式I的核苷类似物中的胞嘧啶核碱基优选选自：
对于在本文中所描述的方法来说，所制备的APIs、中间体或其前药选自：卡培他滨(Capecitabine)、地西他滨(Decitabine，aza-dCyd或DAC)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，aza-Cyd)、阿糖胞苷(Cytarabine，ara-C)、依诺他滨(Enocitabine，BH-AC)、吉西他滨(Gemcitabine，dFdC)、扎西他滨(Zalcitabine，ddC)、伊巴他滨(Ibacitabine)、沙帕他滨(Sapacitabine)、2’-C-氰基-2’-脱氧-1-β-D-阿糖基-戊呋喃糖基胞嘧啶(CNDAC)、加洛他滨(Galocitabine)、伐洛他滨(Valopricitabine，NM283)、2’-脱氧-4’-硫胞苷、Thiarabine(T-araC)、2’-脱氧-4’-硫代-5-氮杂胞苷或阿立他滨(Apricitarabine，ATC)。
更优选地，所制备的APIs、中间体或其前药选自：卡培他滨(Capecitabine)、地西他滨(Decitabine，aza-dCyd或DAC)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，aza-Cyd)、阿糖胞苷(Cytarabine，ara-C)，并且再更优选地，所描述的方法尤其预期卡培他滨或阿糖胞苷的工业制备。
在实施至此所描述的方法的又一个优选实施方案中，所制备的API、中间体或其前药是卡培他滨(方案2)。
方案2.借助NPs或PyNPs的卡培他滨的合成
在优选范围为20-120℃的温度下进行卡培他滨的生物催化步骤(酶法步骤)，酶法或化学酶法合成。
在实施至此所描述的方法的又一个优选实施方案中，所制备的API、中间体或其前药是阿糖胞苷(方案3)。
方案3.借助NPs或PyNPs的阿糖胞苷的合成
对于进行本说明书的生物催化方法来说，申请人已经选择了含有NPs酶的生物或分离的NPs酶本身，优选地，在两种情况下，为PyNP酶或PyNP/PNP酶混合物，其中从它们能够在范围为18至高至60℃的温度(最佳温度范围为40-55℃)下发挥和实现核苷转移酶活性的意义上来说，酶或含有它们的微生物是嗜温生物或嗜温的。生物或NPs酶尤其是PyNP酶、嗜热生物或嗜热的是能够在范围为超过60℃且高至80℃的温度下发挥或实现核苷转移酶活性的那些。生物或NPs酶尤其是PyNP酶、超嗜热生物或超嗜热的是能够在超过80℃且高至100℃的温度(最佳温度范围为80-95℃)下发挥或实现核苷转移酶活性的那些。
可以从微生物中分离在本发明的方法中使用的NPs(PyNP)酶，所述微生物选自嗜温生物，作为实例，为细菌，尤其是大肠杆菌，或者选自嗜温、嗜热或超嗜热古生菌(Archaea)，尤其是选自热变形菌纲(Thermoproteiclass)，并且更尤其是选自在WO201I/076894中公开的属和种。根据本发明的再更优选的核苷磷酸化酶来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)和敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)。
本发明的又一个实施方案涉及包含由选自SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的核酸序列或其片段编码的氨基酸序列的重组NP酶在公开的方法中的用途。两个DNA序列分离自古生菌，并且更尤其是，分离自具有与核苷磷酸化酶同源的序列的古生菌。
如本说明书自始至终描述的，用于实施本发明的方法的优选实施方案基于嗜温、嗜热或超嗜热NPs酶(嘌呤NPs(PNPs)、或嘧啶NPs(PyNPs)、它们的混合物)的作为生物催化剂的用途，用于进行碱基转移一步一锅反应(one step-one pot reaction)。优选的嗜热或超嗜热NPs酶是重组型的，包含基因序列或其片段，编码能够在范围为超过60℃且高至100℃的温度下以及更优选在本文中所描述的适合的反应条件下进行核碱基转移一步一锅反应的NP酶活性。
对于本说明书来说，在本发明的生物催化方法中使用的优选的酶。克隆其的方法、携带编码其的核酸序列的载体以及被上述载体转化的宿主细胞，均为在本发明的一些发明人名下的WO2011/076894中公开的那些，并且他们的专利申请的全部说明书通过引用完全包含在本文中。
用于实施本发明的方法的不同实施方案的适合的条件包括：
a)范围为20-120℃的温度
b)范围为1-1000h的反应时间
c)范围为1-1000mM的起始材料浓度
d)范围为1∶5至5∶1的化学计量核苷起始材料∶核碱基。
e)范围为0,001-100mg/ml的NP酶的量
f)加入至反应介质、任选地溶解于有机溶剂的核碱基
g)任选还含有至多40％的适合有机溶剂的水性反应介质优选地，至多20％，并且更优选至多5％。
任选地，可以将有机溶剂加入至反应介质中或者用于事先溶解核碱基。优选的是极性非质子溶剂，优选选自：四氢呋喃、乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜(DMSO)。
根据本发明的方法还包括通过选自沉淀、过滤、浓缩或结晶的标准操作方式的所制备的NA的分离和/或纯化步骤。
嗜热NP酶能够在使得核碱基转移反应在时间和总产率方面更有效的较高温度下起作用。
本发明的方法具体公开了卡培他滨的制备(方案2)作为本发明的实施方案，其中用作起始材料的核糖核苷是选自5’-脱氧尿苷、5’-脱氧-5-甲基尿苷或5’-氯-5’-脱氧尿苷的5’-脱氧呋喃核糖基核苷；用作由PyNP酶转移的起始材料的核碱基是(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯并且PyNP是从细菌中分离的自然存在的嗜温、嗜热或超嗜热酶。
本发明的方法的一个备选实施方案是这样的实施方案，其中所制备的API是卡培他滨(方案2)，用作起始材料的核糖核苷是5’-脱氧尿苷、5’-脱氧-5-甲基尿苷或5’-氯-5’-脱氧尿苷，还用作由PyNP酶转移的起始材料的核碱基是(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯并且PyNP是重组的嗜温、嗜热或超嗜热酶，其克隆的DNA是从细菌中分离的。
本发明的方法的另一个备选实施方案是以下实施方案，其中所制备的API是卡培他滨(方案2)，用作起始材料的核糖核苷是5’-脱氧尿苷、5’-脱氧-5-甲基尿苷或5’-氯-5’-脱氧尿苷，还用作由PyNP酶转移的起始材料的核碱基是(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯并且PyNP是从古生菌中分离的自然存在的嗜温、嗜热或超嗜热酶。
本发明的方法的又一个备选实施方案是这样的实施方案，其中所制备的API是卡培他滨(方案2)，用作起始材料的核糖核苷是5’-脱氧尿苷、5’-脱氧-5-甲基尿苷或5’-氯-5’-脱氧尿苷，还用作由PyNP酶转移的起始材料的核碱基是(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯并且PyNP是从古生菌中分离的重组的嗜温、嗜热或超嗜热酶。
本发明的方法还由以下实施方案表示，其中所制备的API是阿糖胞苷(方案3)，用作起始材料的核糖核苷是阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶或阿拉伯糖核苷，还用作由PyNP酶转移的起始材料的核碱基是N-(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)戊酰胺并且PyNP是从细菌中分离的自然存在的嗜温、嗜热或超嗜热酶。
本发明的方法的另一个实施方案是以下实施方案，其中所制备的API是阿糖胞苷(方案3)，用作起始材料的核糖核苷是阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶或阿拉伯糖核苷，还用作由PyNP酶转移的起始材料的核碱基是N-(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)戊酰胺并且PyNP是重组的嗜温、嗜热或超嗜热酶，其克隆的DNA是从细菌中分离的。
本发明的方法的额外的实施方案是以下实施方案，其中所制备的API是阿糖胞苷(方案3)，用作起始材料的核糖核苷是阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶或阿拉伯糖核苷，还用作由PyNP酶转移的起始材料的核碱基是N-(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)戊酰胺并且PyNP是自然存在的嗜温、嗜热或超嗜热酶，其克隆的DNA是从古生菌中分离的。
本发明的方法的另一个实施方案是以下实施方案，其中所制备的API是阿糖胞苷(方案3)，用作起始材料的核糖核苷是阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶或阿拉伯糖核苷，还用作由PyNP酶转移的起始材料的核碱基是N-(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)戊酰胺并且PyNP是重组的嗜温、嗜热或超嗜热酶，其克隆的DNA是从古生菌中分离的。
为了形成相同发明构思的一部分，本说明书还公开了重组核苷磷酸化酶(PNPs或PyNPs)，其用于如上所述的本发明的方法中的任何一种。所述天然的或重组的NP酶可以分离自嗜温生物，更优选细菌和古生菌；或者分离自嗜热生物，更优选细菌和古生菌；或者分离自超嗜热生物，更优选细菌和古生菌，并且更尤其是分离自硫磺矿硫化叶菌和敏捷气热菌。
同样为了整合单个本发明相关概念，本说明书还公开了嗜温、嗜热或超嗜热核苷磷酸化酶(NP或PyNP)在制备APIs、中间体或其前药中的用途，那些APIs、它们的中间体或它们的前药是可用作抗癌或抗病毒药物的胞嘧啶核苷类似物(NAs)。更优选地，前面提到的用途通过也在前面详述的作为APIs的NAs、中间体或其前药的制备方法及其变体实现。尤其是，关于前面提到的用途，重组的嗜热核苷磷酸化酶(PNPs、PyNPs或其混合物)在制备APIs中是优选的，那些APIs或其中间体是尤其可用作抗癌或抗病毒药物的核苷类似物(NAs)。
在根据此类用途制备的APIs、中间体或其前药中，可以发现以下各项：
卡培他滨(Capecitabine)、地西他滨(Decitabine，aza-dCyd或DAC)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，aza-Cyd)、阿糖胞苷(Cytarabine，ara-C)、依诺他滨(Enocitabine，BH-AC)、吉西他滨(Gemcitabine，dFdC)、扎西他滨(Zalcitabine，ddC)、伊巴他滨(Ibacitabine)、沙帕他滨(Sapacitabine)、2’-C-氰基-2’-脱氧-1-β-D-阿糖基-戊呋喃糖基胞嘧啶(CNDAC)、加洛他滨(Galocitabine)、伐洛他滨(Valopricitabine，NM283)、2’-脱氧-4’-硫胞苷、Thiarabine(T-araC)、2’-脱氧-4’-硫代-5-氮杂胞苷或阿立他滨(Apricitarabine，ATC)。
更优选地，根据在本文中所公开的酶的用途制备的APIs、中间体或其前药选自：卡培他滨(Capecitabine)、地西他滨(Decitabine，aza-dCyd或DAC)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，aza-Cyd)、阿糖胞苷(Cytarabine，ara-C)，并且再更优选地，所描述的方法尤其预期卡培他滨或阿糖胞苷以及它们各自的中间体或前药的工业制备。
在本发明中还包括重组表达载体，其包含可操作地连接至在适合的宿主中引导所述核苷磷酸化酶的表达或过量表达的一个或多个控制序列的编码核苷磷酸化酶活性(NPs)的序列。根据本发明的优选的重组表达载体是携带并且表达或过量表达编码NP酶活性的基因的任何表达载体，其存在于嗜热和超嗜热古生菌中，优选泉古菌(Crenarchaeote)，并且更优选来自热变形菌(Thermoprotei)纲，如：A1RW90(A1RW90THEPD)，来自下垂热丝菌(Thermofilum pendens)(菌株Hrk 5)的假定蛋白；Q97Y30(Q97Y30SULSO)，来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的假定蛋白；A3DME1(A3DME1STAMF)，来自海葡萄嗜热菌(Staphylothermus marinus)(菌株ATCC 43588/DSM 3639/Fl)的假定蛋白；Q9YA34(Q9YA34AERPE)，来自敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)的假定蛋白；A2BJ06(A2BJ06HYPBU)，来自丁醇栖高温菌(Hyperthermusbutylicus)(菌株DSM 5456/JCM 9403)的假定蛋白；以及D9PZN7(D9PZN7ACIS3)，食糖酸叶菌(Acidilobus saccharovorans)(菌株DSM 16705/VKM B-2471/345)的假定蛋白。
根据本发明的优选的重组表达载体携带并且表达或过量表达选自下列各项的核酸序列：SEQ ID NO.1、2、5、7、9或11；或
a)作为SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的互补体的核苷酸序列；或
b)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11简并的核苷酸序列；或
c)在高严格性条件下与下列各项杂交的核苷酸序列：SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11；与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的互补体；或与来自SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的杂交探针；或它们的互补体；或
d)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；
e)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11具有至少59％序列同一性的核苷酸序列；
f)编码选自SEQ ID.NO：3、4、6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还涵盖前面提到的重组表达载体的用途，其用于重组NPs的制备或用于活性药物成分(APIs)、中间体或其前药的制备，那些APIs或其中间体是尤其可用作抗癌或抗病毒药物的核苷类似物(NAs)。尤其是，根据上述用途制备的APIs、中间体或其前药选自：卡培他滨(Capecitabine)、地西他滨(Decitabine，aza-dCyd或DAC)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，aza-Cyd)、阿糖胞苷(Cytarabine，ara-C)、依诺他滨(Enocitabine，BH-AC)、吉西他滨(Gemcitabine，dFdC)、扎西他滨(Zalcitabine，ddC)、伊巴他滨(Ibacitabine)、沙帕他滨(Sapacitabine)、2’-C-氰基-2’-脱氧-1-β-D-阿糖基-戊呋喃糖基胞嘧啶(CNDAC)、加洛他滨(Galocitabine)、伐洛他滨(Valopricitabine，NM283)、2’-脱氧-4’-硫胞苷、Thiarabine(T-araC)、2’-脱氧-4’-硫代-5-氮杂胞苷和阿立他滨(Apricitarabine，ATC)。
更优选地，所制备的APIs、中间体或其前药选自：卡培他滨(Capecitabine)、地西他滨(Decitabine，aza-dCyd或DAC)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，aza-Cyd)、阿糖胞苷(Cytarabine，ara-C)；并且再更优选地，在本文中所描述的表达载体尤其是适用于卡培他滨或阿糖胞苷、中间体或其前药的工业制备。
更优选地，前面提到用于制备APIs、中间体或其前药的用途通过也在前面详述的制备方法及其变体实现。
本发明还涵盖包含前面描述的重组表达载体的宿主细胞，尤其是当所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)时。还预期了作为相同发明的单个相关概念的一部分而包括的包含如前面描述的重组表达载体的宿主细胞的用途，其用于重组NPs(或PyNP)的制备。类似地，包含如前面描述的重组表达载体的宿主细胞的用途也是本发明的一部分，其用于制备活性药物成分(APIs)、中间体或其前药，那些APIs或其中间体是可用作抗癌或抗病毒药物的核苷类似物(NAs)。尤其是，如果那些宿主细胞包含如前面描述的重组表达载体，其用于制备选自下列各项的APIs、中间体或其前药：卡培他滨(Capecitabine)、地西他滨(Decitabine，aza-dCyd或DAC)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，aza-Cyd)、阿糖胞苷(Cytarabine，ara-C)、依诺他滨(Enocitabine，BH-AC)、吉西他滨(Gemcitabine，dFdC)、扎西他滨(Zalcitabine，ddC)、伊巴他滨(Ibacitabine)、沙帕他滨(Sapacitabine)、2’-C-氰基-2’-脱氧-1-β-D-阿糖基-戊呋喃糖基胞嘧啶(CNDAC)、加洛他滨(Galocitabine)、伐洛他滨(Valopricitabine，NM283)、2’-脱氧-4’-硫胞苷、Thiarabine(T-araC)、2’-脱氧-4’-硫代-5-氮杂胞苷和阿立他滨(Apricitarabine，ATC)。
更优选地，使用本发明的宿主细胞制备的、由前面描述的重组表达载体转化的APIs、中间体或其前药选自：卡培他滨(Capecitabine)、地西他滨(Decitabine，aza-dCyd或DAC)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，aza-Cyd)、阿糖胞苷(Cytarabine，ara-C)；并且再更优选地，在本文中所描述的宿主转化细胞尤其是适用于卡培他滨或阿糖胞苷、中间体或其前药的工业制备。
更优选地，前面提到的用途通过也在前面详述的作为APIs的NAs、中间体或其前药的制备方法及其变体实现。
比较例1：从未修饰的5-氟胞嘧啶和脱氧尿苷出发的5-氟-5’-脱氧胞苷的合成
将pH 7的2.5mM 5-氟胞嘧啶和8.0mM 5’-脱氧尿苷在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(5.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。通过UV-DAD(紫外-二极管阵列检测)未检测到预期的产物5-氟-5’-脱氧胞苷。
比较例2：从未修饰的5-氟胞嘧啶和氯-5’-脱氧尿苷出发的5-氟-5’-脱氧胞苷的合成
将pH 7的2.5mM 5-氟胞嘧啶和8.6mM 5-氯-5’-脱氧尿苷在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(5.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。通过UV-DAD未检测到预期的产物5-氟-5’-脱氧胞苷。
比较例3：从未修饰的胞嘧啶和阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶出发的阿糖胞苷的合成
将pH 7的3.0mM胞嘧啶和10mM 9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(4.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。通过UV-DAD未检测到预期的产物1-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶(阿糖胞苷)，但是得到了来自借助脱氨基的胞嘧啶分解的尿嘧啶。
比较例4：从未修饰的胞嘧啶和阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶出发的阿糖胞苷的合成
将pH 7的3.0mM胞嘧啶和7.6mM 9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)腺嘌呤在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(4.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。通过UV-DAD未检测到预期的产物1-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶(阿糖胞苷)，但是得到了来自腺嘌呤脱氨基的次黄嘌呤和底物脱氨基的9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)次黄嘌呤。
比较例5：从未修饰的胞嘧啶和阿拉伯呋喃糖基次黄嘌呤出发的阿糖胞苷的合成
将pH 7的3.0mM胞嘧啶和7.5mM 9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)次黄嘌呤在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(4.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。通过UV-DAD未检测到预期的产物1-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶(阿糖胞苷)。
比较例6：从未修饰的胞嘧啶和阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤出发的阿糖胞苷的合成
将pH 7的3.0mM胞嘧啶和8.6mM 9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)鸟嘌呤在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(4.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。未检测到预期的产物1-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶(阿糖胞苷)。
实施例7：(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯的合成
在惰性气氛下，将氯甲酸戊酯(5g，1.0当量)加入至5-氟胞嘧啶(1.0当量)在无水吡啶中的搅拌溶液中，并且将反应加热至60℃。在2小时之后，在没有观察到更高的转化率时，通过在室温下冷却将反应猝灭。之后，使用AcOEt和HCl 1N萃取粗反应物，并且使有机相经过Na2SO4干燥并且将溶剂蒸发。使用SiO2和AcOEt作为流动相，将得到的白色固体色谱纯化，得到所需的产物(88％)。
实施例8：N-(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)乙酰胺的合成
在惰性气氛下，在室温下在25小时的过程中将三乙胺(18,1μL，0,13mmol)和乙酰氯(9,2μL，0,13mmol)加入至胞嘧啶(10,0mg，0,09mmol)在无水DMF中的搅拌溶液中。之后，将溶剂蒸发，并且将得到的浅黄色固体用水洗涤、过滤并且在真空中干燥，赋予预期的产物55％的收率。
实施例9：(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯的合成
在惰性气氛下，将氯甲酸戊酯(0.8mmol，1.0当量)逐滴加入至胞嘧啶(0.8mmol，1.0当量)在无水吡啶中的搅拌溶液中，并且将反应加热至60℃。在2小时之后，在没有观察到更高的转化率时，通过在室温下冷却将反应猝灭。之后，使用AcOEt和HCl 1N萃取粗反应物，并且使有机相经过Na2SO4干燥并且将溶剂蒸发。使用SiO2和AcOEt作为流动相，将得到的白色固体色谱纯化，得到所需的产物。
实施例10：从尿苷出发的N4-戊氧基羰基-5’-脱氧-5-氟胞苷(卡培他滨)的合成
将pH 7的2.7mM(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯和8.0mM 5’-脱氧尿苷在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(5.0U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。与其中未形成或检测到最终产物的参考例1相比，检测到具有68％的收率的预期的产物N4-戊氧基羰基-5’-脱氧-5-氟胞苷(卡培他滨)。
实施例11：从脱氧尿苷出发的N4-戊氧基羰基-5’-脱氧-5-氟胞苷(卡培他滨)的合成。
将pH 7的2.5mM(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯和8.6mM 5’-脱氧尿苷在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(5.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。与其中未形成或检测到最终产物的参考例2相比，检测到具有77％的收率的预期的产物N4-戊氧基羰基-5’-脱氧-5-氟胞苷(卡培他滨)。
实施例12：从阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶出发的9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶(阿糖胞苷)的合成
将pH 7的2.5mM(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯和8.6mM9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(5.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。检测到预期的产物N4-戊氧基羰基胞苷。
N4位可以任选地去保护以得到9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶(阿糖胞苷)。
实施例13：从阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤出发的9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶(阿糖胞苷)的合成
将pH 7的2.5mM(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯和8.6mM9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)腺嘌呤在30mM水性磷酸盐缓冲液中的溶液和10％DMSO在60℃下加热30分钟。之后，加入PyNP(5.4U/μmol碱基)并且在相同的条件下将反应物在60℃下搅拌4小时。之后，通过10KDa膜过滤粗反应物，并且将一部分稀释并且通过HPLC分析。检测到预期的产物N4-戊氧基羰基胞苷。
N4位可以任选地去保护以得到9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶(阿糖胞苷)。
Claims (14)
1.一种通过化学-酶法或酶法合成的方法制备式I的胞嘧啶核苷类似物、中间体或其前药的方法
其中，
Z1是O、CH2、S、NH；
Z2独立于Z1为：O、C(RS2RS5)、S(RS2RS5)、S(RS2)、S(RS5)，优选基团SO或SO2；N(RS2RS5)、N(RS2)、N(RS5)；
RS1是氢、OH、其选自下列的醚或酯：
n是0或1，A是氧或氮，并且每个M独立地为氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链任选连接至P的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链任选连接至P的任选取代的杂环、或者药用抗衡离子如，但不限于，钠、钾、铵或烷基铵；
RS2是氢、OH或其醚或酯残基、卤素、CN、NH2、SH、C≡CH、N3；
在NA来自2′-脱氧核糖核苷或阿糖核苷的情况下，RS3是氢，或者当NA来自核糖核苷时，RS3选自OH、NH2、卤素、OCH3；
RS4是氢、OH或其醚或酯残基、NH2、卤素、CN；条件是当二者均为OH残基的醚或酯时，RS1和RS4是不同的；
在Z2与氧不同的情况下，RS5是氢、OH或其醚或酯残基、NH2或卤素；
R1是O、CH2、S、NH；
R2是氢、任选取代的C4-40烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的杂环、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR7、CN、SR6、SO2R6、SO2R6R7、CN、P(O)芳基、P(O)杂环、P(S)芳基、P(S)杂环、P(O)O2R8；
R3是氢、任选取代的C4-40烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至N的任选取代的杂环、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR7、CN、SR6、SO2R6、SO2R6R7、CN、P(O)芳基、P(O)杂环、P(S)芳基、P(S)杂环、P(O)O2R8；R3和R2彼此独立；并且条件是R2或R3中的至少一个与氢不同；
R4是氢、OH、NH2、SH、卤素；任选取代的烷基链；任选取代的烯基链；任选取代的炔基链、三卤代烷基、OR6、NR6R7、CN、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR6、OCONR6R7、OCO2R6、OC(S)OR6、NHCONR6R7、NHCO2R6、NHC(S)OR6、SO2NR6R7、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至Y的任选取代的芳基、通过任选取代的烷基、烯基或炔基链连接至Y的任选取代的杂环、以及独立选自下列的R2、R3、R4或R5的任何任选取代的杂环或任选取代的芳基：
条件是Y是碳或硫原子，并且备选地，R4不存在，条件是Y是氮原子；
其中
X是O、S、N-RB2、Se；RB1是H、OH、NH2、SH、直链或支链C1-10烷基、F、Cl、Br、I、X-RB2、-C≡C-RB2、CO2RB2；RB2是H、OH、NH2、直链或支链C1-5烷基、苯基；
R5是氢、OH、NH2、SH、卤素、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、三卤代烷基、OR6、NR6R7、CN、COR6、CONR6R7、CO2R6、C(S)OR6、OCONR6R7、OCO2R6、OC(S)OR6、NHCONR6R7、NHCO2R6、NHC(S)OR6、SO2NR6R7；CH2-杂环、CN；
以及独立选自下列的R2、R3、R4或R5的任何任选取代的杂环或任选取代的芳基：
其中
X是O、S、N-RB2、Se；RB1是H、OH、NH2、SH、直链或支链C1-10烷基、F、Cl、Br、I、X-RB2、-C≡C-RB2、CO2RB2；RB2是H、OH、NH2、直链或支链C1-5烷基、苯基；
R6和R7各自独立地为氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、杂环或任选取代的芳基；
R8是氢、任选取代的烷基链、任选取代的烯基链、任选取代的炔基链、任选取代的芳基、任选取代的杂环；
Y是C、N、S；
其中用于制备胞嘧啶核苷类似物的方法包括以下步骤：
(i)使其中Y、R1、R4、R5、R6和R7如以上定义的式II的胞嘧啶核碱基的前体与用于修饰其在N4位的氨基的适合的试剂进行化学反应以便加入被描述为取代基R2和R3的适合取代，由其形成的所述修饰的式II的胞嘧啶核碱基任选地通过常规纯化方法纯化；或者备选地，所述方法从由式II的胞嘧啶核碱基表示的起始产物本身直接出发，
(ii)使上述修饰的式II的胞嘧啶核碱基与适合的式III的核苷类似物底物进行生物催化反应，
其中Z1、Z2、RS1、RS2、RS3、RS4、RS5如以上定义，并且碱基选自：尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、硫尿嘧啶、硫鸟嘌呤、9-H-嘌呤-2-胺、7-甲基鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5，6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶、蝶啶、以及它们的任何取代的衍生物；
其中在步骤ii)中进行的上述反应包括在适合的反应水性介质中并在适合的反应条件下将核苷磷酸化酶加入至包含式II的胞嘧啶核碱基和式III的核苷类似物的起始材料的混合物中，所述核苷磷酸化酶可以是嘧啶核苷磷酸化酶、嘌呤核苷磷酸化酶或它们的组合，
(iii)任选地，将在胞嘧啶核苷类似物中的N4位的氨基去保护以便在通过常规纯化方法进一步纯化的式I的胞嘧啶核苷类似物上恢复游离的伯氨基N4。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述嘧啶核苷磷酸化酶转移的所述式II的胞嘧啶核碱基选自：
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中制备的核苷类似物、中间体或其前药选自：卡培他滨、地西他滨、5-氮杂胞苷、阿糖胞苷、依诺他滨、吉西他滨、扎西他滨、伊巴他滨、沙帕他滨、2′-C-氰基-2′-脱氧-1-β-D-阿糖基-戊呋喃糖基胞嘧啶、加洛他滨、伐洛他滨、2′-脱氧-4′-硫胞苷、Thiarabine、2′-脱氧-4′-硫代-5-氮杂胞苷和阿立他滨。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中天然的和其突变体或变体、或重组核苷磷酸化酶的来源是嗜温、嗜热或超嗜热生物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中天然的和其突变体或变体、或重组核苷磷酸化酶的来源选自古生菌(Archaea)或细菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述核苷磷酸化酶从选自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)或敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)的古生菌中分离。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷磷酸化酶或其功能部分由选自SEQ ID NO.1、2、5、7、9或11的核苷酸序列编码；或者由下列编码：
a)作为SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的互补体的核苷酸序列；或
b)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11简并的核苷酸序列；或
c)在高严格性条件下与下列杂交的核苷酸序列：SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11；SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的互补体；或来自SEQID.NO：1、2、5、7、9或11的杂交探针；或它们的互补体；或
d)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；
e)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11具有至少59％序列同一性的核苷酸序列；
f)编码选自SEQ ID.NO：3、4、6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.根据权利要求3所述的方法，其中制备的核苷类似物是卡培他滨，用作起始材料的核糖核苷选自：5′-脱氧尿苷、5′-脱氧-5-甲基尿苷或5′-脱氧-5-氯尿苷；并且也用作起始材料的通过所述嘧啶核苷磷酸化酶转移的核碱基是(5-氟-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸戊酯。
9.根据权利要求3所述的方法，其中制备的核苷类似物是阿糖胞苷，用作起始材料的所述核糖核苷是9-(b-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶并且还用作起始材料的通过所述嘧啶核苷磷酸化酶转移的所述核碱基是N-(2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)戊酰胺。
10.嗜温、嗜热或超嗜热核苷磷酸化酶，或重组表达载体，或含有其的微生物或宿主细胞，在制备用作抗癌或抗病毒药物的胞嘧啶核苷类似物、中间体或其前药中的用途，所述嗜温、嗜热或超嗜热核苷磷酸化酶可以是天然的或其突变体或变体，或重组酶，或其功能部分，所述重组表达载体包含编码天然或重组，嗜温，嗜热或超嗜热核苷磷酸化酶或其功能部分的序列，所述序列可操作地连接至在适合的宿主中引导所述核苷磷酸化酶表达或过量表达的一个或多个控制序列。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述嗜温、嗜热或超嗜热核苷磷酸化酶、或其功能部分由选自SEQ ID NO.1、2、5、7、9或11的核苷酸序列编码；或者由下列编码：
a)作为SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的互补体的核苷酸序列；或
b)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11简并的核苷酸序列；或
c)在高严格性条件下与下列杂交的核苷酸序列：SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11；SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11的互补体；或来自SEQID.NO：1、2、5、7、9或11的杂交探针；或它们的互补体；或
d)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；
e)与SEQ ID.NO：1、2、5、7、9或11具有至少59％序列同一性的核苷酸序列；
f)编码选自SEQ ID.NO：3、4、6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的用途，其中制备的胞嘧啶核苷类似物、中间体或其前药选自：卡培他滨、地西他滨、5-氮杂胞苷、阿糖胞苷、依诺他滨、吉西他滨、扎西他滨、伊巴他滨、沙帕他滨、2′-C-氰基-2′-脱氧-1-β-D-阿糖基-戊呋喃糖基胞嘧啶、加洛他滨、伐洛他滨、2′-脱氧-4′-硫胞苷、Thiarabine、2′-脱氧-4′-硫代-5-氮杂胞苷和阿立他滨。
13.根据权利要求12所述的用途，其中制备的胞嘧啶核苷类似物、中间体或其前药是卡培他滨。
14.根据权利要求12所述的用途，其中制备的胞嘧啶核苷类似物、中间体或其前药是阿糖胞苷。
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