CN106103701A

CN106103701A - 改造的自然杀手细胞及其组成与用途

Info

Publication number: CN106103701A
Application number: CN201480072082.9A
Authority: CN
Inventors: 李建谋
Original assignee: Fu Hesheng Cures Ltd Co
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2034-12-23
Also published as: CA2935459A1; WO2015100495A1; CA2935459C; US20160324895A1; CN106103701B; TW201531561A; JP2017502698A; TWI546380B; JP6588465B2; US10195231B2

Abstract

本发明提供一种改造的自然杀手细胞、一种包含该改造的自然杀手细胞及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的医药组成物、以及该改造的自然杀手细胞的用途。在此揭露一种用于鉴定经纯化的自然杀手细胞以及培养该改造的自然杀手细胞的方法。

Description

改造的自然杀手细胞及其组成与用途

技术领域

本发明是关于一种改造的自然杀手细胞(natural killer cells)以及包含该改造的自然杀手细胞的医药组成物。提供一种用于鉴定经纯化的自然杀手细胞以及培养所述改造的自然杀手细胞的方法。

背景技术

免疫监控(Immune surveillance)就抗癌而言扮演了重要角色，同时也是一种极具吸引力的治疗方法，特别是对比于癌症处理中的传统手术治疗、放射线疗法、化学疗法的诸多缺点而言。

人体抵御癌症的第一道防线是具有表现型为CD3^-CD14^-CD19^-CD56⁺CD16⁺NGK2D⁺CD11c⁺HLA-DR^-CD86^-CD83^-的自然杀手细胞(natural killer cell,NK cell)。自然杀手细胞是一种具有细胞毒性的淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte)，其主动地扫描身体以发现异常细胞，并于异常细胞发展成癌细胞前将其摧毁。当自然杀手细胞在体内巡逻时，它们透过其活化型及抑制型表面受器(activating and inhibiting surface receptors)的阵列，与许多种细胞进行交互作用(interact)。大部分的癌细胞会与自然杀手细胞的活化型受器结合，进而启动自然杀手细胞的自然杀伤反应(natural kill response)。

这些发现证实了用来发展以NK为基础的癌症细胞治疗法以及在临床应用中产生较多数量的具疗效的NK细胞培养方法的合理推论，但有效的癌症疗法及癌症预防方法的需求仍未获满足。本发明提供一种具有独特表现型(phenotype)的改造的自然杀手细胞，以满足这些以及其他需求。这种细胞可用于自体疗法(autologous therapy)或非自体疗法(non-autologous therapy)。

发明内容

于一实施例中，本发明提供一种改造的自然杀手细胞，该细胞包括CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞表现型，并且包括一个或更多个选自HLA-DR、CD83、以及CD86群组的树突细胞表面抗原(dendritic cell surface antigens)。

有些实施例提供一些包含该改造的自然杀手细胞以及一种药学上可接受的载体或赋形剂的医药组成物。

有些实施例提供一些抑制癌细胞的方法，包括将一个或更多个改造的自然杀手细胞施用于需要该方法的主体。

其他实施例提供一些抑制癌细胞的方法，包括将有效剂量的如权利要求1所述的改造的自然杀手细胞施用于需要该方法的主体，其中，该癌细胞为被抑制的。

本发明的第四个实施例提供一种自检体中鉴定经纯化的自然杀手细胞的方法，包含自检体的单核球细胞中剔除一种或更多种下列细胞表面抗原：CD14、CD19、或CD25。其中，所述经纯化的自然杀手细胞本质上不包含一个或更多个选自CD14、CD19、及CD25的细胞表面抗原。

本发明的第五个实施例提供一种组成物，包含一第一型辅助性T细胞的细胞激素以及一T细胞生长因子。

本发明的第六个实施例提供一种培养改造的自然杀手细胞的方法，包含将经纯化的自然杀手细胞与一组成物接触，该组成物的组成分包括(a)第一型辅助性T细胞的细胞激素，以及(b)T细胞生长因子。其中，所述经纯化的自然杀手细胞本质上不包含一个或更多个选自CD14、CD19、及CD25的细胞表面抗原。

于另一实施例中，本发明提供一种培养改造的自然杀手细胞的方法，包含(a)将经纯化的自然杀手细胞与一第一组成物接触，该第一组成物的组成分包括干扰素伽玛(IFN-γ)以及介白素15(IL-15)；以及(b)将步骤(a)的该经纯化的自然杀手细胞与一第二组成物接触，该第二组成物的组成分包括介白素15(IL-15)、介白素12(IL-12)、以及干扰素伽玛(IFN-γ)。其中，所述经纯化的自然杀手细胞本质上不包含一个或更多个选自CD14、CD19、及CD25的细胞表面抗原。

透过在此所述的鉴定及培养方法，能够自定量的检体(例如10毫升血液)中分离出大量改造的自然杀手细胞。

附图说明

本专利或专利申请包含至少一张彩色附图。申请人将根据要求及缴交必要规费，提交本专利或本专利申请的影本及其彩色附图的影本。

以下为本发明各说明性实施例的详细说明，并请参阅下列附图：

图1：示意性地说明经纯化的自然杀手细胞的鉴定步骤及改造的自然杀手细胞的培养步骤。

图2：一组图像，分别说明剔除/鉴定流程前后，自然杀手细胞表面的CD14、CD19、以及CD25细胞表面抗原表现量。A组：在细胞剔除前，利用前散射光(forward scatter,FSC)及侧散色光(side scatter,SSC)检测系统分析CD14⁺、CD19⁺、以及CD25⁺细胞所得的流式细胞分析结果；B组：在细胞剔除后，CD14⁺、CD19⁺、以及CD25⁺细胞的流式细胞分析结果。

图3：习知的自然杀手细胞、美国专利申请(申请号US 13/918,529)中的自然杀手细胞、以及本发明改造的自然杀手细胞的流式细胞仪分析结果图像组。A-C组以及J-L组说明习知的自然杀手细胞的CD56、CD11c、CD16、HKG2D、HLA-DR、CD86、以及CD83抗原的流式细胞仪分析结果。G-I组以及P-R组说明本发明改造的自然杀手细胞的流式细胞仪分析结果。D-F组以及M-O组说明美国专利申请13/918,529中的自然杀手细胞的流式细胞仪分析结果。

图4：一组流式细胞分析图像，说明改造的自然杀手细胞的细胞毒杀活性。A组：在缺乏改造的自然杀手细胞时，具有凋亡蛋白酶6的标靶细胞的百分比。B组：在本发明改造的自然杀手细胞存在时，具有凋亡蛋白酶6的标靶细胞的百分比。

图5：一组细胞分裂的流式细胞分析图像，说明改造的自然杀手细胞对T淋巴细胞增生作用的影响。A组：在不包含同种异体T淋巴细胞的情况下，改造的自然杀手细胞在体外的增生情形。B组：在不包含改造的自然杀手细胞的情况下，同种异体T淋巴细胞在体外的增生情形。C组：在改造的自然杀手细胞存在的情况下，同种异体T淋巴细胞在体外的增生情形。

图6：一组流式细胞分析图像，说明不同浓度的介白素12对改造的自然杀手细胞的影响。

图7：一组流式细胞分析图像，说明包含介白素2的组成物(A-C组、G-I组、以及M组)或包含介白素15的组成物(D-F组、J-L组、以及N组)对改造的自然杀手细胞的细胞表面抗原表现量的影响。

具体实施方式

本申请主张2014年1月3日申请的美国第61/923,354号专利申请案的利益，并于此一并检附该专利申请的全部揭露内容做为参考之用。

在本文中，“一”指的是一或大于一(也就是“至少一”)个本文所述的主体。例如，“一改造的自然杀手细胞”意指一个改造的自然杀手细胞或大于一个改造的自然杀手细胞。

在本文中，“有效剂量”指的是一种改造的自然杀手细胞或医药组成物的剂量，该剂量足以使癌症病征及癌症症状减少，所述病征及症状包含但不限于体重减轻、疼痛、或可以被侦测到的肿瘤块(tumor mass)，可以是临床上明显的块体或是透过各种放射线影像装置侦测。

“主体”(subject)指的是罹患癌症的脊椎动物或是被认为需要癌症治疗的脊椎动物。主体包括温血动物，例如哺乳动物，例如一灵长类动物，特别是一人类。非人类的灵长类动物也是这里所指的主体。主体包括家养动物(domesticated animals)，例如猫、狗…等等，也包括家畜(livestock，例如牛、马、猪、绵羊、山羊)以及实验动物(laboratoryanimal，例如小鼠、兔子、大鼠、沙鼠、天竺鼠…等等)。从而，兽医用途和医学制剂都包括在此预期的范畴中。

只要表现量相对于负对照族群(标示为“－”)而言为正偏离，自然杀手细胞表面的一细胞表面抗原(例如CD83、CD86、HLA-DR)的表现量(expression level)或表面密度(surface density)即为“+”。

在此所有的数值也许均应被理解为以“约略”作修改。

改造的自然杀手细胞

天然的或习知的自然杀手细胞具有CD3^-/CD56⁺表现型。在一实施例中，天然的或习知的自然杀手细胞具有如表一所示的CD3^-CD14^-CD19^-CD56⁺CD16⁺NKG2D⁺CD11c⁺表现型。

于一实施例中，本发明提供一种改造的自然杀手细胞，其包含CD3^-/CD56⁺的自然杀手细胞表现型，且如表一所示，该细胞包括一或更多个选自HLA-DR、CD83、以及CD86群组的树突细胞表面抗原(dendritic cell surface antigens)。本发明的该改造的自然杀手细胞是非天然的。该改造的自然杀手细胞包含一或更多个完全活化的树突细胞表面抗原(例如HLA-DR、CD83、以及CD86)、兼具自然杀手细胞的功能及树突细胞(dendritic cell)的功能、且具有增强的抗癌活性(anti-cancer activity)。

表一：习知的自然杀手细胞以及改造的自然杀手细胞的表现型

于一实施例中，该改造的自然杀手细胞本质上不含CD11c(具有CD3^-CD56⁺CD11^-表现型)。于另一实施例中，该改造的自然杀手细胞包含一或更多个选自CD14^-、CD19^-、CD16⁺、以及NKG2D⁺群组的自然杀手细胞表现型(例如具有CD3^-CD14^-CD19^-CD56⁺CD16⁺NKG2D⁺表现型)。于又一实施例中，该改造的自然杀手细胞本质上不包含CD14以及/或CD19。

于一较佳实施例中，本发明提供一种改造的自然杀手细胞，该细胞包括一CD3^-/CD56⁺表现型的自然杀手细胞，其中，所述CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞包括一CD83细胞表面抗原(具有CD3^-CD56⁺CD83⁺表现型)。于另一较佳实施例中，本发明提供一种改造的自然杀手细胞，该细胞包括一CD3^-/CD56⁺表现型的自然杀手细胞，其中，所述CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞更包括一CD86细胞表面抗原(具有CD3^-CD56⁺CD86⁺表现型)。于又一较佳实例中，本发明提供一种改造的自然杀手细胞，该细胞包括一种CD3^-/CD56⁺表现型的自然杀手细胞，其中，所述CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞更包括一HLA-DR细胞表面抗原(具有CD3^-CD56⁺HLA-DR⁺表现型)。

第四较佳实施例提供一种改造的自然杀手细胞，该细胞包括一种CD3^-/CD56⁺表现型的自然杀手细胞，其中，所述CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞更包括一CD83细胞表面抗原以及一CD86细胞表面抗原(具有CD3^-CD56⁺CD86⁺CD83⁺表现型)。第五较佳实施例提供一种改造的自然杀手细胞，该细胞包括一种CD3^-/CD56⁺表现型的自然杀手细胞，其中，所述CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞更包括一CD86细胞表面抗原以及一HLA-DR细胞表面抗原(具有CD3^-CD56⁺CD86⁺HLA-DR⁺表现型)。第六较佳实施例提供一种改造的自然杀手细胞，该细胞包括一种CD3^-/CD56⁺表现型的自然杀手细胞，其中，所述CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞更包括一HLA-DR细胞表面抗原以及一CD83细胞表面抗原(具有CD3^-CD56⁺HLA-DR⁺CD83⁺表现型)。

于一些较佳实施例中，本发明提供一种改造的自然杀手细胞，该细胞包括一种CD3^-/CD56⁺表现型的自然杀手细胞，其中，所述CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞更包括一HLA-DR细胞表面抗原、一CD83细胞表面抗原、以及一CD86细胞表面抗原(具有CD3^-CD56⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83⁺表现型)。

于一实施例中，细胞表面抗原的表现量(expression level)或表面密度透过下列方法进行量化：将该改造的自然杀手细胞暴露在带有萤光染剂的专一性抗人类单株抗体中(例如CD86-PE(Beckman Coulter；Cat.No:IM2729U)或抗人类CD83-PE-Cy5(BioLegend；Cat.No:305310))，接着利用流式细胞仪(例如Gallios，可购自Beckman Coulter,Inc.,USA)执行改造的自然杀手细胞的分选(sorting)。

该改造的自然杀手细胞可以源自于单一个体(也就是自体(autologous))或是源于多个个体(非自体，同种异体(allogeneic))。

医药组成物

于一实施例中，本发明提供一种医药组成物，该医药组成物包含一改造的自然杀手细胞以及一药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂(excipient)。

本发明亦提供一种抑制癌细胞的方法，施用一足以抑制癌细胞的剂量的本发明改造的自然杀手细胞或本发明的医药组成物于一需要该方法的主体。不受限于任何特定理论，本发明改造的自然杀手细胞被认为是经由一或多种自然杀手细胞/树突细胞的功能，达到抑制癌细胞的结果，该些功能包括：更强的细胞毒杀能力、能刺激癌症专一性T淋巴细胞增生或分泌干扰素伽玛(IFNγ)的能力。

本发明的医药组成物或改造的自然杀手细胞的给药途径，包括但不限于静脉的(intravenous)、肌肉内的(intramuscular)、皮下的(subcutaneous)、口服的(oral)、局部的(topical)、皮下的(subcutaneous)、皮内的(intradermal)、经由皮肤吸收的(transdermal)、皮下的(subdermal)、非口服的(parenteral)、直肠的(rectal)、脊髓的(spinal)、或表皮的(epidermal)给药方式。于一实施例中，该改造的自然杀手细胞是透过静脉注射(intravenous injection)或静脉内输注(intravenous infusion)。

本发明的医药组成物可以被制备成液态溶液或悬浮液的可注射形式，亦或是，一种适合在注射前利用液态载体(liquid vehicles)溶解成溶液或悬浮液的固体形式。该医药组成物可以被制备成固体形式、乳化的或在其他特定的载体(carrier)中，用以持续输出(delivery)。例如，该医药组成物可以是下列形式：油乳化液(oil emulsion)、油包水乳液(water-in-oil emulsion)、水包油包水乳液(water-in-oil-in-water emulsion)、位置特异性乳液(site-specific emulsion)、长滞留乳液(long-residence emulsion)、黏性乳液(sticky emulsion)、微乳(micro emulsion)、毫微乳(nano emulsion)、微脂体(liposome)、微粒(microparticle)、微珠(microsphere)、纳米小球(nanosphere)、纳米粒子(nanoparticle)、以及各种天然或人造的聚合物{polymer，例如不可吸收的不透水聚合物[nonresorbable impermeable polymers，例如乙烯/醋酸乙烯酯共聚物(ethylenevinylacetate copolymers)以及共聚物]、可膨胀的共聚物[swellable polymers，例如水合胶(hydrogels)]、或可吸收的聚合物[resorbable polymer，例如胶原蛋白(collagen)以及特定的多元酸(polyacids)或共聚酯(polyesters，例如那些可以被用来制造可吸收结构的物质)]}。这些载体能确保该医药组成物的持续释出(sustained release)。

本发明改造的自然杀手细胞被制备成医药组成物，以递送至一哺乳类动物主体。该医药组成物是被单独施用，以及/或与一种药学上可接受的媒介物(vehicle)、赋形剂(excipient)、或载体(carrier)混合。可接受的媒介物是例如盐水(saline)、葡萄糖(dextrose)、甘油(glycerol)或其他相似的物质及其组合。再者，媒介物可以包含少量的辅助物质(auxiliary substances)，例如润湿剂(wetting agents)或乳化剂(emulsifyingagents)、pH值缓冲剂、或佐剂(adjuvants)。药学上可接受的载体可以包含生理学上可接受的化合物(compounds)，其作用为例如稳定、或增加或减少本发明医药组成物的吸收率(absorption)或清除率(clearance rates)。生理学上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物{carbohydrates，例如葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、或葡萄聚糖(dextran)、抗氧化剂[antioxidants，例如抗坏血酸(ascorbic acid)或谷胱胺肽(glutathione)]}、螫合剂(chelating agents)、低分子量的蛋白质、界面活性剂(detergents)、微脂体型的载体(liposomal carriers)、或赋形剂(excipients)或其他安定剂(stabilizers)及/或缓冲液(buffer)。其它生理学上可接受的化合物包含润湿剂(wetting agents)、乳化剂(emulsifying agents)、分散剂(dispersing agents)、或保存剂(preservatives)。请参见第21版《雷明顿的制药科学》(the 21st edition of Remington's PharmaceuticalScience,Mack Publishing Company,Easton,Pa.)。本发明的医药组成物也可以包含辅助物质(ancillary substances)，例如药理剂(pharmacological agents)、细胞激素(cytokines)、或其他生物反应调节剂(biological response modifiers)。

实际制备这些剂型的方法为本领域技术人员已知或显而易见，请参阅例如第21版《雷明顿的制药科学》。

改造的自然杀手细胞或本医药组成物可以仅被施用于单一剂量治疗(singledose treatment)，或是依照主体的年龄、体重以及条件、所施用的特定组成物、给药途径、该改造的自然杀手细胞或本医药组成物是否是用于预防或治疗的目的等等条件，按计划于一定期间内被施用于多剂量的治疗(multiple dose treatments)。例如，于一实施例中，本发明的该改造的自然杀手细胞或医药组成物是一个月施用一次、一个月施用二次、一个月施用三次、隔周施用一次(every other week,qow)、每周施用一次(once per week,qw)、每周施用二次(twice per week,biw)、每周施用三次(three times per week,tiw)、每周施用四次、每周施用五次、每周施用六次、隔日施用一次(every other day,qod)、每日施用一次(daily,qd)、每日施用二次、或每日施用三次(three times a day,tid)。

本发明改造的自然杀手细胞或医药组成物的给药期间(例如改造的自然杀手细胞或医药组成物的施用期间)应视情况而异，取决于任何不同的因子，例如主体的反应等等。例如，该改造的自然杀手细胞或医药组成物可以被施用的期间为例如从一或多秒钟至一或多分钟、一或多小时至一天至约一周、从约二周至约四周、从约一个月至约二个月、从约二个月至约四个月、从约四个月至约六个月、从约六个月至约八个月、从约八个月至约一年、从约一年至约二年、从约二年至约四年、或更多年。

较佳者，配置易于给药、剂量均匀的非口服医药组成物(parenteralpharmaceutical compositions)或改造的自然杀手细胞计量单位型式(dosage unitform)。所述剂量单位型式，请参考适合作为被治疗主体单次剂量的物理上独立的单元(physically discrete units)。

自细胞培养实验及动物研究所得的数据，可用于制定施用于人类的剂量范围。于一实施例中，这种自然杀手细胞的剂量介于一个范围内，该剂量范围含盖几乎无毒性或无毒性的50％有效剂量(50％Effective dose,ED50)。在此剂量范围内，可以根据所采用的剂型及给药途径作剂量变化。于另一实施例中，可以根据细胞培养实验的结果，初步估计治疗上的有效剂量。可以在实验动物身上制定一剂量，使循环血浆浓度范围包含细胞实验中所得出的半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50；亦即，改造的自然杀手细胞的浓度，达到最大抑制症状效果的一半；Sonderstrup,Springer,Sem.Immunopathol.25:35-45,2003.Nikula et al.,Inhal.Toxicol.4(12):123-53,2000)。

该医药组成物被制备成包含有效剂量的该改造的自然杀手细胞，其中，该剂量取决于所欲治疗的动物以及所欲治疗的病情。适用于任何特定主体的具体剂量取决于各种因子，包含改造的自然杀手细胞的活性、年纪、体重、总体健康状况(general health)、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合、以及正在治疗中的疾病的严重程度。较佳的，本发明的改造的自然杀手细胞用以供治疗或预防的有效量的非限制范围至少为约每一剂量1×10³个细胞至每一剂量1×10⁹个细胞。也有可能是其他计量，包含但不限于1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、或1×10⁹。

该改造的自然杀手细胞或该医药组成物可以被单独施用或与其它治疗剂(therapeutic agent)合并使用，例如化学疗法(chemotherapy)、放射性治疗(radiotherapy)、标靶治疗(targeted therapy)、或癌症疫苗(cancer vaccine)。

鉴定及培养改造的自然杀手细胞的方法

于一实施例中，鉴定经纯化的自然杀手细胞以及培养改造的自然杀手细胞的方法说明于图1。改造的自然杀手细胞以经纯化的自然杀手细胞(纯化的CD14^-CD19^-CD25^-单核球细胞)作为起始的细胞族群，进行扩大培养。

于一实施例中，如同图1所示，该为了获得高纯度CD14^-CD19^-CD25^-单核球细胞(经纯化的自然杀手细胞)的鉴定/剔除步骤如下：

(a)自一主体采集检体。该检体包含但不限于任何包含一或多个单核球细胞的体液，例如周边血(peripheral blood)、脐带血(cord blood)、或骨髓检体(bone marrowsample)。

(b)利用离心方法(Ficoll-Paque^TM PREMIUM,GE Healthcare USA)，将步骤(a)检体中的单核球细胞自其他种类的血球细胞中分离。其它分离单核球细胞的方法为本领域技术人员已知或显而易见。

(c)利用例如MACS分选仪(MACS sorting；Mitenyi Biotec,Germany)，自步骤(b)的其他单核球细胞中，剔除一或多个包含CD25细胞表面抗原(例如表现型为CD25⁺CD3^-以及CD25⁺CD3⁺的单核球细胞)、CD14细胞表面抗原、或CD19细胞表面抗原的单核球细胞。

(d)收集步骤(c)中的CD14^-CD19^-CD25^-单核球细胞(即经纯化的自然杀手细胞)，作为后续培养之用。

本发明的一实施例，提供一种自样品中鉴定经纯化的自然杀手细胞的方法，包含从样品的单核球细胞中剔除一或更多个下列细胞表面抗原：CD14、CD19、或CD25，其中，所述经纯化的自然杀手细胞本质上不包含一个或更多个选自CD14、CD19、及CD25的细胞表面抗原。

于一实施例中，步骤(b)所述的包含CD25的单核球细胞在样品中被剔除。于另一实施例中，步骤(b)所述的包含CD14的单核球细胞在样品中被剔除。于再一实施例中，步骤(b)所述的包含CD19的单核球细胞在样品中被剔除。于又一实施例中，步骤(b)所述的包含CD14的一或更多个单核球细胞以及包含CD25的一或更多个单核球细胞在样品中被剔除。于又一实施例中，步骤(b)所述的包含CD14的一或更多个单核球细胞以及包含CD19的一或更多个单核球细胞在样品中被剔除。于又一实施例中，步骤(b)所述的包含CD19的一或更多个单核球细胞以及包含CD25的一或更多个单核球细胞在样品中被剔除。于又一实施例中，步骤(b)所述的包含CD19的一或更多个单核球细胞、包含CD25的一或更多个单核球细胞、以及包含CD14的一或更多个单核球细胞在样品中被剔除。

于一实施例中，基本上所有包含CD25的单核球细胞都在样品中被剔除。于另一实施例中，基本上所有包含CD14的单核球细胞都在样品中被剔除。于一实施例中，基本上所有包含CD19的单核球细胞都在样品中被剔除。

于一实施例中，如图1所示，将一种高度纯化的CD14^-CD19^-CD25^-单核球细胞(即经纯化的自然杀手细胞)与一种培养基组成物接触，该培养基组成物包含T细胞生长因子(Tcell growth factor)以及第一型辅助性T细胞细胞激素(T help 1cytokine)。于另一实施例中，将步骤(c)的CD14^-CD19^-CD25^-单核球细胞(即经纯化的自然杀手细胞)与一组成物混合，该组成物包含T细胞生长因子、第一型辅助性T细胞细胞激素、以及介白素12(IL-12)。非用以限定的例子，该T细胞生长因子为例如介白素15(IL-15)。非用以限定的例子，该第一型辅助性T细胞细胞激素包括干扰素伽玛(IFN-γ)。于另一实施例中，该组成物更包含造血细胞的培养基(hematopoietic cell medium)。非用以限定的例子，造血细胞的培养基包括X-vivo 20(可购买自Lonza,Switzerland)。

于一实施例中，该培养基组成物本质上不包含一或更多个选自下列的生长因子：干细胞生长因子(stem cell factor)、FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-Like TyrosineKinase 3ligand,FLT3ligand)、介白素2(IL-2)、介白素7(IL-7)、介白素21(IL-21)、以及烟碱酰胺(nicotinamide)。于另一实施例中，干细胞生长因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、介白素2、介白素7、介白素21、或烟碱酰胺存在于该培养基组成物中的量为≤2重量％、≤1.5重量％、≤1重量％、以及≤0.5重量％。

于一实施例中，所述包含一T细胞生长因子以及一第一型辅助性T细胞细胞激素的组成物，用于在5％二氧化碳、37℃条件下培养该改造的自然杀手细胞。

本发明一些实施例的组成物能促进该改造的自然杀手细胞增生。于一实施例中，该组成物使自然杀手细胞的活化的树突细胞标志物(marker)的表现量提升，所述活化的树突细胞标志物例如改造的自然杀手细胞的HLA-DR、CD83、以及CD86细胞表面抗原。于另一实施例中，该组成物基本上使改造的自然杀手细胞的CD11c细胞表面抗原的表现量减少。改造的自然杀手细胞的细胞增生率是利用流式细胞分选仪(Fluorescence Activated CellSorter,FACS)检测，以CD3^-CD14^-CD19^-CD56⁺CD11c^-细胞的信号强度为依据。其他细胞增生分析方法为本领域技术人员所熟知，例如成株实验(clonogenic assay)、代谢分析(metabolic assay)、以及直接增殖实验(direct proliferation assay)。

较佳者，该CD14^-CD19^-CD25^-单核球细胞以及该组成物的接触时间的非限制范围(non-limiting range for the contact time)，从约1分钟至约1小时、从约1小时至约24小时、从约1天至约3天、从约1天至约6天、从约1天至约9天、从约3天至约6天、或至少1天。于一实施例中，该接触时间为约3天。于另一实施例中，该接触时间为约6天。

于一实施例中，先将该CD14^-CD19^-CD25^-单核球细胞(即经纯化的自然杀手细胞)与一第一组成物接触，该第一组成物包含介白素15、干扰素伽玛(IFN-γ)、以及介白素12；接着，再与一第二组成物接触，该第二组成物包含介白素15、以及干扰素伽玛(IFN-γ)。于另一实施例中，该第一组成物以及该第二组成物更包含造血细胞的培养基(hematopoieticcell medium)，例如X-vivo 20。

介白素12对于自然杀手细胞而言是具有毒性的。因此，在培养及增殖该改造的自然杀手细胞时，该组成物中的介白素12的浓度是相当重要的因子─较高浓度的介白素12导致存活的改造的自然杀手细胞的细胞产量降低(请参见图6)。于一实施例中，介白素12的有效浓度小于或等于15ng/mL，例如14.5、14、13.5ng/mL。于另一实施例中，介白素12的有效浓度大于0.1ng/mL，例如0.15、0.2、0.25ng/mL。于又一实施例中，介白素12的有效浓度为约0.1至约5ng/mL，或任何增量为0.1ng/mL且介于其中的数值或数值范围(例如约0.6ng/mL、约4.3ng/mL等等)。于再一实施例中，介白素12的有效浓度为约5至约10ng/mL，或任何增量为0.1％且介于其中的数值或数值范围(例如约6.5ng/mL、约8.2ng/mL等等)。于又一实施例中，介白素12的有效浓度为等于约10至少于约15ng/mL，或任何增量为0.1％且介于其中的数值或数值范围(例如约13.7ng/mL、约12.8ng/mL等等)。

以下本发明的具体实施例仅用于说明本发明，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：改造的自然杀手细胞的鉴定

自健康的自愿者(volunteer)身上采集40mL周边血至包含K2EDTA的真空管中。将血液检体与同体积已预先加温的磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate-buffered saline,PBS)(Biological Industries,Israel)混合。将其中的40mL周边血稀释液放入50mL离心管中，再向下置入10mL已预先加温的Ficoll-Paque^TM PREMIUM。于2000rpm、室温条件下，将该离心管离心30分钟。收取介面层(interface layer)的单核球细胞(mononuclear cells)，于磷酸盐缓冲生理盐水中(PBS)清洗一次。将细胞团块(cell pellet)重新悬浮至浓度为10⁶/100mL MACS缓冲液。

为了剔除CD14⁺细胞、CD19⁺细胞、以及CD25⁺细胞，我们进一步根据制造商的说明书操作QuadroMACS分选仪(QuadroMACS Separator；Miltenyi Biotec Bergisch,Gladbach,Germany)，进而对该些单核球细胞执行免疫磁珠分离技术(immunomagnetic beadseparation)。简而言之，将该些单核球细胞与生物素-抗CD14抗体(biotin-anti-CD14)、生物素-抗CD19抗体(biotin-anti-CD19)、以及生物素-抗CD25抗体(biotin-anti-CD25)反应(react)，利用磁力分离器(magnetic separator)分离，接着，利用冲洗(wash)的方式将CD14^-CD19^-CD25^-族群的细胞自未键结的细胞中纯化出来。该富集的(enriched)单核球细胞族群基本上不包含CD14⁺细胞、CD19⁺细胞、以及CD25⁺细胞(即经纯化的自然杀手细胞)。

如图2所示，剔除前(A组)，CD14⁺细胞、CD19⁺细胞、以及CD25⁺自然杀手细胞信号强度显著高于剔除后(B组)。

实施例2：培养改造的自然杀手细胞

在负向剔除(negative depletion)后，培养实施例1所得的纯化的CD14^-CD19^-CD25^-自然杀手细胞(经纯化的自然杀手细胞)族群，步骤如下：

(a)于第0天将1×10⁶个CD14^-/CD19^-/CD25^-自然杀手细胞(经纯化的自然杀手细胞)与一组成物接触，该组成物包含1mL X-vivo 20培养基、1mL介白素15(浓度为10ng/mL)、1mL介白素12(浓度为4ng/mL)、以及1mL干扰素伽玛(IFN-γ；浓度为20ng/mL)。

(b)于第三天收取步骤(a)所得的经纯化的自然杀手细胞中的一半数量，经短暂离心(spin down)后，以包含X-vivo 20培养基、10ng/mL介白素15、4ng/mL介白素12、以及20ng/mL干扰素伽玛(IFN-γ)的一组成物，将细胞团块重新悬浮。其中，用以重新悬浮细胞团块的X-vivo 20的体积以及任一种生长因子(growth factor)的体积，应等于细胞团块的体积。

(c)于第六天收取步骤(b)所得的经纯化的自然杀手细胞中的一半数量，经短暂离心(spin down)后，以包含X-vivo 20培养基、10ng/mL介白素15、以及20ng/mL干扰素伽玛(IFN-γ)的一组成物，将细胞团块重新悬浮。其中，用以重新悬浮细胞的X-vivo 20的体积以及任一种生长因子(growth factor)的体积，应等于细胞团块的体积。

(d)于第九天将步骤(c)所得的经过培养的经纯化的自然杀手细胞全部收集起来(collect)。

利用Gallios流式细胞仪(Gallios Flow Cytometer,10COLORS/3LASERS,serialnumber:AU18419,Beckman Coulter,Inc.USA)、Kazula软件第1.2版(Beckman Coulter,Inc.USA)、以及表2中所列的抗体，分析步骤(d)所得的经过培养的经纯化自然杀手细胞的表现型(phenotype)。

表二：用于改造的自然杀手细胞表现型的抗体

于此实施例中，利用FACS/流式细胞仪分析所得的细胞表面抗原表现量或表面密度，其定义请参见表3。表3有关于不同表现量的解释，是定义细胞表面抗原表现量的一种例子。应特别注意的是，流式细胞仪的信号量强度会随着下列因子而异：流式细胞仪、软件、以及使用不同批次的抗体。

表三

符号	说明
		-	流式细胞仪的信号量强度小于或等于10⁰(亦即，1)
+(Dim)	流式细胞仪的信号量强度界于10⁰至10¹之间
		+	流式细胞仪的信号量强度界于10¹至10²之间
+(hi)	流式细胞仪的信号量强度大于或等于10²

结果：如图3G～3I以及图3P～3R所示，经过培养的自然杀手细胞具有CD3^-CD19^-CD14^-CD56⁺CD16⁺NKG2D⁺CD11c^-CD86⁺HLA-DR⁺CD83⁺表现型。图3A～3C以及图3J～3L说明习知的自然杀手细胞具有CD3^-CD19^-CD14^-CD56⁺CD16⁺NKG2D⁺CD11c⁺CD86^-HLA-DR^-CD83^-表现型。图3D～3F以及3M～3O说明美国第13/918,529号专利申请案中的自然杀手细胞经流式细胞仪分析的结果。

习知的自然杀手细胞的表现型以及改造的自然杀手细胞的表现型的差异，概述如下：

·图3A显示习知的自然杀手细胞具有CD11c⁺表现型，图3G则显示改造的自然杀手细胞具有CD11c^-表现型。

·图3J显示习知的自然杀手细胞具有HLA-DR^-表现型，图3P则显示改造的自然杀手细胞具有HLA-DR⁺表现型。

·图3K显示习知的自然杀手细胞具有CD86^-表现型，图3Q则显示改造的自然杀手细胞具有CD86⁺表现型。

·图3L显示习知的自然杀手细胞具有CD83^-表现型，图3R则显示改造的自然杀手细胞具有CD83⁺表现型。

实施例3：测定自然杀手细胞的功能

毒杀试验(“killing”assay)：将实施例2所得的改造的自然杀手细胞、经过异藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)标定的K562白血病标靶细胞以1：1的比例，共培养30分钟。标靶细胞死亡的情形，被流式细胞分选仪(FACS)检测为表现凋亡蛋白酶6(Caspase 6-positive，为死细胞)的经APC标定的标靶细胞中的比例。表现凋亡蛋白酶6的细胞越多，表示毒杀效果越好。

结果：如图4A所示，表现凋亡蛋白酶6的标靶细胞(改造的自然杀手细胞不存在)占8.3％；图4B中，表现凋亡蛋白酶6的标靶细胞(改造的自然杀手细胞存在)占57.8％。此结果显示改造的自然杀手细胞对于白血病标靶细胞具有较高的毒杀效果。

T淋巴细胞的增生实验

将实施例2所得的改造的自然杀手细胞、经过CFSE(6-Carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester,CFSE)标定的异体T淋巴细胞(allogeneic T lymphocytes)共培养。T淋巴细胞增生将导致细胞激素的分泌，例如干扰素伽玛(IFN-γ)以及介白素2(IL-2)。异体淋巴球细胞的增生情形，被流式细胞分选仪(FACS)检测为经CFSE标定的单核球细胞的数量。

结果：当与实施例2所得的自然杀手细胞共培养时(图5C)，异体T淋巴细胞的分裂比例较高；当单独培养时，也就是实施例2所得的自然杀手细胞不存在的情况下(图5B)，异体T淋巴细胞几乎不分裂或未分裂。

实施例4：介白素12的浓度，对培养改造的自然杀手细胞的影响

介白素12可能具有毒性。利用流式细胞分选仪/流式细胞仪(FACS/Flowcytometry)对一组成物中的介白素12的浓度进行体外评估(in vitro evaluation)。

下列介白素12的浓度是其在组成物中的浓度，所述组成物用于培养实施例2中的自然杀手细胞：0ng/mL(无介白素12)、0.18ng/mL、0.55ng/mL、1.66ng/mL、5ng/mL、以及15ng/mL。

结果：如图6所示，当介白素12的浓度较高时，实施例2所得的存活的自然杀手细胞数量降低。当介白素12的浓度为5ng/mL时，约14.13％经过培养的自然杀手细胞存活；当介白素12的浓度为15ng/mL时，仅7.31％经过培养的自然杀手细胞存活。

实施例5：介白素2对培养改造的自然杀手细胞的影响

利用流式细胞分选仪/流式细胞仪(FACS/Flow cytometry)进行体外评估，以了解介白素2组成物以及介白素15组成物对培养自然杀手细胞的影响。

如图7H以及7I所示，当培养基组成物中含有介白素2时，所得的自然杀手细胞不会表现CD86细胞表面抗原以及CD83细胞表面抗原。另一方面，如图7K以及7L所示，当培养基组成物中含有介白素15时，所得的自然杀手细胞会同时表现CD86细胞表面抗原以及CD83细胞表面抗原。

虽然本发明的特定面向已经被描述和说明，这样的面向应视为仅仅是本发明的例示，并非用以在解释所附权利要求书时限制本发明的范围。所有本说明书引用的出版文献及专利申请的整体为所有目的皆于此被纳入参考，如同任一被特别或个别指出的出版文献或专利申请为所有目的而被纳入参考。尽管为了达到清楚理解的目的，前述发明已透过举例说明和实施例的方式，在一定程度上被详细描述，但对于一位本技术领域具有通常知识的技术人员而言，在不脱离所附权利要求书的精神和范围的状况下，根据本发明的教导而作的某些变化和修改，都是显而易见的。

Claims

1.一种改造的自然杀手细胞，包括

一CD3^-/CD56⁺自然杀手细胞表现型；以及

一或更多种选自HLA-DR、CD83、以及CD86群组的树突细胞表面抗原。

2.如权利要求1所述的改造的自然杀手细胞，该改造的自然杀手细胞不包括CD11c细胞表面抗原。

3.如权利要求1所述的改造的自然杀手细胞，该改造的自然杀手细胞包括一或更多种选自CD14^-、CD19^-、CD16⁺、以及NKG2D⁺群组的自然杀手细胞表现型。

4.一种医药组成物，包括

(a)如权利要求1所述的改造的自然杀手细胞；以及

(b)一药学上可接受的载体或赋形剂。

5.如权利要求4所述的医药组成物，其中该改造的自然杀手细胞不包括CD11c细胞表面抗原。

6.如权利要求4所述的医药组成物，其中该改造的自然杀手细胞包括一种或更多种选自CD14^-、CD19^-、CD16⁺、以及NKG2D⁺群组的自然杀手细胞表现型。

7.一种抑制癌细胞的方法，包括将有效剂量的如权利要求1所述的改造的自然杀手细胞施用于需要该方法的主体，其中，该癌细胞为被抑制的。

8.如权利要求7所述的方法，其中该改造的自然杀手细胞不包括CD11c细胞表面抗原。

9.如权利要求7所述的方法，其中该改造的自然杀手细胞包括一或更多种选自CD14^-、CD19^-、CD16⁺、以及NKG2D⁺群组的自然杀手细胞表现型。

10.如权利要求1所述的方法，其中的有效剂量为每剂量约1×10³至约1×10⁹个自然杀手细胞。

11.一种组成物，包括

一第一型辅助性T细胞的细胞激素；以及

一T细胞生长因子。

12.如权利要求11所述的组成物，其中该第一型辅助性T细胞的细胞激素为干扰素伽玛(IFN-γ)。

13.如权利要求11所述的组成物，其中该T细胞生长因子为介白素15。

14.如权利要求11所述的组成物，其中更包括介白素12。

15.如权利要求14所述的组成物，其中该介白素12的浓度为约0.1ng/mL至小于15ng/mL。

16.如权利要求11所述的组成物，其中更包括造血细胞的培养基。

17.如权利要求11所述的组成物，其中该造血细胞的培养基为X-vivo 20。

18.一种培养如权利要求1所述的改造的自然杀手细胞的方法，包括

将不包含一或更多种选自CD14、CD19、CD25细胞表面抗原的经纯化的自然杀手细胞与一组成物接触，其中，该组成物包含(a)一第一型辅助性T细胞的细胞激素；以及(b)一T细胞生长因子。

19.如权利要求18所述的方法，其中该第一型辅助性T细胞的细胞激素为干扰素伽玛。

20.如权利要求18所述的方法，其中该T细胞生长因子为介白素15。

21.如权利要求18所述的方法，其中该组成物更包括介白素12。

22.如权利要求21所述的方法，其中该介白素12的浓度为约0.1ng/mL至小于15ng/mL。

23.如权利要求18所述的方法，其中该组成物更包括造血细胞的培养基。

24.如权利要求23所述的方法，其中该造血细胞的培养基为X-vivo 20。

25.如权利要求18所述的方法，其中该经纯化的自然杀手细胞与该组成物接触约1天至约3天。

26.如权利要求21所述的方法，其中该经纯化的自然杀手细胞与该组成物接触约1天至约3天。

27.一种培养如权利要求1所述的改造的自然杀手细胞的方法，包括

(a)将一经纯化的自然杀手细胞与包括干扰素伽玛以及介白素15的一第一组成物接触；以及

(b)将步骤(a)的该经纯化的自然杀手细胞与包括介白素15、介白素12、以及干扰素伽玛的一第二组成物接触，

其中，该经纯化的自然杀手细胞不包括一或更多种选自CD14、CD19、CD25群组的细胞表面抗原。

28.如权利要求27所述的方法，其中该介白素12的浓度为约0.1ng/mL至小于15ng/mL。

29.如权利要求27所述的方法，其中该第一组成物以及该第二组成物更包括造血细胞的培养基。

30.如权利要求29所述的方法，其中该造血细胞的培养基为X-vivo 20。

31.如权利要求27所述的方法，其中该经纯化的自然杀手细胞与该第一组成物接触约1天至约6天。

32.如权利要求27所述的方法，其中该经纯化的自然杀手细胞与该第二组成物接触约1天至约3天。