CN106146615B

CN106146615B - 咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯，其合成，活性和应用

Info

Publication number: CN106146615B
Application number: CN201510127236.6A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王玉记; 吴建辉; 刘文超
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-03-23
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2035-03-23
Also published as: CN106146615A

Abstract

本发明公开了下式的咪唑并吡啶‑6‑甲酰‑氨基酸苄酯，公开了它们的制备方法、公开了它们对肿瘤生长的抑制作用，公开了它们的抗炎活性。结果表明，它们具有抗肿瘤和抗炎症活性，具有良好的临床应用前景。

Description

咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯，其合成，活性和应用

发明领域

本发明涉及下式的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA代表L-Pro，L-Gly，L-Ala，L-C(PMB)，L-Phe，L-Ile，L-Leu，L-Met，L-Asn，L-Arg，L-Ser，L-Tyr，L-Val，L-Trp，L-Thr和L-Glu(OBzl)残基)，涉及它的制备，涉及它对肿瘤细胞增殖的抑制作用，涉及它对肿瘤生长的抑制作用，进一步涉及它的抗炎活性。结果表明，3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)是具有抗肿瘤和抗炎双重活性的化合物。本发明属于生物医药领域。

背景技术

癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。因此，开发新的高效，低毒，毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。

随着对肿瘤特性和发病本质的认识，发明人曾经公开下式代表的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表L-氨基酸残基)在1μmol/kg剂量下显示一定的抗肿瘤活性。通过进一步研究发明人认识到，在3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl的6-甲酰基和AA-OBzl基之间插入Trp残基，不仅可以延缓它的代谢达到提高抗肿瘤活性的目的，而且可以获得抗炎症活性。炎症是危害肿瘤患者预后的并发症。通过这种修饰，获得的下面通式的具有抗肿瘤和抗炎症双重活性的化合物，具有良好的临床应用前景。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(1(式中AA代表L-Pro，L-Gly，L-Ala，L-C(PMB)，L-Phe，L-Ile，L-Leu，L-Met，L-Asn，L-Arg，L-Ser，L-Tyr，L-Val，L-Trp，L-Thr和L-Glu(OBzl)残基)。

本发明的第二个内容是提供制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)的合成方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)Boc-Trp与氨基酸苄酯(选自L-Pro，L-Gly，L-Ala，L-C(PMB)，L-Phe，L-Ile，L-Leu，L-Met，L-Asn，L-Arg，L-Ser，L-Tyr，L-Val，L-Trp，L-Thr和L-Glu(OBzl氨基酸苄酯)偶联得到Boc-Trp-AA-OBzl；

(6)Boc-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)在4N氯化氢/乙酸乙酯中得到L-Trp-AA-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与L-Trp-AA-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl。

本发明的第三个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)对S180小鼠肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)对ICR雄性小鼠耳肿胀模型上的抗炎活性。

附图说明

图1.3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl的合成路线.i)HCHO，H₂O，H₂SO₄，65℃；ii)MeOH，SOCl₂，0℃；iii)DMF，三乙胺，KMnO₄；iv)NaOH，H₂O，0℃；v)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，四氢呋喃(THF)；vi)4N氯化氢/乙酸乙酯，0℃；vii)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF；viii)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)

10.00g(64.5mmol)L-组氨酸，30mL水混合于100mL茄瓶中，冰浴下用恒压漏斗逐滴加入2mL浓硫酸，随浓硫酸的加入，原料逐渐溶解，待其完全溶解后，向反应液中加入10mL40％的甲醛溶液，在微波加速反应仪65℃下反应5小时。反应完毕后，冰浴下缓慢滴加浓氨水调溶液pH 7，有大量无色沉淀析出，减压过滤，得到10.76g(99.2％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：168[M+H]⁺。

实施例2制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(2)

冰浴下在100mL茄瓶里加15.6mL甲醇，用恒压漏斗缓慢滴加1.56mL二氯亚砜，30min后加入1.00g(6mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)，室温反应3天后，TLC监测反应完全，反应混合物减压浓缩，残留物加甲醇溶解并减压浓缩。该操作重复3次得白色泡状固体，再加乙醚抽干重复3次得无色粉末，最后用甲醇/乙醚重结晶得0.58g(53％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)181[M+H]⁺。

实施例3制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)

冰浴下在100mL茄瓶里加1.1g(6.1mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)，加DMF使溶解。向该溶液中滴加1mL三乙胺调pH 8，分3次加入1.2g(7.6mmol)高锰酸钾。反应6小时后，TLC监测反应完毕。反应物减压浓缩至干，得到的黑色固体用1N HCl溶液溶解，冰浴下滴加2N NaOH溶液调pH 7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.68g(63％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)177[M+H]⁺。

实施例4制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(4)

冰浴下在100mL茄瓶里加40mL NaOH溶液(2N)，10min后加入5.30g(29.9mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)，反应1小时后TLC显示反应完毕，冰浴下向反应液中滴加2NHCl溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得1.50g(30％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)162[M-H]^-。

实施例5制备Boc-Trp-Asp(OBzl)-OBzl

称取4.54g(14.93mmol)Boc-Trp于250mL茄瓶中，加入50mL THF。在冰浴和搅拌下依次加入1.92g(14.93mmol)HOBt及3.52g(17.08mmol)DCC，活化30min。称取6.8g(14.24mmol)Tos·Asp(OBzl)-OBzl于100mL小三角瓶中，用THF溶解后，于冰浴下用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕后，反应混合物减压浓缩至于，残留物加60mL乙酸乙酯溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)和饱和NaCl溶液(20mL×3)洗，有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到4.7g(51.37％)标题化合物，为无色固体。

实施例6制备Boe-Trp-AA-OBzl(式中AA代表L-Pro，L-Gly，L-Ala，L-Cys(PMB)，L-Phe，L-Ile，L-Leu，L-Met，L-Asn，L-Arg，L-Ser，L-Tyr，L-Val，L-Trp，L-Thr和L-Glu(OBzl)残基)

按照实施例5的方法，从912mg(3mmol)Boc-Trp和(3.6mmol)Tos·AA-OBzl得到标题化合物，为无色固体。收率为80-90％。

实施例7制备HCl·Trp-Asp(OBzl)-OBzl

将3g Boc-Trp-Asp(OBzl)-OBzl置于100mL茄瓶中，用15mL干燥乙酸乙酯将其完全溶解，于冰浴下搅拌并加入30mL 4N氯化氢/乙酸乙酯，于冰浴下搅拌1.5h，有无色固体析出。TLC显示反应完毕后，将反应液于37℃温水浴下减压浓缩。将残留物用无水乙醚(10mL×3)减压浓缩，得到1.997g(80％)标题化合物，为无色固体。

实施例8制备HCl·Trp-AA-OBzl(式中AA的定义同上)

按照实施例7的方法，从1.202g Boc-Trpt-AA-OBzl得到标题化合物，为无色固体。收率为95-98％。

实施例9制备3H-眯唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Asp(OBzl)-OBzl(5a)

称取163mg(1mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸于100mL茄瓶中，加入15mLDMF。在冰浴和搅拌下加入380mg(1mmol)HATU，活化30min。称取531.5mg(1mmol)HCl·Trp-Asp(OBzl)-OBzl于50mL小三角瓶中，用DMF溶解后，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温搅拌过夜，TLC显示反应完毕后，将反应混合物减压浓缩至干，残留物加60mL乙酸乙酯溶解，过滤除去不溶物，滤液层依次用饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)和饱和NaCl溶液(20mL×3)洗，有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到40mg(9％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：644.94[M+H]⁺；Mp：90～92℃；[α]_D ²⁵＝-110.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.15(s，1H)，10.80(s，1H)，8.93(s，1H)，8.89(d，J＝6.0Hz，1H)，8.70(d，J＝9.0Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.20(s，1H)，7.57(d，J＝6.0Hz，1H)，7.56-6.87(m，10H)，7.13(s，1H)，7.02(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，6.88(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.09(d，J＝12.0Hz，4H)，4.90(m，1H)，4.80(m，1H)，3.11-3.35(m，2H)，2.96(dd，J＝6.0Hz，J＝15.0Hz，1H)，2.80(dd，J＝6.0Hz，J＝15.0Hz，1H)。

实施例10制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Pro-OBzl(5b)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.026g(2.4mmol)HCl·Trp-Pro-OBzl得到107mg(10％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：537[M+H]⁺；Mp：187～189℃；[α]_D ²⁵＝-106.66(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.13(s，1H)，10.84(s，1H)，8.95(s，1H)，8.76(d，J＝6.0Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.20(s，1H)，7.57(d，J＝6.0Hz，1H)，7.56-6.87(m，6H)，7.24(s，1H)，7.04(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，6.94(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.17(s，2H)，5.04(m，1H)，4.46(m，1H)，3.65-3.75(m，1H)，3.2(m，2H)，2.2(m，1H)，1.87(m，3H)。

实施例11制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Trp-OBzl(5c)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.196g(2.4mmol)HCl·Trp-Trp-OBzl得到37.5mg(3.0％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：625.94[M+H]⁺；Mp：109～111℃；[α]_D ²⁵＝-110.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.00(s，2H)，3.30(m，2H)。

实施例12制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Val-OBzl(5d)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.031g(2.4mmol)HCl·Trp-Val-OBzl得到216mg(20％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：539.94[M+H]⁺；Mp：128～130℃；[α]_D ²⁵＝-70.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.15(s，1H)，10.80(s，1H)，8.92(s，1H)，8.73(d，J＝9Hz，1H)，8.58(d，J＝6Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.20(s，1H)，7.51(d，J＝6Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.04(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，6.94(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝9Hz，2H)，4.98(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.31(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.43(m，2H)，2.11(m，1H)，0.89(t，J＝6.0Hz，J＝12.0Hz，6H)。

实施例13制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ala-OBzl(5e)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和0.963g(2.4mmol)HCl·Trp-Ala-OBzl得到255mg(25％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：510.94[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D ²⁵＝-11.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.43(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.26(m，2H)，1.35(d，J＝9Hz，3H)。

实施例14制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Met-OBzl(5f)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.107g(2.4mmol)HCl·Trp-Met-OBzl得到30mg(2.6％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：570.94[M+H]⁺；Mp：123～125℃；[α]_D ²⁵＝-101.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.13(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，2H)，8.53(s，1H)，8.18(s，1H)，7.60(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.04(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，6.94(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.13(s，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.26(m，2H)，2.47(m，1H)，2(m，5H)。

实施例15制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ile-OBzl(5g)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Ile-OBzl得到200mg(18％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：552.94[M+H]⁺；Mp：131～133℃；[α]_D ²⁵＝-111.00(c＝0.1，甲醇)，¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.98(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.35(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.26(m，2H)，1.85(m，1H)，1.40(m，1H)，1.18(m，1H)，0.86(m，6H)。

实施例16制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Leu-OBzl(5h)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Leu-OBzl得到200mg(18％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：552.94[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D ²⁵＝-11.00(c＝0.1，甲醇)，¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.98(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.35(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.2(m，2H)，1.65(m，3H)，0.9(d，J＝9Hz，3H)，0.85(d，J＝9Hz，3H)。

实施例17制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Phe-OBzl(5i)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.189g(2.4mmol)HCl·Trp-Phe-OBzl得到23mg(2.0％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：586.94[M+H]⁺；Mp：141～143℃；[α]_D ²⁵＝-70.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，11H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝9Hz，4H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.78(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.26(m，4H)。

实施例18制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Gly-OBzl(5j)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和930g(2.4mmol)HCl·Trp-Gly-OBzl得到159mg(16％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：496.94[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D ²⁵＝-98.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.00(s，2H)，3.30(m，2H)。

实施例19制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Tyr-OBzl(5k)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.184g(2.4mmol)HCl·Trp-Tyr-OBzl得到60mg(2.6％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：602.94[M+H]⁺；Mp：100～101℃；[α]_D ²⁵＝-120.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，9.2(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，11H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝15Hz，4H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.78(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.20(m，2H)，2.95(m，2H)。

实施例20制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ser-OBzl(5l)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.002g(2.4mmol)HCl·Trp-Ser-OBzl得到42mg(4.0％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：526.94[M+H]⁺；Mp：118～120℃；[α]_D ²⁵＝-101.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.75(m，2H)，3.49(m，2H)，3.22(m，2H)。

实施例21制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Cys(PMB)-OBzl(5m)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.808g(2.4mmol)HCl·Trp-Cys(PMB)-OBzl得到265mg(2.6％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：662.94[M+H]⁺；Mp：98～100℃；[α]_D ²⁵＝-110.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，3H)，7.06(m，3H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.75(s，2H)，3.21(m，2H)，2.8(m，1H)，2.68(m，1H)，2.21(m，3H)。

实施例22制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-R(NO₂)-OBzl(5n)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.275g(2.4mmol)HCl·Trp-R(NO₂)-OBzl得到256mg(20％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：640.94[M+H]⁺；Mp：122～124℃；[α]_D ²⁵＝-125.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.25(m，4H)，1.85(m，1H)，1.65(m，1H)，1.52(m，2H)。

实施例23制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Asn-OBzl(5o)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Asn-OBzl得到200mg(18％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：553.94[M+H]⁺；Mp：111～113℃；[α]_D ²⁵＝-114.00(c＝0.1，甲醇)，1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.43(s，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.96(s，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.25(m，2H)，2.6(m，2H)。

实施例24制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Glu(OBzl)-OBzl(5p)

按照实施例9，从1250mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.432g(2.4mmol)HCl·Trp-Glu(OBzl)-OBzl得到66mg(5％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：658[M+H]⁺；Mp：157～159℃；[α]_D ²⁵＝-116.66(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.15(s，1H)，10.80(s，1H)，8.93(s，1H)，8.89(d，J＝6.0Hz，1H)，8.70(d，J＝9.0Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.20(s，1H)，7.57(d，J＝6.0Hz，1H)，7.56-6.87(m，10H)，7.13(s，1H)，7.02(t，J＝9.0Hz，J＝18.OHz，1H)，6.88(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.09(d，J＝12.0Hz，4H)，4.90(m，1H)，4.80(m，1H)，3.11-3.35(m，2H)，2.49(m，2H)，2.08(m，1H)，1.94(m，1H)。

实施例25制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Thr-OBzl(5q)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.026g(2.4mmol)HCl·Trp-Thr-OBzl得到28mg(3％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：540.94[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D ²⁵＝-11.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(s，2H)，5.02(m，2H)，4.49(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.22(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.25(m，2H)，1.10(d，J＝9Hz，2H)。

实施例26制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-OBzl(6)

按照实施例9，从326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和793.2g(2.4mmol)HCl·Trp-OBzl得到263mg(30％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：440.04[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D ²⁵＝-11.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.88(s，1H)，8.94(s，1H)，8.86(d，J＝9Hz，1H)，8.55(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(s，2H)，4.95(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.45(m，2H)。

实验例1测定化合物的细胞毒作用

1)本发明的化合物用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。

2)实验用的肿瘤细胞为MCF-7(人乳腺癌细胞)，HL60(人早幼粒白血病细胞)，K562(人白血病慢性粒细胞)，A549(人肺癌细胞系)，HaCa-T(人表皮永生化细胞)，L02(人正常肝细胞)。

3)实验方法

MCF-7，HL-60，K562和S180细胞选用RPMI-1640培养基；培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

贴壁细胞MCF-7、HaCa-T、L02和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5a，5b与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

悬浮细胞HL60和K562的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5a，5b与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养48小时后，每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于条件为37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

按下式求出各个浓度下化合物抑制肿瘤细胞增殖的活性：

细胞增殖(％)＝(化合物组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

4)结果见表1。结果表明，化合物抑制六种肿瘤细胞不显示细胞毒作用。

表1化合物的体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀，μM)

实验例2评价化合物抑制肿瘤生长的活性

1)本发明的化合物用含吐温80的生理盐水溶解，阿霉素用生理盐水溶解作为阳性对照，

含吐温80的生理盐水作为阴性对照；

2)化合物，含吐温80的生理盐水和阿霉素均为腹腔给药，化合物的给药剂量为100nmol/kg，含吐温80的生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g，阿霉素给药剂量为2μmol/kg，连续给药10天，共给药10次。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)动物模型与治疗

无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射化合物5a，5b，剂量为100nmol/kg和20nmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素，剂量为2μmol/kg。实验进行至第10天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以

表示。结果见表2。由表2可以看出，在100nmol/kg的剂量下，化合物5a-n治疗的肿瘤小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重，说明化合物5a-n的有效剂量低达100nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表色氨基酸或其它L-氨基酸残基除脯氨酸)的有效剂量1μmol/kg低10倍。体现了明确的技术优势。

表2化合物对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

n＝10；生理盐水是含吐温80的生理盐水；a)与生理盐水组比p＜0.05，b)与生理盐水组比p＜0.01.

由表3可以看出，在20nmol/kg和1nmol/kg的剂量下，化合物5a-c，e治疗的肿瘤小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重，说明化合物5a-c，e的有效剂量低达1nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表色氨基酸或其它L-氨基酸残基)的有效剂量1μmol/kg低1000倍。

表3不同剂量5a-c，e对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

N≥10；生理盐水是含吐温80的生理盐水；a)与生理盐水组比p＜0.05，b)与生理盐水组比p＜0.01.

实验例3评价化合物的抗炎活性

1)实验方法

18-22g ICR雄性小鼠随机分为空白对照组，阿司匹林阳性药组，化合物5a-c给药组，小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次性给药30分钟后往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.03mL)，2小时后将小鼠用乙醚麻醉之后颈椎脱臼处死。将小鼠的左，右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度。肿胀度＝左耳圆片重量-右耳圆片重量。

2)给药方法和剂量

给药方式为灌胃给药。空白对照：含吐温80的生理盐水，给药剂量为0.2mL/20g；阳性对照：阿司匹林，给药剂量为1.11mmol/kg；化合物的给药剂量为100nmol/kg.

3)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，肿胀度以

表示。

4)实验结果列入表4。

结果表明，化合物5a-c在100nmol/kg剂量下化合物治疗小鼠的耳肿胀度明显低于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的耳肿胀度。说明化合物在发挥体内抗肿瘤作用的剂量下，还具有抗炎作用。

表4化合物5a-c的体内抗炎活性评价

n＝10；生理盐水为含吐温80的生理盐水；a)与含吐温80的生理盐水组比p＜0.01，b)与含吐温80的生理盐水组比p＜0.05。

Claims

1.下式的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl，式中AA代表L-Asp，L-Pro,L-Gly,L-Ala,L-C(PMB),L-Phe,L-Ile,L-Leu,L-Met,L-Asn,L-Arg,L-Ser,L-Tyr,L-Val,L-Trp,L-Thr或L-Glu(OBzl残基)，

2.权利要求1所述的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl的制备方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在2N的NaOH溶液中皂化成3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)Boc-Trp与氨基酸苄酯偶联得到Boc-Trp-AA-OBzl；

(6)Boc-Trp-AA-OBzl在4N氯化氢/乙酸乙酯中得到L-Trp-AA-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸与L-Trp-AA-OBzl残基偶联得到3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl。

3.权利要求1所述的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1所述的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl在制备抗炎药物中的应用，式中AA选自L-Asp、L-Pro或L-Trp。