CN105886498A

CN105886498A - CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA

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Publication number: CN105886498A
Application number: CN201510240981.1A
Authority: CN
Inventors: 沈志荣; 王凤超
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2016-08-24

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，通过云端高通量计算设计、合成了一组利用CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因中特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，并分别将该sgRNA与线性的pCG-U6-SgRNA质粒连接成载体，将一对正向和方向sgRNA寡核苷酸载体与pCG-NLS-FLAG-Cas9质粒一起成功转染细胞即可实现PCSK9基因的敲除，sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产的优点，该制备方法简单易行、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系统的敲除效率高。

Description

CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA。

背景技术

规律成族间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strandbreaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologous endjoining，NHEJ)，造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除(如图1)。

这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始流行开来。由于其容易操作、可以同时靶向多个基因，可以高通量制备、造价低等优势，Cas9已经成为一种发展最快的技术。正是由于其优越性，这一技术在Nature推荐的2013十大进展中位列第一，在Science推荐的2013十大进展中位列第二位。近年来，全世界的科学家已经利用此技术在小鼠、大鼠及猕猴上开展了高效的基因编辑工作。

Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA-crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性敲除。因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术(如图1)。

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是降脂的一个新的靶点。PCSK9为分泌型丝氨酸蛋白酶，可与低密度脂蛋白胆固醇受体(low-density lipoprotein receptor，LDL-R)结合并将其内化引导至溶酶体降解，抑制其再循环到肝细胞表面，从而减弱肝脏代谢血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的能力。PCSK9的无义突变可以降低血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

PCSK9的单克隆抗体在临床阶段备受关注，如美国安进公司研发的PCSK9单克隆抗体AMG145即可以显著降低正常人及高胆固醇血症患者的LDL-C水平。但是，利用PCSK9抗体的治疗高血脂也具有一定的局限性。因为利用抗体进行靶基因的治疗还受到一些因素的限制：(1)抗体的作用只是暂时阻断的作用；(2)需要定期进行注射，如每两周到四周需要注射一次，增加了患者的负担；(3)不容易研发出有效的抗体；(4)只针对细胞外靶点；(5)抗体药物昂贵等。

CRISPR-Cas9快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过靶向敲除PCSK9基因，为实现肿瘤免疫治疗提供了一种可行的策略。但是，能否设计、制备出精确性和特异性靶向PCSK9基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9特异性敲除PCSK9基因的关键技术。本发明的目的就是要解决这一关键技术问题，提供相应的技术方案，达到特异性敲除PCSK9基因的目的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种结构简单，设计合理、使用方便的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，它通过云端高通量计算设计、合成了一组利用CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因中特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，并分别将该sgRNA与线性的pCG-U6-SgRNA质粒连接成载体，将一对正向和方向sgRNA寡核苷酸载体与pCG-NLS-FLAG-Cas9质粒一起成功转染细胞即可实现PCSK9基因的敲除，有效地解决了利用抗体治疗存在的问题：直接敲除PCSK9基因，可以实现永久的效果；提供了高效的SgRNA；sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，它采用如下的技术方案：

一、sgRNA寡核苷酸的高通量设计和选择

1.靶向PCSK9基因的sgRNA的设计：

文中的设计均采用著作权软件《云端CRISPR-Cas9二核酸内切酶靶点优化设计系统V1.0》高通量设计。基本原理如下：

(1)在PCSK9基因上选择5，-GGN(19)GG的序列，如果没有5，-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。

(2)sgRNA在PCSK9基因上的靶向位点位于基因的外显子。

(3)sgRNA在PCSK9基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。

(4)在NCBI数据库中用BLAST，对sgRNA的靶序列进行计算打分，选取并保留高分的sgRNA，确保sgRNA对PCSK9的特异性。

2.靶向PCSK9基因的sgRNA的选择：

(1)不能离ATG起始子太近，防止转录会后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活；

(2)sgRNA在PCSK9基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，优先选择基因的第一或者第二外显子；

(3)选择相隔一定距离(5～30bp)成对的位点。这样既有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应；

二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链

根据选择的sgRNA，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G)；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链，如下：

Forward oligo：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNN

IIIIIIIIIIIIIIIIII

Reverse oligo：NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

三、sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建

1.线性化pCG-U6-sgRNA质粒(结构如图4所示)。

2.将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pCG-U6-SgRNA质粒连接获得pCG-U6-hPCSK9sg质粒。

3.转化并涂氨苄平板(50μg/ml)。

4.用通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。

5.37℃摇床摇菌过夜并用Qiagen Plasmid Miniprep Kit抽提pCG-U6-hPCSK9sg质粒。

四、转染细胞获得PCSK9基因敲除细胞

1、按照Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent(Invitrogen，11668-019)的操作手册，将分别带有对应sgRNA寡聚核苷酸的pCG-U6-sgRNA质粒(一种或者多种)与序列为SEQ ID NO.457的pCG-NLS-Cas9质粒混匀，共转染细胞。

2、用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认PCSK9基因已经被敲除。

更进一步的，同时利用一对相邻(在PCSK9基因上的靶向起始位点相距5bp-10bp)的sgRNA可以显著提高敲除效率。在靶向PCSK9的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将靶向PCSK9的sgRNA寡聚核苷酸与线性化pCG-U6-sgRNA质粒连接获得含靶向PCSK9的sgRNA寡聚核苷酸的载体pCG-U6-hPCSK9sg，在转染细胞获得PCSK9基因敲除细胞过程中，如下操作：

1、按照LipofectamineTM 2000Transfection Reagent操作手册，将两个分别含1个靶向PCSK9的sgRNA寡聚核苷酸的载体pCG-U6-sgRNA(这两个载体分别带有的靶向PCSK9的sgRNA寡聚核苷酸在PCSK9基因上的互补起始位点相距5bp-8bp)与序列为SEQ ID NO.457的pCG-NLS-FLAG-Cas9质粒混匀，共转染细胞。

2、用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认PCSK9基因已经被敲除。本发明还提供了特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，其序列如SEQ ID NO..46-54所示。

相比于现有利用PCSK9抗体进行降血脂的方法，本发明的优点在于：

(1)抗体的作用只是暂时封闭的作用，本发明直接敲除PCSK9基因，可以实现永久的效果；

(2)抑制性受体有多种，如何利用多种抗体封闭多种抑制性受体还没有对策，本发明既可以针对PCSK9的多个编码序列进行敲除；

(3)有效的PCSK9抗体研发很困难，本发明提供了针对人PCSK9基因的一组高效的sgRNA；

(4)抗体作用只能针对细胞外靶点，本发明既可以针对胞外，也能针对胞内靶点；

(5)开发抗体药物是一项费时、费力、费钱的过程，使得抗体药物昂贵等，利用sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产

采用上述结构后，本发明有益效果为：本发明所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，它针对现有利用PCSK9抗体进行降血脂的问题：(1)抗体的作用只是暂时阻断的作用；(2)需要定期进行注射，如每两周到四周需要注射一次，增加了患者的负担；(3)不容易研发出有效的抗体；(4)只针对细胞外靶点；(5)抗体药物昂贵等等问题，本发明通过云端高通量计算设计、合成了一组利用CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因中特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，并分别将该sgRNA与线性的pCG-U6-SgRNA质粒连接成载体，将一对正向和方向sgRNA寡核苷酸载体与pCG-NLS-FLAG-Cas9质粒一起成功转染细胞即可实现PCSK9基因的敲除，有效地解决了利用抗体治疗存在的问题：直接敲除PCSK9基因，可以实现永久的效果；提供了高效的SgRNA，sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产的优点。

附图说明

图1是Cas9实现定点切割导致DNA双链断裂过程示意图；

图2是T7EN1酶切鉴定sgRNA/Cas9介导的基因人PCSK9特异性切割；

图3是载体pCG-U6-sgRNA的结构；

图4是载体pCG-NLS-FLAG-Cas9的结构。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

针对上述附图说明的图1和图2，进一步说明如下：

图1是Cas9实现定点切割导致DNA双链断裂过程示意图，CRISPR/Cas9系统定向识别和剪切从而导致基因敲除是通过sgRNA和Cas9实现的。sgRNA决定了Cas9的靶向性。

图2是T7EN1酶切鉴定sgRNA/Cas9介导的基因人PCSK9特异性切割，以提取的HEK293T细胞基因组为模板，使用序列如SEQ ID NO.464和SEQ ID NO..465的hPCSK9test For和hPCSK9test Rev为引物进行PCR扩增，PCR产物为390bp，纯化PCR产物。将上述PCR产物取200ng退火，使用T7EN1酶切鉴定，电泳。如图2所示，加入针对人PCSK9的sgRNA的样品都出现了切割条带，而且具有很高的效率。

本发明所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，实施例1CRISPR_Cas9特异性敲除人PCSK9基因中用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA的设计和合成

1.靶向人PCSK9基因的sgRNA的设计：

(1)在PCSK9基因上选择5，-GGN(19)GG的序列，如果没有5，-GGN(19)GG 的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。

(2)sgRNA在PCSK9基因上的靶向位点位于基因的外显子，这样更容易引起片段的缺失或移框突变，从而达到基因完全失活的目的。

(4)在NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一，减少潜在的脱靶位点。

根据以上方法，我们一共设计了457个靶向人PCSK9基因的sgRNA，序列分别如序列表SEQ ID NO..1-457所示。

2.靶向人PCSK9基因的sgRNA的选择：

(1)靶向PCSK9基因的sgRNA的靶序列在PCSK9基因上不能离ATG起始子太近，防止转录会后下游另一个ATG开始而出现一个截短的基因形式，不能保证基因完全失活。

(2)sgRNA在PCSK9基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能结构域中，常常位于第二外显子中。

(3)在PCSK9基因上选择相隔一定距离(5～30bp)成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。

根据以上方法，在457个靶向人PCSK9基因的包含PAM序列的sgRNA(序列分别如序列表SEQ ID NO..46-80所示)中符合的序列有35个我们从中选择了6个(分别如序列表SEQ ID NO..46，49，51，52，54或70所示)进行后续实验。

3.靶向人PCSK9基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和构建

根据选择的6个(SEQ ID NO..46，49，51，52，54或70所示)，在其5’ 加上CACC得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G)；根据选择的sgRNA，获得其互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸，模式如下：

Forward oligo：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNN

I I I I I I I I I I I I I I I I I

Reverse oligo：NNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA-5’

变性、退火体系为：

2.5μL forward Oligo(100μM)

2.5μL reverse Oligo(100μM)

1μL NEB buffer2

4μl灭菌水

在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95℃，5min；95-85℃at 2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at4℃。

选择的第1个sgRNA(如序列表SEQ ID NO..46所示)，其forward oligo和reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO..466和467所示意)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。

选择的第2个sgRNA(如序列表SEQ ID NO..49所示)，其forward oligo和reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO..468和469所示)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。

选择的第3个sgRNA(如序列表SEQ ID NO..51所示)，其forward oligo和reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO..470和471所示)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。

选择的第4个sgRNA(如序列表SEQ ID NO..52所示)，其forward oligo和reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分另如序列表SEQ ID NO..472和473所示)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。

选择的第5个sgRNA(如序列表SEQ ID NO..54所示)，其forward oligo和reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分另如序列表SEQ ID NO..474和475所示)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。

选择的第6个sgRNA(如序列表SEQ ID NO..70所示)，其forward oligo和reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO..476和477所示)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。

实施例2利用CRISPR_Cas9特异性敲除人PCSK9基因(用于靶向PCSK9基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO..46，49，51，52，54或70所示，以46为例)

1、线性化序列如序列表SEQ ID NO..458所示的pCG-U6-sgRNA质粒。

酶切体系和条件如下：

2μg pCG-U6-sgRNA(400ng/μL)；

1μL CutSmart Buffer；

1μL BfuAI(NEB，R0701L)；

补水至50μL，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发

至管盖上。

酶切完成后用AxyPr印PCR Clean up Kit(AP-PCR-250)纯化回收至20～40μL灭菌水中。

2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO..466和467所示)与线性化的pCG-U6-sgRNA质粒相连获得pCG-U6-hPCSK9sgl质粒。

连接体系如下：

3μL，50μM退火产物(双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO..466所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO..467所示)

1μL线性化的pCG-U6-sgRNA质粒(25ng/μL)

1μL T4 ligation Buffer

0.5μl T4 ligase(NEB，M0202S)

4.5μl灭菌水

16℃孵育1小时。

4、将上述步骤获得的连接产物转化DH5a感受态细胞并涂氨苄平板(50μg/ml)，并挑取克隆。

5、用如序列表SEQ ID NO..463所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。

6、37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，用Qiagene质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得pCG-U6-PCSK9sgl质粒(如序列表SEQ ID NO..478所示)。

7、细胞培养与转染

(1)293T细胞接种培养于DMEM培养基中，其中含10％FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)在转染前分至6孔板中，待70％～80％密度时进行转染。(3)按照Lipofectamine^TM 2000Transfection Reagent(Invitrogen，11668-019)的操作手册，将0.5μg pCG-U6-hPCSK9sgl(如序列表SEQ ID NO..14所示)与1.5μg的pCG-NLS-FLAG-Cas9质粒(如序列表SEQ ID NO.457所示)混匀，共转染至每孔细胞中，6～8小时后换液，并加入G418(Sigma，A1720)进行药筛，48小时后收取细胞。

8、T7EN1酶切检测

(1)将收集的细胞在裂解液(10μM Tris-HCl，0.4M NaCl，2μM EDTA，1％SDS)中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μL去离子水中。

(2)使用序列如SEQ ID NO..464和SEQ ID NO..465的引物hPCSK9test For和hPCSK9test Rev进行PCR扩增，用AxyPr印PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200ng统一稀释到20μL进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95-85℃at 2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at4℃。

(3)在20μL体系中加入T7E N1 0.3μL，37℃酶切30分钟后，加入2μL 10X Loading Buffer，用2.5％的琼脂糖胶电泳检测。如图2所示，靶向序列为46，51，52，54时敲除成功。

以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。

Claims

1.CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于：

(1)所述SgRNA在PCSK9基因上的靶序列符合5’-GGN(19)GG、5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG的序列排列规则；

(2)所述SgRNA在PCSK9基因上的靶序列位于基因的外显子；

(3)所述SgRNA在PCSK9基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上；

(4)所述SgRNA在PCSK9基因上的靶序列是唯一的。

2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于：其对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO..1-456任意一条序列所示。

3.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于：其对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO..46-80任意一条序列所示。

4.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于：其对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO.46、51、52或者54任意一条序列所示。

5.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法，其特征在于：

(1)权利要求1-4任意一项所述的sgRNA，在其对应DNA序列的5’加上CACC，合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；权利要求1-4任意一项所述的sgRNA，获得其对应DNA序列的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的一对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；

(2)线性化序列如序列表SEQ ID No.458所示的pCG-U6-BfuAI-sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与用BfuAI线性化pCG-U6-BfuAI-sgRNA质粒连接获得pCG-U6-hPCSK9sg质粒；pCG-U6-hPCSK9sg质粒转化stab13感受态细菌并涂氨苄平板，挑选阳性克隆并用序列如序列表SEQID NO..XX所示的通用引物U6测序的方法鉴定出阳性克隆；37℃摇床摇阳性克隆菌过夜并用康为试剂Plasmid Miniprep Kit抽提pCG-U6-hPCSK9sg质粒；

(3)用脂质体lipofectamine 2000混合pCG-U6-hPCSK9sg质粒和序列为SEQ ID NO..457的pCG-NLS-FLAG-Cas9质粒，共转染细胞；

(4)用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认PCSK9基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。

6.根据权利要求5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法，其特征在于：步骤(3)所述的脂质体为Lipofectamine^TM2000 TransfectionReagent。

7.根据权利要求5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法，其特征在于：

步骤(1)所述的sgRNA其对应的DNA序列为序列表SEQ ID NO.46、51、52或者54任意一条序列所示，分别对应的步骤(2)和(3)所述的pCG-U6-hPCSK9sg质粒的序列为序列表SEQ ID NO..459-462，即sgRNA序列为SEQ IDNO..46对应的pCG-U6-hPCSK9sg质粒为SEQ ID NO..459，sgRNA序列为SEQ IDNO...51对应的pCG-U6-hPCSK9sg质粒为SEQ ID NO..460，sgRNA序列为SEQ ID NO..52对应的pCG-U6-hPCSK9sg质粒为SEQ ID NO..461，sgRNA序列为SEQ ID NO..54对应的pCG-U6-hPCSK9sg质粒为SEQ ID NO..462。

8.根据权利要求7所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法中用到的pCG-U6-hPCSK9sg质粒，其特征为序列如序列表SEQ ID NO..459-462任意一条所述。

9.根据权利要求7所述的CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于：

(1)权利要求1-4任意一项所述的sgRNA，在其对应的DNA链5’加上CACC合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；权利要求1-4任意一项所述的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的I对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；

(2)线性化序列如序列表SEQ ID NO..458所示的pCG-U6-sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pCG-U6-sgRNA质粒连接获得pCG-U6-hPCSK9sg质粒；pCG-U6-hPCSK9sg质粒转化感受态细菌并涂氨苄平板，挑选阳性克隆并用序列如序列表SEQID NO.463所示的通用引物U6测序的方法鉴定出阳性克隆；37℃摇床摇阳性克隆菌过夜并用康为试剂PlasmidMiniprep Kit抽提质粒；

(3)用Lipofectamine^TM2000 Transfection Reagent装载两种或者两种以上不同的pCG-U6-hPCSK9sg质粒和序列为SEQ ID NO.457的pCG-NLS-Cas9质粒，共转染细胞；

(4)用T7EN1酶切检测确认PCSK9基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。