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CN106086102A - 一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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CN106086102A CN201610248615.5A CN201610248615A CN106086102A CN 106086102 A CN106086102 A CN 106086102A CN 201610248615 A CN201610248615 A CN 201610248615A CN 106086102 A CN106086102 A CN 106086102A
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Abstract

本发明公开了一种生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用。本发明所提供的工程菌的构建方法，包括A1)和A2)：A1)向受体细胞中导入L‑脯氨酸‑4‑羟化酶基因、谷氨酸‑5‑激酶基因和谷氨酸‑5‑半醛脱氢酶基因；A2)为将受体细胞的α－酮戊二酸脱氢酶基因、异柠檬酸裂解酶基因或脯氨酸脱氢酶基因敲除、或用乙酰辅酶A合成酶基因替换受体细胞的丙酮酸氧化酶基因；利用重组细胞与底物进行反应得到反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。实验证明，可以利用本发明的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的生产方法生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。

Description

一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，Hyp)是广泛存在于动物胶和骨胶原中的亚氨基酸，分子式如式1。
反式-4-羟基-L-脯氨酸可以作为胶原蛋白合成的增强剂而用于化妆品和医药产品行业。也可以作为许多组织(如皮肤、骨骼和消化道)的补充营养物而用于食品行业。此外，反式-4-羟基-L-脯氨酸带有手性分子，是合成药物时有用的手性元件。其有用的衍生品包括MK-1220、聚胺-4-L-羟脯氨酸和N-乙酰-羟脯氨酸(奥沙西罗)。MK-1220被认为是一个高活性的丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂；聚胺-4-L-羟脯氨酸被用作非降解性丙烯酸骨结合剂；N-乙酰-羟脯氨酸可以抑制炎症和减少肿胀，是有用的治疗骨关节炎等影响结缔组织疾病，奥沙西罗已经被确立为一种无毒副作用的治疗关节疾病的药物。
目前，生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的主要方法是生物提取法：利用动物蛋白如明胶、猪皮为原料，经酸、碱水解后提取反式-4-羟基-L-脯氨酸，该方法纯化步骤长，成本高，且废弃物污染严重。随着脯氨酸-4-羟化酶的开发和生物技术的发展，利用微生物生产反式-4-羟基-L-脯氨酸成为可能。
国外，Shibasaki等人于2000发表文章称已构建可以工业化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物，即在含有葡萄糖和L-脯氨酸的培养基中，用大肠杆菌过量表达L-脯氨酸-4-羟化酶来转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸。国内，刘合栋等人于2013年构建了过量表达L-脯氨酸-4-羟化酶的大肠杆菌，利用葡萄糖做底物，发酵法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。以上方法的共同缺点是耗时较长，而且L-脯氨酸做底物，成本昂贵。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何低成本生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，该方法以谷氨酸和/或可溶性谷氨酸盐为底物，葡糖糖作辅因子，利用工程菌全细胞转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，不但降低了生产成本，还缩短了生产周期。
本发明所提供的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，包括利用重组细胞与底物进行反应得到反式-4-羟基-L-脯氨酸；
所述重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行A1)、A2)、A3)和A4)的改造得到重组细胞的步骤：
A1)向所述受体细胞中导入L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)基因；
A2)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-激酶(ProB)基因；
A3)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-半醛脱氢酶(ProA)基因；
A4)为如下B1)、B2)、B3)和B4)这四种中的任一种、任两种、任三种或四种：
B1)将所述受体细胞的α－酮戊二酸脱氢酶(SucA)基因敲除，该改造以“ΔsucA”表示；
B2)将所述受体细胞的异柠檬酸裂解酶(AceA)基因敲除，该改造以“ΔaceA”表示；
B3)为如下B31)和B32)，该改造以“ΔpoxB::acs”表示：
B31)将所述受体细胞的丙酮酸氧化酶(PoxB)基因敲除；
B32)向所述受体细胞中导入乙酰辅酶A合成酶(Acs)基因；
B4)将所述受体细胞的脯氨酸脱氢酶(PutA)基因敲除，该改造以“ΔputA”表示；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
上述方法中，所述受体细胞为大肠杆菌。所述受体细胞具体可为大肠杆菌K12。
上述方法中，所述底物可为谷氨酸或/和可溶性谷氨酸盐。
上述方法中，B3)可为用所述乙酰辅酶A合成酶基因替换所述受体细胞的所述丙酮酸氧化酶基因。
上述敲除和替换均可通过同源重组实现。
上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羟化酶可为如下G1)或G2)的蛋白质：
G1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
G2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述L-脯氨酸-4-羟化酶功能的由G1)衍生的蛋白质；
所述谷氨酸-5-激酶可为下述H1)或H2)的蛋白质：
H1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
H2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-激酶功能的由H1)衍生的蛋白质；
所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶可为下述I 1)或I2)的蛋白质：
I1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；
I2)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶功能的由I1)衍生的蛋白质；
所述α－酮戊二酸脱氢酶可为下述J1)或J2)的蛋白质：
J1)氨基酸序列为SEQ ID No.7的蛋白质；
J2)在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述α－酮戊二酸脱氢酶功能的由J1)衍生的蛋白质；
所述脯氨酸脱氢酶可为下述K1)或K2)的蛋白质：
K1)氨基酸序列为SEQ ID No.8的蛋白质；
K2)在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述脯氨酸脱氢酶功能的由K1)衍生的蛋白质；
所述异柠檬酸裂解酶可为下述L1)或L2)的蛋白质：
L1)氨基酸序列为SEQ ID No.9的蛋白质；
L2)在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述异柠檬酸裂解酶功能的由L1)衍生的蛋白质；
所述丙酮酸氧化酶可为下述M1)或M2)的蛋白质：
M1)氨基酸序列为SEQ ID No.10的蛋白质；
M2)在SEQ ID No.10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述丙酮酸氧化酶功能的由M1)衍生的蛋白质；
所述乙酰辅酶A合成酶可为下述N1)或N2)的蛋白质：
N1)氨基酸序列为SEQ ID No.11的蛋白质；
N2)在SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述乙酰辅酶A合成酶功能的由N1)衍生的蛋白质。
上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因可为下述G11)-G13)中的任一种DNA分子：
G11)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；
G12)在严格条件下与G11)限定的DNA分子杂交且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA；
G13)与G11)或G12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酸-5-激酶基因可为下述H11)-H13)中的任一种DNA分子：
H11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；
H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA；
H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因可为下述I11)-I13)中的任一种DNA分子：
I11)编码序列是SEQ ID No.6所示的cDNA分子或基因组DNA；
I12)在严格条件下与I11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
I13)与I11)或I12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述乙酰辅酶A合成酶基因可为下述N11)-N13)中的任一种DNA分子：
N11)编码序列是SEQ ID No.12所示的cDNA分子或基因组DNA；
N12)在严格条件下与N11)限定的DNA分子杂交且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分子或基因组DNA；
N13)与N11)或N12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分子或基因组DNA。
上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。
上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因可通过含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒的重组表达载体导入所述受体细胞中。
本发明中所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒可含有所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因和启动所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因转录的启动子。本发明中所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.1所示的L-脯氨酸-4-羟化酶的DNA，该DNA不但可包括启动所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因转录的启动子，还可包括终止所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因转录的终止子。进一步，所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒还可包括增强子序列。
上述方法中，所述谷氨酸-5-激酶基因可通过含有谷氨酸-5-激酶基因表达盒的重组表达载体导入所述受体细胞中。
本发明中所述谷氨酸-5-激酶基因表达盒可含有所述谷氨酸-5-激酶基因和启动所述谷氨酸-5-激酶基因转录的启动子。本发明中所述谷氨酸-5-激酶基因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.3所示的谷氨酸-5-激酶的DNA，该DNA不但可包括启动所述谷氨酸-5-激酶基因转录的启动子，还可包括终止所述谷氨酸-5-激酶基因转录的终止子。进一步，所述谷氨酸-5-激酶基因表达盒还可包括增强子序列。
上述方法中，所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因可通过含有谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因表达盒的重组表达载体导入所述受体细胞中。
本发明中所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因表达盒可含有所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因和启动所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因转录的启动子。本发明中所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.5所示的谷氨酸-5-半醛脱氢酶的DNA，该DNA不但可包括启动所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因转录的启动子，还可包括终止所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因转录的终止子。进一步，所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因表达盒还可包括增强子序列。
所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒、所述谷氨酸-5-激酶基因表达盒和所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因表达盒的启动子均可为ara启动子。
在本发明中的一个实施例中，所述含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒的重组表达载体为将重组载体pYB1S的Bgl Ⅱ和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子得到的重组载体pYB1s-p4h。所述重组载体pYB1s-p4h表达SEQ ID No.1所示的L-脯氨酸-4-羟化酶。
所述重组载体pYB1S的制备方法如下：以P15ASal I_F:GTCGACGTGCGTCAGCAGAATATGTG和StrSph I_R:ACCTACCAAGGCAACGCTAT为引物，以载体pACYCDuet-1(Novagen公司)为模板扩增得到含有复制子和链霉素抗性基因的DNA片段，将该DNA片段命名为ori-aadA；利用引物araC-TrrnB_sphI_F:GCACATGCATGCAATGTGCCTGTCAAATG和araC-TrrnB_SalI_R:ATATACGCGTCGACGAAAGGCCCAGTCTTTC，从pBAD-hisB扩增得到含有pBAD启动子、酶切位点和终止子的DNA片段，将该DNA片段命名为araC-TrrnB。分别用SphI和SalI双酶切ori-aadA和araC-TrrnB，将ori-aadA双酶切得到的大片段和araC-TrrnB双酶切得到的大片段连接，得到重组载体pYB1S。重组载体pYB1S的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。
所述含有谷氨酸-5-激酶基因表达盒的重组表达载体和所述含有谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因表达盒的重组表达载体均可为将所述重组载体pYB1s-p4h的EcoR I和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.4所示的DNA分子得到的重组载体pHBA。所述重组载体pHBA表达SEQ ID No.1所示的L-脯氨酸-4-羟化酶、SEQ ID No.3所示的谷氨酸-5-激酶和SEQID No.5所示的谷氨酸-5-半醛脱氢酶。所述含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒的重组表达载体也可为所述重组载体pHBA。
其中，SEQ ID No.4的第1-6位核苷酸为RBS的序列，SEQ ID No.4的第12-1115位核苷酸为ProB基因的序列，编码SEQ ID No.3所示的ProB，SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷酸为ProA基因的序列，编码SEQ ID No.5所示的ProA。
上述方法中，所述对受体细胞进行A1)、A2)、A3)和A4)的改造可为向α－酮戊二酸脱氢酶基因缺失细胞、异柠檬酸裂解酶基因缺失细胞、脯氨酸脱氢酶缺失细胞或丙酮酸氧化酶基因缺失的含有乙酰辅酶A合成酶基因的细胞中导入所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因。
所述α－酮戊二酸脱氢酶基因缺失细胞具体可为国立遗传学研究所的ΔsucA菌株。所述异柠檬酸裂解酶基因缺失细胞具体可为国立遗传学研究所的ΔaceA菌株。所述脯氨酸脱氢酶缺失细胞具体可为国立遗传学研究所的ΔputA菌株。所述丙酮酸氧化酶基因缺失的含有乙酰辅酶A合成酶基因的细胞具体可为将大肠杆菌K12的丙酮酸氧化酶基因替换为乙酰辅酶A合成酶基因得到的重组细胞，该细胞的名称为ΔpoxB::acs突变株。
在本发明的一个实施例中，所述重组细胞为向所述ΔsucA菌株、所述ΔaceA菌株、所述ΔputA菌株和所述ΔpoxB::acs突变株中导入所述重组载体pHBA得到的重组细胞pHBA/ΔsucA、pHBA/ΔaceA、pHBA/ΔputA和pHBA/ΔpoxB::acs。
上述方法中，所述重组细胞与所述底物在体系R中进行反应；所述体系R由水、Tris、FeSO4、维生素C和W组成，所述W为α-酮戊二酸(α-KG)、葡萄糖和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)这三种中的任一种、任两种或三种。
上述方法中，所述体系R为下述体系R1-R8中任一种：
体系R1：体系R1由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.5-2g/100mL葡萄糖、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0；
体系R2：体系R2由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.5-2g/100mL葡萄糖、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0；
体系R3：体系R3由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、5-100mMα-酮戊二酸、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0；
体系R4：体系R4由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0；
体系R5：体系R5由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0；
体系R6：体系R6由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、5-100mMα-酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0；
体系R7：体系R7由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.5-2g/100mL葡萄糖、5-100mMα-酮戊二酸、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0；
体系R8：体系R8由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.5-2g/100mL葡萄糖、5-100mMα-酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0。
上述方法中，所述0.5-2g/100mL葡萄糖具体可为0.5-1.5g/100mL葡萄糖或1g/100mL葡萄糖。
所述5-100mMα-酮戊二酸具体可为25-100mMα-酮戊二酸或50mMα-酮戊二酸。
所述0.05-0.2g/100mL Triton X-100具体可为0.1g/100mL Triton X-100。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述重组细胞。
本发明所要解决的另一个技术问题是如何提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。
为解决上述技术问题，本发明提供了生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的成套试剂。
本发明所提供的生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的成套试剂，为D1)或D2)：
D1)由所述重组细胞与a)组成的成套试剂；
所述a)为α-酮戊二酸、葡萄糖和Triton X-100这三种中的任一种、任两种或三种；
D2)由用于构建所述的重组细胞的生物材料与所述a)组成的成套试剂；
所述用于构建所述重组细胞的生物材料，为C1)或C2)：
C1)用于构建所述重组细胞的成套DNA分子，含有所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因这三个基因中的至少一个基因；
C2)含有C1)所述成套DNA分子中所述三个基因、或其中任两个基因的载体。
上述成套试剂中，所述重组细胞和所述α-酮戊二酸的配比可为30mg(细胞湿重)：5×10-6-100×10-6mol。所述重组细胞和所述α-酮戊二酸的配比具体可为30mg(细胞湿重)：25×10-6-100×10-6mol或30mg(细胞湿重)：50×10-6mol。
所述重组细胞和所述葡萄糖的配比可为30mg(细胞湿重)：0.005-0.02g。所述重组细胞和所述葡萄糖的配比具体可为30mg(细胞湿重)：0.005-0.015g或30mg/mL细胞(细胞湿重/体积)：0.01g。
所述重组细胞和所述Triton X-100的配比可为30mg(细胞湿重)：0.0005-0.002g。所述重组细胞和所述Triton X-100的配比具体可为30mg(细胞湿重)：0.001g。
在本发明的一个实施例中，C2)所述载体为所述重组载体pHBA。
上述成套试剂中，C1)所述成套DNA分子由所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因、所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因和所述乙酰辅酶A合成酶基因组成，这四个基因各自独立包装；
C2)所述载体为含有C1)所述成套DNA分子中所述四个基因、或其中任三个基因、或其中任两个基因的载体。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
M1、所述重组细胞在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M2、所述重组细胞在生物转化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M3、所述成套试剂在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M4、所述成套试剂在生物转化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述α－酮戊二酸脱氢酶基因和/或所述异柠檬酸裂解酶基因和/或所述丙酮酸氧化酶基因和/或所述脯氨酸脱氢酶基因的敲除在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。
上文中，所述可溶性谷氨酸盐可为谷氨酸钠。
实验证明，本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法——向将大肠杆菌K12的sucA基因、aceA基因、putA基因敲除或将大肠杆菌K12的poxB基因敲除并导入acs基因得到的重组细胞中导入p4H基因、proB基因和proA基因，可以提高细胞转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量：大肠杆菌K12菌体反应液中无反式-4-羟基-L-脯氨酸，pHBA/BW菌体(将P4H基因、ProB基因和ProA基因的pHBA导入大肠杆菌K12得到的工程菌)反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为10.66±0.06mM，pHBA/ΔputA菌体(向将大肠杆菌K12putA基因缺失得到的ΔputA菌株中导入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为18.13±0.21mM，pHBA/ΔsucA菌体(向将大肠杆菌K12sucA基因缺失得到的ΔsucA菌株中导入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为20.94±0.57mM，pHBA/ΔaceA(向将大肠杆菌K12aceA基因缺失得到的ΔaceA菌株中导入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为14.74±0.61mM，pHBA/ΔpoxB::acs菌体(向将大肠杆菌K12poxB基因敲除并导入acs基因得到的突变株ΔpoxB::acs中导入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为13.67±0.45mM。pHBA/ΔputA、pHBA/ΔsucA、pHBA/ΔaceA和pHBA/ΔpoxB::acs转化谷氨酸钠产生的反式-4-羟基-L-脯氨酸分别为pHBA/BW的1.70倍、1.96倍、1.38倍和1.28倍。
实验证明，α-KG可以提高细胞转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量：当转化液中α-KG浓度为0mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为5.94±0.14mM；当转化液中α-KG浓度为5mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为9.10±0.06mM，为0mMα-KG转化液的1.53倍；当转化液中α-KG浓度为25mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为12.91±0.34mM，为0mMα-KG转化液的2.17倍；当转化液中α-KG浓度为50mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为18.51±0.87mM，为0mMα-KG转化液的3.12倍；当转化液中α-KG浓度为100mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为15.18±0.32mM，为0mMα-KG转化液的2.56倍。
实验证明，葡萄糖可以提高细胞转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量：当转化液为中无葡萄糖时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为5.94±0.14mM；当转化液中葡萄糖浓度为0.5g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.5±0.47mM，为无葡萄糖的2.27倍；当转化液中葡萄糖浓度为1.0g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为15.22±0.30mM，为无葡萄糖的2.56倍；当转化液中葡萄糖浓度为1.5g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.67±0.35mM，为无葡萄糖的2.30倍；当转化液中葡萄糖浓度为2.0g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为10.66±0.06mM，为无葡萄糖的1.79倍。
实验证明，Triton X-100可以提高细胞转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量：当转化液中无Triton X-100时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.67±0.35mM；当转化液中Triton X-100的浓度为为0.1g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为28.74±0.13mM，为无Triton X-100转化液的2.10倍。
实验证明，可以利用本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，并可以通过添加α-KG、葡萄糖和/或Triton X-100提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。
附图说明
图1为重组质粒pHBA的示意图。
图2为工程菌的蛋白表达SDS-PAGE图。其中，泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为pYB1S/BW；泳道2为pYB1S-p4h/BW；泳道3为pHBA/BW。
图3为基因改造过的工程菌株蛋白表达SDS-PAGE图。其中，泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为pHBA/BW；泳道2为pHBA/ΔsucA；泳道3为pHBA/ΔaceA；泳道4为pHBA/ΔpoxB::acs；泳道5为pHBA/ΔputA。
图4为Hyp标准曲线。
图5为不同工程菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量。其中，pYB1s/BW表示pYB1S/BW。
图6为α-酮戊二酸(α-KG)对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。
图7为葡萄糖对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。
图8为在最优条件下利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌K12(Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner,andHirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.)公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的ΔputA菌株(JW0999)(国立遗传学研究所(NIG，Japan)产品)(Baba,Tomoya,et al."Construction of Escherichia coli K‐12 in‐frame,single‐geneknockout mutants:the Keio collection."Molecular systems biology 2.1(2006).)是大肠杆菌K12的putA基因缺失菌株，putA基因编码序列表中SEQ ID No.8所示的脯氨酸脱氢酶。
下述实施例中的ΔsucA菌株(为国立遗传学研究所(NIG，Japan)产品，NIG编号为JW0715)(Baba et al.,2006)是将大肠杆菌K12的α－酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1300bp)从而将大肠杆菌K12的sucA敲除(缺失)的大肠杆菌K12突变体，其基因型为ΔsucA::Kan。sucA编码SEQ ID No.7所示的蛋白质，sucA的编码序列如SEQ ID No.13所示。引物对sucA_up550F(AACCTCTTGTCCGTCTTTCTG)和sucA_down353R(CGCATCGTTGTTTTGCTC)从ΔsucA菌株的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约3705bp的片段。其中，sucA_up550F和sucA_down353R引物结合位置分别是大肠杆菌K12的sucA基因的上游550bp和下游350bp附近区域。测序分析结果表明ΔsucA菌株的基因组上没有sucA。
下述实施例中的ΔaceA菌株(为国立遗传学研究所(NIG，Japan)产品，NIG编号为JW3975)(Baba et al.,2006)是将大肠杆菌K12的异柠檬酸裂合酶基因(aceA)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将大肠杆菌K12的异柠檬酸裂合酶基因(aceA)敲除(缺失)的大肠杆菌K12突变体，其基因型为ΔaceA::Kan。异柠檬酸裂合酶基因(aceA)位于大肠杆菌K12基因组4217109..4218413的位置，其编码序列为SEQ ID No.14，编码SEQ ID No.9所示的异柠檬酸裂合酶。用引物对aceA_up380_F：GTGAACGCACCGAAGAAGG和aceA_d700_R：GTCAGATGGCGAATAATGTAATGGA从ΔaceA菌株的基因组DNA中扩增得到一个约2500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2429bp的片段。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的aceA基因的上游和下游区域。测序分析结果表明ΔaceA菌株的基因组上没有aceA。
下述实施例中的5052自诱导培养基为无菌培养基，其配制方法如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E；
A为ZY溶液，ZY溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)胰蛋白胨和0.5％(质量百分比浓度)酵母粉；
B为50×M溶液，50×M溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C为50×5052溶液，50×5052溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：25％(质量百分比浓度)甘油，2.5％(质量百分比浓度)葡萄糖，10％(质量百分比浓度)L-阿拉伯糖；
D为1M MgSO4水溶液；
E为1000×微量元素溶液，1000×微量元素溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，2mM CoCl2，2mM NiCl2，2mM Na2Mo4，2mM Na2SeO3，2mM H3BO3。
实施例1、重组细胞的制备
1、重组载体pHBA的构建
构建表达L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)、谷氨酸-5-激酶(ProB)和谷氨酸-5-半醛脱氢酶(ProA)的重组载体，P4H的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，P4H由SEQ ID No.2所示的P4H基因编码，ProB的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，ProA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，ProB由SEQ ID No.4的第12-1115位核苷酸所示的ProB基因编码，ProA由SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷酸所示的ProA基因编码。具体方法如下：
制备名称为pYB1S的载体：以P15ASal I_F:GTCGACGTGCGTCAGCAGAATATGTG和StrSphI_R:ACCTACCAAGGCAACGCTAT为引物，以载体pACYCDuet-1(Novagen公司)为模板扩增得到含有复制子和链霉素抗性基因的DNA片段，将该DNA片段命名为ori-aadA；利用引物araC-TrrnB_sphI_F:GCACATGCATGCAATGTGCCTGTCAAATG和araC-TrrnB_SalI_R:ATATACGCGTCGACGAAAGGCCCAGTCTTTC，从pBAD-hisB(invitrogen公司,货号：V430-01)扩增得到含有pBAD启动子、酶切位点和终止子的DNA片段，将该DNA片段命名为araC-TrrnB。分别用SphI和SalI双酶切ori-aadA和araC-TrrnB，将ori-aadA双酶切得到的大片段和araC-TrrnB双酶切得到的大片段连接，得到重组载体pYB1S。pYB1S的核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示。SEQ ID No.15中，第1667-3450位为复制子和链霉素抗性基因，第86-1660位为pBAD启动子、多克隆位点和终止子。
将重组载体pYB1S的BglⅡ和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子(即P4H基因)，得到重组载体pYB1s-p4h。重组载体pYB1s-p4h表达SEQ IDNo.1所示的P4H。pYB1s-p4h和pYB1S的差别仅在于：pYB1s-p4h为将pYB1s的Bgl Ⅱ和EcoRI识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子得到的重组载体。
将重组载体pYB1s-p4h的EcoR I和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ IDNo.4所示的DNA分子，得到重组载体pHBA(图1)。pHBA和pYB1s-p4h的差别仅在于：pHBA为将pYB1s-p4h的EcoR I和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.4所示的DNA分子得到的重组载体。重组载体pHBA表达SEQ ID No.1所示的P4H、SEQ ID No.3所示的ProB和SEQ ID No.5所示的ProA。
其中，SEQ ID No.4的第2-6位核苷酸为RBS的序列，SEQ ID No.4的第12-1115位核苷酸为ProB基因的序列，编码SEQ ID No.3所示的ProB，SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷酸为ProA基因的序列，编码SEQ ID No.5所示的ProA。
2、重组细胞的构建
2.1突变株ΔpoxB::acs的构建
首先构建大肠杆菌K12的突变株ΔpoxB::acs，ΔpoxB::acs突变株为将大肠杆菌K12的丙酮酸氧化酶(PoxB)编码基因替换为乙酰辅酶A合成酶(Acs)编码基因的菌株。ΔpoxB::acs突变株的构建如下：
(1)宿主菌的制备：
将pKD46质粒(Clontech公司产品)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌K12，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌K12/pKD46。重组大肠杆菌K12/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。
(2)poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段的制备：
poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6，由3970个核苷酸组成，含有(a)大肠杆菌FumA启动子(SEQ ID No.6第62-195位)、(b)大肠杆菌乙酰CoA合成酶基因(acs)(SEQ ID No.6第216至2177位(由1962个核苷酸组成))、(c)TrrnB终止子(SEQ ID No.6第2184-2440位)、(d)带FRT侧翼的卡那霉素抗性基因(FRT-kan-FRT)(卡那霉素抗性基因如SEQ ID No.6第2858-3652位，FRT序列为：gaagttcctatactttctagagaataggaacttcg，FRT-kan-FRT的核苷酸序列如SEQ ID No.6第2450－3877位)、(e)poxB的上游同源臂poxBup(SEQ ID No.6第1-61位)、(f)poxB的下游同源臂poxBdown(SEQ ID No.6第3907-3970位)。
(3)同源重组：
将SEQ ID No.6所示的poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段电转入重组大肠杆菌K12/pKD46的感受态细胞，利用卡那霉素平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)筛选到阳性转化体—将poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown转入重组大肠杆菌K12/pKD46得到的重组大肠杆菌，命名为ΔpoxB::acs突变株。用poxB_up_480_F(TGGGTAGAGCAGGAAGTGAAA)和poxB_down_410_r(TGCGGGCGAAATGGA)进行PCR验证，从ΔpoxB::acs突变株的基因组DNA中扩增得到一个约4500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2600bp的片段。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的poxB基因的上游和下游区域。测序分析结果表明ΔpoxB::acs突变株的基因组上没有丙酮酸氧化酶基因(poxB)，ΔpoxB::acs突变株的基因组上含有SEQ ID No.6所示的FumA-acs-kan片段。
2.2突变株ΔsucA ΔputA的构建
具体采用如下P1噬菌体介导的转染法构建：
(1)将ΔsucA的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除ΔsucA的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体ΔsucA△kan(简称ΔsucA△kan)。具体如下：首先，利用表达Flp重组酶的质粒pCP20(Clontech公司)化学转化ΔsucA，将ΔsucA的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除ΔsucA的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体ΔsucA△kan(简称ΔsucA△kan)。以ΔsucA△kan的基因组DNA为模板，用引物对sucA_up550F(AACCTCTTGTCCGTCTTTCTG)和sucA_down353R(CGCATCGTTGTTTTGCTC)进行PCR验证，扩增得到一个约1000bp的片段，结果表明卡那霉素抗性已经消除。ΔsucA△kan在涂有卡那霉素的LB平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上不生长，表明已经消除ΔsucA的卡那抗性。
(2)将ΔsucA△kan的脯氨酸脱氢酶(PutA)替换为卡那霉素抗性基因得到的突变体ΔsucAΔputA。具体如下：(a)获得供体菌的P1：将供体菌ΔputA接种于含10mmol/L MgCl2、5mmol/L CaCl2和0.1％葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1-3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1vir△putA。(b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株PG03,具体步骤如下：过夜培养ΔsucA△kan(受体菌)，1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mM CaCl2和5mM MgSO4)重悬ΔsucA△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△putA与100μLΔsucA△kan细胞悬浮液混合，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μLLB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上，筛选阳性克隆(能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆)即PG03，以阳性克隆ΔsucAΔputA的基因组DNA为模板,用putA_up604_f(AACAGCCAGCCGCTCAT)和putA_down243_r(GCCGGTTGGGTCAAAAG)进行PCR验证，从ΔsucAΔputA的基因组DNA中扩增得到一个约1000bp的片段。测序结果表明ΔsucAΔputA是将ΔsucA△kan的脯氨酸脱氢酶(PutA)替换为卡那霉素抗性基因得到的突变体。
2.2重组细胞的构建
将步骤1的重组载体pHBA分别导入大肠杆菌K12及ΔputA菌株、ΔsucA菌株、ΔaceA菌株、ΔpoxB::acs和ΔsucAΔputA突变株中，分别得到含有重组载体pHBA的工程菌株(重组细胞)pHBA/BW、pHBA/ΔputA、pHBA/ΔsucA、pHBA/ΔaceA和pHBA/ΔpoxB::acs，pHBA/ΔsucAΔputA。
将步骤1中的重组载体pYB1S和pYB1s-p4h分别导入大肠杆菌K12中，得到含有目的载体的重组细胞pYB1S/BW和pYB1s-p4h/BW。
分别将pYB1S/BW、pYB1s-p4h/BW、pHBA/BW、pHBA/ΔputA、pHBA/ΔsucA、pHBA/ΔaceA和pHBA/ΔpoxB::acs于5052自诱导培养基中、在30℃下进行培养，并用SDS-PAGE电泳分析各重组细胞中蛋白的表达，结果如图2和图3所示。结果显示，pYB1S/BW不表达P4H、ProB和ProA；pYB1s-p4h/BW表达P4H，不表达ProB和ProA；pHBA/BW、pHBA/ΔputA、pHBA/ΔsucA、pHBA/ΔaceA和pHBA/ΔpoxB::acs均表达P4H、ProB和ProA。
实施例2、利用实施例1的重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸
利用实施例1的重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
从平板上挑取pHBA/BW的单菌落于LB培养基中，于37℃、220rpm下培养10h，得到pHBA/BW菌液；按照1％接种量将pHBA/BW菌液接种于5052自诱导培养基中，于30℃、220rpm下培养16h，得到pHBA/BW培养液；将pHBA/BW培养液于4℃、4200rpm下离心10min，弃上清液，得到pHBA/BW粗菌体。用氯化钠质量百分浓度为0.85％的氯化钠水溶液洗涤pHBA/BW粗菌体2次，每次均在4℃、4200rpm下离心10min，收集菌体，得到pHBA/BW菌体。
将pHBA/BW菌体重悬于1mL转化液(转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为100mM Tris、50mM谷氨酸钠(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A602012)、1.5g/100mL葡萄糖、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)中，得到反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系，反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系pHBA/BW的浓度为30OD/mL(30mg/mL细胞(细胞湿重/体积))；将反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系于30℃、250rpm下孵育12h，得到pHBA/BW菌体反应液，用氯胺T法测定pHBA/BW菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。
按照如下氯胺T法制备标准曲线、测定反式-4-羟基-L-脯氨酸含量，用到的标准品为反式-4-羟基-L-脯氨酸(阿拉丁公司，产品编号H111005)：
(1)将样品按照一定比例稀释后，取100μl于2mL离心管中，向离心管中加入200μl异丙醇和100μl氧化剂溶液(氧化剂溶液为将7％(质量百分比浓度)氯胺T水溶液与醋酸-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)按照1:4的体积比混合得到的溶液，其中，醋酸-柠檬酸缓冲液(pH6.0)由水与溶质组成，溶质及其浓度分别为34.4g/L无水醋酸钠、37.5g/L二水合柠檬酸钠、5.5g/L一水合柠檬酸和385mL/L异丙醇)。
(2)摇匀，室温放置4分钟；向离心管中加入200μl新配制的艾氏试剂(艾氏试剂由对二甲氨基苯甲醛、高氯酸与异丙醇组成，艾氏试剂中各物质的比例关系为：二甲氨基苯甲醛：高氯酸：异丙醇＝1mg：4mL：6mL)，摇匀，置于60℃水浴中20分钟，自来水冷却至室温；于560nm处检测吸光值。
Hyp标准曲线的结果如表1，标准曲线为y＝10.6x+0.0845，R2＝0.9988(图4)。
表1、Hyp标准曲线
Hyp浓度(mM) OD560
0.01 0.159
0.05 0.632
0.1 1.178
0.2 2.185
按照上述方法，将pHBA/BW分别替换为大肠杆菌K12、pYB1S/BW、pYB1s-p4h/BW、pHBA/ΔputA、pHBA/ΔsucA、pHBA/ΔaceA和pHBA/ΔpoxB::acs，其他步骤均不变，分别检测大肠杆菌K12菌体反应液、pYB1S/BW菌体反应液、pYB1s-p4h/BW菌体反应液、pHBA/ΔputA菌体反应液、pHBA/ΔsucA菌体反应液、pHBA/ΔaceA菌体反应液和pHBA/ΔpoxB::acs菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。
结果(图5)显示，大肠杆菌K12菌体反应液中无反式-4-羟基-L-脯氨酸，pHBA/BW菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为10.66±0.06mM，pYB1S/BW菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为0.06±0.02mM，pYB1s-p4h/BW菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为0.79±0.07mM，pHBA/ΔputA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为18.13±0.21mM，pHBA/ΔsucA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为20.94±0.57mM，pHBA/ΔaceA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为14.74±0.61mM，pHBA/ΔpoxB::acs菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为13.67±0.45mM。表明，pYB1S/BW转化谷氨酸钠几乎不产生反式-4-羟基-L-脯氨酸，pYB1s-p4h/BW转化谷氨酸钠可产生极少量的反式-4-羟基-L-脯氨酸，pHBA/BW转化谷氨酸钠产生的反式-4-羟基-L-脯氨酸分别为pYB1s/BW和pYB1s-p4h/BW的178倍和13.43倍，表明，P4H、ProB和ProA可以大幅度提高大肠杆菌K12转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量；pHBA/ΔputA、pHBA/ΔsucA、pHBA/ΔaceA和pHBA/ΔpoxB::acs转化谷氨酸钠产生的反式-4-羟基-L-脯氨酸分别为pHBA/BW的1.70倍、1.96倍、1.38倍和1.28倍，表明，sucA基因、aceA基因和putA基因的缺失可以提高大肠杆菌K12转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量，poxB基因的缺失与acs基因的导入也可以提高大肠杆菌K12转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。
实施例3、利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸条件的优化
1、α-酮戊二酸(α-KG)对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响
根据实施例2的利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，将pHBA/BW替换为pHBA/ΔputA，并将转化液分别替换为0mMα-KG转化液(0mMα-KG转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、5mMα-KG转化液(5mMα-KG转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为5mMα-KG、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、25mMα-KG转化液(25mMα-KG转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为25mMα-KG、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、50mMα-KG转化液(50mMα-KG转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为50mMα-KG、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、100mMα-KG转化液(100mMα-KG转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为100mMα-KG、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)，其他步骤均不变，分别检测不同浓度的α-KG对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响，结果如图6所示。
结果显示，当转化液为0mMα-KG转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为5.94±0.14mM；当转化液为5mMα-KG转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为9.10±0.06mM，为0mMα-KG转化液的1.53倍；当转化液为25mMα-KG转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为12.91±0.34mM，为0mMα-KG转化液的2.17倍；当转化液为50mMα-KG转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为18.51±0.87mM，为0mMα-KG转化液的3.12倍；当转化液为100mMα-KG转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为15.18±0.32mM，为0mMα-KG转化液的2.56倍。结果表明，当向转化液中加入α-KG时，可以提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量，当转化液中α-KG的浓度为50mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量最高。
2、葡萄糖对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响
根据实施例2的利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，将pHBA/BW替换为pHBA/ΔputA，并将转化液分别替换为0葡萄糖转化液(0葡萄糖转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、0.5g/100mL葡萄糖转化液(0.5g/100mL葡萄糖转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为0.5g/100mL葡萄糖、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、1.0g/100mL葡萄糖转化液(1.0g/100mL葡萄糖转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为1.0g/100mL葡萄糖、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、1.5g/100mL葡萄糖转化液(1.5g/100mL葡萄糖转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为1.5g/100mL葡萄糖、100mMTris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、2.0g/100mL葡萄糖转化液(2.0g/100mL葡萄糖转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为2.0g/100mL葡萄糖、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)，其他步骤均不变，分别检测不同浓度的葡萄糖对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响，结果如图7所示。
结果显示，当转化液为0葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为5.94±0.14mM；当转化液为0.5g/100mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.5±0.47mM，为0葡萄糖转化液的2.27倍；当转化液为1.0g/100mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为15.22±0.3mM，为0葡萄糖转化液的2.56倍；当转化液为1.5g/100mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.67±0.35mM，为0葡萄糖转化液的2.30倍；当转化液为2.0g/100mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为10.66±0.06mM，为0葡萄糖转化液的1.79倍。结果表明，当向转化液中加入葡萄糖时，可以提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量，当转化液中葡萄糖的浓度为1.0g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量最高。
3、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响
根据实施例2的利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，将pHBA/BW替换为pHBA/ΔputA，并将转化液分别替换为0Triton X-100转化液(0Triton X-100转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为1.5g/100mL葡萄糖、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)、0.1g/100mL Triton X-100转化液(0.1g/100mL Triton X-100转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为0.1g/100mLTriton X-100、1.5g/100mL葡萄糖、100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)，其他步骤均不变，分别检测不同浓度的Triton X-100对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。
结果显示，当转化液为0Triton X-100转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.67±0.35mM；当转化液为0.1g/100mL Triton X-100转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为28.74±0.13mM，为0Triton X-100转化液的2.10倍。结果表明，当向转化液中加入Triton X-100时，可以提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量，当转化液中Triton X-100的质量百分比浓度为0.1g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量最高。
4、优化后的反应液的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量
从平板上挑取pHBA/ΔputA的单菌落于LB培养基中，于37℃、220rpm下培养10h，得到pHBA/ΔputA菌液；按照1％接种量将pHBA/ΔputA菌液接种于5052自诱导培养基中，于30℃、220rpm下培养16h，得到pHBA/ΔputA培养液；将pHBA/ΔputA培养液冰浴10min后于4℃、4200rpm下离心10min，弃上清液，得到pHBA/ΔputA粗菌体。用氯化钠质量百分浓度为0.85％的氯化钠水溶液洗涤pHBA/ΔputA粗菌体2次，每次均在4℃、4200rpm下离心10min，收集菌体，得到pHBA/ΔputA菌体。
将pHBA/ΔputA菌体重悬于1mL转化液1(转化液1由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为100mM Tris、50mM谷氨酸钠、1.5g/100mL葡萄糖、0.1g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，用盐酸调节pH至pH7.0)中，得到反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系，反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系中pHBA/ΔputA的浓度为30OD/mL(即30mg/mL细胞(细胞湿重/体积))；将反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系于30℃、250rpm下孵育12h，得到pHBA/ΔputA菌体反应液1，用氯胺T法测定pHBA/ΔputA菌体反应液1中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。
结果显示，pHBA/ΔputA菌体反应液1中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为28.7mM，为转化液为1.0g/100mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量的1.89倍，为转化液为0.1g/100mL Triton X-100转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量的1.025倍。
实施例4、在最优条件下利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸
根据实施例2的利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，将pHBA/BW分别替换为pHBA/ΔsucA、pHBA/ΔputA和pHBA/ΔsucAΔputA。转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为100mM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4、8mM维生素C、1.0g/100mL葡萄糖和0.1g/100mL Triton X-100，用盐酸调节pH至pH7.0。其他步骤均不变，分别检测反式-4-羟基-L-脯氨酸产量(图8)。
结果显示，最优转化液条件下，pHBA/BW菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为16.74±0.37mM，pHBA/ΔsucA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为22.35±0.99mM，为pHBA/BW菌体反应液产量的1.34倍。pHBA/ΔputA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为39.80±0.53mM，为pHBA/BW菌体反应液产量的2.38倍。pHBA/ΔsucAΔputA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为17.79±0.47mM，为pHBA/BW菌体反应液产量的1.06倍。

Claims (11)

1.反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，包括利用重组细胞与底物进行反应得到反式-4-羟基-L-脯氨酸；
所述重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行A1)、A2)、A3)和A4)的改造得到重组细胞的步骤：
A1)向所述受体细胞中导入L-脯氨酸-4-羟化酶基因；
A2)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-激酶基因；
A3)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因；
A4)为如下B1)、B2)、B3)和B4)这四种中的任一种、任两种、任三种或四种：
B1)将所述受体细胞的α－酮戊二酸脱氢酶基因敲除；
B2)将所述受体细胞的异柠檬酸裂解酶基因敲除；
B3)为如下B31)和B32)：
B31)将所述受体细胞的丙酮酸氧化酶基因敲除；
B32)向所述受体细胞中导入乙酰辅酶A合成酶基因；
B4)将所述受体细胞的脯氨酸脱氢酶基因敲除；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体细胞为大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述底物为谷氨酸或/和可溶性谷氨酸盐。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述L-脯氨酸-4-羟化酶是如下G1)或G2)的蛋白质：
G1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
G2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述L-脯氨酸-4-羟化酶功能的由G1)衍生的蛋白质；
所述谷氨酸-5-激酶是下述H1)或H2)的蛋白质：
H1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
H2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-激酶功能的由H1)衍生的蛋白质；
所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶是下述I 1)或I2)的蛋白质：
I1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；
I2)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶功能的由I 1)衍生的蛋白质；
所述α－酮戊二酸脱氢酶是下述J1)或J2)的蛋白质：
J1)氨基酸序列为SEQ ID No.7的蛋白质；
J2)在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述α－酮戊二酸脱氢酶功能的由J1)衍生的蛋白质；
所述脯氨酸脱氢酶是下述K1)或K2)的蛋白质：
K1)氨基酸序列为SEQ ID No.8的蛋白质；
K2)在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述脯氨酸脱氢酶功能的由K1)衍生的蛋白质；
所述异柠檬酸裂解酶是下述L1)或L2)的蛋白质：
L1)氨基酸序列为SEQ ID No.9的蛋白质；
L2)在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述异柠檬酸裂解酶功能的由L1)衍生的蛋白质；
所述丙酮酸氧化酶是下述M1)或M2)的蛋白质：
M1)氨基酸序列为SEQ ID No.10的蛋白质；
M2)在SEQ ID No.10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述丙酮酸氧化酶功能的由M1)衍生的蛋白质；
所述乙酰辅酶A合成酶是下述N1)或N2)的蛋白质：
N1)氨基酸序列为SEQ ID No.11的蛋白质；
N2)在SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述乙酰辅酶A合成酶功能的由N1)衍生的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因为下述G11)-G13)中的任一种DNA分子：
G11)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；
G12)在严格条件下与G11)限定的DNA分子杂交且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA；
G13)与G11)或G12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酸-5-激酶基因为下述H11)-H13)中的任一种DNA分子：
H11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；
H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA；
H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因为下述I 11)-I 13)中的任一种DNA分子：
I11)编码序列是SEQ ID No.6所示的cDNA分子或基因组DNA；
I12)在严格条件下与I 11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
I13)与I11)或I12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述乙酰辅酶A合成酶基因为下述N11)-N13)中的任一种DNA分子：
N11)编码序列是SEQ ID No.12所示的cDNA分子或基因组DNA；
N12)在严格条件下与N11)限定的DNA分子杂交且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分子或基因组DNA；
N13)与N11)或N12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分子或基因组DNA。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述重组细胞与所述底物在体系R中进行反应；所述体系R由水、Tris、FeSO4、维生素C和W组成，所述W为α-酮戊二酸、葡萄糖和Triton X-100这三种中的任一种、任两种或三种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述体系R为下述体系R1-R8中任一种：
体系R1：体系R1由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.5-2g/100mL葡萄糖、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0；
体系R2：体系R2由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.5-2g/100mL葡萄糖、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0；
体系R3：体系R3由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、5-100mMα-酮戊二酸、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0；
体系R4：体系R4由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0；
体系R5：体系R5由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0；
体系R6：体系R6由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、5-100mMα-酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0；
体系R7：体系R7由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.5-2g/100mL葡萄糖、5-100mMα-酮戊二酸、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0；
体系R8：体系R8由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为100mM Tris、0.5-2g/100mL葡萄糖、5-100mMα-酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeSO4和8mM维生素C，pH7.0。
8.权利要求1-5中任一所述重组细胞。
9.生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的成套试剂，为D1)或D2)：
D1)由权利要求8所述重组细胞与a)组成的成套试剂；
所述a)为α-酮戊二酸、葡萄糖和Triton X-100这三种中的任一种、任两种或三种；
D2)由用于构建权利要求8所述的重组细胞的生物材料与所述a)组成的成套试剂；
所述用于构建权利要求8所述的重组细胞的生物材料，为C1)或C2)：
C1)用于构建权利要求8所述的重组细胞的成套DNA分子，含有权利要求1-5中任一所述方法中的所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因这三个基因中的至少一个基因；
C2)含有C1)所述成套DNA分子中所述三个基因、或其中任两个基因的载体。
10.根据权利要求9所述的成套试剂，其特征在于：C1)所述成套DNA分子由权利要求1-5中任一所述方法中的所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因、所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因和所述乙酰辅酶A合成酶基因组成，这四个基因各自独立包装；
C2)所述载体为含有C1)所述成套DNA分子中所述四个基因、或其中任三个基因、或其中任两个基因的载体。
11.下述任一应用：
M1、权利要求8所述重组细胞在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M2、权利要求8所述重组细胞在生物转化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M3、权利要求9或10所述成套试剂在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M4、权利要求9或10所述成套试剂在生物转化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
M5、权利要求1或4所述α－酮戊二酸脱氢酶基因和/或所述异柠檬酸裂解酶基因和/或所述丙酮酸氧化酶基因和/或所述脯氨酸脱氢酶基因的敲除在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。
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