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CN106170699B - 免疫层析分析方法 - Google Patents

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CN106170699B CN201580018517.6A CN201580018517A CN106170699B CN 106170699 B CN106170699 B CN 106170699B CN 201580018517 A CN201580018517 A CN 201580018517A CN 106170699 B CN106170699 B CN 106170699B
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Abstract

本发明的课题在于，提供一种可在不降低检测灵敏度的情况下缩短展开时间、并且可降低展开成分的回液的免疫层析分析方法，提供一种使用含有由玻璃纤维构成的吸收部的免疫层析分析装置检测检体所包含的被检测物质的方法，其中，在非离子性表面活性剂存在下使检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开，并在检测部检测被检测物质。

Description

免疫层析分析方法
技术领域
本发明涉及免疫层析分析方法、免疫层析分析装置及免疫层析分析试剂盒。
背景技术
近年来，作为利用抗体所拥有的特异的反应性检测样本液中的抗原的简便的体外诊断试剂盒或便携用诊断装置，无需进行检体的前处理的、基于免疫层析进行的免疫测定的重要性提高。特别是病毒及细菌等的病原体检查试剂盒是也被广泛用于一般的医院及诊所的身边的免疫层析装置。
作为免疫层析装置的最简单的结构，为样本添加部、标记物质保持部、担载有检测部的层析介质、及吸收部相互连接的结构。
其中，作为吸收部目前使用由纤维素纤维或纸浆纤维等构成的棉、无纺布或滤纸等。但是，仅由这些原料构成的吸收材料一旦在保持吸收的展开成分的力上出现不足，其结果存在发生来自吸收材料的展开成分的逆流这种问题。
目前，为了防止这种来自吸收材料的展开成分的逆流，尝试使用高吸水性纤维构成吸收材料(专利文献1)。另外，提案有含有吸水性聚合物的吸收材料(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-63482号公报
专利文献2：日本特开2012-189346号公报
发明内容
发明所要解决的课题
但是，专利文献1所记载的含有高吸水性纤维的吸收材料具有下述问题：展开成分的吸收速度慢，在规定的反应时间(10～15分钟)内展开成分不能充分被吸收材料吸收，因残存在层析介质上的过剩的液体样本而使得在检测部显现的阳性信号变模糊，或因有色的标记物质未被充分回收，所以背景信号上升。
另外，专利文献2所记载的含有吸水性聚合物的吸收材料虽然解决上述问题点，但有在制造时吸水性聚合物易散落这种问题。
另外，在为了缩短展开成分的展开时间而使展开速度上升时，因在吸收部展开成分的吸收效率差，从而有在吸收部不吸收展开成分而产生展开成分的回液(液戻り)，产生假阳性这种问题。
因此，本发明的目的在于，提供一种可在不降低检测灵敏度的情况下缩短展开时间且可降低展开成分的回液的免疫层析分析方法。
用于解决课题的方案
本发明如以下所述。
1.一种免疫层析分析方法，其为使用免疫层析分析装置检测检体中所含的被检测物质的方法，所述免疫层析分析装置包括样本添加部、标记物质保持部、担载有检测部的层析介质部及由玻璃纤维构成的吸收部，该方法包括以下的工序(1)～(4)：
(1)在样本添加部中添加通过检体稀释液对检体进行了稀释的检体含有液的工序；
(2)通过保持在标记物质保持部中的标记物质识别被检测物质的工序；
(3)在非离子性表面活性剂存在下将检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开的工序；以及
(4)在检测部中检测展开的移动相中的被检测物质的工序。
2.根据上述1所述的方法，其中，在所述样本添加部及所述检体稀释液的至少一者中含有非离子性表面活性剂。
3.根据上述2所述的方法，其中，所述样本添加部中的非离子性表面活性剂的含量每1cm2为0.05～5mg。
4.根据上述2所述的方法，其中，所述检体稀释液中的非离子性表面活性剂的含量为0.05～10质量％。
5.根据上述1～4中任一项所述的方法，其中，所述非离子性表面活性剂的HLB值为10以上。
6.根据上述1～5中任一项所述的方法，其中，所述层析介质部含有阴离子性表面活性剂。
7.根据上述6所述的方法，其中，所述层析介质部中的阴离子性表面活性剂的含量为0.02～4质量％。
8.根据上述1～7中任一项所述的方法，其中，所述层析介质部由硝化纤维构成。
9.根据上述1～8中任一项所述的方法，其中，所述吸收部的滤水时间为20秒～110秒，且密度为150～500mg/cm3。
10.一种免疫层析分析装置，其依次包括样本添加部、标记物质保持部、担载有检测部的层析介质部及吸收部，其中，该样本添加部干燥保持有非离子性表面活性剂，该吸收部由玻璃纤维构成。
11.一种免疫层析分析试剂盒，其包括免疫层析装置和将检体中所含的被检测物质进行稀释的检体稀释液，所述免疫层析装置依次包括样本添加部、标记物质保持部、担载有检测部的层析介质部及吸收部，其中，该吸收部由玻璃纤维构成，该检体稀释液含有非离子性表面活性剂。
发明效果
本发明的免疫层析分析方法通过使用在非离子性表面活性剂存在下使检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开的免疫层析分析装置，可以不降低检测灵敏度而缩短展开时间。
在现有的免疫层析分析方法中，由于展开时间缩短，从而在吸收部不吸收展开成分，产生展开成分的回液，但本发明的免疫层析分析方法通过在吸收部使用玻璃纤维，可以降低展开成分的回液，避免假阳性。
附图说明
图1表示免疫层析分析装置的结构。
具体实施方式
以下，说明用于实施本发明的方式。
本发明的免疫层析分析方法是使用包括样本添加部、标记物质保持部、担载有检测部的层析介质部及由玻璃纤维构成的吸收部的免疫层析分析装置，在非离子性表面活性剂的存在下检测检体所含的被检测物质的方法。
以下，对本发明中可以使用的免疫层析分析装置及其使用方法进行说明。
免疫层析分析装置如图1所示，依次包括样本添加部(也称为样品垫)(1)、标记物质保持部(也称为结合垫)(2)、层析介质部(3)、检测部(4)、吸收部(5)，还具有衬板(6)。依次表示在本发明的免疫层析分析装置中样本展开的各部位的顺序。这些各部位的结构、规格及样式如以下所述。
样本添加部(1)是在免疫层析分析装置中滴下样品的部位。只要是用于通常免疫层析的原料即可，也可以是任何原料。通常，样本添加部使用吸收保持样本的玻璃纤维或纤维素的膜。
样本添加部优选含有非离子性表面活性剂。由此，防止检体吸附于样本部的添加部件而使检测灵敏度降低。而且，通过降低样本的表面张力，展开时间缩短。
样本添加部中的非离子性表面活性剂的含量优选为0.05～5mg，更优选为0.2mg～5mg，进一步优选为0.2mg～2.5mg。
这是因为，通过样本添加部中的非离子性表面活性剂的含量为0.05mg以上，可以有意地降低样本的表面张力，通过含量为5mg以下，可以抑制非离子性表面活性剂产生的对样本的变性作用。
作为非离子性表面活性剂，例如可以举出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(商品名“Tween”系列)、聚氧乙烯对叔辛基苯基醚(商品名“Triton”系列)、聚氧乙烯对叔壬基苯基醚(商品名“TritonN”系列)、烷基多葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、烷基单甘油醚、NP-40(Sigma-Aldrich制)、 IGAPEL CA-520(Sigma-Aldrich制)等。
非离子性表面活性剂的HLB值优选为10以上，更优选为11.0以上，进一步优选为12.4以上。对于上限值没有特别限定，优选为18以下。
通过非离子性表面活性剂的HLB值为10以上，由此可以抑制疏水性相互作用造成的对样本的变性效果。通过非离子性表面活性剂的HLB值为18以下，由此可以抑制疏水性相互作用造成的对样本的变性效果。
非离子性表面活性剂的CMC值优选为5μmol～60mmol，更优选为10μmol～60mmol，进一步优选为12μmol～60mmol。
通过非离子性表面活性剂的CMC值为5μmol以上，由此可以发挥添加的效果。另外，通过非离子性表面活性剂的CMC值为60mmol以下，由此可以减少使用量，为经济的。
将非离子性表面活性剂包含于样本添加部的情况下的非离子性表面活性剂制成0.05～10质量％的浓度的水溶液，将用于样本添加部的部件浸渍于该溶液中，其后使其真空干燥或自然干燥，制成含有非离子性表面活性剂的样本添加部。
标记物质保持部(2)预先含有与和被检测物质结合的抗体结合的后述的标记物质(marker物质)。被检测物质在标记物质保持部内移动时与抗体结合而被标记。标记物质保持部(例如)由玻璃纤维无纺布或纤维素膜等构成。
层析介质部(3)是层析的展开部位。层析介质部是由表示毛细管现象的微细多孔性物质构成的惰性的膜。与层析中使用的检测试剂、固定化试剂或被检测物质等没有反应性，例如可举出硝化纤维制的膜(以下有时称为“硝化纤维素膜”)等。
作为硝化纤维制的膜，硝化纤维只要以主体含有即可，可以使用以纯物质或硝化纤维混合品等硝化纤维为主要材料的膜，但其它材料也没问题。作为其它材料，例如可举出纤维素类膜、尼龙膜及多孔质塑料布类(聚乙烯、聚丙烯)等。
上述硝化纤维素膜还可以含有进一步促进毛细管现象的物质。 作为该物质，优选降低膜面的表面张力而带来亲水性的物质。例如，优选糖类、氨基酸的衍生物、脂肪酸酯、各种合成表面活性剂或乙醇等具有两亲性的作用的物质，即对被检测物质在免疫层析上的移动没有影响，且不影响标记物质(例如，金胶体等)的发色的物质。
作为上述物质，可举出例如阴离子性表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子性表面活性剂、甘油，其中，优选阴离子性表面活性剂。作为阴离子性表面活性剂，可举出(例如)十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、C12～C18烷基的磺酸钠(烷烃磺酸钠)、二烷基磺基琥珀酸钠及胆酸钠等。
特别优选十二烷基磺酸钠(SDS)或C12～C18的烷基的磺酸钠(烷烃磺酸钠)。
层析介质部中的阴离子性表面活性剂的含量优选为0.02～4质量％，更优选为0.02～1质量％，进一步优选为0.1～1质量％。
通过层析介质部中的阴离子性表面活性剂的含量为0.02质量％以上，由此，得到充分的灵敏度和检测时间的缩短效果，能够避免保存稳定性的降低。通过层析介质部中的阴离子性表面活性剂的含量为4质量％以下，由此可以防止产生阴性检体的非特异反应。
将层析介质部中所包含的阴离子性表面活性剂制成0.1～10质量％的浓度的水溶液，在该溶液中浸渍硝化纤维素膜，之后使其真空干燥或自然干燥，制成含有阴离子性表面活性剂的层析介质。除上述方法外，对于成膜的膜直接添加添加剂使其干燥等的、通过外添加使其含于成膜的膜中的方法也可，不限于这些方法。
这样制备的硝化纤维素膜为多孔性，显示毛细管现象。该毛细管现象的指标可通过测定吸水速度(吸水时间：capillary flow time)来确认。吸水速度影响检测灵敏度和检查时间。
作为在本发明的免疫层析分析方法中使用的层析介质的硝化纤维素膜的形式及大小没有特别限制，只要在实际操作的方面及反应结果的观察的方面适当即可。
另外，为了使操作更简便，优选在表面形成有反应部位的层析介质的背面设置由塑料等构成的支持体。该支持体的性状没有特别限 制，通过目视判定进行测定结果的观察的情况下，优选支持体具有不类似于通过标记物质带来的色彩的色彩，通常，优选为无色或白色。
检测部(4)形成于上述层析介质部(3)上，即，形成将与被检测物质特意性结合的物质(例如抗体)作为固定化试剂固定于任意的位置的反应部位。
作为将固定化试剂固定于层析介质的方法，有下述方法：通过物理或化学性方法将固定化试剂直接固定于层析介质的方法；将固定化试剂与胶乳粒子等微粒物理或化学性结合，捕捉该微粒固定于层析介质的间接固定化方法。
作为直接固定化的方法，可以利用物理吸附，也可以通过共价结合。在硝化纤维素膜的情况下，可以进行物理吸附。共价结合中，层析介质的活化一般使用溴化氰、戊二醛或碳化二亚胺等，也可以使用任何方法。
作为间接固定化的方法，有将固定化试剂与不溶性微粒结合后，固定于层析介质的方法。不溶性微粒的粒径可以选择被层析介质捕捉而不能移动的尺寸的粒径，优选为平均粒径5μm左右以下的微粒。
作为这些粒子，已知有各种用于抗原抗体反应的粒子，在本发明中也可以使用这些公知的粒子。例如，可举出通过聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯或丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等的乳化聚合法得到的有机高分子胶乳粒子等有机高分子物质的微粒；明胶、皂土、琼脂糖或交联葡聚糖等的微粒；二氧化硅、二氧化硅-氧化铝或氧化铝等无机氧化物、或在无机氧化物中通过硅烷偶联处理等导入官能团的无机粒子等。
本发明中，从灵敏度调整的容易度来看，优选直接固定化。另外，固定化试剂向层析介质的固定化可以使用各种方法。例如，可使用微量注射器、带调整泵的笔或喷墨印刷等各种技术。作为反应部位的形式，没有特别限制，可以作为圆形的点、与层析介质的展开方向垂直地延伸的线、数字、文字或+、-等记号等固定化。
将固定化试剂固定化后，为了防止因非特异性吸附而使得分析的精度降低，根据需要，可以利用公知的方法对层析介质进行阻断处理。
通常，阻断处理优选使用牛血清白蛋白、脱脂乳、酪素或明胶等蛋白质。在该阻断处理后，根据需要例如也可以组合一种或二种以上Tween20、TritonX-100或SDS等表面活性剂进行洗净。
吸收部(5)为了吸收展开液而设置于层析介质的末端。本发明的免疫层析分析装置中，吸收部由玻璃纤维构成。通过吸收部由玻璃纤维构成，由此，可以大幅降低展开成分的回液。
通过在非离子性表面活性剂存在下进行免疫层析分析，展开时间缩短，但在吸收部展开成分的吸收效率低时，在吸收部不吸收展开成分，会产生展开成分的回液。
在此，在吸收部使用纤维素纤维等的广泛使用的部件作为吸收剂时，由于吸收速度慢，展开成分及非离子性表面活性剂等在吸收部的扩散速度也慢，所以非离子性表面活性剂带来的吸附抑制效果明显存在，因此会产生展开成分的逆流。
但是，由玻璃纤维构成的吸收部的吸水速度快，展开成分在吸收部快速扩散，展开成分及非离子性表面活性剂等变得稀薄，逆流受到抑制。即，通过在吸收部使用玻璃纤维，可以大幅降低展开成分的回液，可以缩短展开时间及减少假阳性。
在上述的样本添加部中，因每体积的非离子性表面活性剂的密度高，所以发挥抑制对部件的吸附的作用，但在吸收部因体积比添加部大，所以非离子性表面活性剂的每吸收部体积的密度降低，吸附抑制被缓和，因此，难以引起展开成分从吸收部件的逆流。
吸收部优选滤水时间为20秒～110秒，更优选为20～105秒，进一步优选为20～100秒。
由于吸收部的滤水时间为20秒以上，从而可以将反应所需的时间确保为最低限，而检测灵敏度不会降低。由于吸收部的滤水时间为110秒以下，从而可以缩短判定时间。吸水部的滤水时间可以根据JIS P 3801：1995进行测定。
另外，所使用的吸收部的密度优选为150～500mg/cm3，更优选 为200～500mg/cm3，进一步优选为200～350mg/cm3。通过使用密度为200～350mg/cm3的玻璃纤维，可以大幅减少展开成分的回液。
衬板(6)是基材。通过在其单面涂布粘接剂、或通过粘贴粘接带，从而使单面具有粘接性，在该粘接面上密合设置样本添加部(1)、标记物质保持部(2)、层析介质部(3)、检测部(4)、及吸收部(5)的一部分或全部。衬板(6)只要通过粘接剂从而相对于样本液为不透过性、非透湿性即可，作为基材没有特别限定。
本发明的免疫层析分析方法包括以下的工序(1)～(4)，使用上述的免疫层析分析装置检测检体中所含的被检测物质。
(1)在样本添加部添加通过检体稀释液对检体进行了稀释的检体含有液的工序；
(2)通过保持在标记物质保持部的标记物质识别被检测物质的工序；
(3)在非离子性表面活性剂存在下使检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开的工序；以及
(4)用检测部检测展开的移动相中的被检测物质的工序。
以下，对于各工序进行说明。
(1)在样本添加部添加通过检体稀释液对检体进行了稀释的检体含有液的工序
在工序(1)中，第1，在不使测定精度降低的情况下，利用检体稀释液将检体调整或稀释为在免疫层析介质中顺畅地移动的程度的浓度，从而制成检体含有液。第2，在样本添加部(1)上以规定量(通常，0.1～2ml)滴下该检体含有液。滴下检体含有液时，检体含有液在样本添加部(1)中开始移动。
检体稀释液优选含有非离子性表面活性剂。由此，可不降低检测灵敏度，且展开时间缩短。非离子性表面活性剂可以使用与上述同样的表面活性剂。检体稀释液中的非离子性表面活性剂的含量优选为0.05～10质量％，更优选为0.05～5质量％，进一步优选为0.05～3.5质量％。
通过检体稀释液中的非离子性表面活性剂的含量为0.05质量％ 以上，由此，能够防止检体吸附在样本滴下部的部件上而使得检测灵敏度降低，且通过降低检体稀释液的表面张力，可以缩短展开时间。
这是因为，由于检体稀释液中的非离子性表面活性剂的含量为10质量％以下，从而可以抑制非离子性表面活性剂带来的样本的变性作用。
作为含有被检测物质的检体，例如，除生物样本即全血、血清、血浆、尿、唾液、痰、鼻拭子或咽拭子、脊髓液、羊水、乳头分泌液、泪、汗、来自皮肤的渗液、来自组织或细胞及粪便的提取液等外，还举出牛乳、蛋、小麦、豆、牛肉、猪肉、鸡肉等或含有它们的食品等的提取液等。
(2)通过保持在标记物质保持部的标记物质识别被检测物质的工序
工序(2)是这样的工序：其中使在工序(1)中添加于样本添加部中的检体含有液移动到标记物质保持部(2)，通过被标记物质保持部保持的标记物质识别检体中的被检测物质。
标记物质将与被检测物质特异性结合的物质(例如抗体)标记化。免疫层析法中的检测试剂的标记一般还使用酶等，但从适于通过目视判定被检测物质的存在的观点出发，作为标记物质优选使用不溶性载体。通过将检测试剂与不溶性载体敏化，可以制备标记化的检测试剂。
作为标记物质的不溶性载体中可以使用金、银或白金那样的胶体状金属粒子、氧化铁那样的胶体状金属氧化物粒子、硫等胶体状非金属粒子及由合成高分子构成的胶乳粒子或其它。特别是金胶体的检测简便，故而优选。
不溶性载体是适于视觉上判定被检测物质的存在的标记物质，为了使目视下的判定变得容易优选为有色的。胶体状金属粒子及胶体状金属氧化物粒子其自身呈现与粒径对应的特定的自然色，可以将该色彩作为标记利用。
作为可以用作标记物质的胶体状金属粒子及胶体状金属氧化物粒子，例如可举出胶体状金粒子、胶体状银粒子、胶体状白金粒子、 胶体状氧化铁粒子、胶体状氢氧化铝粒子等。
特别是胶体状金粒子和胶体状银粒子在适当的粒径时，胶体状金粒子显示红色，胶体状银粒子显示黄色，从这一点上优选。
在作为胶体状金属粒子使用例如胶体状金粒子的情况下，可以使用市售的胶体状金粒子。或者，通过常用方法，例如用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，可以制备胶体状金粒子。
作为将检测试剂与胶体状金属粒子敏化的方法，可以使用物理吸附或化学结合等公知的方法。例如，关于将抗体与胶体状金粒子敏化的检测试剂，在金粒子以胶体状分散的溶液中添加抗体使其物理吸附后，通过添加牛血清白蛋白溶液阻断未结合抗体的粒子表面，从而进行制备。
在实际的免疫层析分析的实施中，由不溶性载体标记的检测试剂还可以分散在构成移动相的展开液中应用，也可以存在于构成固定相的层析介质的移动相的展开移动路径上即存在于层析介质的移动相所应用的端部和反应部位之间的区域来应用。
在存在于层析介质上的情况下，优选以检测试剂在展开液中快速溶解并可通过毛细管作用自由移动的方式支持检测试剂。为了使检测试剂被敏化的不溶性载体的再溶解性良好，在支持的部位添加并涂布蔗糖、麦芽糖或乳糖等糖类、或甘露醇等糖醇，或者预先涂布这些物质。
在通过涂布、干燥等使检测试剂存在于层析介质上时，也可以直接涂布在固定有固定化试剂的层析介质上并干燥等，在其它的多孔性物质例如纤维素滤纸、玻璃纤维滤纸或尼龙无纺布上涂布、干燥等而形成检测试剂保持部件后，也可以以利用毛细管与固定有固定化试剂的层析介质相连的方式配置。
作为通过本发明的方法检测的被检测物质，只要是存在与它们特异性结合的物质，就没有特别限制，例如，可举出蛋白质、肽、核酸、糖(特别是糖蛋白质的糖部分、糖脂质的糖部分等)、复合糖质等。
在本发明中，“特异性结合”是指基于生物体分子具有的亲和力 而结合。作为这种基于亲和力的结合，例如可举出抗原和抗体的结合、糖和凝集素的结合、激素和受体的结合、酶和抑制剂的结合、互补性核酸彼此及核酸和核酸结合蛋白质的结合等。
因此，在被检测物质具有抗原性的情况下，作为与被检测物质特异性结合的物质，例如，可举出多克隆抗体或单克隆抗体。另外，在被检测物质为糖的情况下，作为与被检测物质特异性结合的物质，例如可举出凝集素蛋白。
作为具体的被检测物质，例如，可举出癌胚抗原(CEA)、HER2蛋白、前列腺特异抗原(PSA)、CA19-9、α-甲胎蛋白(AFP)、免疫抑制酸性蛋白(IPA)、CA15-3、CA125、雌激素受体、孕激素受体、便隐血、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、CK-MB、CRP、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、黄体形成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、梅毒抗体、流感病毒、人体血红蛋白、衣原体抗原、A组β链球菌抗原、HBs抗体、HBs抗原、轮状病毒、腺病毒、白蛋白或糖化白蛋白等，但不限定于这些。
(3)在非离子性表面活性剂存在下使检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开的工序
工序(3)是在工序(2)中在被检测物质被识别为标记物质后，使检体及标记物质在非离子性表面活性剂存在下作为移动相在层析介质部(3)上通过的工序。
非离子性表面活性剂在使检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开的过程中存在。如上述，优选预先包含于样本添加部，或包含于检体稀释液。
这是因为，通过预先含有非离子性表面活性剂，可以防止检体向样本滴下部的部件上吸附而使得检测灵敏度降低，并通过降低样本溶液的表面张力，可以缩短判定时间。更优选在检体稀释液中含有非离子性表面活性剂。
通过在检体稀释液中含有非离子性表面活性剂，可以预先在样本中使成分均匀，与包含于部件相比，可以期待进一步抑制向部件的吸附的效果。而且，这是因为，由于没有非离子性表面活性剂在样本 滴下部的溶析时间，所以可以进一步缩短判定时间。非离子性表面活性剂也可以包含于样本添加部和检体稀释液两者中。
在本发明的免疫层析分析方法中，如果需要，则也可以使用展开液。展开液是在免疫层析法中构成移动相的液体，在固定相即层析介质上与含有被检测物质的样本及被标记的检测试剂一起移动。只要是这种展开液即可，也可以是任何的展开液。
(4)由检测部检测展开后的移动相中的被检测物质的工序
工序(4)是这样的工序：其中在层析介质部(3)上作为移动相通过的检体中的被检测物质通过抗原/抗体的特异性结合反应而保持于检测部(4)，即以通过担持固定的抗体和标记试剂夹心状夹持的方式特异性反应结合，而使得检测部(4)着色。
在被检测物质不存在的情况下，溶解于样本的水分中的标记试剂即使通过层析介质部(3)上的检测部(4)，也不会引起特异性结合反应，因此检测部(4)不着色。
最后，检体含有液的水分移动到吸收部(5)。
这样，通过检查检体中所含的被检测物质，例如检体含有液中的流感病毒的有无，可以正确地判定有无感染流感病毒。
实施例
以下，通过实施例及比较例进一步说明本发明，但本发明不限于下述实施例。
[实施例1～4]
(1)在层析介质上的检测部的制作
使用由硝化纤维构成的片材(ミリポア社制、商品名：HF120、300mm×25mm)作为膜。作为前处理，在使膜浸渍于0.25质量％的表1中记载的阴离子性表面活性剂的水溶液后，使其在30℃干燥24小时。
接着，在含有阴离子性表面活性剂并干燥的膜上的检测部位(检测线)以1mm的宽度涂布由含有5质量％的异丙醇的磷酸缓冲液(pH7.4)将鼠源性抗流感A单克隆抗体(第一抗体)稀释为1.0mg/ml的浓度而成的溶液150μL，为了确认金纳米粒子标记试剂的展开的有无及展开速度，在检测部位的下游，在控制部位(控制线)涂布由磷酸缓冲液(pH7.4)稀释羊源性抗血清而成的液体，所述羊源性抗血清与金纳米粒子标记物质及被检测物质即动物肉中的蛋白质等广泛具有亲和性。之后，在50℃干燥30分钟，在室温干燥一晩，制作层析介质。
(2)标记物质溶液的制作
在金胶体悬浊液(田中贵金属工业社制：LC40nm)0.5ml中加入用磷酸缓冲液(pH7.4)稀释为0.05mg/ml的浓度的鼠源性抗流感A单克隆抗体(第二抗体)0.1ml，在室温下静置10分钟。
接着，加入0.1ml含有1质量％的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(pH7.4)，再在室温下静置10分钟。之后，充分搅拌后，以8000×g进行15分钟离心分离，去除上层清液后，加入0.1ml含有1质量％的BSA的磷酸缓冲液(pH7.4)。按以上的顺序制作标记物质溶液。
(3)样本添加部的制作
将由玻璃纤维构成的无纺布(ミリポア社制：300mm×30mm)作为样本添加部浸渍于2质量％的表1所示的非离子性表面活性剂水溶液中后，在30℃下干燥24小时，制作样本添加部。将包含于所制作的样本添加部中的非离子性表面活性剂的种类、其HLB值及含量示于表1。表1中，Tween20为聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯，Tween80为聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯，TritonX-100为聚氧乙烯(10)辛基苯基醚，均为和光纯药工业株式会社制。另外，NP-40为(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇，Sigma-Aldrich社制。
(4)免疫层析分析装置的制作
在15mm×300mm的玻璃纤维垫(ミリポア社制)上以均匀的方式添加在上述制作的标记物质溶液300μL中加入300μL的10质量％海藻糖水溶液和1.8mL的蒸馏水而成的液体后，在真空干燥机中使其干燥，制作标记物质保持部件。
接着，在由衬板构成的基材上贴合上述制作的层析介质、标记物质保持部件、添加样本的部分所用的样本添加部、作为用于吸收展开的样本及标记物质的吸收部的玻璃纤维制的无纺布(密度0.25g/cm3)。而且，用切断机切断成宽为5mm，作为免疫层析分析装置。将用于吸收部的无纺布的种类及吸水部的滤水时间示于表1。
滤水时间根据JIS P 3801：1995测定。
(5)检体稀释液
制备含有2质量％酪蛋白、25mM KCl、0.095％叠氮化钠的50mM BICINE缓冲液(pH8.5)，作为检体稀释液。
(6)测定
使用上述制作的免疫层析用试验片，用以下的方法测定样本中的流感A病毒有无存在。即，将抽吸捕集器的一侧的管插在抽吸泵上，将另一侧的管插入至未感染流感的人的鼻腔的里部，使抽吸泵成为负压而采集鼻液。用上述检体稀释液将采集的鼻液稀释20倍，将其作为阴性检体样本。另外，在阴性检体样本中以蛋白浓度为50ng/mL的方式加入市售的灭活流感A病毒，将所得样本作为阳性检体样本。
将阴性检体样本、阳性检体样本均150μL放置在免疫层析用试验片的样本添加部上使其展开，10分钟后进行目视判定。将可以确认测试线的红线的情况设为“+”，将能够确认红的线但颜色非常淡的情况设为“±”，将不能确认红的线的情况设为“-”。
另外，观察从检查开始10分钟的时刻的背景着色的有无、从检查开始60分钟的时刻的展开成分的逆流及假阳性的有无(仅阴性检体)。将试验的结果示于表1。
背景的着色源于展开的标记物质(金纳米粒子)，红色的金纳米粒子完全被吸收垫吸收时，背景的着色消失，观察到层析介质本来的白色。表1中，关于背景，将与层析介质本来的白色同等的颜色的情况用○(良好)表示，将稍微偏红色的情况用△(稍微不良)表示，将带红色的情况用×(不良)表示。
层析介质在干燥状态和湿润状态下可以看到色调不同，因此，展开成分的逆流通过用目视观察层析介质的色调来判定。关于展开成分的逆流的评价，将60分钟后的背景着色比10分钟后差(红色加深)的情况评价为有，将除此以外评价为无。
假阳性的有无通过在检查开始60分钟的时刻观察是否在层析介质的检测部产生源于标记物质(金纳米粒子)的红的线来判定。使用的样本是通过基于PCR法的检查判定为阴性的样本，在使用了基于免疫层析法的检查试剂盒的试验中，在检查开始15分钟的时刻在检测部未观察到显示阳性的红线。但是，在有展开成分的逆流的情况下，在检查开始60分钟的时刻往往在检测部产生红的线，该情况下判定出有假阳性。将结果示于表1。
[实施例5]
(1)在层析介质上的检测部的制作
对于检测部，与实施例1～4同样地制作。
(2)标记物质溶液的制作
对于标记物质溶液，与实施例1～4同样地制作。
(3)样本添加部的制作
对于样本添加部，与实施例1～4同样地制作。
(4)免疫层析分析装置的制作
对于免疫层析分析装置，与实施例1～4同样地制作。
(5)检体稀释液
制备含有2质量％酪蛋白、25mM KCl、0.095％叠氮化钠的50mM BICINE缓冲液(pH8.5)，以使2质量％Tween80成为记载含有率的方式进行混合，制作检体稀释液。
(6)测定
对于测定，与实施例1～4同样地实施、评价。结果示于表1。
[实施例6～8]
(1)在层析介质上的检测部的制作
对于检测部，与实施例1～5同样地制作。
(2)标记物质溶液的制作
对于标记物质溶液，与实施例1～5同样地制作。
(3)样本添加部的制作
作为样本添加部使用由玻璃纤维构成的无纺布(ミリポア社 制：300mm×30mm)。
(4)免疫层析分析装置的制作
对于免疫层析分析装置，与实施例1～5同样地制作。
(5)检体稀释液
制备含有2质量％酪蛋白、25mM KCl、0.095％叠氮化钠的50mM BICINE缓冲液(pH8.5)，以表1记载的非离子性表面活性剂分别为记载含有率的方式进行混合，制作检体稀释液。表1中，IGAPEL CA-520为聚氧乙烯(5)异辛基苯基醚，Sigma-Aldrich社制。
(6)测定
对于测定，与实施例1～5同样地实施、评价。结果示于表1。
[比较例1、2]
(1)在层析介质上的检测部的制作
对于检测部，与实施例同样地制作。
(2)标记物质溶液的制作
对于标记物质溶液，与实施例同样地制作。
(3)样本添加部的制作
作为样本添加部使用由玻璃纤维构成的无纺布(ミリポア社制：300mm×30mm)。
(4)免疫层析分析装置的制作
在15mm×300mm的玻璃纤维垫(ミリポア社制)上以均匀的方式添加在上述制作的标记物质溶液300μL中加入300μL的10质量％海藻糖水溶液和1.8mL的蒸馏水而成的溶液后，用真空干燥机使其干燥，制作标记物质保持部件。
接着，在由衬板构成的基材上贴合上述制作的层析介质、标记物质保持部件、添加样本的部分所用的样本添加部、作为用于吸收展开的样本及标记物质的吸收部的无纺布。而且，用切断机切断为宽为5mm，作为免疫层析分析装置。用于吸收部的无纺布的种类及吸收部的滤水时间示于表1。
滤水时间根据JIS P 3801：1995测定。
(5)检体稀释液
制备含有2质量％酪蛋白、25mM KCl、0.095％叠氮化钠的50mM BICINE缓冲液(pH8.5)，以表1记载的非离子性表面活性剂分别为记载含有率的方式进行混合，制作检体稀释液。
(6)测定
对于测定，与实施例同样地实施、评价。结果示于表1。
[比较例3]
(1)在层析介质上的检测部的制作
对于检测部，与实施例同样地制作。
(2)标记物质溶液的制作
对于标记物质溶液，与实施例同样地制作。
(3)样本添加部的制作
作为样本添加部使用由玻璃纤维构成的无纺布(ミリポア社制：300mm×30mm)。
(4)免疫层析分析装置的制作
对于免疫层析分析装置，与实施例同样地制作。
(5)检体稀释液
制备含有2质量％酪蛋白、25mM KCl、0.095％叠氮化钠的50mM BICINE缓冲液(pH8.5)，制作检体稀释液。
(6)测定
对于测定，与实施例同样地实施、评价。结果示于表1。
[表1]
如表1所示，实施例1～8中，吸收部使用玻璃纤维，且在非离子性表面活性剂存在下使检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开时，未确认到样本的回液，其结果未见假阳性的反应。
另一方面，在比较例1中，吸收部使用棉绒，比较例2中，吸收部使用纤维素纤维，其结果确认到样本的回液，出现假阳性的反应。
另外，比较例3中，虽然吸收部使用玻璃纤维，但在非离子性表面活性剂的非存在下使检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开，结果虽未确认到样本的回液，但出现假阳性的反应。
这认为是，由于非离子性表面活性剂不存在，所以展开速度减小，且由于展开成分的剥离速度也减小，所以未产生展开成分的逆流，但由于在层析介质上留有标记试剂，所以10分钟后和60分钟后在背景的着色上未观察到变化，出现假阳性的反应。
根据以上的结果可知，在非离子性表面活性剂存在下使检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开时，可以使样本的展开速度上升，另外，即使样本的展开速度上升，由于吸收部使用玻璃纤维，从而也能够降低展开成分的回液，能够避免假阳性。
使用特定的形式详细地说明了本发明，但在不脱离本发明的意图和范围的情况下可进行各种变更及变形，这对本领域技术人员来说是显而易见的。此外，本申请基于2014年4月4日申请的日本专利申请(特愿2014-077861)，其整体通过引用方式并入本文。
符号的说明
1.样本添加部(样品垫)
2.标记物质保持部(结合垫)
3.免疫层析介质部
4.检测部
5.吸收部
6.衬板

Claims (10)

1.一种免疫层析分析方法，其为使用免疫层析分析装置检测检体中所含的被检测物质的方法，所述免疫层析分析装置包括样本添加部、标记物质保持部、担载有检测部的层析介质部及由玻璃纤维构成的吸收部，所述方法包括以下的工序(1)～(4)：
(1)在样本添加部中添加通过检体稀释液对检体进行了稀释的检体含有液的工序；
(2)通过标记物质保持部所保持的标记物质识别被检测物质的工序；
(3)在非离子性表面活性剂存在下将检体及标记物质作为移动相在层析介质部展开的工序；以及
(4)在检测部中检测展开的移动相中的被检测物质的工序，
其中，所述吸收部的滤水时间为20秒至110秒，且密度为150至500mg/cm3。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
在所述样本添加部及所述检体稀释液的至少一者中含有非离子性表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，
所述样本添加部中的非离子性表面活性剂的含量每1cm2为0.05至5mg。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，
所述检体稀释液中的非离子性表面活性剂的含量为0.05至10质量％。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，
所述非离子性表面活性剂的HLB值为10以上。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述层析介质部含有阴离子性表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，
所述层析介质部中的阴离子性表面活性剂的含量为0.02至4质量％。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述层析介质部由硝化纤维构成。
9.一种免疫层析分析装置，其依次包括样本添加部、标记物质保持部、担载有检测部的层析介质部及吸收部，其中，该样本添加部干燥保持有非离子性表面活性剂，该吸收部由玻璃纤维构成，并且，所述吸收部的滤水时间为20秒至110秒，且密度为150至500mg/cm3。
10.一种免疫层析分析试剂盒，其包括免疫层析装置和将检体所包含的被检测物质稀释的检体稀释液，所述免疫层析装置依次包括样本添加部、标记物质保持部、担载有检测部的层析介质部及吸收部，其中，该吸收部由玻璃纤维构成，并且，所述吸收部的滤水时间为20秒至110秒，且密度为150至500mg/cm3，该检体稀释液含有非离子性表面活性剂。
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