CN105954239B - 一种血小板聚集功能的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血小板聚集功能的检测方法，依次包括取样、血小板血浆的提取、乏血小板血浆的提取、富血小板血浆的提取和测定等步骤。与传统方法相比，本发明的检测方法获得的富血小板血浆的总量大，其中的血小板浓度不发生变化，完全可以满足多次重复测定的要求，且检测的结果准确可信。

Description

一种血小板聚集功能的检测方法

技术领域

本发明涉及血液制品的检测领域，特别是涉及一种检测血小板聚集功能的方法。

背景技术

血小板(blood platelet，简称为PLT)是哺乳动物血液中的有形成分之一，是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。血小板体积小，无细胞核，即没有染色体，呈双面微凸的圆盘状，直径为2-3微米，在血液中的浓度为(100-300)×10⁹个/L。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量(如人的血小板数为每立方毫米10-30万)，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。

血小板聚集是血小板参与生理止血的重要环节，在许多病理性血栓形成过程中血小板聚集发挥着先导而关键的作用。因此，血小板聚集功能的检测对临床出血与血栓性疾病的诊断及疗效监测有指导意义，已广泛应用于抗血小板聚集药物的治疗监测中。

目前光学比浊法(以下简称传统方法)因其操作简便、快速，易于掌握且经济实用，作为“金标准”试验用于临床血小板聚集功能的检测中。该方法的操作参见《全国临床检验操作规程》(第三版)，具体为：采集静脉血，先经1000r/min离心10min后，在上层血浆层中吸取300μL，作为富血小板血浆(简称PRP)，剩余血液样品再经3000r/min离心20min后,在上层血浆层中吸取300μL，作为乏血小板血浆(简称PPP)；然后将PPP作为透光度100％的对照，以PRP的初始透光度为0％，加入诱导剂ADP,用血小板聚集仪测定PRP的透光度，从而得到血小板聚集率，绘制成血小板聚集曲线，并计算得到最大聚集率(PAgT)。该过程中的300μL是最后测定时血小板聚集仪所要求的样品体积量。

然而可以看出传统方法是先从血液样品中离心提取出300μL富血小板血浆，再从剩下的大量血液样品中离心提取300μL乏血小板血浆。如果需要重复测定，就要将离心过两次的剩余血液样品重新混匀，重复以上两次离心，再分别得到PRP和PPP。但是由于前一次测定时已经取走300μL富血小板血浆和300μL乏血小板血浆，剩余血液样品再次离心获得的PRP中血小板浓度与前一次测定时偏差很大，而且反复离心会严重破坏血小板的聚集功能，因此重复测定结果不可能准确。并且这种方法中影响结果的因素众多，即使在同一实验室因实际操作不同，结果也会不同，稳定性较差，可比性不强。基于以上缺点传统方法在临床上的广泛应用受到极大的限制；且因结果不稳定，所得的数据不被所有临床医生认可，只用作参考。为此研究出一种新的能够准确检测血小板聚集功能的方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种能为临床提供准确血小板聚集功能结果的检测方法，使该检测方法能够将血小板聚集功能的检测流程标准化，从而得到准确的结果。该血小板聚集功能的检测方法，依次包括取样、血小板血浆的提取、乏血小板血浆的提取、富血小板血浆的提取和测定等步骤。

所述血小板血浆的提取为将血液在200-250g下离心5-10min，取上层，即是血小板血浆。

所述乏血小板血浆的提取和富血小板血浆的提取同时完成。

所述乏血小板血浆的提取和富血小板血浆的提取为将血小板血浆在1200-2500g下离心5-10min，上层为乏血小板血浆，其余为富血小板血浆。

具体包括以下步骤：

(1)、取样：

对来自受试对象的静脉血作抗凝处理；

(2)、血小板血浆的提取：

将步骤(1)的静脉血在200-250g下离心5-10min，取上层血浆，即是血小板血浆；

(3)、乏血小板血浆(PPP)和富血小板血浆(PRP)的提取：

将步骤(2)得到的血小板血浆以1200-2500g离心5-10min，取上层血浆，即是乏血小板血浆(PPP)；剩余血小板血浆混匀后，即是富血小板血浆；

(4)、测定：

以乏血小板血浆的透光度为100％,以富血小板血浆的初始透光度为0％,加入诱导剂,测定富血小板血浆的透光度，绘制成血小板聚集曲线，并计算得到最大聚集率(PAgT)。

步骤(2)中的离心条件为250g下离心5min。

步骤(3)中的离心条件为1200-1500g下离心10min或2000-2500g下离心5min；优选1200g下离心10min。

所述诱导剂可以是二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸、胶原、肾上腺素或瑞斯托霉素等。

第二方面，本发明提供一种血小板聚集功能检测中血小板血浆的提取方法，将血液在200-250g下离心5-10min，取上层血浆，即得到血小板血浆；优选250g下离心5min。

第三方面，本发明提供一种血小板聚集功能检测中乏血小板血浆和富血小板血浆的提取方法，包括以下步骤：

(ⅰ)、将血液在200-250g下离心5-10min，取上层血浆，得到血小板血浆；优选250g下离心5min；

(ⅱ)、将所述血小板血浆以1200-2500g离心5-10min，取上层血浆，即得到乏血小板血浆(PPP)；剩余血小板血浆混匀后，即得到富血小板血浆；优选1200-1500g下离心10min或2000-2500g下离心5min；更优选1200g下离心10min。

与传统方法相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的检测方法在第一次离心后一次性吸取含有血小板的全部血浆,弃去血细胞，第二次离心后根据血小板富集在底部的原理，取300μL上层血浆作为乏血小板血浆，剩下大量的血浆作为富血小板血浆；由于本发明检测方法中以乏血小板血浆作为对照样品，可以重复使用；富血小板血浆作为测定样品，虽然只能使用一次，但富血小板血浆的总量大，且血小板浓度与测定过的PRP完全一致，完全可以满足多次重复测定的要求，且检测的结果与传统方法相比，会更加准确。

2、本发明的检测方法可以实现检测流程的标准化：

1)传统方法是先吸取富血小板血浆，然后最少要经过20分钟的离心，才能得到乏血小板血浆，再用于测定。而实际工作中因样品量大，富血小板血浆获取后还需等待相当长的时间才能用于测定，在静置等待的过程中富血小板血浆中的血小板会在重力的作用下沉降，使得PRP中不同位置的血小板浓度并不相同，导致测定出的结果不能真实反映血小板的聚集功能。本发明检测方法中富血小板血浆与乏血小板血浆是同时提取的，避免了因前后提取两种血浆之间存在的时间差及更多的实验操作，由血小板沉降而造成血小板浓度的差异引起的误差，保证了PRP中血小板浓度的一致性。

2)传统方法中第一次离心后，含有血小板的上层血浆层与含有红细胞和白细胞的下层血细胞层之间分层不明显，越靠近血浆层的上部，血小板浓度越低，越靠近血浆层的下部，即血浆层与血细胞层的分界处，血小板浓度越高。实际操作时，操作者往往为避免误吸血细胞层，而靠近血浆层上部液面处吸取血小板，吸取到的血小板浓度极有可能过低，并不是血浆中血小板浓度的真实值，对检测结果造成误差。而本发明方法在第一次离心时保留了全部血浆层，弃去血细胞层，之后的整个过程中，没有血小板的损失，在吸取富血小板血浆前会混匀样品，用于测定的富血小板血浆中血小板浓度与真实值相差不大，规避了传统方法中富血小板血浆中的浓度与真实值相差较大的情况出现。

3)传统方法中第一次离心得到的血浆量少，易吸取到血细胞层的红细胞和白细胞，而红细胞和白细胞的存在会降低样品的透光度，掩盖血小板聚集变化，影响实验结果。本发明的检测方法通过调整第一次离心的离心条件，不但可以尽可能回收血小板，还能够降低红细胞、白细胞的污染量，使干扰测定的因素减少，从而得到更准确的结果。

4)本发明的检测方法得到的富血小板血浆总量大大增加，远多于传统方法的300μL，即使红细胞压积大的样品，也能够获得比传统方法更大量的富血小板血浆。

5)本发明的检测方法可以测定同样样品在不同诱导剂诱导下的最大聚集率(PAgT)，进而进行比较，为筛选诱导剂提供科学可靠的方法，避免了用不同样品研究不同诱导剂诱导作用的不可比性。

具体实施方式

发明人在使用传统方法检测血小板的聚集功能时，发现在第一次离心后，吸取富血小板血浆时需要十分小心，因为血浆层与血细胞层的分界不明显，为了保证血小板的浓度符合要求，要尽可能地靠近血浆层与血细胞层的分界处吸取血浆，这样很容易将下层血细胞层中的红细胞和白细胞吸取上来，在等待乏血小板血浆制备的过程中，可以观察到盛装富血小板血浆的容器底部有红细胞沉淀下来。出现这种情况后，该样品作废，只能重新离心，重新吸取，血小板的聚集功能在以上反复的过程中很可能已被破坏，得到的检测结果不能真实反映被检者的血小板聚集功能。因此，本发明对传统的光学比浊法进行了改良，优化了检测过程的操作过程及参数，使得本发明的检测方法可以实现样品的重复测定，使血小板聚集功能的检测过程标准化、流程化，从而为临床提供更加准确的数据。

本发明提到的血小板聚集功能的检测方法，包括以下步骤：

(1)、取样：

用枸橼酸钠凝血试验管(其中枸橼酸钠浓度为109mmol/L)盛装采集到的受试对象的静脉血；

(2)、提取血小板血浆：

将步骤(1)采集的静脉血在200-250g下离心5-10min，吸取上层全部血浆作为血小板血浆；

(3)、提取乏血小板血浆(PPP)和富血小板血浆(PRP)：

将步骤(2)得到的血小板血浆以1200-2500g离心5-10min，一般在1200-1500g下离心10min或2000-2500g下离心5min效果更好，离心后吸取300μL上层血浆作为乏血小板血浆(PPP)于PPP检测杯内；剩余血浆混匀后取300μL作为富血小板血浆(PRP)于PRP检测杯内；

(4)、测定：

以PPP检测杯的透光度为100％,以PRP检测杯的初始透光度为0％,加入诱导剂,用血小板聚集仪测定PRP检测杯的透光度，绘制成血小板聚集曲线，并计算得到最大聚集率(PAgT)；

诱导剂可以是二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸、胶原、肾上腺素、瑞斯托霉素等。

本发明的检测方法中用到的试剂、耗材和仪器均商购得到。如诱导剂为二磷酸腺苷(ADP)，购自北京普利生仪器有限公司；血小板聚集仪为北京泰利康信科技有限公司的LBY-NJ4A全自动血小板聚集仪；KX-21型血细胞分析仪购自日本SYSMEX(希森美康)株式会社。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

用本发明提出的血小板聚集功能的检测方法对若干血液样品进行检测，筛选出步骤(2)和(3)中的离心条件；具体实施的步骤同上述检测方法，仅以下步骤略有不同：

(1)、取样：

采集受试对象晨起空腹静脉血，每位受试对象均采集2管；一管作为本发明不同离心条件下检测方法中的样品，另一管作为传统方法中的样品。

(2)和(3)中的离心条件见表1；步骤(3)完成后，先用SysmexKX-21型血细胞分析仪测定得到的PRP中的血小板浓度，用移液枪测量出血浆量，再进行步骤(4)的测定，得到PAgT；同时也测定用传统方法得到的PRP中的血小板浓度、血浆量及PAgT，实验结果见表2。

表1 本发明检测方法中的不同离心条件

表2 不同检测方法得到的PRP中的血小板数据结果

本领域的操作规程规定富血小板血浆中血小板浓度为(100-200)×10⁹/L时，得到的血小板最大聚集率较准确，并显示血小板浓度过低(＜100×10⁹/L)或过高(＞200×10⁹/L)都会影响结果，得到的最大聚集率误差会较大。最大聚集率的误差大，会导致大夫在诊断时做出错误的判断，不能准确地判断出哪些是血小板聚集功能正常的人群，哪些是血小板聚集功能增强或有缺陷或需要治疗的患者。表1和表2的结果也表明，随着PRP中血小板浓度的增加,最大聚集率也增高，PRP中血小板浓度的降低,最大聚集率也降低，误差较大，因此测定时血小板的终浓度为(100-200)×10⁹/L较合适。

其余离心条件不在本发明范围内的实验组(如第1-4组、第17-20组)，要不就是最终得到的血小板浓度过高或过低，要不得到的富血小板血浆量较少，这些因素最终都会导致得到的血小板最大聚集率的数据不准确，或无法进行重复试验。例如步骤(2)中：若离心力过小的话(第1组和第2组)，获得的血小板浓度过高(＞200×10⁹/L)，PAgT结果明显高于传统方法得到的结果；若离心时间过短的话(第3组和第4组)，虽然PAgT结果和传统方法结果较一致，但获取到的富血小板血浆量较少，无法进行重复试验；若离心时间过长或离心力过大的话(第17组和第18组、第19组和第20组)，获得的血小板浓度过低(＜100×10⁹/L)，PAgT结果明显低于传统方法得到的结果；因此步骤(2)中最优选的离心条件为200g-250g下离心5-10min，不仅得到的富血小板血浆量多于传统方法，血小板浓度也比较合适，得到的检测结果准确度高。

而步骤(3)中：离心条件对最终血小板最大聚集率的影响不大，这是因为步骤(3)中的离心过程结束后，只要能够获取到300μL的乏血小板血浆即可，最终的富血小板血浆是将剩余的乏血小板血浆与底部富集的血小板混合后得到的，有这一步混合的过程，使得步骤(3)中的离心条件对检测结果影响不大，从而减少了影响检测结果的因素，保证了检测结果的准确性；为了保证乏血小板血浆中的血小板浓度、血小板活性损失和出于对离心设备寿命的考虑，步骤(3)中的离心条件优选为1200-2500g下离心5-10min，最优选的离心条件是1200-1500g下离心10min或2000-2500g下离心5min。

实验例、本发明检测方法结果的准确性

(1)、取样：

将受试对象分为三组，分别采集晨起空腹静脉血，每位受试对象均采集2管；一管作为本发明检测方法中的样品，另一管作为传统方法中的样品。

正常组：受试对象选用健康志愿者，共53例，其中男性32例，女性21例，年龄23-71岁(平均45.6岁)。健康志愿者均无心脑血管、血液或呼吸系统疾病，无高血压病史，近期无感染及服用各种抗血小板聚集药物。

高值组：受试对象选用冠心病及易栓症患者，共69例，其中男性42例，女性27例，年龄45-79岁(平均58.1岁)。

低值组：受试对象选用口服氯吡格雷的冠心病患者及血小板聚集不良患者，共45例，其中男性25例，女性20例，年龄31-65岁(平均46.7岁)。

(2)、提取血小板血浆：

将步骤(1)采集的静脉血在250g下离心5min，弃掉下层血细胞，取上层全部血浆置于一空试管内，得到血小板血浆并对PLT计数；。

(3)、提取乏血小板血浆(PPP)和富血小板血浆(PRP)：

将步骤(2)得到的血小板血浆以1200g离心10min，吸取300μL上层血浆作为乏血小板血浆(PPP)于PPP检测杯内并对PLT计数；剩余血浆混匀后取300μL作为富血小板血浆(PRP)于PRP检测杯内并对PLT计数；

本发明方法本身不用计数血小板，但此处和以下实验例中为检验本发明方法取得的乏血小板血浆和富血小板血浆是否合格，做了血小板计数，目的是验证本发明方法的准确性。

(4)、测定：

以PPP检测杯的透光度为100％,以PRP检测杯的初始透光度为0％,加入诱导剂ADP,用血小板聚集仪测定PRP检测杯的透光度，绘制成血小板聚集曲线，并计算得到最大聚集率(PAgT)。

传统方法：参见《全国临床检验操作规程》(第三版)，采集静脉血，先经1000r/min离心10min后，在上层血浆层中吸取300μL，作为富血小板血浆(简称PRP)，剩余血液样品再经3000r/min离心20min后,在上层血浆层中吸取300μL，作为乏血小板血浆(简称PPP)；然后将PPP作为透光度100％的对照，以PRP检测杯的初始透光度为0％，加入诱导剂ADP,用血小板聚集仪测定PRP检测杯的透光度，绘制成血小板聚集曲线，并计算得到最大聚集率(PAgT)。

实验结果见表3：

表3本发明检测方法和传统方法在血小板最大聚集率(PAgT)上的相关性(n＝167例，X±SD)

分组	例数(n)	传统方法(％)	本发明(％)	相关系数	配对t检验
						正常组	53	64.39±10.53	63.81±11.52	r＝0.92，P＜0.05	P＞0.05
低值组	45	26.35±15.26	27.59±17.61	r＝0.91，P＜0.05	P＞0.05
						高值组	69	85.36±19.83	87.59±20.49	r＝0.90，P＜0.05	P＞0.05

对两种方法测定的血小板聚集率测定结果计算相关系数，相关系数均大于0.95(P＜0.05)，满足临床实际需求。说明本发明方法与传统方法相比较具有相似的临床适用性。配对t检验进行比较，结果均为P＞0.05,判定差别无统计学意义。可见，本发明的检测方法得到的结果准确可信。

实施例一、用本发明的检测方法测定血小板高聚集患者的血小板聚集率

选择实验例一高值组中的冠心病及易栓症患者共10例，其中男性6例，女性4例。分别按照实验一中本发明方法和传统方法检测10位患者的血小板数据，其结果见表4。

表4 本发明检测方法和传统方法对血小板高聚集患者的血小板测定结果

表4数据表明：本发明检测方法的PRP中血小板浓度为(100-200)×10⁹/L,PPP中血小板浓度为0/L,完全符合实验要求，并且获取到的富血小板血浆量远远大于传统方法的300μL。本发明检测方法与传统方法测定血小板最大聚集率的结果绝对误差在10％以内,说明本发明检测方法测定结果准确性良好。

实施例二、用本发明的检测方法测定血小板低聚集患者的血小板聚集率

选择实验例一低值组中的口服氯吡格雷冠心病患者及血小板聚集不良患者共10例，其中男性7例，女性3例。分别按照实验例一中本发明方法和传统方法检测10位患者的血小板数据，其结果见表5。

表5数据表明：本发明的检测方法的PRP中血小板终浓度为(100-200)×10⁹/L,PPP中血小板终浓度为0/L,完全符合实验要求，并且获取到的富血小板血浆量远远大于传统方法300μL。本发明的检测方法与传统方法测定血小板最大聚集率的结果绝对误差在5％以内,说明本发明的检测方法测定结果准确可信。

结合表4和表5的数据，可以得出，本发明的血小板聚集功能的检测方法不仅可以检测正常血液样品的血小板聚集功能，还可用于血小板高聚集或低聚集患者的血液样品血小板聚集功能的检测，说明本发明的检测方法适用范围全面、准确度高、稳定性和重复性好，可在临床检测中应用和推广。

表5 本发明检测方法和传统方法对血小板低聚集患者的血小板测定结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (4)

1.一种血小板聚集功能的检测方法，其特征在于，依次包括取样、血小板血浆的提取、乏血小板血浆的提取、富血小板血浆的提取和测定步骤；

所述取样为对来自受试对象的静脉血作抗凝处理；

所述血小板血浆的提取为将血液在200-250g下离心5-10min，取上层，即是血小板血浆；

所述乏血小板血浆的提取和富血小板血浆的提取同时完成；

所述乏血小板血浆的提取和富血小板血浆的提取为将血小板血浆离心，取300μL上层血浆即是乏血小板血浆；剩余血小板血浆混匀后，即是富血小板血浆，富血小板血浆的体积为750-950μL，富血小板血浆中血小板浓度为（100-200）×10⁹/L；离心条件为1200-1500g下离心10min或2000-2500g下离心5min；

所述测定为以乏血小板血浆的透光度为100%,以富血小板血浆的初始透光度为0%,加入诱导剂,测定富血小板血浆的透光度，绘制成血小板聚集曲线，并计算得到最大聚集率。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述血小板血浆的提取中的离心条件为250g下离心5min。

3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述乏血小板血浆的提取和富血小板血浆的提取中的离心条件为1200g下离心10min。

4.根据权利要求1或2或3所述检测方法，其特征在于，所述诱导剂是二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸、胶原、肾上腺素或瑞斯托霉素。