CN105920598A - 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达禽类病原体的抗原的重组HVT载体及其用途。具体而言本发明提供了包含并表达禽类病原体的抗原的火鸡(HVT)载体的重组疱疹病毒、包含重组HVT载体的组合物、包含重组HVT载体和一种或多种野生型病毒或重组载体的多价疫苗。本发明还提供了接种抗多种禽类病原体的疫苗的方法和制备重组HVT载体的方法。

Description

表达禽类病原体的抗原的重组HVT载体及其用途

本申请是申请号为201280066323.X、申请日为2012年11月29日、发明名称为“表达禽类病原体的抗原的重组HVT载体及其用途”的发明专利申请的分案申请。

交叉参考相关申请

本申请要求2011年11月30日提交的美国临时申请61/564,877和2012年8月30日提交的美国临时申请61/694,957的优先权。

技术领域

本发明涉及用于插入和表达外来基因以用作保护免受多种病原体体感染的安全免疫媒介物的重组病毒载体。其还涉及包含一种或多种重组病毒载体以用于保护免受多种病原体感染的多价组合物或疫苗。本发明涉及制备和使用重组病毒载体的方法。

背景技术

家禽接种被广泛用于保护家禽群体免受破坏性疾病，包括新城疫疾病(ND)、传染性法氏囊病(IBD)、马立克氏病(MD)、传染性支气管炎(IB)、传染性喉气管炎(ILT)和禽流感(AI)。ND由属于副粘病毒科的禽副粘病毒1型(APMV-1)(也称为ND病毒(NDV))引发。MD由也称为MD病毒血清型1(MDV1)的鸡疱疹病毒2型(疱疹病毒科)引发。IB由属于冠状病毒科的IB病毒(IBV)引发，ILT由也称为ILT病毒(ILTV)的鸡疱疹病毒1(疱疹病毒科)引发，AI由属于正粘病毒科的AI病毒(AIV)引发。

许多重组禽病毒载体已被提出用于接种鸡以抗这些禽类病原体。使用的病毒载体包含禽痘病毒，特别地鸡痘病毒(EP-A-0,517,292)、马立克氏病毒例如血清型2和3(HVT)(WO-A-87/04463)或可选择地ITLV、NDV和禽腺病毒。当这些重组禽病毒载体中的一些用于接种时，它们显示可见水平的保护作用。

已开发和许可了表达来自不同病原体(美国专利No.5,980,906,5,853,733,6,183,753,5,187,087)(包括IBDV、NDV、ILTV和AIV)的抗原的几种火鸡重组疱疹病毒(HVT，也称为吐绶鸡疱疹病毒1或MDV血清型3)载体。特别吸引人的是表达IBDV VP2保护基因的HVT载体，其已显示明确的优于经典IBD疫苗(Bublot等人J.Comp.Path.2007,第137卷,S81-S84；US 5,980,906)的有利方面。其它目标HVT载体是表达NDV(Morgan等人1992,Aviandis.36,858-70；US 6,866,852；US5,650,153)或ILTV(Johnson等人,2010Avian Dis 54,1251-1259；US6,299,882；US5,853,733)保护性基因的载体。一起使用若干基于HVT的重组疫苗的实际问题之一是它们的干扰。当将两种表达不同抗原的HVT重组体混合时针对至少一种疾病诱导更低的保护作用(Rudolf Heine 2011；Issues of the PoultryRecombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the EconomicBenefits of those Vaccines；2011年8月14日-18日在Cancún,Mexico的第XVII届世界家畜兽医协会(WVPA)会议提供的论文；Slacum G,Hein R.和Lynch P.,2009,Thecompatibility of HVT recombinants with other Marek’s disease vaccines,第58届西方家禽疾病会议(Western Poultry Disease Conference),Sacramento,CA,USA,3月23-25日,p 84)。

HVT和SB-1、鸡疱疹病毒3(MDV血清型2或MDV-2)疫苗株的组合已显示对MD保护作用的协同效果(Witter和Lee,1984,Avian Pathology 13,75-92)。为了说明干扰问题，有益地评估HVT病毒作为表达抗多种禽类病原体的一种或多种保护性抗原的疫苗载体。

克隆SB-1基因组，在细菌人工染色体(BAC)中进行表征(Petherbridge,等人,J.Virol.Methods 158,11-17,2009；Singh等人,Research in Veterinary Science 89,140-145,2010)。最近获得了MDV2 SB-1序列，并分析所述序列(Spatz和Schat,Virus Gene42,331-338,2011)。SB-1病毒的糖蛋白E缺失由Petherbridge,等人(J.Virol.Methods158,11-17,2009)进行了描述。然而，未报导使用SB-1作为表达外来保护性基因的病毒载体的研究。

鉴于动物病原体例如NDV和IBDV对兽医公共健康和经济的潜在影响，需要有预防感染和保护动物的高效方法。存在对用于制备可缓解在两种基于HVT的载体疫苗之间观察到的干扰问题的组合的有效载体疫苗和适当方法的解决方案的需要。

发明内容

本发明显示了当包含单一或双重HVT载体的多价组合物或疫苗有效地保护动物免受多种禽类病原体感染而无干扰的令人惊讶的结果。当启动子、密码子最优化的基因、polyA尾和插入位点的不同组合对一个或多个异源基因的体内表达赋予不同水平的效力和稳定性时也观察到令人惊讶的结果。

本发明涉及包含编码和表达禽类病原体的至少一种抗原的一个或多个异源多核苷酸的重组HVT载体。

本发明提供了包含一种或多种重组HVT载体的组合物或疫苗，所述载体包含编码和表达禽类病原体的至少一个抗原的一个或多个异源多核苷酸。

本发明提供了包含一种或多种重组HVT载体和一种或多种重组SB1载体的多价组合物或疫苗，所述重组HVT载体包含编码和表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸，所述重组SB1载体包含编码和表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸。

本发明涉及接种动物或诱导动物的免疫原性或保护性反应的方法，其包括本发明组合物或载体的至少一次施用。

附图说明

通过实例给出的并且无意将本发明限定于描述的特定实施方案的下列详细描述，可结合附图(通过引用并入本文)来理解，其中：

图1是显示被赋予每一个DNA和蛋白质序列的SEQ ID NO的表。

图2描述HVT的基因组结构及其插入位点。

图3描述pHM103的质粒图谱。

图4描述vHVT114的PCR分析结果。

图5描述双重免疫荧光测定结果。

图6描述vHVT114的Southern印迹结果。

图7描述vHVT114的免疫沉淀和Western印迹分析结果。

图8描述来自vHVT306感染细胞的免疫沉淀样品的Western印迹分析。

图9描述来自vSB1-009感染细胞的免疫沉淀样品的Western印迹分析。

图10描述vHVT304和vHVT114抗NDV ZJ1和CA02的攻击研究的结果。

图11描述NDV CA02和ZJ1攻击后的病毒脱落结果。

图12描述NDV Chimalhuacan攻击后的病毒脱落结果。

图13显示序列比对和百分比同一性。

图14显示DNA和蛋白质序列。

发明详述

应指出在本公开内容中，特别地在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”、“含有”等可具有美国专利法中的含义；例如，可意指“包括”、“包含的”、“含有”等；术语例如“基本上由……组成”和“基本上由……组成”具有它们在美国专利法中的含义，例如，它们允许包括未明确引述的元素，但不包括在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新型特征的元素。

除非另外指出，否则根据常规惯用法使用技术术语。分子生物学中的一般术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V.由Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑.),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

除非上下文明确地另有所指，否则单数术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数形式。类似地，除非明确地另有所指，否则单词“或”意欲包括“和”。单词“或”意指特定列表的任一个成员，并且还包括该列表的成员的任意组合。

术语“动物”在本文中用于包括所有哺乳动物、鸟类和鱼。本文中使用的动物可选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、草原狼、豺)、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫，和其它猫科动物包括猎豹和山猫)、牛族动物(例如，牛)、猪类(例如，猪)、羊类(例如，绵羊、山羊、羊驼、野牛)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、驼鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类动物(例如，狐猴、跗猴、猴子、长臂猿、人猿)、人和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育阶段包括胚胎期和胎儿期中的个体动物。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示连续氨基酸残基的多聚体。

术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且意指RNA、DNA、cDNA或cRNA及其衍生物，例如包含修饰主链的那些核酸。应当理解，本发明提供了包含与本文中描述的序列互补的序列的多核苷酸。本发明中涉及的“多核苷酸”包括正向链(5’至3’)和反向互补链(3’至5’)。根据本发明的多核苷酸可以以不同的方式(例如通过化学合成，通过基因克隆等)来制备，并且可采取不同的形式(例如，线性的或分支的、单链或双链的，或其杂合体、引物、探针等)。

术语“基因组DNA”或“基因组”可互换使用，意指宿主生物的可遗传的遗传信息。基因组DNA包括细胞核的DNA(也称为染色体DNA)，还包括质体(例如，叶绿体)以及其它细胞器(例如，线粒体)的DNA。本发明中涉及的基因组DNA或基因组还指病毒的RNA。RNA可以是正链或负链RNA。本发明中涉及的术语“基因组DNA”包括包含与本文中描述的序列互补的序列的基因组DNA。术语“基因组DNA”还指信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)和互补RNA(cRNA)。

术语“基因”被广泛用于指与生物功能相关的多核苷酸的任意区段。因此，基因或多核苷酸包括内含子和外显子(如在基因组序列中)或仅编码序列(如在cDNA中)，例如开放阅读框架(ORF)，其始于起始密码子(甲硫氨酸密码子)并终于终止信号(终止密码子)。基因和多核苷酸还可包括调节它们的表达例如转录起始、翻译和转录终止的区域。因此，还包括的是启动子和核糖体结合区域(一般地，这些调控元件位于编码序列或基因的起始密码子上游约60至250个核苷酸处；Doree S M等人；Pandher K等人；Chung J Y等人)、转录终止子(一般地，终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游约50个核苷酸内；Ward C K等人)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段，其包括调控序列。

如本文中所用，术语“异源DNA”是指来源于不同生物，例如不同细胞类型或与受体不同的物种的DNA。该术语还指宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，其中异源DNA被插入基因组内与其原始位置不同的区域中。

如本文中所用，术语“抗原”或“免疫原”意指诱导宿主动物的特异性免疫反应的物质。抗原可包括完整生物体(杀死的、减毒的或活的)；生物体的亚单位或部分；包含具有免疫原性性质的插入物的重组载体；能够在呈递至宿主动物后诱导免疫反应的DNA碎片或片段；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。

如本文中所用，术语“免疫原性蛋白或肽”包括在一旦给宿主施用后，其能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上具有免疫活性的多肽。优选，蛋白质片段是这样的片段，该片段具有与整个蛋白质大体上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包括至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文中所用，"免疫原性"蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。"免疫原性片段"意指包括一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。这样的片段可使用本领域内已知的许多表位作图技术来鉴定。例如，线性表位可通过例如在固体载体上同时合成大量肽(所述肽对应于该蛋白质分子的部分)，并且使肽与抗体反应(同时肽仍然连接于载体上)来测定。类似地，构象表位可通过测定氨基酸的空间构象(例如通过例如X射线晶体学和二维核磁共振)来容易地鉴定。

术语“免疫原性蛋白或肽”还涉及序列的缺失、添加和置换，只要多肽能够产生本文中定义的免疫反应即可。术语"保守改变"意指用另一个生物学上相似的残基进行氨基酸残基的替换或核酸序列中核苷酸的替换使得编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学上相似的残基。在这一点上，特别优选的置换通常是性质上保守的，即在氨基酸的家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族：(1)酸性—天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性—赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守改变的实例包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水残基的置换或一个极性残基对另一个极性残基的置换，例如精氨酸对赖氨酸的置换、谷氨酸对天冬氨酸或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或对生物活性不会具有主要影响的结构上相关的氨基酸对氨基酸的相似保守替换。因此，具有与参照序列大体上相同的氨基酸序列但具有大体上不影响蛋白质的免疫原性的少数氨基酸置换的蛋白质在参考多肽的定义之内。所有由这些修饰产生的多肽包括在本文中。术语"保守改变"还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲代氨基酸，只要针对被取代的多肽产生的抗体也与未被取代的多肽发生免疫反应。

术语"表位"是指特异性B细胞和/或T细胞对其反应的抗原或半抗原上的部位。该术语还可与"抗原决定簇"或"抗原决定部位"互换使用。识别相同表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一种抗体对靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中被鉴定。

对组合物或疫苗的"免疫反应"是宿主中针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应的发展。通常地，"免疫反应"包括但不限于下列效应中的一个或多个：特异性针对目标组合物或疫苗中包含的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，从而对新感染的抗性得到增强和/或疾病的临床严重性减轻。这样的保护作用可通过通常由被感染宿主显示的症状的减轻或不存在、被感染宿主的更快恢复时间和/或更低病毒滴度来显示。

术语“重组的”和“遗传修饰的”可互换使用，意指多核苷酸或蛋白质在其天然形式或结构上的任何修饰、改变或工程化，或多核苷酸或蛋白质在其天然环境或周围事物上的任何修饰、改变或工程化。多核苷酸或蛋白质的修饰、改变或工程化可包括但不限于一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失、整个基因的缺失、基因的密码子最优化、氨基酸的保守置换、一个或多个异源多核苷酸的插入。

术语“双重HVT构建体”或“双重HVT载体”是指包含两种异源多核苷酸的HVT病毒载体。

术语“多价疫苗或组合物”、“组合或复合(combo)疫苗或组合物”和“多价疫苗或组合物”可互换用于指包含超过一种组合物或疫苗的组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可包含2、3、4或更多种组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可包含重组病毒载体、活性或减毒或杀死的野生型病毒，或重组病毒载体与以活性或减毒的或杀死的形式存在的野生型病毒的混合物。

本发明的一个实施方案提供了重组HVT病毒载体，其包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原或多肽的一个或多个异源多核苷酸。用于重组病毒载体的HVT株可以是任何HVT株，包括但不限于HVT株FC126(Igarashi T.等人,J.Gen.Virol.70,1789-1804,1989)。

本发明的另一个实施方案提供了重组SB-1病毒载体，其包含一个或多个编码并表达禽类病原体的至少一个抗原或多肽的异源多核苷酸。SB-1株可以是任意SB-1株，包括但不限于商业化马立克氏病疫苗(SB-1疫苗)(Merial Select Inc.,Gainesville,GA 30503,USA)、具有如由GenBank登录号HQ840738.1定义的基因组序列的SB-1株。

编码抗原或多肽的基因可以是编码如下蛋白的那些基因：新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)、新城疫病毒血细胞凝集素神经氨酸酶(NDV-HN)、马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)、马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)、马立克氏病病毒糖蛋白E(gE)、马立克氏病病毒糖蛋白I(gI)、马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或马立克氏病病毒糖蛋白L(gL)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2、IBDV VPX、IBDV VP3、IBDV VP4、ILTV糖蛋白B、ILTV糖蛋白I、ILTV UL32、ILTV糖蛋白D、ILTV糖蛋白E、ILTV糖蛋白C、流感血凝素(HA)、流感神经氨酸酶(NA)、来源于鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)(MG)或滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)(MS)的保护性基因或其组合。抗原或多肽可以是来自家禽病原体的任何抗原，所述病原体选自禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、鸡贫血病毒、禽星状病毒、禽细小病毒、球虫病病毒(艾美球虫属的一个种(Eimeria sp.))、弯曲杆菌属的种(Campylobacter sp.)、沙门菌属的种(Salmonellasp.)、巴斯德菌属的种(Pasteurella sp.)、禽杆菌属的种(Avibacterium sp.)、鸡败血支原体、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、梭菌属的种(Clostridium sp)和大肠杆菌(E.coli)。

此外，上述抗原或多核苷酸的同源物意欲在本发明的范围内。如本文中所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能，但已在无关生物中分开进化的两个多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种、但已通过物种形成从共同祖先基因进化而来的两个多核苷酸或多肽。通常地，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同功能，但这些功能可以相关。野生型多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可与野生型多肽在翻译后修饰、氨基酸序列差异或两者方面有差异。具体地，本发明的同源物通常显示与上述抗原的多核苷酸或多肽序列的全部或部分有至少80-85％、85-90％、90-95％或95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且可显示相似的功能。

在一个实施方案中，本发明提供了包含编码和表达NDV-F抗原或多肽的一个或多个异源多核苷酸的重组HVT或SB-1病毒载体。在该实施方案的一个方面，NDV-F抗原或多肽与具有SEQ ID NO:2、4、6、33、35或37所示的序列的多肽或这些多肽之一的保守变体、等位基因变体、同源物或包含所述多肽的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段或这些多肽的组合具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方案的另一个方面，异源多核苷酸编码与具有SEQ ID NO:2、4、6、33、35或37所示序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的NDV-F抗原或多肽。在该实施方案的另一个方面，异源多核苷酸与具有SEQ IDNO:1、3、5、32、34或36所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"是指包含导致蛋白质的氨基酸序列的变化并且存在于天然群体(例如，病毒的种或变种)内的多态性的多核苷酸或多肽。这样的天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽内1-5％的变异。等位基因变体可通过对许多不同物种的目标核酸序列进行测序来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定那些物种中相同基因的基因座来容易地进行。作为天然等位基因变异的结果并且不改变目标基因的功能活性的任何和所有这样的核酸变异和所得的氨基酸多态性或变异意欲包括在本发明的范围内。

关于序列的术语“同一性”可指例如具有相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以两个序列中更短序列内的核苷酸或氨基酸数目，其中两个序列的比对可按照Wilbur和Lipman的算法(Wilbur和Lipman)来测定。两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性或者两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)来测定。当RNA序列被认为是与DNA序列相似的或与其具有一定程度的序列同一性或同源性时，该DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列包括在本发明的范围内并且可来源于DNA序列，其中DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。

本公开内容的多核苷酸包括作为遗传密码的结果(例如对于特定宿主的最优化密码子选择)是简并的序列。如本文中所用，“最优化的”是指经遗传工程改造以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码NDV-F多肽的最优化的多核苷酸，NDV-F蛋白基因的DNA序列可被修饰来1)包含在特定物种中高度表达的基因所偏好的密码子；2)以与大体上在所述物种中发现的核苷酸碱基组成相似的核苷酸碱基组成包含A+T或G+C含量；3)形成所述物种的初始序列；或4)消除引起RNA的去稳定作用、不适当的多聚腺苷酸化、降解和终止或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。NDV F蛋白在所述物种中的增加表达可通过使用真核生物和原核生物中或特定物种中的密码子用法分布频率来实现。术语“偏好密码子用法的频率”是指由特定宿主细胞在核苷酸密码子的使用中显示的指定给定氨基酸的偏好性。存在20种天然氨基酸，其大部分由超过一个密码子指定。因此，所有简并核苷酸序列包括在本公开内容中，只要由所述核苷酸序列编码的NDV-F多肽的氨基酸序列在功能上不被改变即可。

异源多核苷酸被重组/修饰感染性病毒成功表达需要两个条件。首先，必须将异源多核苷酸插入或引入病毒基因组的区域以使修饰病毒保持活力。表达插入的异源多核苷酸的第二个条件是存在允许基因在病毒背景中表达的调控序列(例如：启动子、增强子、供体和受体剪接位点和内含子、Kozak翻译起始共有序列、多聚腺苷酸化信号、非翻译序列元件)。

插入位点可以是HVT基因组的任何非必需区域，包括但不限于ORF UL55的ATG和UL与相邻重复区域的连接处之间的区域(US5,980,906)、IG1基因座、IG2基因座、IG3基因座、UL43基因座、US10基因座、SORF3/US2基因座(参见图2)。

一般而言，使用在真核细胞中具有功能的强启动子是有利的。启动子包括但不限于立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子,豚鼠CMV启动子、SV40启动子、假狂犬病毒启动子例如糖蛋白X启动子、单纯疱疹病毒-1的启动子例如α4启动子、马立克氏病病毒(包括MDV-1、MDV-2和HVT)启动子例如驱动糖蛋白gC、gB、gE或gI表达的启动子、感染性喉气管炎病毒启动子例如糖蛋白gB、gE、gI、gD基因的启动子或其它疱疹病毒启动子。

本发明的一个实施方案提供了包含编码并表达NDV-F抗原或多肽的异源多核苷酸的重组HVT载体。在该实施方案的一个方面，编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于具有SEQ ID NO:9中所示序列的SV40启动子，从而NDV-F抗原或多肽的表达受SV40启动子调控。在该实施方案的另一个方面，NDV-F抗原或多肽的表达受具有SEQ ID NO:11所示序列的SV40 polyA信号调控。在该实施方案的另一个方面，编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于具有SEQ ID NO:38所示序列的MDV gB启动子，从而NDV-F抗原或多肽的表达受MDV gB启动子调控。

本发明的另一个实施方案提供了包含编码并表达NDV-F抗原或多肽的第一异源多核苷酸和编码并表达IBDV VP2抗原或多肽的第二多核苷酸的重组双重HVT载体。在该实施方案的一个方面，NDV-F抗原或多肽与具有SEQ ID NO:2、4、6、33、35或37所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方案的另一个方面，IBDV VP2抗原或多肽与具有SEQ ID NO:8或42所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在另一个方面，编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于具有SEQ ID NO:9所示序列的SV40启动子，从而NDV-F抗原或多肽的表达受SV40启动子调控。在另一个方面，NDV-F抗原或多肽的表达受具有SEQ ID NO:11所示的序列的SV40 polyA信号或具有SEQ ID NO:12所示序列的合成polyA信号调控。在另一个方面，IBDV VP2抗原或多肽的表达受具有SEQ ID NO:10所示序列的CMV-IE启动子和具有SEQ ID NO:11所示序列的SV40 polyA信号调控。

本发明的另一个实施方案提供了包含两个编码并表达IBDV VP2抗原或多肽的多核苷酸的重组双重HVT载体。在所述实施方案的一个方面，IBDV VP2抗原或多肽与具有SEQID NO:8或42中所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，编码第一IBDV VP2抗原或多肽的多核苷酸有效地连接于具有SEQ ID NO:10中所示的序列的CMV-IE启动子，编码第二IBDV VP2抗原或多肽的多核苷酸有效地连接于具有SEQ ID NO:43中所示的序列的豚鼠CMV启动子。在另一个方面，第一IBDV VP2抗原或多肽的表达受具有SEQ ID NO:10所示的序列的CMV-IE启动子和具有SEQID NO:11所示序列的SV40 polyA信号调控，第二IBDV VP2抗原或多肽的表达受具有SEQ IDNO:43所示序列的豚鼠CMV启动子和具有SEQ ID NO:12所示序列的合成polyA信号调控。在该实施方案的另一个方面，可将编码IBDV VP2抗原或多肽的多核苷酸插入一个或多个基因座区域，所述基因座区域选自HVT基因组的IG1、IG2、US10、SORF3-US2和gD。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物或疫苗，其中包含一种或多种本发明的重组HVT或SB-1病毒载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了组合物或疫苗，其包含含有编码NDV-F抗原的多核苷酸、SV40启动子的HVT病毒载体和任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物或疫苗，其包含含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的第一HVT载体和含有编码IBDV VP2抗原的多核苷酸的第二HVT载体以及任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物或疫苗，其包含含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的HVT载体、含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的SB-1载体、任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。本发明的药物组合物或疫苗可包含含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的第一HVT载体、含有编码IBDV VP2抗原的多核苷酸的第二HVT载体、含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的SB-1载体、任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含双重HVT病毒载体的组合物或疫苗，其包含：i)编码并表达NDV-F抗原或多肽的第一异源多核苷酸；ii)编码并表达IBDV VP2抗原或多肽的第二多核苷酸；和iii)任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方案中，本发明提供了组合物或疫苗，其包含含有编码并表达IBDV VP2抗原或多肽的两个多核苷酸的双重HVT病毒载体，和任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方案中，包含双重HVT病毒载体的组合物还包含含有编码IBDV VP2抗原的多核苷酸的HVT载体或含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的SB-1载体或其组合。药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂对于本领域技术人员来说是公知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂可以是用于MD疫苗的马立克氏病疫苗稀释剂。可用于本发明的方法的其它药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂包括但不限于0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液、多聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是有利于载体(或从本发明的载体体外表达的蛋白质)的施用或有利于载体(或蛋白质)的转染或感染和/或改善其保存的任何化合物或化合物的组合。剂量和剂量体积在本文中在一般描述中进行了论述，其还可由本领域技术人员根据本公开内容结合本领域的知识来确定，而无需任何过度的实验。

任选地可添加其它化合物作为药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂，包括但不限于明矾；CpG寡核苷酸(ODN)，特别地ODN 2006、2007、2059或2135(Pontarollo R.A.等人,Vet.Immunol.Immunopath,2002,84：43-59；Wernette C.M.等人,Vet.Immunol.Immunopath,2002,84：223-236；Mutwiri G.等人,Vet.Immunol.Immunopath,2003,91：89-103)；polyA-polyU，二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)(“Vaccine Design TheSubunit and Adjuvant Approach”，由Michael F.Powell和Mark J.Newman编辑的,Pharmaceutical Biotechnology,6：p.03,p.157)；N,N-双十八烷基-N’,N’-双(2-羟乙基)丙二胺(例如)(出处同前,p.148)；卡波姆、壳聚糖(参见例如美国专利系列No.5,980.912)。

根据本发明的药物组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由一种或多种佐剂组成。用于实施本发明的适当佐剂为(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生物的聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)例如具有一个或多个非甲基化CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人,1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如在由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and AdjuvantApproach”第147页上描述的SPT乳剂，和相同著作第183页上描述的乳剂MF59；(4)包含季铵盐例如DDA的阳离子脂质，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在引用的和通过引用并入本申请中的任何文献中论述的其它佐剂或(9)其任意组合或混合物。

本发明的另一个方面涉及用于诱导动物中抗一种或多种抗原的免疫反应或者动物中抗一种或多种禽类病原体的保护性反应的方法，所述方法包括用本发明的疫苗或药物组合物接种动物至少一次。本发明的另一个方面涉及用于诱导动物中针对一种或多种抗原的免疫反应或者在初免-加强施用方案中诱导动物中抗一种或多种禽类病原体的保护性反应的方法，所述方法包括使用至少一种常用多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初始施用和至少一次加强施用。初始施用中使用的免疫组合物或疫苗可以相同，可在性质上与用作加强剂的免疫组合物或疫苗不同。

禽类病原体可以是新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(即，IBDV或禽肾病病毒)、马立克氏病病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒球虫病(艾美球虫属的种)、弯曲杆菌属的种、沙门菌属的种、鸡败血支原体、滑液囊支原体、巴斯德菌属的种、禽杆菌属的种、大肠杆菌和梭菌属的种。

通常地，在1日龄时通过皮下或肌内途径进行疫苗的一次施用，或在17-19日龄胚胎中通过卵内途径进行疫苗的一次施用。第二次施用可在第一个10日龄内进行。动物优选在第一次施用时为至少17日胚胎或1日龄。

在各日龄鸡中可以例如皮下或肌内、皮内、经皮肤地使用多种施用途径。可在羊膜囊和/或胚胎中进行卵内接种。商购可得的卵内和SC施用装置可用于接种。

本发明现通过下列非限定性实施例来进一步描述。

实施例

使用由J.Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)描述的标准分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒载体的构建。

实施例1 表达NDV-F的重组vHVT114的构建

供体质粒pHM103+Fopt的制备

利用NotI消化包含HVT FC126的基因间I臂(参见图2)、SV40启动子和SV40 poly A的质粒pHM103(Merial Limited)，将其去磷酸化，通过凝胶提取5.6kb片段。也对化学合成的密码子最优化基因型VIId NDV-F基因(SEQ ID NO:1，编码SEQ ID NO:2)的侧翼连接有NotI的1.7kb片段进行NotI消化，随后凝胶提取该1.7kb片段。连接5.6与1.7kb片段以产生pHM103+Fopt(图3)。

重组HVT病毒载体的产生

使用pHM103+Fopt(作为供体质粒)和从HVT株FC126分离的病毒DNA通过次代鸡胚成纤维细胞(2°CEF细胞)的共电穿孔来进行体外重组(IVR)。使用300ul Opti-MEM中的1x10⁷个2°CEF进行共电穿孔，利用950的电容在150伏于2mm电穿孔杯中进行电休克。将转染的细胞接种入96孔板，温育5天。随后将96孔板中生长的细胞以一式两份分入两个96孔板。将一组96孔板用于使用抗NDV-F的鸡多克隆血清的IFA以鉴定包含重组体的阳性孔，将另一组96孔板用于从阳性孔回收被感染的细胞。

首先通过96孔板复制并进行IFA选择来筛选出包含最具IFA阳性的斑和最少量IFA阴性斑的孔，以进行重组病毒纯化。随后收获符合这些标准的孔，将其在DMEM+2％FBS中调整至1ml。从1ml原液取出5-20ul，将其与1x10⁷个CEF于10ml DMEM+2％FBS中混合，随后等分至新的96-孔板中以便每孔具有单个HVT斑。通过PCR测试包含单个斑的孔的上清液中亲代病毒的不存在。在5轮斑纯化后，分离称为vHVT114的重组病毒，通过IFA和PCR测试纯度以确认NDV-F表达和亲代病毒的不存在。

重组vHVT114的PCR分析

通过酚/氯仿提取从vHVT114提取DNA，将DNA进行乙醇沉淀，随后重悬浮于20mMHEPES。PCR引物(表1中显示的)被设计来特异性鉴定密码子最优化的NDV-F、SV40启动子的存在以及来自FC126CL2亲代病毒的重组病毒的纯度。使用200ng的DNA模板与表1中所示的指定引物对进行PCR。PCR循环条件如下：在94℃进行2min；30个循环(在94℃进行30秒、在55℃进行30秒、在68℃进行3分钟)；在68℃进行5分钟。预期的PCR产物示于表2中。PCR结果示于图4中。如图4中所示，凝胶电泳后PCR产物的尺寸对应于具有预期尺寸和条带模式的孔。

表1

引物	SEQ ID NO	序列5’-3’
			MB080	13	CGA ACA AAC TTC ATC GCT ATG C
MB081	14	TAA CTC AAA TGC GAA GCG TTG C
			optF	15	ACT GAC AAC ACC CTA CAT GGC
VlloptF RP	16	GCC AGC ACC AGG CTC AGG G
			SV40启动子F	17	AGC TTG GCT GTG GAA TGT

表2

重组vHVT114的表达分析

使用vHVT114进行免疫荧光测试，所述vHVT114已在实验性主板前(pre-master)接种(pre-MSV)之外被传代超过10次。将pre-MSV和pre-MSV+12材料以1:100稀释于培养基中。将50微升的稀释病毒添加至具有1x10⁷个CEF的10ml DMEM+2％FBS中，随后等分至96孔板(100ul/孔)中。将板在37℃+5％CO₂温育3天直至病毒斑可见。用95％冰冷丙酮固定板3分钟，用PBS洗涤3次。添加1:1000的抗新城疫病毒鸡抗血清(lot#C0139,Charles RiversLaboratory)和1:3000的单克隆抗体L-78(Merial Limited)，并将板在37℃温育1小时。在1小时的温育后，用PBS洗涤板3次，添加1:500的FITC抗-鸡(cat#F8888,Sigma)和AlexzFluor 568驴抗-小鼠(IgG)(cat#A 10037,Molecular Probe)。再次将板在37℃温育1小时。在1小时的温育后，用PBS漂洗细胞3次。添加少量PBS以阻止单层干燥和引起自发荧光。随后使用组合的四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)和异硫氰酸荧光素(FITC)滤光器通过荧光显微镜显现细胞。

使用TRITC和FITC滤光器(对于双重染色)来显现vHVT114病毒斑。FITC测试显示NDV-F表达，TRITC测试显示HVT表达。由于96孔板的孔小，因此记录各孔时，首先用TRITC滤光器计数每一个孔的斑，随后利用FITC滤光器计数每一个孔的斑。对于pre-MSV和pre-MSV+12传代计数了超过500个斑。在两个板上所有斑对FITC和TRITC都是阳性的。(图5)

重组vHVT114的Southern印迹分析

按照标准基因组DNA提取方案从HVT FC126和vHVT114提取总的基因组DNA。对于每一个限制酶切消化，对于每一个样品，采用20μl的总消化体积，使用3μg的基因组DNA(对于供体质粒，1ng)。将HVT FC126的基因组DNA(阴性对照)、pHM103+Fopt供体质粒和vHVT114在37℃利用BamHI、PstI、SphI和NcoI限制性核酸内切酶消化过夜。通过1％琼脂糖凝胶分离HVT FC126(阴性对照)、pHM103+Fopt供体质粒和vHVT114基因组DNA的限制片段，将其转移至带正电荷的尼龙膜。按照North2South Chemiluminescent Hybridization andDetection试剂盒(Thermo Scientific)制造商的说明书，将膜预杂交1hr，随后与生物素化NDV-F探针在55℃杂交过夜。在过夜杂交后，进行数次严格洗涤直至将膜置于添加了链霉抗生物素蛋白-HRP的封闭缓冲液中。在漂洗膜除去任何未结合的链霉抗生物素蛋白-HRP后，添加鲁米诺和过氧化物的底物溶液。随后将膜暴露于X射线胶片，并显影。其中生物素化探针结合于DNA的区域是化学发光的并被X射线胶片捕获。表3显示使用NDV-F探针产生的预期的Southern印迹条带。Southern印迹结果显示如所预期的消化模式(图6)。

表3

NDV-F探针

重组vHVT114中被插入区域的序列分析

vHVT114基因组DNA区域的分析通过PCR扩增来进行。将总共10个引物用于扩增整个盒，此外，还包括供体质粒中使用的侧翼BamHI-I臂。凝胶纯化4.727kb PCR产物，使用测序引物对完整片段进行测序。序列结果确认vHVT114包含正确的SV40启动子、密码子最优化的NDV-F和SV40 polyA序列，所述序列完全匹配与SEQ ID NO:18中针对供体质粒pHM103+Fopt描述的序列。

重组vHVT114的Western印迹分析

利用vHVT114Pre-MSV以约0.1MOI感染2x10⁶个鸡成纤维细胞。在于37℃温育2天后，在除去培养基和利用PBS漂洗后使用细胞刮棒收集感染的以及未感染的细胞。利用1mlPBS收集细胞，随后离心。按照Pierce Classic IP试剂盒(cat#26146,Thermo Scientific)裂解细胞沉淀。将100μl的抗-NDV-F单克隆抗体001C3(Merial Limited)用于形成免疫复合物。将抗体/裂解物样品添加至蛋白A/G Plus琼脂糖以捕获免疫复合物。将免疫复合物洗涤3次以除去未结合的材料，随后在非还原条件下使用样品缓冲液洗脱将其洗脱在50ul体积中。在煮沸5分钟后，将10μl的样品加载至10％丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)中。将PAGE凝胶在MOPS缓冲液(Invitrogen)中在200伏下电泳1小时。随后将凝胶转移至PVDF膜。

通过使用试剂和遵照制造商的指导将蛋白质检测器Western印迹试剂盒TMB系统(KPL,cat#54-11-50)用于印迹PVDF膜。在于室温封闭膜1小时后，随后在1X洗涤缓冲液中洗涤膜3次，每次5分钟，随后将其浸于含有针对NDV病毒产生的鸡血清(Lot#C0139,CharlesRiver Laboratories)1:1000稀释物的封闭缓冲液中。在于洗涤缓冲液中洗涤3次后，在室温以1:2000的稀释度用过氧化物酶标记的山羊抗-鸡IgG(KPL,cat#14-24-06)温育膜1小时。随后在1X洗涤缓冲液中洗涤膜3次，每次5分钟。将5ml的TMB膜过氧化物酶底物添加至膜，轻轻摇动约1分钟。通过将膜置于水中来终止显影反应。

免疫沉淀和Western印迹技术在vHVT114样品中检测到对应于NDV-F蛋白的F1组分预期尺寸的约55kD蛋白(图7)。

实施例2 表达NDV-F的重组vHVT110、vHVT111、vHVT112、vHVT113和vHVT116的构建

基本上以与实施例1中描述的用于vHVT114的方式相同的方式进行HVT重组体vHVT110、vHVT111、vHVT112、vHVT113和vHVT116的产生和表征。表4显示表达盒周围对于每一个构建体独特的特征，包括各自的序列。

表4

单个HVT重组体的表达盒的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT039	HVT	MDV gB	Wtnm-Texas	SV40	IG1
vHVT110	HVT	mCMV IE	Wt-VIId	SV40	IG1
						vHVT111	HVT	SV40	Wt-VIId	SV40	IG1
vHVT112	HVT	MCMV IE	Wt-YZCQ	SV40	IG1
						vHVT113	HVT	MCMV IE	Wt-Texas	SV40	IG1
vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
						vHVT116	HVT	SV40	Opt-Ca02	SV40	IG1

vHVT110

用NotI消化包含HVT FC126的基因间I臂、小鼠CMV启动子和SV40 poly A的质粒pCD046(Merial的专利材料)，将其去磷酸化，经凝胶提取6.6kb片段。也对包含野生型F序列的化学合成NDV-F基因(SEQ ID NO:3，编码SEQ ID NO:4)的侧翼连接有NotI的1.7kb片段进行NotI消化，随后凝胶提取1.7kb片段。连接6.6与1.7kb片段以产生用于转染而得到重组vHVT110的供体质粒pCD046+NDV-F wt(对于vHVT110，SEQ ID NO:21)。插入序列的测序确认了vHVT110包含mCMV启动子、野生型NDV-F基因和SV40 polyA的正确序列。该序列也完全符合EQ ID NO:21中针对供体质粒pCD046+NDV-F wt描述的序列。

vHVT111

利用NotI消化包含HVT FC126的基因间I臂、SV40启动子和SV40 polyA的质粒pHM103质粒(Merial专利材料)，将其去磷酸化，随后凝胶提取5.6kb片段。也对包含野生型F序列的化学合成NDV-F基因(SEQ ID NO:3，编码SEQ ID NO:4)的侧翼连接有NotI的1.7kb片段进行NotI消化，随后凝胶提取1.7kb片段。连接5.6与1.7kb片段以产生用于转染而得到重组vHVT111的供体质粒(对于vHVT1110，SEQ ID NO:22)。插入序列的测序确认了vHVT111包含SV40启动子、野生型NDV-F基因和SV40 polyA的正确序列，如供体质粒pHM103+NDV-F wt的序列(SEQ ID NO:22)中显示的。

vHVT112

使用NotI从pUC57NDV-F YZCQ质粒(由GeneScript合成的)切出包含合成NDV-FYZCQ野生型基因(编码SEQ ID NO:35的SEQ ID NO:34)的片段，并将其插入含有mCMV启动子和SV40 polyA尾的pCD046质粒的相同位点内。使用Top10 Oneshot试剂盒(cat#C404002,Invitrogen)转化连接的材料。将细菌菌落生长在LBamp液体培养基中，使用QiagensMiniSpin Prep试剂盒提取质粒，随后筛选插入物的定向。正确的供体质粒被命名为pCD046+NDV-F VII YZCQ。生长大规模培养物，使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。在鸡胚成纤维细胞(CEF’s)中使用Fugene转染剂和抗NDV鸡多克隆血清验证大制备物的瞬时表达。

将质粒pCD046+NDV-F VII YZCQ(SEQ ID NO:29)用于转染以产生重组vHVT112。插入区域的测序确认了vHVT112包含mCMV启动子、野生型NDV-F YZCQ基因和SV40 polyA的正确序列。该序列也与SEQ ID NO:29中对于供体质粒pCD046+NDV-F VII YZCQ描述的序列完全匹配。

vHVT113

使用NotI从UC57 NDV Texas F质粒(由GeneScript合成的)切出包含合成NDVTexas F基因(编码SEQ ID NO:37的SEQ ID NO:36)的片段，将其插入包含mCMV启动子和SV40 polyA尾的pCD046质粒的相同位点。使用Top10 Oneshot试剂盒(cat#C404002,Invitrogen)转化连接的材料。将细菌菌落生长在LBamp液体培养基中，通过使用QiagensMiniSpin Prep试剂盒提取质粒，筛选插入物的定向。正确的供体质粒命名为pCD046+TexasNDV-F。生长大规模培养物，使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。在鸡胚成纤维细胞(CEF’s)中使用Fugene转染剂和抗NDV鸡多克隆血清验证大制备物的瞬时表达。

质粒pCD046+Texas NDV-F(SEQ ID NO:30)用于转染以产生重组vHVT113。对插入区域的测序确认了vHVT113包含mCMV启动子、野生型NDV-F Texas F基因和SV40 polyA的正确序列。序列也完全匹配SEQ ID NO:30中对于供体质粒pCD046+Texas NDV-F描述的序列。

vHVT039

使用引物HM101(5'-CCG-GAA-TTC-CGA-TGT-TTA-GTC-ACG-ATA-GAC-3')(SEQ IDNO:44)和HM102(5'-ATA-AGA-GCG-GCC-GCA-GTG-AGA-TGA-TCT-TAA-TGA-TG-3')(SEQ IDNO:45)通过PCR从由MDV1RB1B株提取的DNA扩增MDV gB启动子(SEQ ID NO:38)。前者包含EcoRI位点，后者包含用于将EcoRI/NotI消化的630bp PCR产物连接入EcoRI/NotI消化的pCD046质粒的NotI位点。连接产物用于转化DH5α感受态细胞。挑拣菌落，通过利用EcoRI和NotI的限制性分析来筛选插入的PCR片段的存在。所得的质粒被命名为pHM102。

将速发型NDV Texas株(基因型IV)生长在11日龄SPF鸡胚蛋中并进行半纯化。提取总RNA，使用两个引物F-ATG(5’TAT-AGC-GGC-CGC-AAG-ATG-GGC-TCC-AGA-TCT-TCT-ACC-AG3’)(SEQ ID NO:46)和F-STOP(5’CGA-GGC-GGC-CGC-TCA-TAT-TTT-TGT-AGT-GGC-TCT-C 3’)(SEQ ID NO:47)进行RT PCR。它们允许完整扩增NDV F基因，在ATG上游和终止密码子下游添加NotI位点。利用NotI消化1.7kb PCR片段，将其连接入NotI-消化的pHM102。所得的质粒命名为pHM119，在体外重组研究中用作供体质粒，通过与HVT亲代DNA一起共转染CEF细胞，以产生上述vHVT039。对插入区域的测序确认了vHVT039包含MDV gB启动子、来自Texas株的野生型未修饰NDV-F基因(编码SEQ ID NO:33的SEQ ID NO:32)和供体质粒pHM119的部分序列中显示的SV40 polyA(SEQ ID NO:31)的正确序列。

vHVT116

利用NotI消化包含HVT FC126的基因间I臂、SV40启动子和SV40 polyA的质粒pHM103质粒(Merial专利材料)，将其去磷酸化，凝胶提取5.6kb片段。化学合成侧翼连接有NotI的1.7kb片段，将其进行密码子最优化，也用NotI消化CA02基因型V NDV-F基因(SEQ IDNO:5，编码SEQ ID NO:6)，凝胶提取1.7kb片段。将5.6和1.7kb片段连接来产生用于转染得到重组vHVT116的pHM103+NDV-F CA02(SEQ ID NO:23，对于vHVT116)。对插入区域的测序确认了vHVT116包含供体质粒pHM103+NDV-F wt的序列中显示的SV40启动子、密码子最优化的CA02 NDV-F基因和SV40 polyA(SEQ ID NO:23)的正确序列。

讨论

将在mCMV或非-CMV启动子之下的各种盒插入在HVT基因组的不同基因座(表4)。尽管进行了重复尝试，但具有mCMV和密码子最优化的F序列的构建体的产生在超过第2代后不成功。然而，当通过mCMV驱动野生型序列时，可产生稳定的构建体vHVT110。此外，具有在SV40启动子之下的野生型F序列的重组vHVT111对于超过10次体外传代也是稳定的。令人惊讶地，类似地发现在SV40启动子之下的密码子最优化F序列对于超过10次体外传代是稳定的(例如vHVT114和vHVT116)。这些结果显示了启动子的强度与它们所控制基因(密码子-最优化的或未最优化的)的性质之间在产生遗传上稳定的HVT构建体中的微妙平衡。

实施例3 vHVT306(表达NDV-F和IBDV VP2的双重HVT载体)的构建

构建供体质粒pHVT US2 SV-Fopt-synPA，其包含SV40启动子、合成NDV F密码子最优化的VII基因、合成polyA尾并且侧翼连接有HVT FC126的SORF3和US2臂。

重组病毒的产生

在标准同源重组操作之后，使用供体质粒pHVT US2 SV-Fopt-synPA和从vHVT13(表达IBDV VP2基因的HVT载体，Merial Limited)分离的病毒DNA进行次级CEF细胞的共电穿孔。进行基本上如实施例1中针对vHVT114描述的方法以产生重组体，进行噬斑纯化，通过免疫荧光鉴定重组体。

在5斑噬斑纯化后，分离纯的重组病毒(vHVT306)，测试vHVT306的纯度，通过IFA和PCR确认纯度。

PCR分析

利用QIA DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen cat#69506)从vHVT306主板前种子病毒(pre-MSV)提取病毒DNA。PCR引物被设计来鉴定最优化的NDV F、NDV F野生型、SV40启动子、mCMV启动子、US2HVT病毒和SB-1病毒的侧翼连接臂的存在。

利用不同引物的PCR扩增确认了vHVT306具有预期的扩增模式和扩增子。

表达分析

对vHVT306 pre-MSV原液进行间接免疫荧光测定(IFA)。在室温用冰冷的95％丙酮固定利用vHVT306接种的CEF，进行3分钟，随后风干10分钟。在利用PBS洗涤3次后，添加两种一抗，即以1:500稀释的鸡抗-新城疫病毒血清(Charles Rivers Laboratories cat#10100641,lot#C0117A)和以1:3000稀释的抗HVT的L78单克隆抗体(Merial Select,Gainesville,GA)，在37℃温育45分钟。在利用PBS洗涤3次后，添加两种二抗，即以1:500稀释的山羊抗-鸡IgG-荧光素(KPL cat#.02-24-06,lot#110020)和以1:300稀释的驴抗-小鼠IgG-Alexa Fluor 568(Molecular Probe#A10037,lot#989784)。将板在37℃温育45分钟，随后利用PBS洗涤3次。使用Nikon Eclipse Ti倒置显微镜的异硫氰酸荧光素(FITC)-和四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)-滤光片，利用荧光显微观察细胞，以鉴定IFA阳性噬斑。

类似地，使用鸡抗-IBDV血清(Charles River Laboratories cat#10100610lot#G0117)(1:500的稀释度)和抗-NDV F单克隆抗体001C3(Asceitic fluid,Batch 10/09/044,02/11/2010)(1:300的稀释度)作为一抗，随后使用山羊抗-鸡IgG-荧光素(KPL cat#.02-24-06,lot#110020)(1:500的稀释度)和驴抗-小鼠IgG-Alexa Fluor 568(MolecularProbe#A10037,lot#989784)(1:300的稀释度)作为二抗，通过IFA来检查vHVT306的IBDVVP2蛋白(由SEQ ID NO:7编码的SEQ ID NO:8)的表达。

IFA结果表明vHVT306在病毒感染的CEF中表达NDV F基因。

使用显微镜的FITC-滤光片和TRITC-滤光片计数超过400个vHVT306噬斑。NDV F基因和IBDV VP2的总体表达匹配HVT噬斑(表5)。

表5 vHVT306的双重IFA

Southern印迹分析

从vHVT306pre-MSV原液感染的CEF提取总的基因组DNA。按照标准方案进行Southern印迹分析。

将总共3个探针用于确认vHVT306的SORF3与US2之间的NDV F盒(SV40启动子,NDVF密码子最优化的基因，合成poly A尾)以及IBDV VP2盒(mCMV启动子、IBDV VP2基因、SV40poly A尾)的保留。

Southern印迹结果显示基于Vector NTI(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)图谱分析所预期的消化模式。NDV F盒(SV40启动子、NDV F密码子最优化的基因、合成poly A尾)位于SORF3与US2之间，IBDV VP2盒(mCMV启动子、IBDV VP2基因、SV40poly A尾)是如亲代病毒(vHVT13)一样完整的。

基因组分析

对vHVT306 pre-MSV原液的基因组DNA进行测序以验证重组臂区域以及插入的基因盒的序列。

引物被设计来扩增用于供体质粒的整个被插入基因盒(包括重组臂)。vHVT306基因组DNA的分析通过PCR扩增和随后通过核苷酸序列测定来进行。

包含重组臂、SV40启动子和NDV F密码子最优化的基因的vHVT306(供体质粒pHVTUS2 SV-Fopt-synPA)经确认是正确的，如SEQ ID NO:20中显示的。

Western印迹分析

利用vHVT306 pre-MSV以MOI～0.1感染CEF单层。在4天的温育后，沉淀CEF，利用PBS洗涤CEF，随后按照制造商的方案，利用Pierce Classic IP试剂盒(Thermo Scientificcat#26146)的IP裂解/洗涤缓冲液进行裂解。预先澄清裂解物，用100ul抗-NDV F单克隆抗体001C3温育裂解物以制备免疫复合物。通过蛋白A/G Plus琼脂糖捕获免疫复合物，在通过洗涤步骤除去未结合的免疫复合物之后，将50ul的样品缓冲液用于在非还原条件下洗脱。包括有未感染的CEF作为对照。将20ul的洗脱样品在10％Bis-Tris凝胶中通过电泳进行分离。在电泳后，将分离的蛋白质转移至PVDF膜。按照制造商的方案，利用鸡抗-NDV血清(Charles River Laboratories Laboratories cat#10100641,lot#C0117A)和山羊抗-鸡IgG-过氧化物酶缀合物(KPL cat#14-24-06)，将Protein Detection TMB Western Blot试剂盒(KPL cat#54-11-50)用于检测PVDF膜上的NDV抗原。

通过两步免疫检测来确认vHVT306的NDV F蛋白表达。首先，使用抗-NDV F单克隆抗体001C3通过免疫沉淀捕获来自vHVT306感染的CEF的表达NDV F蛋白。随后，将使用抗-NDV多克隆血清(Charles River Laboratories cat#10100641,lot#C0117A)的Western印迹分析用于检测被捕获样品(NDV F蛋白-单克隆抗体复合物)中的NDV F蛋白(图8)。利用抗-NDV血清检测vHVT306pre-MSV裂解物中的55kDa蛋白，其对应于NDV F1融合蛋白的预期尺寸(图8)。

实施例4 表达NDV-F和IBDV VP2的双重HVT载体vHVT301、vHVT302、vHVT303、vHVT304和vHVT307以及表达IBDV VP2变体的双重HVT载体vHVT202的构建

实施例4.1 vHVT301、vHVT302、vHVT303、vHVT304和vHVT307的构建

双重HVT重组体vHVT301、vHVT302、vHVT303、vHVT304和vHVT307的产生和表征基本上以与实施例3中针对vHVT306所描述的方式相同的方式来进行。表6.1显示了表达盒周围对于每一个构建体而言独特的特征，包括各自的序列。

表6.1 双重HVT重组体的表达盒的特征

名称	亲代病毒	启动子	NDV-F基因	Poly-A	基因座
						vHVT301	vHVT13	SV40	Wt-VIId NDV-F	SV40	IG2
vHVT302	vHVT13	US10	Opt-VIId NDV-F	US10	US10
						vHVT303	vHVT13	US10	Opt-V NDV-F	US10	US10
vHVT304	vHVT13	SV40	Opt-VIId NDV-F	合成的	IG2
						vHVT306	vHVT13	SV40	Opt-VIId NDV-F	合成的	SORF3-US2
vHVT307	vHVT13	SV40	Opt-V NDV-F	合成的	SORF3-US2

vHVT301

用SmaI消化包含vHVT13的基因间2个臂序列的质粒pHVT IG2 SbfI(Merial专利材料)，随后对其进行去磷酸化，凝胶提取4.3kb片段。将包含SV40启动子、野生型NDV-F基因型VIId、SV40 poly A尾的供体质粒pHM103+NDV-F wt进行EcoRI和SalI消化，进行klenow处理，凝胶提取2.3kb片段。将两个片段连接以产生用于转染而得到重组vHVT301的供体质粒pHVT IG2 SV Fwt SbfI(SEQ ID NO：24)。

vHVT302

用NotI消化包含vHVT13的US10臂序列的合成质粒pHVT US10 cds，随后对其进行去磷酸化，凝胶提取4.7kb片段。将化学合成的、密码子最优化的NDV-F基因型VIId的侧翼连接有NotI的1.7kb片段进行NotI消化和凝胶提取。将两个片段连接以产生用于转染而得到重组vHVT302的供体质粒pHVT US10 cds F opt。被插入的F基因的转录应当由天然US10启动子驱动，并通过天然US10polyA信号终止。未添加外源启动子或polyA来表达该插入物。插入区域的测序确认了vHVT302包含密码子最优化的VIId NDV-F基因的正确序列，如供体质粒pHVT US10 cds F opt的序列(SEQ ID NO：25)中显示的。

vHVT303

用NotI消化包含vHVT13的US10臂序列的合成地合成的质粒pHVT US10 cds，对其进行去磷酸化，凝胶提取4.7kb片段。将化学合成的、密码子最优化的NDV-F基因型V的侧翼连接有NotI的1.7kb片段进行NotI消化和凝胶提取。将两个片段连接以产生用于转染以产生重组vHVT303的供体质粒pHVT US10 cds F CAO2 opt。与vHVT302一样，被插入的F基因的转录也应当由天然US10启动子驱动，并通过天然US10polyA信号终止。未添加外源启动子或polyA来表达该插入物。插入区域的测序确认了vHVT303包含密码子最优化的NDV-F基因型V的正确序列，如供体质粒pHVT US10 cds F CA02的序列(SEQ ID NO：26)中显示的。

vHVT304

用SbfI消化包含vHVT13的基因间2个臂序列的供体质粒pHVT IG2 SbfI，对其进行去磷酸化，凝胶提取4.3kb片段。用SbfI消化包含侧翼连接有SbfI的SV40启动子+密码子最优化的NDV-F基因型VIId+合成poly A尾的合成地合成的质粒，凝胶提取2.3kb片段。将两个片段连接以产生用于转染以产生重组vHVT304的供体质粒pHVT IG2 SV Fopt syn尾。插入物区域的测序确认了vHVT304包含SV40启动子、密码子最优化的VIId NDV-F基因和合成poly A尾的正确序列，如供体质粒pHVT IG2 SV Fopt syn尾的序列(SEQ ID NO:27)中显示的。

vHVT307

用SbfI消化包含vHVT13的US2和SORF3臂序列的供体质粒pHVT US2-SORF3，对其进行去磷酸化，凝胶提取5.1kb片段。用SbfI消化包含侧翼连接有SbfI的SV40启动子+密码子最优化的NDV-F基因型V+合成poly A尾的质粒SB-1 UL55 SV CaF syn尾SbfI，凝胶提取2.3kb片段。将两个片段连接以产生用于转染以产生重组vHVT307的供体质粒pHVT US2 SV-FCA02 opt-synPA。插入物区域的测序确认了vHVT307包含SV40启动子、密码子最优化的VIId NDV-F基因和合成poly A尾的正确序列，如供体质粒pHVT US2 SV-FCA02 opt-synPA的序列(SEQ ID NO：28)中显示的。

讨论

本工作的主要目的之一是通过将多个感兴趣的保护性基因整合至一个禽疱疹病毒主链(例如HVT)来开发多价的基于禽疱疹病毒的载体。该方法的前提条件是确定包含适当启动子-基因-plyA组合的表达盒并评价它们的遗传稳定性和保护免受特定疾病的能力。

为了产生有效的MD-IBD-ND三价载体疫苗，将密码子最优化的或非最优化的新城疫病毒(NDV)-F基因序列在人CMV(小鼠CMV已用于vHVT13中)下克隆入vHVT13主链(HVT-IBD，被批准的同时保护鸡免受MD和IBD感染的疫苗)。所有在人CMV启动子下的vHVT-IBD-F构建体在6代内失去F-蛋白表达，无论NDV-F序列是否被密码子最优化以及无论插入位点在何处。当将hCMV与密码子最优化的F蛋白组合时，与hCMV与野生型F-序列的组合(F蛋白表达在6代内丢失)相比较，F蛋白表达很快丢失(在2代内)。综合起来，这些数据显示人CMV不是用于产生表达NDV-F蛋白的稳定HVT重组体的理想启动子。令人惊讶地，本实施例显示SV40启动子和HVT内源启动子(US10启动子)产生表达NDV-F蛋白的稳定HVT重组体。

实施例4.2 vHVT202的构建

供体质粒HVT SORF3-US2 gpVar-Ewtsyn的构建

使用NotI从pUC57 Varient E wt质粒(由GeneScript合成的)切下包含合成Varient E野生型IBDV VP2基因(编码SEQ ID NO:42的SEQ ID NO:41)的片段，将其插入包含gpCMV启动子和合成polyA尾的SORF3和US2质粒的相同位点。使用Top10 Oneshot试剂盒(cat#C404002,Invitrogen)转化连接的材料。将细菌菌落生长在LBamp液体培养基中，使用Qiagens MiniSpin Prep试剂盒提取质粒，使用SacI+HindIII消化筛选插入物的定向。正确的供体质粒称为pHVT SORF3-US2 gpVar-Ewt Syn。表6.2显示表达盒周围对于构建体而言独特的特征，包括各自的序列。生长大规模培养物，使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。使用Fugene转染剂和抗IBDV鸡多克隆血清在鸡胚成纤维细胞(CEF’s)中验证大制备物的瞬时表达。

表6.2 双重HVT重组体的表达盒的特征

名称	亲代病毒	启动子	IBDV VP2基因	Poly-A	基因座
						vHVT202	vHVT306	豚鼠CMV	IBDV E VP2	合成的	SORF3-US2

重组体的产生

在进行标准同源重组操作后，使用pHVTSORF3-US2 gpVar-Ewt Syn供体质粒和从vHVT306分离的并用SbfI消化的病毒DNA进行二级CEF细胞的共电穿孔。将表达IBDV的经典VP2和NDV-F的vHVT306选择作为亲代来简化下述过程(section process)。变体E VP2供体质粒被设计来替代F基因，并且最初就F基因表达的不存在选择重组体，随后通过PCR就变体E VP2的存在选择重组体。使用1x10⁷个2°CEF(于300μl Opti-MEM中)进行共电穿孔，在2mm电穿孔杯中以950的电容于150伏下进行电击。将转染的细胞接种入96孔板，温育5-7天。随后将96孔板中生长的细胞复制成2个96孔板，再温育5天。将一套96孔板用于使用抗NDV-F的鸡多克隆血清的IFA，以鉴定包含vHVT30亲代的阳性孔，将另一套96孔板用于从IFA阴性孔回收被感染的细胞。

首先通过96孔板复制和通过IFA选择包含最多IFA阴性(抗NDV-F)噬斑和最少量IFA阳性噬斑的孔来进行重组病毒纯化法。随后收集匹配这些标准的孔，将其在DMEM+2％FBS中调整至1ml。从1ml原液取出5-20μl(取决于可见噬斑的数目)，将其与1x10⁷个CEF在10ml DMEM+2％FBS中混合，等分至新的96孔板上以试图在每孔中得到单个HVT噬斑。在4天的温育后复制96孔板，通过IFA和PCR就重组HVT的存在和亲代病毒的不存在测试包含噬斑的孔。再次地收获显示具有更多重组病毒和更少亲代病毒的孔(通过与PCR条带(PCRbanding)结果相比较)，将其调整至1ml，等分至新的96孔板中(与先前一样)。在5轮病毒感染细胞的纯化后，分离具有2种IBDV VP2蛋白的重组HVT，通过PCR测试重组病毒的纯度以确认亲代病毒的不存在。

插入区的测序确认了vHVT202包含豚鼠CMV启动子、IBDV变体E野生型VP2基因和合成poly A尾的正确序列，如供体质粒HVT SORF3-US2 gpVar-Ewtsyn的序列(SEQ ID NO:39)中显示的。

通过PCR进行重组体分析

通过酚/氯仿提取从原液病毒提取DNA，将DNA乙醇沉淀，重悬浮于20mM HEPES中。PCR引物被设计来特异性鉴定Varient E wt基因、启动子、polyA以及来自HVT亲代病毒的重组病毒的纯度。使用200μg DNA模板以及表1中显示的指定引物对来进行PCR。PCR循环条件如下(除非另有所指)：94℃–2分钟；30个循环(94℃–30秒，55℃–30秒，68℃–3分钟)；68℃–5分钟。

使用对于HVT侧翼连接臂、gpCMV启动子、Varient E基因和syn尾是特异性的引物对通过PCR来确认重组病毒的纯度。特异于SB1、MDV血清型2(SB1US1.FP+SB1Sorf4.RP)的引物也包括在分析中。PCR结果显示重组病毒vHVT202具有期望的表达盒并且病毒原液不含可检测量的亲代HVT病毒。

表达IBDV的两个VP2蛋白的重组vHVT202病毒的免疫荧光染色

为了进行免疫荧光测试，将P3材料以1:100稀释于介质中。将约50μl的稀释病毒添加至10ml含有1x10⁷个CEF的DMEM+2％FBS中，随后等分至96孔板(100μl/孔)中。将板在37℃+5％CO₂温育4天，直至病毒噬斑可见。用95％冰冷丙酮固定板，进行3分钟，用PBS洗涤3次。将一个孔用于1:1000的抗新城疫病毒鸡抗-血清(lot#C0139,Charles RiversLaboratory)，将板在37℃温育1小时。其它孔用于抗IBDV的鸡抗-血清(lot#G0117)。在1小时的温育后，用PBS洗涤板3次，以1:500添加FITC抗-鸡(cat#F8888,Sigma)。再次地将板在37℃温育1小时。在1小时的温育后，用PBS漂洗细胞3次，使用异硫氰酸荧光素(FITC)滤光片利用荧光显微镜进行显现。

当使用抗经典E VP2蛋白和变体E VP2蛋白的多克隆血清时，免疫荧光染色结果表明vHVT202显示了极强的VP2蛋白表达。

结论

基于PCR和免疫荧光分析，vHVT202是其中在gpCMV启动子控制下的变体E IBDV的VP2基因被成功地插入重组HVT背景(其已表达经典IBDV的VP2基因)的重组HVT。因此，vHVT202具有变体E和经典IBDV的VP2基因，并且其不含任何可检测的亲代vHVT306病毒。

实施例5 表达NDV-F的重组vSB1-009、vSB1-004、vSB1-006、vSB1-007、vSB1-008和vSB1-010的构建

实施例5.1 vSB1-009、vSB1-004、vSB1-006、vSB1-007和vSB1-008的构建

本研究的目的是构建重组SB-1病毒载体vSB1-009，其中包含SV40启动子和新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)的表达盒被插入来替代SB-1的UL44编码序列(gC)。

构建包含SB1病毒的UL44侧翼连接臂、SV40启动子和NDV F密码子最优化基因序列(SEQ ID NO:5，编码SEQ ID NO:6)的供体质粒pSB1 44 cds SV FCAopt。

重组病毒的产生

在进行标准同源重组操作后，使用供体质粒pSB1 44 cds SV FCAopt和从SB-1病毒感染的CEF分离的病毒DNA进行次级CEF细胞的共电穿孔。进行基本上如实施例1中针对vHVT114描述的方法以产生重组体，进行噬斑纯化，通过免疫荧光表征重组体。

在5轮噬斑纯化后，分离纯重组病毒(vSB1-009)，通过IFA和PCR测试vSB1-009的纯度以确认适当的插入以及无残留亲代病毒。

PCR分析

利用QIA DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen cat#69506)从vSB1-009原种前种子病毒(pre-MSV)原液提取病毒DNA。PCR引物被设计来鉴定最优化的NDV F、NDV F野生型、SV40启动子、mCMV启动子、SB-1病毒的UL44侧翼连接臂和HVT病毒的存在。使用约200ng DNA模板和引物对进行PCR扩增。

利用不同引物的PCR扩增确认vSB1-009具有预期的扩增模式和扩增子。

表达分析

对vSB1-009 pre-MSV原液进行间接免疫荧光测定(IFA)以检查NDV F基因和SB-1病毒抗原的表达。在室温用冰冷的95％丙酮固定利用vSB1-009接种的CEF，进行3分钟，风干10分钟。在利用PBS洗涤板后，添加两种一抗，即以1:500稀释的鸡抗-新城疫病毒血清(Charles Rivers Laboratories cat#10100641,lot#C0117A)和以1:3000稀释的抗SB-1病毒的Y5.9单克隆抗体(Merial Select,Gainesville,GA)，在37℃温育板45分钟。在利用PBS洗涤3次后，添加两种二抗，即以1:500稀释的山羊抗-鸡IgG-荧光素(KPL cat#.02-24-06,lot#110020)和以1:250稀释的驴抗-小鼠IgG-Alexa Fluor 568(Molecular Probe#A10037,lot#989784)。将板在37℃温育45分钟，随后利用PBS洗涤3次。使用Nikon EclipseTi倒置显微镜的异硫氰酸荧光素(FITC)和四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)-滤光片，利用荧光显微镜筛选孔的IFA阳性噬斑。类似地，使用抗-MDV血清(Charles RiverLaboratories,cat#10100628,lot#D0111)(1/300的稀释度)和抗-NDV F单克隆抗体(1/300的稀释度)作为一抗通过双重IFA来检查vSB1-009与NDV F Mab的反应性。将山羊抗-鸡IgG-荧光素(KPL cat#.02-24-06,lot#110020)(1:500的稀释度)和驴抗-小鼠IgG-Alexa Fluor568(Molecular Probe#A10037,lot#989784)(1:300的稀释度)用作二抗。使用NikonEclipse Ti倒置显微镜的FITC-和TRITC-滤光片利用荧光显微镜观察孔以鉴定IFA阳性噬斑。

IFA结果表明vSB1-009在病毒感染的CEF中表达NDV F蛋白。利用双重IFA计数超过500个vSB1-009噬斑的NDV F蛋白表达以及SB-1病毒特异性蛋白表达。NDV F蛋白的表达完全匹配每一个病毒噬斑中的SB-1病毒抗原表达(表7)。

表7 vSB1-009的双重IFA

通过双重IFA确认NDV F Mab反应性。检查超过200个vSB1-009噬斑的NDV F Mab反应性以及抗-MDV血清反应性。与NDV F Mab的反应性完全匹配每一个病毒噬斑中的抗-MDV血清反应性(表8)。

表8 vSB1-009与抗-NDV F Mab的反应性

Southern印迹分析

从vSB1-009 pre-MSV原液感染的CEF提取总的基因组DNA。分别用EcoRI、NcoI和KpnI限制性核酸内切酶在37℃消化vSB1-009、SB-1病毒(阴性对照)、pSB1 44 cds SV FCAopt供体质粒的基因组DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离限制性片段，将其转移至带正电荷的Nylon膜上。转移后，用0.4M NaOH处理膜，随后用2XSSC-HCl缓冲液中和。随后风干膜，进行UV交联。

按照North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection试剂盒(Thermo Scientific cat#89880)制造商的说明书，将膜预杂交1hr，随后在55℃与探针杂交过夜。为了进行杂交，使用两个探针；1)作为NDV F盒探针的pSB1 44cds SV FCA opt的SbfI片段，2)作为重组臂探针的pUC57SB1 44臂的SmaI-EcoRI片段(GenScript)。在过夜杂交后，进行数次严格性洗涤，直至膜被置于添加有链霉抗生物素蛋白-HRP的封闭缓冲液中。在漂洗掉膜的任何未结合的链霉抗生物素蛋白-HRP后，添加鲁米诺和过氧化物的底物溶液。随后将膜暴露于X射线胶片，使胶片显影。

Southern印迹结果是如基于Vector NTI图谱分析所预期的。NDV F盒(SV40启动子、NDV-F CA02密码子最优化的基因)替代SB-1病毒的UL44编码序列。

基因组分析

通过重组臂的区域以及插入的基因盒的核苷酸序列测定来进行vSB1-009 pre-MSV原液的基因组DNA分析。引物被设计来用于扩增包括重组臂的完整NDV-F基因盒。

包含重组臂、SV40启动子和NDV F密码子最优化的基因的vSB1-009序列(供体质粒pSB1 44 cds SV FCAopt)经确认是正确的，如SEQ ID NO:19中显示的。

Western印迹分析

利用vSB1-009 pre-MSV以MOI～0.1感染CEF单层。在5天的温育后，沉淀CEF，利用PBS洗涤CEF，随后按照制造商的方案，利用Pierce Classic IP试剂(Thermo Scientificcat#26146)的IP裂解/洗涤缓冲液进行裂解。预先澄清裂解物，用100ul抗-NDV F单克隆抗体温育裂解物以制备免疫复合物。通过蛋白A/G Plus琼脂糖捕获免疫复合物，在通过洗涤步骤除去未结合的免疫复合物之后，将50ul的样品缓冲液用于在非还原条件下洗脱。包括未感染的CEF作为对照。将20ul的洗脱样品在10％Bis-Tris凝胶中通过电泳进行分离。在电泳后，将凝胶中分离的蛋白质转移至PVDF膜。按照制造商的方案，利用鸡抗-NDV血清(Charles River Laboratories Laboratories cat#10100641,lot#C0117A)和山羊抗-鸡IgG-过氧化物酶缀合物(KPL cat#14-24-06)，将Protein Detection TMB Western Blot试剂盒(KPL cat#54-11-50)用于检测PVDF膜上的NDV抗原。

通过两步免疫检测来确认vSB1-009的NDV F蛋白表达。首先，使用抗-NDV F单克隆抗体001C3通过免疫沉淀捕获来自vSB1-009感染的CEF裂解物的表达NDVF蛋白。随后，将使用抗-NDV多克隆血清的Western印迹分析(Charles River Laboratories cat#10100641,lot#C0117A)用于检测捕获的样品(NDV F蛋白-单克隆抗体复合物)中的NDV F蛋白(图9)。利用抗-NDV血清检测vSB1-007 pre-MSV裂解物中的约55kDa蛋白，其对应于NDV F1融合蛋白的预期尺寸(图9)。

基本上以与本实施例中描述的用于vSB1-009的方式相同的方式进行HVT重组体vSB1-004、vSB1-006、vSB1-007和vSB1-008的产生和表征。表9.1显示表达盒周围对于每一个构建体而言独特的特征，包括各自的序列。重组SB1病毒载体的产生和表征也描述于2012年11月29日提交的美国专利申请系列No.US SN13/689,572(Merial limited)(将其通过引用整体并入本文)中。

表9.1 SB1重组体的表达盒的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	基因座
					vSB1-009	SB1	SV40	Opt-CA02	UL44(gC)
vSB1-004	SB1	mCMV IE	Wt-VIId	US10
					vSB1-006	SB1	SV40	Opt-VIId	UL55/LORF5
vSB1-007	SB1	SV40	Opt-VIId	UL44(gC)
					vSB1-008	SB1	SV40	Opt-CA02	UL55/LORF5

实施例5.2 双重构建体vSB1-010的构建

供体质粒SB1US2 gpVIIdwtsyn的构建

使用质粒HVT SOrf3-US2 gpVar-Ewt Syn，通过SbfI消化除去gpCMV、Varient E、Syn尾。将该片段连接入SB1 US2供体质粒。通过NotI切出Varient E基因，并利用NDV-FVIId wt替代。使用NotI消化从pUC57 NDV-F VIId wt质粒(由GeneScript合成的)切出合成NDV-F VIId野生型基因(SEQ ID NO:3，编码SEQ ID NO:4)。使用Top10 Oneshot试剂盒(cat#C404002,Invitrogen)转化连接的材料。将细菌菌落生长在LBamp液体培养基中，使用Qiagens MiniSpin Prep试剂盒提取质粒，使用NcoI+SalI消化筛选插入物的定向。正确的供体质粒称为pSB1US2gpVIIdwt Syn。表9.2显示表达盒周围对于构建体独特的特征，包括各自的序列。生长大规模培养物，使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。使用Fugene转染剂和抗NDV-F鸡多克隆血清在鸡胚成纤维细胞(CEF’s)中验证大制备物中的瞬时表达。

重组体的产生

在进行标准同源重组法后，使用pSB1 US2 gpVIIdWt Syn供体质粒和从vSB1-009(vSB1-009是表达NDV的CA02 F基因的重组病毒)分离的病毒DNA进行次级CEF细胞的共电穿孔。基本上按照实施例1中针对vHVT114描述的方法产生重组体，进行噬斑纯化，通过免疫荧光表征重组体。

在5轮噬斑纯化后，分离纯的重组病毒(vSB1-010)，通过IFA和PCR测试vSB1-010的纯度以验证适当的插入以及无残留亲代病毒。

表9.2 vSB1-010的表达盒的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	基因座
					vSB1-010	vSB1-009	豚鼠CMV	NDV-F VIId	SORF4-US2

插入区的测序确认了vSB1-010包含豚鼠CMV启动子和NDV-F VIId wt基因的正确序列，如供体质粒SB1US2 gpVIIdwtsyn的序列(SEQ ID NO:40)中显示的。

通过PCR进行的重组体的分析

通过苯酚/氯仿提取从病毒原液提取DNA，将DNA乙醇沉淀，重悬浮于20mM HEPES中。PCR引物被设计来特异性鉴定NDV-F VIId wt基因、启动子、polyA以及来自SB1亲代病毒的重组病毒的纯度。使用200μg DNA模板以及表1中显示的指定引物对来进行PCR。PCR循环条件如下(除非另有所指)：94℃–2分钟；30个循环(94℃–30秒，55℃–30秒，68℃–3分钟)；68℃–5分钟。

使用对于SB1侧翼连接臂、gpCMV启动子、NDV-F VIId wt基因和syn尾特异性的引物对通过PCR来确认重组病毒的纯度。特异于HVT、MDV血清型3(MB080+MB081)的引物也包括在分析中。PCR结果显示重组病毒vSB1-010具有期望的表达盒并且病毒原液不含可检测量的亲代SB1-009病毒。

表达两个NDV-F蛋白的重组vSB1-010病毒的免疫荧光染色

为了进行免疫荧光测试，将P3材料以1:100稀释于介质中。将约50μl的稀释病毒添加至10ml含有1x10⁷个CEF的DMEM+2％FBS中，随后等分至96孔板(100μl/孔)中。将板在37℃+5％CO₂温育5天，直至病毒噬斑可见。用95％冰冷丙酮固定板，进行3分钟，用PBS洗涤3次。以1:1000添加抗新城疫病毒的鸡抗-血清(lot#C0139,Charles Rivers Laboratory)，将板在37℃温育1小时。在1小时的温育后，用PBS洗涤板3次，以1:500添加FITC抗-鸡(cat#F8888,Sigma)。再次地将板在37℃温育1小时。在1小时的温育后，用PBS漂洗细胞3次，使用异硫氰酸荧光素(FITC)滤光片，利用荧光显微镜进行显现。

当使用抗NDV的CA02和VIId F蛋白的多克隆血清时，免疫荧光染色结果表明vSB1-010显示了极强的NDV-F蛋白表达。

结论

基于PCR测试和免疫荧光分析，vSB1-010是其中在gpCMV启动子控制下的NDV的VIId-F基因被成功地插入vSB1-009(其已表达NDV的CA02-F基因)的重组SB-1。因此，vSB1-010具有NDV基因型的VIId和CA02 F基因，并且其不含任何可检测的亲代vSB1-009。

实施例6表达NDV F基因的vHVT110、vHVT111、vHVT114和vSB1-004在14日龄SPF鸡中抵御NDV Chimalhuacan和Malaysian(MAL04-01)株的攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F基因的3个HVT重组构建体(vHVT110、vHVT111和vHVT114)和1个SB1重组构建体(vSB1-004)抵御在14日龄SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Chimalhuacan和Malaysian病毒株)的效力。

这5个疫苗候选者的特征描述于下面表10中。

表10 用于攻击研究的载体的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT110	HVT	mCMV IE	Wt-VIId	SV40	IG1
vHVT111	HVT	SV40	Wt-VIId	SV40	IG1
						vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
vSB1-004	SB-1	mCMV IE	Wt-VIId	SV40	US10

在D0天，将100只1日龄SPF鸡随机分配至10个组(每组10只鸡)中。如下表11中所描述的，在D0，利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。应当提及的是，给组6的鸡施用的vSB1-004的滴度(31600pfu)大大高于靶剂量。在D14天通过肌内途径利用速发型ND Malaysia(基因型VIId)株(亚组“a”)或利用强毒ND Chimalhuacan(基因型V)株(亚组“b”)攻击鸡。

表11 利用vHVT110、vHVT111、vHVT114和vSB1-004的攻击研究

*通过NDV HI测试显示为阳性的鸡的数目/测试的总数

在攻击之前和之后监控每一个组。如下每日对攻击后临床体征评分：健康/具有特定症状(竖起的羽毛、虚脱、斜颈、颤抖)/死亡。在D14天，采集每一个组的血清样品用于血清学测试(新城疫病毒血细胞凝集抑制(HI)测试)。

如所预期的，未接种的动物(G1a和G1b)在D14天未显示NDV抗体。在每一个接种的组(G2至G5的亚组“a”和“b”)中获得低滴度的血清转化(平均HI滴度<0.6log10)，从而确认了疫苗获得。阳性鸡的数目/测试的总鸡数是组依赖性的，并且在接种vHVT114的鸡中最高(90％)(参见上表)。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表中。在对照组G1a和G1b中观察到完全易感性，从而确认了两个攻击的高度严重性。在接种vHVT111或vSB1-004的组中观察到最低保护水平。在接种vHVT110或vHVT114的组中获得最高的抗死亡和发病的保护率，无论使用的攻击株是什么(同源株即Malaysian基因型VIId或异源株即Chimalhuacan基因型V)。在攻击前通过HI测试显示为阳性的鸡的百分比与保护作用的百分比之间存在关联性。

vHVT110与vHVT111之间获得的保护作用的差异明确地举例说明了启动子的重要性，对于野生型(wt)基因型VIId F基因的转录而言，mCMV IE启动子比SV40启动子更强。vHVT111与vHVT114之间获得的保护作用的差异举例说明了F基因的核苷酸序列的重要性，最优化的序列比野生型(或天然)序列更强。

总之，本研究的结果显示启动子和F基因的核苷酸序列在由马立克氏病载体疫苗诱导的ND保护作用中的重要性。需要找到对于vHVT114实现最佳效力性能的这些因子最佳组合。

实施例7 表达NDV F基因的vHVT114、vHVT116、vHVT301、vHVT302和vHVT303在14日龄SPF鸡中抗NDV Texas GB株的攻击的效力

本研究的目的是估量2个表达NDV F基因的单一HVT重组构建体((vHVT114和vHVT116))和3个表达NDV F和IBDV VP2基因二者的双重HVT重组构建体(vHVT-301、vHVT302和vHVT303)抵御在14日龄SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Texas GB株，基因型II)的效力。

这4个疫苗候选者的特征描述于下表12中。

表12 用于攻击研究的载体的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
vHVT116	HVT	SV40	Opt-V	SV40	IG1
						vHVT301	vHVT13*	SV40	Wt-VIId	SV40	IG2
vHVT302	vHVT13	US10	Opt-VIId	US10	US10
						vHVT303	vHVT13	US10	Opt-V	US10	US10

*vHVT13是基于表达IBDV VP2基因的HVT载体的已批准Vaxxitek HVT-IBD疫苗的活性成分(参见US 5,980,906和EP 0 719 864)。

在D0天，将120只1日龄SPF鸡随机分配至6个组(每组20只鸡)中。如下表13中所描述的，在D0天利用0.2mL包含1000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D14天通过肌内途径利用4.5 log10 EID50速发型ND Texas GB(基因型II)株攻击鸡。

表13 效力的结果

*1只鸡在攻击前死亡

在攻击之前和之后监控每一个组。在攻击后记录NDV临床体征和死亡率。

临床保护作用的百分比报告于上表中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了两个攻击的高度严重性。对于5个疫苗候选者观察到部分保护作用，对于vHVT114和vHVT116观察到最佳性能。在双重HVT重组体中，vHVT302最具保护作用。其表现比vHVT303好，这表明最优化的基因型VIId NDV F基因可具有比最优化的基因型V NDV F基因更好的抗基因型II攻击的交叉保护作用。对于单一HVT观察到类似的趋向，vHVT114(VIId基因)表现比vHVT116(V基因)稍好，但差异不太显著。这些结果表明HVT载体中插入的基因型VIId和V NDV F基因都提供了抗异源基因型II NDV攻击的交叉保护作用；VIId基因可能潜在地更具交叉保护性。vHVT302诱导比vHVT301更好的ND保护作用，从而确认了启动子、poly-A和插入的基因座的重要性。总之，本研究的结果显示由测试的马立克氏病载体疫苗(特别地对于测试的单一HVT-ND)诱导的极好的早期ND保护作用。

实施例8 vHVT114、vHVT116、vSB1-007、vSB1-008(单独地或与vHVT13一起地)和vHVT 304在21日龄SPF鸡中抗利用NDV ZJ1(基因型VIId)和California/02(基因型V)的攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F基因的2个单一HVT重组构建体(vHVT114和vHVT116)、表达NDV F基因的2个SB1重组构建体(vSB1-007和vSB1-008)以及双重HVT重组体(vHVT304)抵御在21日龄SPF鸡中进行的利用NDV ZJ1(基因型VIId)和California/02(基因型V)的新城疫疾病攻击的效力。

这5个疫苗候选者的特征描述于下面表14中。

表14 用于攻击研究的载体的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
vHVT116	HVT	SV40	Opt-V	SV40	IG1
						vSB1-007	SB-1	SV40	Opt-VIId	gC	UL44(gC)
vSB1-008	SB-1	SV40	Opt-V	SV40	IG1
						vHVT304	vHVT13*	SV40	Opt-VIId	Synth	IG2

*vHVT13是基于表达IBDV VP2基因的HVT载体的被批准Vaxxitek HVT-IBD疫苗的活性成分(参见US 5,980,906和EP 0 719 864)。

在D0天，158只1日龄SPF鸡随机分配至6个各24只的组(接种组)和1个12只的组(不接种的对照)中。如下表15中所描述的，在D0，利用0.2mL包含1000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。随后将鸡分成两个亚组，每一个亚组在D21天通过肌内途径利用5 log10 EID50的NDV ZJ1(基因型VIId)或California/02(基因型V)速发型株进行攻击。

表15 效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。对于分离株观察到的技术问题使组2(vHVT114：从24至14)和组3(vHVT116：从24至20)中的鸡的数目减少。攻击后记录NDV临床体征。在攻击(D21)前从采自组2和7的鸡的血液样品收集血清以用于通过使用每一个攻击株作为抗原的HI测试进行的NDV血清学。

攻击前G2和G7中的平均血清学HI滴度示于图10中。在两个组中对ZH1抗原，HI滴度更高。由vHVT114诱导的HI滴度比由vHVT304诱导的HI滴度高。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了两个攻击的高度严重性。所有疫苗诱导了高水平(≥75％)的抗两种攻击的保护作用。vHVT114和vSB1-008诱导了抗两个攻击的完全临床保护作用。遵照与HI滴度相似的趋向，vHVT304诱导的ND保护作用略低于vHVT114诱导的ND保护作用。

攻击后通过实时RT-PCR评价攻击后2和4天采集的口腔和泄殖腔拭子中的脱落。针对两个攻击的阳性(Ct<40)鸡的百分比示于图11A和11B中。注意，利用CA/02分离株攻击的对照组中的所有6只鸡在4dpch死亡，在利用ZJ1攻击的对照组中仅1只鸡(6只中的1只)在4dpch仍然存活。在所有对照鸡中检测到脱落。在所有接种的组中观察到对于脱落呈阳性的鸡的百分比的减少。

总之，本研究的结果显示在3周龄时由测试的马立克氏病载体疫苗诱导的极好ND保护作用。

实施例9 vHVT114、vSB1-007、vSB1-009、vHVT306和vHVT307疫苗在28日龄SPF鸡中抗NDV Texas GB株的攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F和/或IBDV VP2基因的不同马立克氏病载体疫苗的组合抵御在28日龄SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Texas GB株，基因型II)的效力。

本研究中测试的5个重组疫苗候选者的特征描述于下面表16中。

表16 用于攻击研究的载体的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
vSB1-007	SB-1	SV40	Opt-VIId	gC	UL44(gC)
						vSB1-009	SB-1	SV40	Opt-V	gC	UL44(gC)
vHVT306	vHVT13	SV40	Opt-VIId	Synth	SORF3-US2
						vHVT307	vHVT13	SV40	Opt-V	Synth	SORF3-US2

在一些组中，还将马立克氏病病毒血清型1(CVI988(或Rispens)株；禽疱疹病毒2)和血清型2(SB-1株；禽疱疹病毒3)疫苗与重组病毒组合使用。

在D0天，将135只1日龄SPF鸡随机分配至9个组(每组15只鸡)中。在D0，利用在0.2ml中包含2000pfu靶剂量的重组疫苗(vSB1-007、vSB1-009、vHVT13、vHVT306、vHVT307、vHVT114)和1000pfu的亲代马立克氏病疫苗株(SB-1和CVI988)通过皮下注射在颈部注射鸡。9个组的设计示于下面表17中。在D28通过肌内途径利用4.0 log10 EID50速发型NDTexas GB(基因型II)株攻击鸡。

表17 效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后NDV临床体征。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在所有接种的组中观察到极佳水平的保护作用。来自G3、G6、G7和G9的鸡获得完全保护。本研究显示vSB1-ND候选者可与vHVT13与CVI988共施用，并且仍然提供很好的ND保护作用。类似地，双重HVT-IBD+ND与SB-1相容，并且vHVT-ND(vHVT114)与vHVT13和SB-1相容。

总之，本研究的结果显示不存在对由测试的马立克氏病亲代和载体疫苗诱导的ND保护作用的干扰。

实施例10 与vHVT13组合的vHVT114、vHVT307、vSB1-007和vSB1-009在D28SPF鸡中抗NDV Chimalhuacan株(基因型V)的攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F基因的1个HVT重组构建体(vHVT114)和2个SB1重组构建体(vSB1-007和vSB1-009)与vHVT-IBD(vHVT13)的组合，以及表达NDV F和IBDV VP2的双重HVT vHVT307抵御在28日龄SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Chimalhuacan,基因型V)的效力。

这4个疫苗候选者的特征描述于下面表18中。

表18 攻击研究中使用的载体的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT114	HVT	SV40	Opt-VIId	SV40	IG1
vSB1-007	SB-1	SV40	Opt-VIId	gC	UL44(gC)
						vSB1-009	SB-1	SV40	Opt-V	gC	UL44(gC)
vHVT307	vHVT13	SV40	Opt-V	Synth	SORF3-US2

在D0，将45只1日龄SPF鸡随机分配至4个组(每组10只鸡)和1个组(5只鸡，未接种的对照组)中。如下表19中所描述的，在D0天利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D28通过肌内途径利用5.0 log10 EID50速发型Chimalhuacan(基因型V)株攻击鸡。

表19 效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后NDV临床体征。在攻击后5和7天在接种的组中获取口咽拭子来通过实时RT-PCR评估病毒载量。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在所有4个接种的组中观察到极好的保护作用，vHVT114+vHVT13诱导了完全临床保护作用。

阳性鸡的百分比和平均脱落滴度(表达为log10 EID50当量/mL)示于图12A和12B中。令人惊讶地，在G2中未检测到脱落，表明在测试的条件下，即使与vHVT13共施用，vHVT114仍然诱导完全(针对临床体征和脱落而言)ND保护作用。在另一个接种的组中检测到的脱落水平低，仅在感染后(pi)5天在G3中检测到略微更高的水平。

总之，本实施例进一步举例说明了由双重HVT-IBD+ND重组体或SB1-ND或HVT-ND与HVT-IBD(vHVT13)重组病毒的组合诱导的极佳ND保护作用。与第二HVT疫苗(常规HVT疫苗或重组HVT疫苗)干扰对插入第一重组HVT疫苗的外源基因的免疫力的本领域一般观念相反，本发明显示令人惊讶的结果：与vHVT13组合的vHVT114提供极佳的抗NDV保护作用并且未观察到干扰作用。

实施例11 通过SC或卵内途径施用的与vHVT13组合的vHVT306、vSB1-008在D28于SPF鸡中抗NDV Chimalhuacan株(基因型V)的攻击的效力

本研究的目的是估量通过卵内或通过皮下途径施用的表达NDV F和IBDV VP2基因的vHVT306双重HVT和与vHVT-IBD(vHVT13)组合的表达NDV F基因的vSB1-008 SB1重组体抵御在28日龄于SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Chimalhuacan,基因型V)的效力。

这2个ND疫苗候选者的特征报告于表14(vSB1-008)和表16(vHVT306)中。

各组的设计示于表20中。将60个SPF鸡胚蛋(在约18天又18小时的温育后；D-3)用于卵内施用(对于G1、G2和G3，每组20个)。使用来自AviTech LLC的IntelliLab系统装置(Salisbury,MD,USA)通过卵内途径施用50微升包含2000PFU的疫苗。在卵内施用后记录孵化率和存活率。在D0天，将20只1日龄SPF鸡随机分配入2组(G4和G5)(每组10只鸡)。如下表20中所描述的，在D0，利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下(SC)注射在颈部注射鸡。在D28利用5.0 log10 EID50速发型Chimalhuacan(基因型V)株通过肌内途径攻击每组10只鸡。

表20 研究设计和ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后NDV临床体征。在攻击后5和7天在接种的组中采集口咽拭子以通过实时RT-PCR来评估病毒载量。

记录组G1和G2的鸡的完全孵化率和活力直至D28(攻击日)。G3中的孵化率为85％，并且在该组中另有一只鸡在孵化后死亡。该组的更低的孵化率可能归因于鸡胚孵育箱问题。G1、G2和G3中的雄性和雌性的体重在D1和D28相似。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于表20中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在所有4个接种的组中观察到很好的保护作用，通过两个途径施用的vHVT306均诱导了完全临床保护作用。

阳性鸡的百分比和平均脱落滴度(表达为log10 EID50当量/mL)示于表21中。在利用vHVT306接种的G2和G4中未观察到可检测的脱落或仅有极低脱落。在利用vSB1-008+vHVT13接种的组中检测到的脱落水平尤其地在感染后(pi)5天更高。

表21 在NDV攻击后D5和D7评估的抗脱落的保护作用的结果(具有可检测的脱落的鸡的百分比和以log10表示的平均病毒载量)

*以log10 EID50当量表达的平均定量实时PCR值；阈值被设置在2.7log10。

总之，本实施例显示由通过卵内或通过SC途径施用的vHVT306双重HVT重组诱导的极佳ND保护作用。vSB1-008+vHVT13的性能尤其在卵内施用后略微更低，但其可能至少部分归因于鸡胚孵育箱问题。事实上，与6000 PFU的vHVT13结合的1000或4000PFU另一SB1-ND重组体(vSB1-009)的卵内安全性测试在孵化率上和早期存活率方面未显示与仅接受6000PFU的vHVT13的组有任何差异。

实施例12 与vHVT13组合的vHVT304、vHVT306、vSB1-007和vSB1-008在D42在商业肉鸡中抗NDV Chimalhuacan株(基因型V)攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F和IBDV VP2基因的两个双重HVT(vHVT304和vHVT306)和与vHVT-IBD(vHVT13)组合的两个表达NDV F基因的SB1重组体(vSB1-007和vSB1-008)抗在42日龄商业肉鸡中进行的新城疫疾病攻击(Chimalhuacan，基因型V)的效力。

这4个ND疫苗候选者的特征报告于表14和16中。组的设计示于表22中。在D0，将55只1日龄商业肉鸡随机分配入5个组(每组11只鸡)。如下表22中所述，在D0，利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下(SC)注射在颈部注射鸡。在D42，利用5.0 log10 EID50速发型Chimalhuacan(基因型V)株通过肌内途径攻击每组10只鸡。

表22 研究设计和ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后14天期间的NDV临床体征。在攻击后5和7天在接种的组中采集口咽拭子以通过实时RT-PCR来评估病毒载量。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于表22中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在所有4个接种的组中观察到很好的保护作用，vHVT306和vSB1-007+vHVT13诱导了完全临床保护作用。

阳性鸡的百分比和平均脱落滴度(表达为log10 EID50当量/mL)示于表23中。vHVT306和vSB1-007+vHVT13诱导了最佳的脱落减少，就临床保护作用而言它们也是最佳候选者。

表23 在NDV攻击(pi)后D5和D7评估的抗脱落的保护作用结果(具有可检测的脱落的鸡百分比和以log10表示的平均病毒载量)

*以log10 EID50当量表达的平均定量实时PCR值；阈值被设置在2.7 log10。

发现vHVT306ND的保护作用好于vHVT304的保护作用。这两个双重HVT包含相同的NDV F表达盒，但插入在两个不同的基因座，IBDV VP2表达盒插入在相同的位置。因此本实施例举例说明了插入的基因座在HVT重组体的设计中的重要性。vSB1-007+vHVT13好于vSB1-008+vHVT13。vSB1-007基因组结构在不同方面与vSB1-008的基因组结构不同：插入的基因座、启动子、多聚腺苷酸化信号和F基因来源。vSB1-007中这些外来序列与插入的基因座的组合可能负责其更好的ND保护性能。

概括而言，本实施例举例说明了插入的基因座和NDV表达盒中的其它调控序列在通过HVT和MDV血清型2载体诱导的ND保护中的重要性。

实施例13 双重HVT-ND+IBD(vHVT304和vHVT306)或与vHVT13重组疫苗组合的SB1-ND(vSB1-008)在D14于SPF鸡中的抗经典IBDV分离株的攻击的效力

本研究的目的是估量双重HVT重组体vHVT304和vHVT306以及与SB1-ND(vSB1-008)重组构建体共施用的vHVT13抗在14日龄SPF鸡中进行的强毒性传染性法氏囊病病毒(vIBDV)攻击(Faragher52/70株)的早期IBD效力。

本研究中使用的双重HVT和SB1重组体的特征示于表14和16中。

在D0，将95只1日龄SPF鸡随机分配入9个组(每组10只鸡)和1个组(5只鸡，未接种的未被攻击对照组)。如下表24中所描述的，在D0，利用包含300或1000pfu靶剂量的0.2mL的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D14，利用试剂盒plus IBD(Synbiotics Corp)从每组5只鸡收集血液样品来进行血清学测试。在D14，利用2.5 log10EID50通过滴眼剂(0.05mL/鸡)攻击鸡(除其中1只鸡在攻击前死亡的组7外，每组10只鸡)。

表24 研究设计和IBD效力的结果

¹以log10表示的在攻击前于D14取样的每组5只鸡的血清的平均IBD+ELISA滴度；

²患病超过2天或在D25仍然生病的鸡被认为是患病的；

³针对临床体征和严重粘液囊损伤(粘液囊评分<3)的保护作用；

⁴未接种/未被攻击的组的粘液囊重量/体重比为0.0047。

在攻击之前和之后监控每一个组。在攻击后记录IBDV临床体征，进行11天(从D15至D25)。在攻击后观察期结束时(D33)，无痛致死所有存活的鸡，并进行尸检。记录体重和粘液囊重。将每一个法氏腔上囊(BF)称重，随后贮存在单个装有4％甲醛的容器中以进行组织学测试。按照表25中提供的等级对粘液囊的组织学损伤进行评分。

表25 法氏腔上囊的组织学损伤的评分等级*

*来源于欧洲药典的专著No.01/2008:0587“禽类传染性法氏囊病疫苗(活的)”

如果鸡死亡和/或显示疾病的显著体征和/或法氏腔上囊的严重损伤(即，组织学评分≥3)，则其被认为是受累的。

攻击前以log10表达的平均ELISA IBD+抗体滴度示于表24中。在所有接种的组中检测到显著高于对照组G1的显著滴度。血清学滴度不是剂量依赖性的。

攻击后在对照组G1的所有鸡中观察到严重临床体征。该组的10只鸡中有7只在11天的观察期内死亡，这表明攻击的高度严重性。攻击后，除G4的1只死亡的鸡外，被接种的鸡都未显示严重的临床体征。抗严重粘液囊损伤的保护作用的百分比示于上表中。在所有组中观察到显著的IBD保护作用，在G2和G3(单独的vHVT13)中观察到最佳保护作用。vSB1-008+vHVT13与双重vHVT304和vHVT306构建体的共施用诱导了相似的IBD保护水平。保护作用在测试的剂量上不是剂量依赖性的。平均粘液囊重量/体重比率也示于表24中。所有接种的组中的比率高于被攻击的对照组的所述比率。

总之，这些数据表明SB1-ND载体与单一HVT-IBD或表达NDV-F和IBDV-VP2二者的双重HVT的组合在严重IBDV攻击模型中诱导IBD抗体和早期IBD保护作用。

实施例14 与vHVT13重组疫苗组合的单一HVT-ND(vHVT114)或SB1-ND(vSB1-007和vSB1-009)在D23于商业肉鸡中抗超强毒IBDV分离株的攻击的效力

本发明的目的是估量与HVT-ND(vHVT114)或SB1-ND(vSB1-007和vSB1-009)重组构建体共施用的vHVT13抗在23日龄商业肉鸡中进行的超强毒传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)攻击(91-168/980702)的IBD效力。

这4个疫苗候选者的特征描述于表14和16中。在D0，将90只一日龄肉鸡随机分配入7组(每组12只鸡)和1组(每组6只鸡，未接种的未被攻击对照组)。如下表26中所描述的，在D0，利用0.2mL包含3000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D14，从每组5只鸡收集血液样品以利用试剂盒plus IBD(Synbiotics Corp)进行血清学测试。在D0，利用相同试剂盒测试10只额外一日龄肉鸡的血清，以评估IBDV母体抗体的水平。在D23，利用4.3 log10 EID50的vvIBDV 91-168分离株通过滴眼剂(0.05mL/鸡)攻击鸡(10只鸡/组)。

在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后记录IBDV临床体征，进行11天(从D23至D33)。在攻击后观察期结束时(D33)，无痛致死所有存活的鸡，并进行尸检。记录体重和粘液囊重。对每一个法氏腔上囊(BF)称重，随后贮存在单个装有4％甲醛的容器中以进行组织学测试。按照表25中提供的等级对粘液囊的组织学损伤进行评分。

如果鸡死亡和/或显示疾病的显著体征和/或法氏腔上囊的严重损伤(即，组织学评分≥3)，则其被认为是受累的。

表26 研究设计和血清学结果

¹在攻击前在D23取样的每组5只鸡的血清中以log10表达的平均IBD+ELISA滴度；

²未接种/未被攻击的组的粘液囊重量/体重比率为0.0047。

在D0的平均ELISA IBD+血清学滴度为4.36±0.01log10，表明孵化时极高水平的IBD母体抗体。在D23，平均ELISA IBD+滴度在对照组G1中仍然很高(3.9)。接种的组中的ELISA平均滴度与对照组的ELISA平均滴度没有显著差异。

攻击后在任何组中未观察到死亡或发病。针对严重粘液囊损伤的保护作用的百分比示于上表26中。结果显示vHVT114、vSB1-007或vSB1-009的共施用不干扰vHVT13-诱导的IBD保护作用，表明干扰不存在。类似地，接种的组的平均粘液囊重量/体重比相似并且明确地高于对照组的平均粘液囊重量/体重比，表明了IBD保护作用以及接种方案之间无差异。

总之，数据表明vHVT114、vSB1-007或vSB1-009与vHVT13之间在IBD保护作用上的相容性。两个HVT载体之间在IBD保护作用上不存在干扰再次令人惊讶，证实了对于ND保护作用观察到的结果(参见实施例10)，

实施例15 与SB-1结合或不与其结合的双重HVT-ND+IBD(vHVT304和vHVT306)以及与vHVT13重组疫苗组合的SB1-ND(vSB1-007和vSB1-008)在D28于SPF鸡中抗变体E IBDV分离株的攻击的效力

本研究的目的是估量通过给0日龄SPF鸡皮下(SC)施用的两个双重HVT(HVT-ND+IBD：vHVT304和vHVT306)或两个vSB-1-NDV与vHVT13(vSB1-007+vHVT13、vSB1-008+vHVT13)载体化疫苗组合抗接种后28天IBDV-变体(VAR-E)攻击的效力。

在D0，将105只1日龄SPF鸡随机分配入7组(每组15只鸡)，包括一组被攻击的对照(G6)和未被攻击的对照(G7)。在D0，利用0.2mL的各自包含2000pfu靶剂量的组合疫苗和/或SB-1疫苗通过皮下注射在颈部注射组G1至G5的鸡。研究设计示表下表27中。在D28，通过来自University of Delaware(USA)的IBDV变体E分离株的滴眼剂(每只鸡0.03mL(包含3log10 EID50))攻击组G1至G6的所有鸡。在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后11天，将鸡称重并进行尸检。收集粘液囊，并称重。计算粘液囊重量/体重比(粘液囊重量/体重比X100)。

表27 研究设计和IBD效力的结果

平均粘液囊重量/体重比示于表27中。被攻击的对照鸡相较于未被攻击的鸡具有严重的粘液囊萎缩。vSB1-007和vSB1-008疫苗不干扰vHVT13-诱导的保护作用(G4和G5)。利用双重HVT(HVT-ND+IBD)接种的鸡的粘液囊重量/体重比略低于未被攻击的对照组，但明确地高于被攻击的对照组。此外，SB-1血清型2马立克氏病疫苗不干扰vHVT304-诱导的IBD保护作用。

总之，这些数据表明SB1-ND载体与单一HVT-IBD或表达NDV-F和IBDV-VP2二者的双重HVT的组合在变体E IBDV攻击模型中诱导IBD保护作用。

实施例16 vHVT114、vSB1-009和/或SB-1不存在对vHVT13在SPF鸡中诱导的变体EIBD保护作用的干扰

本研究的目的是估量当通过SC或卵内途径与vHVT114、vSB1-009和/或SB-1共施用时vHVT13在D28于SPF鸡中在IBDV-变体(VAR-E)攻击模型中的IBD保护效力。

将75只1日龄SPF鸡和75只SPF 18至19日龄鸡胚随机分配入5组(分别地G1至G5和G6至G10)，包括一组被攻击的对照(分别地G4和G9)和未被攻击的对照(分别地G5和G10)。在D0，利用0.2mL的各自包含3000pfu靶剂量(除具有1000PFU靶剂量的SB-1外)的疫苗通过皮下注射在颈部注射组G1至G3的鸡。G6至G8的鸡在孵化前2-3天通过卵内途径接受相同疫苗剂量(但在0.05ml的体积中)。研究设计示于下表28中。在28日龄，通过来自University ofDelaware(USA)的IBDV变体E分离株的滴眼剂(每只鸡0.03mL(包含3 log10 EID50))攻击组G1至G4和G6至G9的所有鸡。在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后11天，将鸡称重并进行尸检。收集粘液囊，并称重。计算粘液囊重量/体重比(粘液囊重量/体重比X100)。

表28 研究设计和IBD效力的结果

平均粘液囊重量/体重比示于表28中。被攻击的对照鸡(G4和G9)相较于未被攻击的鸡具有严重的粘液囊萎缩。接种的组(G1至G3和G6至G8)的粘液囊重量/体重比与未被攻击的对照组(G5和G10)的粘液囊重量/体重比相似，并明显高于被攻击的对照组(G4和G9)的粘液囊重量/体重比。在SC或卵内途径后vHVT114对vHVT13-诱导的IBD保护作用没有干扰是令人惊讶的，证实了实施例10和14中获得的数据。

总之，这些数据明确地表明当通过SC或卵内途径施用时HVT114+vSB1-009或+SB-1和vSB1-009与vHVT13在变体E IBDV攻击模型中的相容性。

实施例17 vHVT114和vHVT13以及SB1或vSB1-009载体抗超强毒+马立克氏病攻击的效力

本研究的目的是评估通过SC途径给一日龄SPF鸡施用包括vHVT114、vHVT13、SB-1和/或vSB1-009的疫苗的不同组合、并在4天后利用超强毒+马立克氏病病毒(vv+MDV)T-King分离株攻击诱导的马立克氏病效力。

在D0，将100只1日龄SPF鸡随机分配入5个组(每组20只鸡)。在D0，对于每一种疫苗利用0.2mL的包含2000pfu靶剂量(除其靶剂量为1000pfu的SB-1外)的疫苗通过皮下注射在颈部注射组1至3的鸡。组4和5的鸡是未接种的，并且用作被攻击的(组4)或未被攻击的(组5)假对照。研究设计示于表29中。在D4中，使用腹膜内施用途径利用0.2mL的vv+MDV T-King分离株攻击组1至4的所有鸡。

表29 研究设计和MD保护结果

在攻击之前和之后每日对每一个组监控任何不利反应。在第49天，杀死所有活鸡，并进行尸检以检查与马立克氏病相关的肉眼可见损伤。如果观察到神经体征，例如瘫痪、因疾病引起的运动体征(locomotive sign)和严重的消瘦或抑郁症，如果在尸检时观察到直接由马立克氏病发生引起的死亡或如果观察到肉眼可见损伤，将鸡分类为对于马立克氏病的感染是阳性的。损伤可能包括但不限于：肝、心脏、脾、性腺、肾和肌肉损伤。

保护作用的结果示于上表29中。将所有接种的组(G1至G3)同等地进行，在这种非常严重的早期攻击模型中如预期地诱导了部分(65％)MD保护作用。这些结果表明载体疫苗候选者保持了它们抵御马立克氏病的能力。

实施例18 重组HVT和SB1载体抗马立克氏病的效力

还显示了单独的或组合的HVT载体化重组体和SB-1载体化重组体的马立克氏病效力。攻击株包括强毒马立克氏病(vMD)攻击例如GA22、超强毒马立克氏病(vvMD)攻击例如RB1B和/或超强毒+马立克氏病(vv+MD)攻击例如T.King病毒。分别用0.2ml剂量或0.05ml剂量的测试病毒皮下接种一日龄鸡或接种18-19日龄鸡胚蛋。在5日龄时，利用相关马立克氏攻击病毒(v、vv或vv+MDV)攻击接种的鸡和从未接种的对照。观察被攻击的鸡直至7周龄。杀死所有鸡并进行尸检以观察与马立克氏病相关的肉眼可见损伤，如实施例17中描述的。

实施例19 HVT对商业小母鸡中vHVT13诱导的IBDV抗体的干扰

本研究的目的是确定HVT与vHVT13的共施用是否对vHVT13-诱导的商业小母鸡中的IBDV抗体反应具有影响。

将80只0日龄商业棕色小母鸡用于3个隔离单元。在0日龄对15只鸡进行血液采样以测试IBD母体来源的抗体(MDA)。将剩余的鸡分成如表30中显示的3组。通过SC途径，利用商业剂量的vHVT13(VAXXITEK HVT+IBD；Merial SAS,Lyon,France)和/或HVT细胞结合的Bio HVT(Merial S.p.A.,Noventa,Italy)通过SC途径在颈背接种组2和3的鸡。在25、35和45日龄进行血液采样。用于评价IBDV血清学反应的ELISA试剂盒为来自Synbiotics(Synbiotics Corp.,Kansas City,MO,USA)的PROFLOK PLUS IBD(IBD+)Ab ELISA试剂盒。

表30 研究设计和血清学结果

平均ELISA滴度示于表30中。未接种的组G1的滴度从D1至D45减少，这对应于IBDV母体抗体的下降。如所预期的，vHVT13组G2中的ELISA滴度保持高水平至D45，这表明母体抗体逐渐被vHVT13诱导的抗体取代。HVT至vHVT13的添加具有明确的负影响，因为在G3中观察到的抗体滴度与G1相似。这些结果与利用vHVT114+vHVT13观察到的结果相反，因为vHVT114不减少vHVT13-诱导的IBD+ELISA滴度(参见实施例14，表26)。它们确认了vHVT114不干扰vHVT13免疫原性的出乎意料的性质。

总之，与对于vHVT114观察到的相反，HVT至vHVT13的添加对vHVT13-诱导的IBDV体液免疫力具有明确的负影响。

实施例20 商业化HVT-ND对vHVT13-诱导的IBD保护作用的干扰

本研究的目的是确定商业化HVT-ND载体疫苗与vHVT13的共施用是否影响SPF鸡中vHVT13-诱导的IBD保护作用。

在1日龄，利用商业剂量的vHVT13(VAXXITEK HVT+IBD)以及有或没有一个商业剂量被批准HVT-载体化ND疫苗(vHVT-ND1和vHVT-ND2)(如表31中显示的)通过SC途径接种75只SPF鸡(3组(G2、G3和G4)，每组25只)。将15只鸡保持为未接种的对照(G1)。接种后3周，利用经眼途径施用的0.05ml的至少2.0 log10 EID50的IBD病毒Ph/B1株(在菲律宾分离的)攻击鸡(G2、G3和G4的20只鸡和G1的10只鸡)。观察所有鸡中因IBD攻击病毒引起的临床体征或死亡，进行5天，在攻击后观察结束时将其无痛致死以进行IBD损伤(尤其地来自法氏腔上囊)的尸检。如果鸡的粘液囊未显示IBD的典型粘液囊损伤：粘液囊萎缩、粘液囊周水肿和/或粘液囊组织的出血，则它们被认为是被保护的。

表31 研究设计和IBD保护数据

结合示于表31中。全部10只被攻击的对照鸡显示临床体征，10只中有8只在4或5dpi死亡，表明IBDV攻击非常严重。其全部具有严重的粘液囊损伤，包括严重萎缩和出血斑。单独的vHVT13诱导完全保护作用，而与vHVT-ND的两种组合诱导部分临床和粘液囊保护作用。

总之，这些结果明确地表明2个商业化HVT-载体化ND疫苗干扰vHVT13-诱导的IBD保护作用。

实施例21 vSB1-004、vSB1-006、vSB1-007、vSB1-008、SB1-载体化ND疫苗单独地或与vHVT13HVT-载体化IBD疫苗组合时以及vHVT302和vHVT304疫苗在14和/或28日龄于SPF鸡中抗NDV Texas GB株攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F和/或IBDV VP2基因的不同马立克氏病载体疫苗的组合抗在14和/或28日龄于SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Texas GB株，基因型II)的效力。

本研究中测试的6个NDV重组疫苗候选者的特征描述于下表32中。

表32 本研究中测试的6个NDV重组疫苗候选者的特征

在D0，将225只1日龄SPF鸡随机分配入9个组(每组15只鸡)(在D14被攻击的G1a至G9a)和6个组(每组15只鸡)(在D28被攻击的G1b、G3b、G4b、G5b、G8b、G9b)。在D0，利用0.2mL的包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。本研究的设计示于下表33中。在D14或D28，分别利用4.3和4.2 log10 EID50(0.1mL)速发型ND Texas GB(基因型II)株通过肌内途径攻击鸡。

表33 ND效力的结果

*ND＝未进行

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后的NDV临床体征。在攻击前G6和G7中有一只鸡死亡，使得这些组中的鸡的数目从15减少至14。

临床保护作用(包括抗死亡和发病的保护作用)的百分比报告于上表33中。在未接种的被攻击对照组G1a和G1b中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在D14攻击后观察到13.3至46.6％的部分保护作用，vSB1-008、vSB1-007和vHVT304诱导最高水平的保护作用。在D28进行ND攻击后的保护水平对于所有接种的组均高得多，在利用vSB1-008、vSB1-007或vHVT304接种的组中同样略微更高。这些结果表明ND保护水平取决于攻击的日期和构建体。vSB1-008和vSB1-007构建体表现比vSB1-004和vSB1-006略微更好，vHVT304表现比vHVT302略微更好，这表明构建体的不同特征在基于MDV的载体疫苗的性能上起着重要作用。

总之，本研究的结果显示由表达NDV F基因的马立克氏病载体诱导的ND保护水平可取决于不同参数，包括载体、插入的基因座、F基因、启动子、多聚腺苷酸化位点和攻击条件。

实施例22 双重HVT-ND+IBD vHVT304和vHVT306疫苗在14和/或28日龄SPF鸡中抗NDV Texas GB株攻击的效力

本研究的目的是估量表达NDV F和IBDV VP2基因二者的HVT-载体化疫苗抗在14和/或28日龄SPF鸡中进行的新城疫疾病攻击(Texas GB strain,基因型II)的效力。

本研究中测试的2个重组疫苗候选者的特征描述于下表34中。

表34 研究中使用的重组疫苗候选者的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT304	vHVT13	SV40	Opt-VIId	合成的	IG2
vHVT306	vHVT13	SV40	Opt-VIId	合成的	SORF3-US2

在D0，将90只1日龄SPF鸡随机分配入3个组(每组15只鸡)(在D14被攻击的G1a至G3a)和3个组(每组15只鸡)(在D28被攻击的G1b至G3b)。在D0，利用0.2mL的包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。研究设计示于下表35中。在D14或D28，利用4.0 log10 EID50(0.1mL)靶剂量的速发型ND Texas GB(基因型II)株通过肌内途径攻击鸡。

表35 ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。记录攻击后的NDV临床体征。G2b中的一只鸡在攻击之前死亡，从而使该组的鸡数从15减少至14。

临床保护作用(包括抗死亡和发病的保护作用)的百分比报告于上表35中。在未接种的被攻击对照组G1a和G1b中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。在D14攻击后的保护水平比在D28攻击后获得的保护水平低得多。这些疫苗候选者具有相同的插入vHVT13基因组的2个不同基因座的NDV F表达盒。在测试条件下，它们在ND保护方面表现相同，这表明两个插入基因座(IG2和SORF3-US2)同等地适合用于NDV F盒插入。

总之，本研究的结果显示由表达NDV F基因的马立克氏病载体诱导的ND保护水平取决于不同参数，包括载体、插入的基因座、F基因、启动子、多聚腺苷酸化位点和攻击条件。

实施例23 由双重HVT-ND+IBD(vHVT302、vHVT303和vHVT304)或SB1-载体(vSB1-006和vSB1-007)在1日龄SPF鸡中诱导的抗速发型基因型V NDV攻击的ND早期效力

本研究的目的是估量3个双重HVT-ND+IBD(vHVT302、vHVT303和vHVT304)和2个SB1-ND载体(vSB1-006和vSB1-007)在1日龄SPF鸡中抗在D14进行的速发型基因型V(Chimalhuacan)NDV攻击的效力。

在研究中测试的5个重组疫苗候选者的特征描述于下表36中。

表36 本研究中使用的重组疫苗候选者的特征

随机构成6组(1和2)10只1日龄无特异病原体(Specific pathogen free,SPF)白色来亨鸡。以2000PFU靶剂量通过皮下途径(颈背)接种组2至6的鸡，如下表37中显示的。组1的鸡不接种，并被保持作为对照鸡。在2周龄时，利用基因型V Mexican Chimalhuacan(MexV)速发型NDV株攻击所有鸡。使用于0.2ml生理无菌水中稀释的10⁵卵感染剂量50(EID50)通过肌内(IM)途径进行攻击。监控所有鸡直至攻击后14天。攻击后，如下每日对每一只鸡的健康状态进行评分：健康/具有特定症状(竖起的羽毛、虚脱、斜颈、颤抖)/死亡。显示特定症状超过2天或在D28被记录生病的任何鸡被考虑用于发病率的计算。

表37 由不同的表达NDV F基因的MDV载体化候选者在SPF 0日龄鸡中诱导的早期ND保护结果

保护的结果概述于表37中。所有对照组在ND攻击后死亡。不同的测试疫苗在抗死亡和发病的保护作用方面分别诱导10％至80％和0％至60％的变化的ND保护水平。vHVT304候选者诱导比vHVT303和vHVT302候选者更好的保护作用；这可归因于置于NDV F基因之前的外源SV40启动子。vSB1-007表现比vSB1-006略好。此外，利用vHVT304获得的性能与利用vSB1-007获得的性能相当，表明不同马立克氏病载体可达到相同水平的ND保护作用。

总之，本研究显示双重HVT-ND+IBD和SB1-ND载体化疫苗均可在极严重的早期NDV攻击模型中达到显著的ND保护水平。

实施例24 通过卵内或SC途径给1日龄SPF鸡施用的双重HVT-ND+IBD vHVT306诱导的抗在D28进行的速发型基因型V NDV攻击的效力

本研究的目的是评价通过卵内或SC途径给SPF鸡施用的一种双重HVT-ND+IBD(vHVT306)抗在28日龄进行的速发型基因型V(Chimalhuacan)NDV攻击的效力。

本研究中测试的vHVT306重组疫苗候选者的特征描述于下表38中。单一HVT-IBD载体疫苗vHVT13用作对照。

表38 本研究中使用的重组疫苗候选者的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT306	vHVT13	SV40	Opt-VIId	合成的	SORF3-US2

在第-3天，将40个约18日又18小时龄的已孵育SPF鸡胚蛋随机分配入2个组(每组20个蛋)。在D0，添加一组12日龄SPF鸡。组的定义示于下表39中。在D-3(卵内途径)或在D0(SC途径，在颈背中)进行接种，vHVT306和vHVT13的靶剂量为2000PFU/鸡。对于卵内途径，监控鸡的孵化率、活力(直至D28)和生长(在孵化与D28之间)。

在D28，利用强毒ND Chimalhuacan株攻击每组10只鸡。使用于0.2ml生理无菌水中稀释的10⁵卵感染剂量50(EID50)通过肌内(IM)途径进行攻击。监控鸡直至攻击后14天。记录特定的临床体征和死亡率。显示特定症状超过2天或在D42被记录为发病的任何鸡被考虑用于计算发病率。攻击后5和7天(即在D33和D35)，从每一只存活的鸡获取口咽拭子。通过特异性NDV qRT-PCR分析所有拭纸。

表39 通过SC或卵内途径施用至SPF鸡内的表达NDV F和IBDV VP2基因二者的vHVT306MDV载体化候选者诱导的ND保护结果

*实时RT PCR的阈值滴度被设置在2.7log10当量EID50

在卵内接种后记录组1和2的完全孵化率，所有孵化的鸡存活至D28。在D0和D28未检测到两个组间的体重差异，证实了vHVT306在卵内施用时的完美安全性。保护的结果概述于表39中。所有vHVT13-接种的对照鸡到ND攻击后4天均死亡。通过两条途径施用的vHVT306均诱导完全临床ND保护作用。此外，在卵内施用后未检测到脱落，而在SC施用后仅少数鸡脱落可检测量的攻击病毒。

总之，本研究显示双重HVT-ND+IBD vHVT306通过SC或卵内施用途径在非常严重的异源NDV攻击模型中诱导极佳水平的ND保护作用。

实施例25 双重HVT-ND+IBD(vHVT302、vHVT303和vHVT304)重组疫苗抗在D15于SPF鸡中进行的经典IBDV分离株攻击的效力

本研究的目的是估量双重HVT重组体vHVT302、vHVT303和vHVT304重组构建体抗在15日龄于SPF鸡中进行的强毒传染性法氏囊病病毒(vIBDV)攻击(Faragher 52/70株)的早期IBD效力。

本研究中测试的3个双重HVT-ND+IBD重组疫苗候选者的特征描述于下表40中。

表40 双重HVT重组体的表达盒的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因	Poly-A	基因座
						vHVT302	vHVT13	US10	Opt-VIId	US10	US10
vHVT303	vHVT13	US10	Opt-V(CA02)	US10	US10
						vHVT304	vHVT13	SV40	Opt-VIId	合成的	IG2

在D0，将40只1日龄SPF鸡随机分配入4个组(每组10只鸡)，包括一个利用vSB1-004(表达NDV F基因的SB-1载体)接种的对照组(G1)。5只其它SPF鸡保持不接种和不被攻击以进行粘液囊重量/体重评估。如下表41中所描述的，在D0，利用0.2mL包含2000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D15，从每组所有鸡(除其中1只鸡在血液采样前死亡的组1和3外，每组10只鸡)采集血液样品以利用试剂盒plus IBD(Synbiotics Corp)进行血清学测试。在D15，以2.5 log10 EID50通过滴眼剂(0.05mL/鸡)攻击所有4个组的鸡。

表41 研究设计和IBD效力的结果

¹发病超过2天或在D25仍然发病的鸡被认为是发病的。括号内的数字是被攻击的组中的鸡的数目。

²抗临床体征和严重粘液囊损伤的保护作用(粘液囊评分<3)

⁴未接种/未被攻击的组的粘液囊重量/体重比为0.0043。

在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后记录IBDV临床体征11天(从D15至D25)。在攻击后观察期结束时(D25)，无痛致死所有存活的鸡，并进行尸检。记录体重和粘液囊重。将每一个法氏腔上囊(BF)称重，随后贮存于单个装有4％甲醛的容器中以进行组织学测试。按照表42中提供的等级给粘液囊的组织学损伤评分。

表42 法氏腔上囊的组织学损伤的评分标准*

*来源于欧洲药典的专著No.01/2008:0587“鸡传染性法氏囊病疫苗(活的)”

如果鸡死亡和/或显示疾病的显著体征和/或法氏腔上囊的严重损伤(即，组织学评分≥3)，则其被认为是受累的。

攻击前以log10表达的平均ELISA IBD+抗体滴度示于表41中。在所有接种的组中检测到显著高于对照组G1的滴度的显著滴度。血清学滴度在G3(vHVT303)中略微更高。

攻击后在对照组G1的全部9只鸡中观察到几个临床体征，其导致1只鸡的死亡。攻击后G2(vHVT302)中仅一只接种的鸡显示临床体征。抗几个粘液囊损伤的保护作用的百分比示于上表41中。在所有接种的组中观察到显著的IBD保护作用，在G3(vHVT303)中观察到完全保护作用。平均粘液囊重量/体重比也示于表41中。所有接种的组中的比率高于被攻击的对照组G1的所述比率，并且与未接种并且未被攻击的对照组无显著差异。

总之，这些数据表明本研究中测试的3个双重HVT-IBD+ND在严重IBDV攻击模型中诱导IBD抗体和早期IBD保护作用。

实施例26 5个不同HVT-ND疫苗候选者在14日龄SPF鸡中抗速发型NDV ZJ1(基因型VIId)分离株攻击的效力

本研究的目的是估量5个表达NDV F基因的单一HVT重组构建体(vHVT39、vHVT110、vHVT111、vHVT112和vHVT113)抗在14日龄于SPF鸡中进行的速发型NDV ZJ1(基因型VIId)分离株新城疫攻击的效力。

这5个疫苗候选者的特征描述于下表43中。

表43 攻击研究中使用的HVT-ND重组病毒的特征

名称	亲代病毒	启动子	F基因*	Poly-A	基因座
						vHVT039	HVT	MDV gB	Wtnm-Texas	SV40	IG1
vHVT110	HVT	MCMV IE	Wt-VIId	SV40	IG1
						vHVT111	HVT	SV40	Wt-VIId	SV40	IG1
vHVT112	HVT	MCMV IE	Wt-YZCQ	SV40	IG1
						vHVT113	HVT	MCMV IE	Wt-Texas	SV40	IG1

*Wt意指使用野生型速发型F基因序列，但切割位点被修饰成缓发型病毒的切割位点。Wtnm指野生型序列的切割位点未被修饰。Texas速发型株属于基因型IV，YZCQ属于基因型VIId。

在D0，将72只1日龄SPF鸡随机分配入5个组(每组12只鸡)(接种)和1组12只鸡(未接种的对照)。如下表44中所描述的，在D0，利用0.2mL包含6000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射鸡。在D14，利用5 log10 EID50的NDV ZJ1/2000(基因型VIId)速发型株通过肌内途径攻击鸡。

表44 ND效力的结果

在攻击之前和之后监控每一个组。攻击后记录NDV临床体征和死亡率。在感染后2和4天(dpi)采集口咽拭子以使用由Wise等人描述的方法(2004；Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle disease virus RNAin Clinical Samples.J Clin Microbiol 42,329-338)通过实时RT-PCR评估病毒载量。

抗死亡和发病的保护作用的百分比报告于上表44中。在未接种的被攻击对照组G1中观察到完全易感性，从而确认了攻击的高度严重性。疫苗诱导不同水平的抗死亡(25-100％)或抗发病(8％-83％)的保护作用。最佳保护水平由vHVT110诱导，然而最低保护水平由vHVT039诱导，其它候选者给予中间结果。在2和4dpi的口咽脱落的结果也显示于上表44中，并且与临床保护作用的结果一致。这些疫苗候选者在它们的启动子和F基因序列方面不同。这些结果显示这些参数对于最佳HVT-ND疫苗候选者的设计是非常重要的。

总之，本研究的结果显示启动子和F基因序列在由HVT-载体化ND疫苗候选者诱导的ND效力中的重要性。

实施例27 由表达IBDV VP2和NDV F的双重SB1构建体诱导的新城疫疾病效力的评估.

本研究的目的是估量表达IBDV VP2和NDV F的双重SB1构建体抗新城疫疾病攻击的效力。

在D0，将1日龄SPF鸡随机分配入几个组(每组10-20只鸡)，包括接种的和未接种的组。在D0，利用0.2mL包含1000至5000pfu靶剂量的重组疫苗通过皮下注射在颈部注射接种组的鸡。或者，在卵化前2或3天卵内施用0.05mL中的相同剂量。在接种后在不同的时间：例如D14、D28或D42，利用约4.0 log10 EID50(0.1mL)的速发型NDV株例如Texas GB(基因型II)、ZJ1(基因型VIId)、Chimalhuacan(基因型V)株通过肌内途径攻击鸡(至少一个接种组和一个未接种组)。

在攻击之前和之后在临床上监控每一个组。攻击后记录NDV临床体征(发病率)和死亡率。计算所有组中临床保护作用的百分比。攻击后至少90％未接种的被攻击SPF鸡应当死亡或严重患病，以验证攻击的严重性。可在攻击后不同时间例如攻击后3、5、7和9天获取口咽和泄殖腔拭子的样品，可通过实时RT-PCR估计病毒载量。最佳候选者是诱导最高水平的临床保护和最低水平的拭子病毒载量的那些候选者。可在包含NDV母体抗体的肉鸡中进行相似研究；然而，如果早期进行攻击的话，这些母体抗体可潜在地保护未接种的鸡。还可组合其它马立克氏病疫苗或载体疫苗来测试双重SB1构建体。

实施例28 由表达IBDV VP2和NDV F的双重SB1构建体诱导的传染性法氏囊病效力的评估

本研究的目的是估量表达IBDV VP2和NDV F二者的双重SB1的IBD效力。

将1日龄SPF鸡随机分配入几个组(每组10-20只鸡)，包括接种的和未接种的组。将未接种的对照分入2个亚组，包括被攻击的和未被攻击的鸡。在D0，利用0.2mL各自包含1000至5000pfu靶剂量的疫苗通过皮下注射在颈部注射接种组的鸡。或者，在孵化前2或3天卵内施用0.05mL中的相同剂量。在接种后在不同时间：例如接种后14、21、28或42天，利用强毒IBDV(例如Faragher或US标准株)、超强毒IBDV例如91-168分离株或变体IBDV分离株例如USDelaware变体E分离株的滴眼剂(0.03mL，包含2至4 log10 EID50/鸡)攻击来自接种组和被攻击对照的所有鸡。在攻击之前和之后在临床上监控每一个组。在攻击后4或5天可对鸡进行尸检以进行粘液囊肉眼可见损伤评估。还可在攻击后10至11天对它们进行尸检。可评估肉眼可见和/或组织学损伤。此外，称取鸡和粘液囊的重量，相较于未接种未被攻击组的粘液囊重量/体重比计算粘液囊重量/体重比(粘液囊重量/体重比X100)。对照SPF攻击的鸡必须显示临床体征和/或具有显著的肉眼可见和/或组织学损伤，和/或应当具有显著低于未接种未被攻击对照鸡的粘液囊重量/体重比，以证实攻击的严重性。疫苗的效力通过将这些参数与未接种/被攻击的和未接种/未被攻击的组相比较来进行评估。这样的研究可在包含IBDV母体抗体的肉鸡中进行；然而，如果早期进行攻击的话，这些母体抗体可潜在地保护未接种的鸡。还可将双重SB1构建体与其它马立克氏病疫苗或载体疫苗组合来测试。

实施例29 由表达IBDV VP2和NDV F的双重SB1构建体诱导的马立克氏病效力的评估

本研究的目的是评估由表达IBDV VP2和NDVF二者的SB1载体诱导的马立克氏病效力。

将1日龄SPF鸡随机分配入几个组(每组20至50只鸡)，包括接种的和未接种的对照。可将未接种的对照分成2个亚组，包括被攻击的和未被攻击的鸡。在D0，利用0.2mL各自包含1000至5000pfu靶剂量的疫苗通过皮下注射在颈部注射接种组的鸡。或者，可在孵化前2或3天卵内施用0.05mL中的相同剂量。在接种后不同的时间例如接种后3至10天，利用0.2mL的马立克氏病病毒(MDV)株通过腹膜内途径攻击来自接种组和被攻击对照的所有鸡。MDV株可以是几个致病型，例如强毒MDV(vMDV)，包括JM或GA22分离株，超强毒MDV(vvMDV)例如RB-1B或Md5分离株，超强毒+(vv+MDV)例如T-King或648A分离株。通过感染鸡，收获它们的血细胞并在冷冻保护剂例如DMSO存在的情况下冷冻在液氮中来制备MDV攻击株接种物。在进行接种/攻击研究之前，确定每一个攻击批次的鸡感染剂量50(CID50)。在攻击之前和之后在临床上监控每一个组。在接种后至少7周对鸡进行尸检，检测每一只鸡的马立克氏病肉眼可见损伤的存在。损伤可能包括但不限于下列：肝、心脏、脾、性腺、肾、神经和肌肉损伤。这样的研究可在包含MDV母体抗体的肉鸡中进行。还可将双重SB1构建体与其它马立克氏病疫苗(例如HVT和或CVI988Rispens株)或MD载体疫苗组合来进行测试。还可通过接种的鸡与MDV感染的非接种SPF鸡之间的接触来进行MD攻击。

***

上文详细地描述本发明的优选实施方案，应理解通过上述实施例定义的本发明不限于上述说明中所示的特定内容，因为其许多表观变化是可能的，而不背离本发明的精神或范围。

本文中引用或参考的所有文献(“本文中引用的文献”)，和本文中引用的文献中引用或参考的所有文献与本文中或通过引用并入本文中的任何文献中提及的任何产品的许多制造商的说明书、说明、产品说明书和产品介绍一起，通过引用并入本文，并且可用于本发明的实施。

Claims (26)

1.一种组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包含一种或多种火鸡重组疱疹病毒(HVT)载体，其中所述至少一种HVT载体包含两个或多个编码和表达禽类病原体的至少一种抗原的异源多核苷酸。

2.权利要求1的组合物或疫苗，其中所述HVT载体包含编码并表达新城疫病毒F(NDV-F)多肽、一种或多种传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2多肽、或者其组合的异源多核苷酸。

3.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述NDV-F多肽与SEQ ID NO:2、4、6、33、35或37中所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。

4.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述IBDV VP2多肽与SEQ ID NO:8或42中所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

5.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述HVT载体包含一个编码并表达与SEQ ID NO:2、4、6、33、35或37中所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的NDV-F多肽的异源多核苷酸、以及一个或两个编码并表达与SEQ ID NO:8或42中所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的IBDV VP2多肽的异源多核苷酸。

6.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于选自以下的启动子：SV40启动子、US10启动子、MDV gB启动子和豚鼠CMV启动子。

7.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于选自以下的polyA信号：SV40polyA信号、US10 polyA信号和合成的polyA信号。

8.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F和IBDV VP2的多核苷酸被插入在选自以下的HVT基因组的基因座内：IG2(基因间区2)、US10、SOFR3-US2和IG1(基因间区1)。

9.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于选自以下的启动子：SV40启动子、US10启动子、MDV gB启动子和豚鼠CMV启动子，并且其中一种或两种编码IBDV VP2多肽的多核苷酸与CMV启动子、豚鼠CMV启动子或者其组合有效地连接。

10.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述HVT载体选自vHVT301、vHVT302、vHVT303、vHVT304、vHVT306、vHVT307和vHVT202。

11.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗还包含含有编码并表达IBDVVP2多肽的异源多核苷酸的第二重组HVT载体。

12.权利要求11的组合物或疫苗，其中所述第二重组HVT载体为包含在VAXXITEK^TM HVT+IBD中的HVT载体。

13.权利要求2或11的组合物或疫苗，其中所述组合物还包含一种或多种重组SB1载体或亲代SB1毒株。

14.权利要求13的组合物或疫苗，其中所述重组SB1载体包含一个或多个编码并表达NDV-F多肽或IBDV VP2多肽的异源多核苷酸。

15.权利要求2或11的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗任选地还包含药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。

16.权利要求2的组合物或疫苗，其中所述HVT载体包含两个编码并表达两个与SEQ IDNO:8或42中所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的IBDV VP2多肽的异源多核苷酸。

17.一种重组HVT载体，其包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的一个或多个异源多核苷酸。

18.权利要求17的重组HVT载体，其中所述HVT载体包含编码并表达新城疫病毒F(NDV-F)多肽、一种或多种传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2多肽、或者其组合的异源多核苷酸。

19.权利要求18的重组HVT载体，其中所述HVT载体包含一个编码并表达与SEQ ID NO:2、4、6、33、35或37中所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的NDV-F多肽的第一异源多核苷酸、以及一个或两个编码并表达与SEQ ID NO:8或42中所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的IBDV VP2多肽的异源多核苷酸。

20.权利要求18的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于选自以下的启动子：SV40启动子、US10启动子、MDV gB启动子和豚鼠CMV启动子。

21.权利要求18的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F和IBDV VP2的多核苷酸被插入在选自以下的HVT基因组的基因座内：IG2(基因间区2)、US10、SOFR3-US2和IG1(基因间区1)。

22.权利要求18的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F抗原的多核苷酸有效地连接于选自以下的启动子：SV40启动子、US10启动子、MDV gB启动子和豚鼠CMV启动子，并且其中一种或两种编码IBDV VP2多肽的异源多核苷酸与CMV启动子、豚鼠CMV启动子或者其组合有效地连接。

23.权利要求18的重组HVT载体，其中所述HVT载体选自vHVT301、vHVT302、vHVT303、vHVT304、vHVT306、vHVT307和vHVT202。

24.一种用于接种动物或用于诱导动物中抗一种或多种禽类病原体的免疫原性或保护性反应的方法，其包括施用权利要求1或17的组合物或载体至少一次。

25.权利要求24的方法，其中所述禽类病原体选自：新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(即，IBDV或禽肾病病毒)、马立克氏病病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒球虫病(艾美球虫属的种)、弯曲杆菌属的种(Campylobacter sp.)、沙门菌属的种(Salmonella sp.)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、巴斯德菌属的种(Pasteurella sp.)、禽杆菌属的种(Avibacterium sp.)、大肠杆菌(E.coli)和梭菌属的种(Clostridium sp.)。

26.权利要求24的方法，其中所述动物为禽类。