[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN105796478B - 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用 - Google Patents

由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105796478B
CN105796478B CN201610165057.6A CN201610165057A CN105796478B CN 105796478 B CN105796478 B CN 105796478B CN 201610165057 A CN201610165057 A CN 201610165057A CN 105796478 B CN105796478 B CN 105796478B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gel
gelatin
particle
suspension
colloidal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn - After Issue
Application number
CN201610165057.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105796478A (zh
Inventor
王华楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Sino Biological Technology Co., Ltd.
Original Assignee
Shenzhen Sino Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Sino Biological Technology Co Ltd filed Critical Shenzhen Sino Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201610165057.6A priority Critical patent/CN105796478B/zh
Priority to CN201811459839.6A priority patent/CN109662941A/zh
Publication of CN105796478A publication Critical patent/CN105796478A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105796478B publication Critical patent/CN105796478B/zh
Withdrawn - After Issue legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/025—Other specific inorganic materials not covered by A61L27/04 - A61L27/12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/222—Gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/446—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with other specific inorganic fillers other than those covered by A61L27/443 or A61L27/46
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/46—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with phosphorus-containing inorganic fillers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Colloid Chemistry (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明公开了由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用，本发明通过将带相反电荷的两相胶体颗粒在碱性(或酸性)环境中均匀共混，后加入酸化剂(或碱化剂)诱导溶液pH恢复中性，从而引发两相胶体颗粒间的静电自组装而形成均匀分散的复合凝胶网络。凝胶的力学强度高、且调控范围大：弹性模量可在10Pa～100kPa间调控；自修复效率≥100％。最终本发明成功的制备了兼具高机械强度和自修复性能的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶，并证实该复合凝胶在受多次剪切力破坏后仍能快速恢复其力学强度。并且，该复合凝胶具有优异的可注射性和可塑性，并可作为可注射生物材料用于体外细胞培养的基质材料。

Description

由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝 胶材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及由微米或纳米颗粒组装成的、高强度、可自修复、可注射的复合材料胶体凝胶材料及其制备方法和应用；属于材料科学领域、纳米材料领域、生物医学工程领域。
背景技术
胶体凝胶是由胶体颗粒组装成具有连续网络结构的胶体分散液，被广泛应用于如陶瓷/玻璃加工成型领域，油漆和涂料制备，食品加工，化妆品加工和生物医学工程。与传统的聚合物凝胶不同，胶体凝胶结构更加独特，它通过胶体颗粒间的非共价键作用构建成力学性能稳定的胶体颗粒网络结构。这一特殊微观结构赋予胶体凝胶特有的粘弹性能，具有广泛的应用价值。胶体凝胶材料具有特殊的力学性能：它在相对较低的剪切力作用下保持稳定，表现出固体材料特有的刚性行为；而在剪切力超过材料的屈服强度时，它表现出类似于液体的流动性。这些独特的粘弹行为使胶体凝胶在许多新兴领域具有重要的应用价值，其中包括3D打印技术的打印材料，和用于组织工程的可注射生物材料。
自修复材料是近年来新型的一大类新材料体系，这类材料的主要特性是在受到外力破坏后能自动修复全部或部分结构和力学强度，已经成为一大类重要的工程材料。其中，自修复水凝胶材料由于其独特的力学行为和高含水率在许多领域(3D打印，生物医用材料领域等)都具有重要的应用价值。具有自修复能力的水凝胶普遍采用的自修复机制是基于可逆的高分子间相互作用，即高分子间的键合可被打破和重建。常用的高分子间作用包括氢键、金属离子配体的配位作用、静电作用或疏水性作用[1-3]。其中胶体凝胶自修复材料作为新兴材料体系备受关注。然而，目前的自修复胶体凝胶主要由聚合物胶体颗粒构成，机械强度较弱，这限制了它们的应用。而有机/无机组分的复合材料设计是实现机械性能增强的普遍方法，同时也可以赋予材料体系更多的功能性[4]。由无机纳米粒子增强的聚合物凝胶材料是获得高强度水凝胶的有效方法[5,6]，但已有报道指出这一方法设计制备的胶态凝胶体系虽然力学强度显著提高，但自修复能力大大减弱了。因此，设计出具有复合材料组分，且具有高力学强度和强自修复能力的胶体凝胶体系仍是技术空白。
自修复水凝胶材料在生物医学领域具有重要的应用价值。然而传统的自修复高分子水凝胶材料存在诸多难以克服的瓶颈，包括力学强度较弱，无法对药物释放进行准确控制，同时难以兼顾生物相容性和生物降解性。这些都限制了其在生物医药领域，尤其是作为可植入生物材料的应用。
发明内容
本发明提出一个简单而有效的方法制备兼具高强度和自修复性能的复合材料胶体凝胶，通过精确控制带相反电荷胶体颗粒的自组装过程，形成均匀分散的凝胶网络。因此，本发明以带负电荷的二氧化硅纳米颗粒和带正电的明胶纳米颗粒为基本结构单元，通过将带相反电荷的两相胶体颗粒在碱性环境中均匀共混，再通过加入葡萄糖酸内酯诱导溶液pH恢复中性，引发两相胶体颗粒间的静电自组装得到均匀分散的复合凝胶网络。无机纳米颗粒的加入显著增强了凝胶的力学强度：弹性模量在10Pa至100kPa区间可控；均匀分布的胶体凝胶网络和两相胶体颗粒间可逆的静电作用赋予了凝胶体系优异的自修复能力：凝胶体系在受外力剪切破坏后可瞬间回复原有力学强度，实现100％的自修复效率。最终本发明成功的制备了兼具高机械强度和自修复性能的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶，并证实该复合凝胶在受多次剪切力破坏后都能快速恢复其力学强度。该发明所述的制备原理广泛适用于相似的复合胶体凝胶体系，对这一大类材料的开发提供了设计方案。
具体制备方法：通过控制带相反表面电荷的明胶和二氧化硅纳米颗粒静电自组装，得到均匀混合的双相胶体网络，解决了双相胶体颗粒混合时常见的团聚和相分离问题，从而得到高强度模量、具有自修复能力的复合材料胶体水凝胶。该水凝胶体系在受外力剪切破坏后可瞬间回复原有力学强度，实现100％的自修复效率；弹性模量在10Pa至100kPa区间可控。
本发明提供一种由有机/无机微米或纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体水凝胶材料的制备方法，工艺步骤如下：分别将表面带正电荷的明胶和表面带负电荷的无机颗粒分散在pH>10的碱性水溶液中，形成明胶颗粒悬浊液和无机颗粒悬浊液，所述明胶颗粒悬浊液中明胶颗粒的体积百分比为2％～150％；所述无机颗粒悬浊液中无机颗粒的体积百分比为2％～150％。然后将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，得到均匀分散的胶体悬浊液；混合后所有胶体颗粒占悬液总体积的百分比在2％～150％范围内可调控，两相胶体颗粒混合的数量比为无机颗粒/明胶＝0.1～50；向该双相胶体分散液中加入酸化剂干粉，酸化剂最终浓度为10～200mM，并快速混匀，静置2～10分钟即形成复合凝胶以备使用；无机颗粒尺寸为20～2000nm，优选20-500nm；明胶颗粒尺寸为20～2000nm，优选20-500nm。
进一步地，在上述技术方案中，所述酸化剂选自葡萄糖酸内酯、氯化铵、氯化钙等中的一种或几种。
本发明提供另一种由有机/无机纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料的制备方法，工艺步骤如下：分别将表面带正电荷的明胶和表面带负电荷的无机颗粒分散在pH<5的酸性水溶液中，形成明胶颗粒悬浊液和无机颗粒悬浊液，所述明胶颗粒悬浊液中明胶颗粒的体积百分比为2％～150％；所述无机颗粒悬浊液中无机颗粒的体积百分比为2％～150％。然后将相同浓度(即体积分数浓度)的然后将明胶和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，得到均匀分散的胶体悬浊液；混合后两相胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比在2％～150％范围内可调控，两相胶体颗粒混合数量比为无机颗粒/明胶＝0.1～50区间调控；向该双相胶体分散液中加入碱化剂粉末，碱化剂最终浓度为10～200mM，并快速混匀，静置2～20分钟即形成复合凝胶；无机颗粒尺寸为20～2000nm，优选20-500nm；明胶颗粒尺寸为20～2000nm，优选20-500nm。
进一步地，在上述技术方案中，所述碱化剂是尿素和脲酶的组合。尿素在体系中的浓度范围为30-50mM，脲酶在体系中的浓度范围在15-60U/ml。
进一步地，在上述技术方案中，所述无机颗粒表面电势(Zeta电势)为-5～-60mV；
所述明胶颗粒表面电势(Zeta电势)为+5～+60mV。
进一步地，在上述技术方案中，所述无机颗粒选自二氧化硅颗粒、硅酸镁锂纳米颗粒(Laponite)、羟基磷灰石纳米颗粒、石墨烯纳米颗粒等表面带负电荷的颗粒中的一种或几种。
进一步地，在上述技术方案中，所述碱性水溶液选自浓度为5～100mM的NaOH、KOH、氨水等碱性水溶液中的一种或几种。
进一步地，在上述技术方案中，所述酸性水溶液选自浓度为5～100mM的HCl、HNO3、H2SO4等酸性水溶液中的一种或几种。
进一步地，在上述技术方案中，两相纳米颗粒混合数量比为无机颗粒/明胶＝0.1～20。
进一步地，在上述技术方案中，制备明胶/二氧化硅复合胶体凝胶在两相混合比例一定的情况下，胶体颗粒体积占胶体凝胶体系总体积的百分比在2％-150％。
进一步地，在上述技术方案中，所述无机颗粒中含有功能性颗粒，所述功能性颗粒选自纳米碳管、氧化铁纳米颗粒、钛酸钡纳米颗粒中的一种或几种。从而形成多相胶体颗粒体系，而使胶体体系基本性能保持不变。
本发明再提供一种上述制备方法得到的复合胶体凝胶。
本发明再提供一种上述复合胶体凝胶作为水溶性的、生物活性分子的载体的应用。
进一步地，在上述技术方案中，将溶解有生物活性分子的水性溶液直接与复合胶体凝胶混合，得到实现胶体凝胶的药物加载；所述生物活性分子选自具有生物活性的药物、蛋白质和信号因子中的一种。
本发明再提供一种上述复合胶体凝胶作为的活体细胞的载体的应用。
进一步地，在上述技术方案中，将悬浮有细胞的水性溶液直接与复合胶体凝胶混合，实现胶体凝胶的细胞固载；所述的细胞选自原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种。
本发明再提供一种水溶性药物的负载载体的方法，上述方法中的碱性水溶液中含有药物分子；或酸性水溶液中含有药物分子。
本发明再提供一种活体细胞的负载载体的方法，上述方法中的碱性水溶液中含有悬浮的细胞；或酸性水溶液中含有悬浮的细胞。
产物描述：
(1)本发明通过控制带相反电荷的无机纳米颗粒和明胶纳米颗粒间静电自组装的过程，以纳米胶体颗粒为基本结构单元，实现两相胶体颗粒的均匀共混，而避免了直接共混方法导致的混合不均、相分离和团聚的难题。这一均匀分布的两相胶体网络有利于得到更加稳定的胶体力学强度和在剪切破坏后更高效的自修复。
(2)复合二氧化硅纳米胶体颗粒的明胶胶体凝胶体系表现出显著增强的力学强度，复合凝胶的弹性模量相对单相明胶基胶体凝胶的弹性模量增强100倍(体系中胶体颗粒体积分数相同)。同时，调控复合胶体体系中胶体体积分数可实现对凝胶弹性模量在10Pa至500kPa区间的调控；在高体积分数(体积分数)时，可得到高强度的胶体凝胶。
(3)带相反电荷的两相胶体颗粒间的静电作用力的可逆性赋予胶体凝胶材料特有的自修复性能，即凝胶体系在受强外力剪切后网络结构被破坏，弹性模量显著下降，而取消外力后，凝胶力学性能瞬间恢复，且恢复后弹性模量接近甚至超过初始弹性模量，表现出超过100％的自修复能力。相对比，将两相胶体颗粒直接共混得到的胶体凝胶由于结构中存在相分离等缺陷，自修复效率有限，只能实现60-80％力学强度的恢复。
(4)本专利所述的复合胶体凝胶材料制备简单，具有优异的可塑性和可注射性能，可作为可注射凝胶材料用于不同的应用领域。
(5)本专利所述的两相胶体颗粒复合的胶体凝胶体系的设计原理，对该类材料的设计制备具有指导性作用。
(6)本专利所述的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶材料具有良好的生物相容性和生物降解性，允许细胞在凝胶的二维表面贴服并生长，也可作为细胞的三维细胞外基质，实现对细胞三维环境的构建，并支持细胞的生长繁殖等功能，可作为载细胞的三维可注射凝胶支架用于组织工程和再生医学的应用。
发明有益效果
(1)本发明通过控制带相反电荷的二氧化硅和明胶纳米颗粒间静电自组装的过程，以纳米胶体颗粒为基本结构单元，实现两相胶体颗粒的均匀共混，而避免了直接共混方法导致的混合不均、相分离和团聚的难题。这一均匀分布的两相胶体网络有利于得到更加稳定的胶体力学强度和在剪切破坏后更高效的自修复。
(2)复合二氧化硅纳米胶体颗粒的明胶胶体凝胶体系表现出显著增强的力学强度，复合凝胶的弹性模量相对单相明胶基胶体凝胶的弹性模量增强100倍(体系中胶体颗粒体积分数相同)。同时，调控复合胶体体系中胶体体积分数可实现对凝胶弹性模量在10Pa至200kPa区间的调控；在高体积分数(体积分数)时，可得到高强度的胶体凝胶。
(3)带相反电荷的两相胶体颗粒间的静电作用力的可逆性赋予胶体凝胶材料特有的自修复性能，即凝胶体系在受强外力剪切后网络结构被破坏，弹性模量显著下降，而取消外力后，凝胶力学性能瞬间恢复，且恢复后弹性模量接近甚至超过初始弹性模量，表现出超过100％的自修复能力。相对比，将两相胶体颗粒直接共混得到的胶体凝胶由于结构中存在相分离等缺陷，自修复效率有限，只能实现60-80％力学强度的恢复。
(4)本专利所述的复合胶体凝胶材料制备简单，具有优异的可塑性和可注射性能，可作为可注射凝胶材料用于不同的应用领域。
(5)本专利所述的两相胶体颗粒复合的胶体凝胶体系的设计原理，对该类材料的设计制备具有指导性作用。
(6)本专利所述的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶材料具有良好的生物相容性和生物降解性，允许细胞在凝胶的二维表面贴服并生长，也可作为细胞的三维细胞外基质，实现对细胞三维环境的构建，并支持细胞的生长繁殖等功能，可作为载细胞的三维可注射凝胶支架用于组织工程和再生医学的应用。
附图说明
图1是本发明所述方法中加入酸化剂或碱化剂诱发胶体分散液凝胶化的试验原理图和形成凝胶的激光共聚焦显微图片，插图为凝胶化前后样品照片；
图2是实施例1中使用的明胶(A)和二氧化硅(B)微球的扫描电子显微照片，标尺＝100nm；
图3是实施例1中明胶和二氧化硅共混悬浊液在酸化剂(葡萄糖酸内酯)诱导下凝胶化过程中胶体分散液弹性模量(G＇)和粘行模量(G＂)随时间的变化；G＇与G”的交点即为液态向固态力学行为转变的拐点；
图4是对比例1中明胶和二氧化硅共混悬浊液在没有酸化剂(葡萄糖酸内酯)作用下，胶体分散液弹性模量(G＇)和粘行模量(G＂)随时间的变化；
图5是对比例2中单相胶体颗粒分散液在酸化剂葡萄糖酸内酯作用下体系粘弹性参数随时间的变化曲线；
图6是实施例2中明胶和二氧化硅共混悬浊液在碱化剂(尿素和脲酶)诱导下凝胶化过程中胶体分散液弹性模量(G＇)和粘行模量(G＂)随时间的变化；
图7是实施例6中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的自修复行为；
图8是对比例3中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的自修复行为；
图9是实施例9中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶受外力作用下剪切变薄的特性；
图10是实施例9中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶通过磨具成型的样品照片，证实该凝胶的可塑性；
图11是实施例9中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的可注射性；
图12是实施例10中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶作为活体NIH/3T3成纤维细胞体外培养的二维细胞外基质材料，考察该复合凝胶的生物相容性和细胞毒性；
图13是对比例4中制备的单相明胶纳米颗粒构成的胶体凝胶的体外NIH/3T3成纤维细胞培养实验结果；
图14是实施例11中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶作为活体NIH/3T3成纤维细胞体外培养的三维细胞外基质材料，考察该复合凝胶的生物相容性和细胞毒性；
图15是实施例12中使用的羟基磷灰石纳米颗粒的投射电子显微照片；标尺＝500nm；
图16是实施例10和对比例4中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶、单纯明胶颗粒组成的胶体凝胶、及通用细胞培养板作为活体NIH/3T3成纤维细胞体外培养的二维细胞外基质材料，细胞在其表面的增值情况。细胞表面黏附百分比是指细胞在材料表面黏附铺展的面积占材料总面积的百分比，用来半定量表征细胞增殖。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
如图1所示，本发明所述方法中加入酸化剂或碱化剂诱发胶体分散液凝胶化的试验原理图和形成凝胶的激光共聚焦显微图片(插图为凝胶化前后样品照片)。图中明胶和二氧化硅胶体颗粒分别使用红色和绿色荧光标记。
下面结合附图通过实施例对本发明所述的一种以有机/无机纳米颗粒组装成的、高强度可自修复复合材料胶体凝胶材料的制备技术做进一步说明。
实施例1
(I)明胶微球：
本实施例中通过去溶剂法制备明胶纳米微球[7,8]得到明胶纳米微球的围观形貌如图2A所示，纳米微球的粒径约100nm，微球的表面Zeta电势在pH7水溶液中测得约为+10mV。
(II)二氧化硅微球：
本实施例中通过Stober法制备二氧化硅微球[9]。得到二氧化硅微球的围观形貌如图2B所示，纳米微球的粒径约80nm，微球的表面Zeta电势在pH7水溶液中测得约为-40mV。
(III)二氧化硅/明胶复合胶体凝胶：
分别将明胶和二氧化硅颗粒分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为5％，然后将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，得到均匀分散的两相胶体颗粒悬浊液，混合后所有胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为5％；两相胶体颗粒混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝5。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，其浓度为80mM，通过流变仪测量凝胶化过程。通过流变仪测得胶体分散体系粘弹性随时间的变化，结果如图3所示。其中，葡萄糖酸内酯分解导致溶液pH逐渐下降，从而引发两相胶体颗粒自组装并形成凝胶网络，体系弹性模量G’值逐渐增加并超过G”值，两者交点即为胶体分散液由液态流体向固态凝胶的转折点，从而证实凝胶的形成。
对比例1
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，分别将明胶或二氧化硅微球分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为5％，然后将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，其中两相胶体颗粒混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝5，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液，混合后所有胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为5％。通过流变仪测得两相胶体分散体系粘弹性随时间的变化，结果如图4所示。其中，在未加入酸化剂(葡萄糖酸内酯)的体系中，因此未有凝胶网络形成，由于体系仍保持液态流体的属性，体系弹性模量G’值太小而无法测量，体系粘性模量G”值保持稳定。证实制酸剂可诱导复合胶体分散液形成凝胶，而无制酸剂作用下，分散液无法形成凝胶。
对比例2
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，分别将明胶或二氧化硅微球分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为5％。分别向明胶或二氧化硅的单相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯，其浓度为80mM，通过流变仪测量凝胶化过程。通过流变仪测得胶体分散体系粘弹性随时间的变化，结果如图5所示。其中，明胶微球单分散体系在酸化剂作用下导致明胶微球自组装并形成凝胶网络，体系弹性模量G’值逐渐增加并超过G”值，两者交点即为胶体分散液由液态流体向固态凝胶的转折点，证明单纯的明胶微球体系可形成胶体凝胶。相反，二氧化硅微球单分散体系在酸化剂作用下也未发生凝胶化，体系仍保持液态流体的属性，体系弹性模量G’值太小而无法测量，体系粘性模量G”值保持稳定。
实施例2
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，分别将明胶和二氧化硅微球分散在一定体积的HCl(20mM)水溶液中，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为5％，然后将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，得到均匀分散的两相胶体颗粒悬浊液，混合后所有胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为5％；两相胶体颗粒混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝5。向该双相胶体分散液中加入碱化剂尿素和脲酶粉末，其中尿素浓度为为50mM、脲酶浓度为30U/ml，通过流变仪测量凝胶化过程。通过流变仪测得胶体分散体系粘弹性随时间的变化，结果如图6所示。其中，尿素和脲酶反应导致溶液pH逐渐增加，从而引发两相胶体颗粒自组装并形成凝胶网络，体系弹性模量G’值逐渐增加并超过G”值，两者交点即为胶体分散液由液态流体向固态凝胶的转折点，从而证实凝胶的形成。
实施例3
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为5％，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液；然后将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，两相胶体颗粒混合比分别为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝1，5，10，20，50，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液，混合后所有胶体颗粒体积占总体积的百分比仍为5％。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为80mM，静置2～10分钟即形成复合凝胶以备使用。通过流变仪测得胶体分散体系粘弹性随时间的变化，不同混合比例的复合胶体凝胶的粘弹性参数(弹性模量和粘性模量)如表1所示。
表1实施例3中不同混合比的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的粘弹性参数。
实施例4
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为30％，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液；然后将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，两相胶体颗粒混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝1，5，10，50，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液，混合后所有胶体颗粒体积占总体积的百分比仍为30％。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯，其浓度为80mM，静置2分钟即形成复合凝胶以备使用。通过流变仪测得胶体分散体系粘弹性随时间的变化，不同混合比例的复合胶体凝胶的粘弹性参数(弹性模量和粘性模量)如表2所示。
表2实施例4中不同混合比的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的粘弹性参数。
实施例5
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，两种悬液中中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比分别为2.5，5，10，30，50，75，100，120％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，其中两相颗粒的混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝5，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液，混合后所有胶体颗粒体积占总体积的百分比保持不变，分别为2.5，5，10，30，50，75，100，120％。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，使其最终浓度为80mM，静置2～10分钟即形成复合凝胶以备使用。通过流变仪测得胶体分散体系粘弹性随时间的变化，不同混合比例的复合胶体凝胶的粘弹性参数(弹性模量和粘性模量)如表3所示。
表3实施例5中含不同胶体体积分数的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的粘弹性参数。其中胶体颗粒的体积占悬液总体积的百分比分别为2.5，5，10，30，50，75，100，120％；两相颗粒数量比为二氧化硅/明胶＝5的比例共混。
实施例6
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为30％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，其中两相颗粒的混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝1的比例共混，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体分散液，混合后所有胶体颗粒体积占总体积的百分比为30％。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为80mM，静置2～10分钟即形成复合凝胶以备使用。通过流变仪测考察所得复合胶体凝胶的自修复行为，具体测试方法如下。对胶体凝胶进行连续的流变测试：首先进行震荡时间扫描，对样品施加频率为1Hz和应变为0.5％的外力，测试样品的弹性(G’)和粘性模量(G”)，此时凝胶在低剪切力情况下表现出固体的刚性行为，因此弹性模量G’大于粘性模量G”且保持稳定。这一阶段的G’值即为样品的初始弹性模量。随后逐渐增加施加的应变从0.1％至1000％，此过程中通过施加外力将样品破坏，弹性模量G’逐渐降低，最终低于G”，即胶体体系从刚性固体向粘性流体发生转变，结构被破坏。随后立即取消外力作用，考察样品弹性模量的恢复情况。将外力释放后，样品恢复的弹性模量与其初始弹性弹性模的百分比(％)定量考察凝胶的自修复效率。
结果如图7所示，结果表明，二氧化硅/明胶复合胶体凝胶具有超强的自修复能力，凝胶在剪切破坏后其弹性模量瞬间恢复，切修复后弹性模量超过初始模量，意味着该凝胶的自修复能力达到甚至超过100％。并且这样自修复行为可以反复发生：在对样品施加多个循环的剪切破坏过程中，每次取消外力后，凝胶的弹性模量都会快速恢复，并超过破坏前的弹性模量。
图7是本发明所述以葡萄糖酸内酯作为凝胶化引发剂制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的自修复行为。凝胶的粘弹性参数(弹性模量G’和粘性模量G”)在低剪切力情况下(0.1％应变)表现出固体的刚性行为，即弹性模量G’大于粘性模量G”且保持稳定；随后对凝胶施加逐渐增大的剪切力(应变从0.1％增加到1000％)，弹性模量G’逐渐降低，最终低于G”，即胶体体系从刚性固体向粘性流体发生转变，结构被破坏；取消破坏性剪切力后，凝胶的粘弹性瞬间恢复，甚至超过其实机械强度。这一自修复行为可多次重复，保持超过或接近100％的恢复效率。其中，二氧化硅/明胶纳米颗粒数量的混合比为5，胶体体积分数为30％。
对比例3
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的去离子水中，得到单相胶体颗粒悬浊液，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为30％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，混合后所有胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比分别为30％，混合后两相颗粒数量比为二氧化硅/明胶＝5的比例共混，静置20分钟后形成复合凝胶以备使用。采用实施例6中所述测试方法，使用流变仪考察所得复合胶体凝胶的自修复行为，结果如图8所示，将两相胶体颗粒直接共混得到的胶体凝胶在手剪切力破坏后可自修复原有力学强度的60％左右。该对比例中，明胶和二氧化硅胶体分别分散在去离子水中，并将带相反电荷两相颗粒直接共混，因此存在两相颗粒间的团聚、相分离等结构缺陷，不能形成均匀分散的网络结构，并使得凝胶的自修复效率下降。
图8是将两相胶体颗粒直接共混得到的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的自修复行为。由于直接共混导致的胶体颗粒团聚、相分离等结构缺陷，使得凝胶的自修复效率下降。其中，二氧化硅/明胶纳米颗粒数量的混合比为5，胶体体积分数为30％。
实施例7
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，两种悬液中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为30％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，其中两相混合比分别为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝1，5，10，50，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液，混合后所有胶体颗粒的体积占悬液总体积的百分比为30％。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为80mM，静置2分钟即形成复合凝胶以备使用。通过流变仪测考察所得复合胶体凝胶的自修复行为，结果如表4所示。结果表明，胶体体系中二氧化硅/明胶胶体颗粒数量比R≥5时凝胶的自修复效率都大于100％。
表4实施例7中不同混合比的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的自修复效率％。其中胶体颗粒的体积占悬液总体积的百分比为30％。
实施例8
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，两种悬液中中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比分别为5，10，30，50，75，100％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，其中两相颗粒的混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝5，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液，混合后所有胶体颗粒的体积占悬液总体积的百分比保持不变，分别为5，10，30，50，75，100％。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为80mM，静置2～10分钟即形成复合凝胶以备使用。通过流变仪测考察所得复合胶体凝胶的自修复行为，结果如表5所示。结果表明，体积分数在范围内，复合凝胶(R＝5)的自修复效率在100％以上；而当体积分数增加到区间，自修复效率有所下降。
表5实施例8中含不同胶体体积分数的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的自修复效率％。其中胶体颗粒的体积占悬液总体积的百分比分别为5，10，30，50，75，100％；两相颗粒数量比为二氧化硅/明胶＝5的比例共混。
实施例9
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，两种悬液中中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比50％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，其中两相颗粒的混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝5，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液，混合后所有胶体颗粒的体积占悬液总体积的百分比50％。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为80mM，静置2分钟即形成复合凝胶以备使用。通过流变仪测得胶体凝胶具有剪切变薄的特性，如图9所示。即凝胶在逐渐增加的剪切速率作用下，凝胶的粘度随之下降。这一特性表明胶体凝胶具有良好的可注射性；同时凝胶的自修复行为表明了材料的可塑性。进一步使用普通医用针管直接注射证实材料具有良好的可注射性(如图10所示)并可通过挤注成型(如图11所示)。
图9是本发明所述方法中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶受外力作用下剪切变薄的特性。其中，二氧化硅/明胶纳米颗粒数量的混合比为5，胶体体积分数为50％。
图10是本发明所述方法中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶通过磨具成型的样品照片，证实该凝胶的可塑性。其中，二氧化硅/明胶纳米颗粒数量的混合比为5，胶体体积分数为50％。
图11是本发明所述方法中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶的可注射性。其中，二氧化硅/明胶纳米颗粒数量的混合比为5，胶体体积分数为50％。
实施例10
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，两种悬液中中胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比75％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，其中两相颗粒的混合比分别为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝1或5，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液，混合后所有胶体颗粒的体积占悬液总体积的百分比75％。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为80mM，静置2分钟即形成复合凝胶以备使用。通过体外细胞培养实验考察该凝胶材料的生物相容性和是否存在细胞毒性。具体实施步骤如下：
(I)细胞培养：
以NIH3T3(CRL-1658TM)成纤维细胞培养为例，在增殖培养基(DMEM，含有10％的胎牛血清(FBS，Gibco)中，在37℃，95％相对湿度和5％CO2。细胞培养基每三天后更换。使用前，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，使用胰蛋白酶/EDTA溶液中分离(0.25％的胰蛋白酶/0.02％EDTA)5分钟，并悬浮于培养基中以备使用。
(II)作为细胞二维培养基底材料的可注射胶体凝胶的制备：
将上述制备的复合胶体凝胶直接通过注射器注入PDMS硅胶加工的模具(5毫米直径为2mm深度)中成型，并放置入细胞培养6孔板中。以该凝胶材料作为细胞二维培养的基底，将步骤I中制备的细胞悬液直接滴加在凝胶表面，按照细胞浓度为5000个/cm2接种，静置1小时后，加入培养基没过凝胶的表面，每24小时更换培养基。
通过使用死活荧光染色(LIVE/DEAD assay)对凝胶材料的细胞毒性进行考察。为此，染色前用无菌PBS清洗30分钟，在室温下加入2mM钙黄绿素(绿色荧光标记活细胞)和4mM乙锭同型二聚体(红色荧光标记死细胞)，并使用共聚焦激光扫描显微镜检查。结果如图12所示，NIH/3T3成纤维细胞接种在所制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶表面，并作为细胞体外培养的二维细胞外基质材料，通过考察细胞的黏附、铺展和增殖情况考察材料的生物相容性和细胞毒性。
NIH/3T3细胞分别在二氧化硅/明胶混合比例为1(左图)和5(右图)的复合胶体凝胶表面接种，并培养24(上图)和72小时(下图)后对细胞贴附和增值的情况进行考察。其中，所有胶体凝胶的胶体体积分数为75％。结果表明，细胞在复合凝胶表面贴附并快速生长繁殖，与普通细胞培养板相比无显著差异，证实实施例中复合凝胶具有良好的生物相容性并无细胞毒性。
通过考察黏附在材料表面细胞铺展的面积占材料表面总面积的百分比，可以对细胞增殖情况进行半定量的表征。结果如图16所示，细胞随着时间的增加快速增殖，在72小时内几乎铺满了整个材料表面，证实二氧化硅/明胶复合材料胶体凝胶具有良好的相容性。与细胞在普通的细胞培养板表面增殖行为相比，细胞在复合胶体凝胶表面增殖速率相当，证实了材料的生物相容性和无细胞毒性。
对比例4
使用实施例1中的明胶微球，并将其分别将明胶微球分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，其中明胶胶体颗粒体积占悬液总体积的百分比为75％。向明胶单相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为80mM，静置2～10分钟即形成复合凝胶以备使用。细胞培养实验实施步骤与实施例10中相同。
图13是对比例4中制备的单相明胶纳米颗粒构成的胶体凝胶的体外细胞培养实验结果。NIH/3T3成纤维细胞分别在明胶胶体凝胶(左图)和普通细胞培养板(右图)表面接种，并培养24(上图)和72小时(下图)后对细胞贴附和增值的情况进行考察。其中，明胶微球组成的胶体凝胶的胶体颗粒体积分数为75％。结果表明，细胞在明胶胶体凝胶表面贴附并快速生长繁殖，与普通细胞培养板相比无显著差异，证实实施例中明胶胶体凝胶具有良好的生物相容性并无细胞毒性。
通过考察黏附在材料表面细胞铺展的面积占材料表面总面积的百分比，可以对细胞增殖情况进行半定量的表征。结果如图16所示，细胞随着时间的增加快速增殖，在72小时内几乎铺满了整个材料表面，证实单纯明胶颗粒组装而成的胶体凝胶具有良好的相容性。与细胞在普通的细胞培养板表面增殖行为相比，细胞在复合胶体凝胶表面增殖速率相当，证实了材料的生物相容性和无细胞毒性。
实施例11
使用实施例1中的明胶和二氧化硅微球，并将其分别将明胶和二氧化硅微球分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，两种胶体颗粒的体积占分散液总体积的百分比为100％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，其中两相颗粒的混合比为两相颗粒数量比二氧化硅/明胶＝1，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为80mM，静置2分钟即形成复合凝胶以备使用。利用实施例10中所述方法制备细胞浓度为400000个/cm3的细胞悬液，并将其与上述胶体凝胶混合均匀，从而得到胶体颗粒体积分数为75％的载有活体细胞的复合胶体凝胶，凝胶中细胞浓度为100000个/cm3。将上述制备的载细胞复合胶体凝胶直接通过注射器注入PDMS硅胶加工的模具(5毫米直径为2mm深度)中成型，并放置入细胞培养6孔板中。加入培养基没过凝胶的表面，每24小时更换培养基。通过体外细胞培养，以二氧化硅/明胶复合胶体凝胶作为细胞培养的三维细胞外基质材料，通过实施例10中所述的细胞死活染色方法考察本发明中所述的复合胶体凝胶的生物相容性和是否有细胞毒性。结果如图14，表明细胞在复合凝胶内部伸展并快速生长繁殖，证实实施例中复合凝胶具有良好的生物相容性并无细胞毒性。
图14是实施例11中制备的二氧化硅/明胶复合胶体凝胶作为活体细胞体外培养的三维细胞外基质材料，考察该复合凝胶的生物相容性和细胞毒性。被固载于胶体凝胶中的NIH/3T3成纤维细胞三维培养24(左图)和72小时(右图)后细胞增值的死活染色荧光显微镜照片。其中，复合胶体凝胶的胶体体积分数为75％，两相颗粒数量比为二氧化硅/明胶＝1的比例共混。结果表明，细胞在复合凝胶内部伸展并快速生长繁殖，证实实施例中复合凝胶具有良好的生物相容性并无细胞毒性。
实施例12
通过水热法制备羟基磷灰石纳米颗粒[10]，颗粒呈针状纳米颗粒，粒径长轴约为100nm，横轴约为20-30nm(其显微形貌如图15所示)，表面Zeta电势为-5.6±1.4mV。为该纳米颗粒作为带负电荷的胶体颗粒组分，以实施例1中的明胶微球作为带正电荷胶体颗粒组分，并两种胶体颗粒分别分散在一定体积的NaOH(20mM)水溶液中，得到均匀分散的胶体颗粒悬浊液，其中两种胶体颗粒的体积占悬液总体积的百分比分别为50％；将相同浓度(即体积分数浓度)的明胶和二氧化硅胶体颗粒悬液直接共混并快速搅拌混匀，其中两相混合比为两相颗粒数量比羟基磷灰石/明胶＝1，得到两相胶体颗粒均匀混合的胶体悬浊液。向该双相胶体分散液中加入酸化剂葡萄糖酸内酯粉末，最终浓度为50mM，静置2～10分钟即形成复合凝胶以备使用。通过流变仪测得该实施例中羟基磷灰石/明胶复合胶体凝胶的弹性模量约为7645±876Pa，受剪切破坏后自修复效率约为89±16％。该结果证明，本发明所述的复合胶体凝胶体系中的无机相颗粒可选择包括二氧化硅颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒等纳米颗粒，均可用于设计制备具有类似高强度自修复性能的胶体凝胶。
参考文献
1.Cordier,P.,et al.,Self-healing and thermoreversible rubber fromsupramolecular assembly.Nature,2008.451(7181):p.977-80.
2.Lu,H.D.,et al.,Injectable shear-thinning hydrogels engineered witha self-assembling Dock-and-Lock mechanism.Biomaterials,2012.33(7):p.2145-2153.
3.Foo,C.T.W.P.,et al.,Two-component protein-engineered physicalhydrogels for cell encapsulation.Proceedings of the National Academy ofSciences,2009.106(52):p.22067-22072.
4.Diba,M.,et al.,Preparation and characterization ofpolycaprolactone/forsterite nanocomposite porous scaffolds designed for bonetissue regeneration.Composites Science and Technology,2012.72(6):p.716-723.
5.Paul,D.R.and L.M.Robeson,Polymer nanotechnology:Nanocomposites.Polymer,2008.49(15):p.3187-3204.
6.Haraguchi,K.,Nanocomposite hydrogels.Current Opinion in Solid Stateand Materials Science,2007.11(3–4):p.47-54.
7.Coester,C.,et al.,Gelatin nanoparticles by two step desolvation anew preparation method,surface modifications and cell uptake.Journal ofmicroencapsulation,2000.17(2):p.187-193.
8.Balthasar,S.,et al.,Preparation and characterisation of antibodymodified gelatin nanoparticles as drug carrier system for uptake inlymphocytes.Biomaterials,2005.26(15):p.2723-2732.
9.Hench,L.L.and J.K.West,The sol-gel process.Chemical Reviews,1990.90(1):p.33-72.
10.Kumar,R.,et al.,Temperature driven morphological changes ofchemically precipitated hydroxyapatite nanoparticles.Langmuir,2004.20(13):p.5196-5200.

Claims (12)

1.一种由有机/无机微米或纳米颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料的制备方法，工艺步骤如下：
将表面带正电荷的明胶颗粒分散在pH>10的碱性水溶液中形成明胶颗粒悬浊液；
将表面带负电荷的无机颗粒分散在pH>10的碱性水溶液中形成无机颗粒悬浊液；
将相同体积分数浓度的明胶颗粒悬浊液和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，得到均匀分散的胶体悬浊液；向所述胶体悬浊液中加入酸化剂干粉，并快速混匀，静置2～10分钟即形成复合凝胶；
酸化剂最终浓度为10～200mM；
无机颗粒尺寸为20～2000nm；
明胶颗粒尺寸为20～2000nm；
所述酸化剂选自葡萄糖酸内酯；
所述明胶颗粒悬浊液中明胶颗粒的体积百分比为2％～150％；
所述无机颗粒悬浊液中无机颗粒的体积百分比为2％～150％；
明胶颗粒悬浊液和无机颗粒悬浊液按照无机颗粒/明胶颗粒＝0.1～50的数量比混合。
2.一种由有机/无机微米或纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料的制备方法，工艺步骤如下：
将表面带正电荷的明胶颗粒分散在pH<5的酸性水溶液中形成明胶颗粒悬浊液；
将表面带负电荷的无机颗粒分散在pH<5的酸性水溶液中形成无机颗粒悬浊液；
将相同体积分数浓度的明胶颗粒悬浊液和无机颗粒悬浊液直接混合并快速搅拌混匀，得到均匀分散的胶体悬浊液；向所述胶体悬浊液中加入碱化剂干粉，并快速混匀，静置2～10分钟即形成复合凝胶；
碱化剂最终浓度为10～200mM；
无机颗粒尺寸为20～2000nm；
明胶颗粒尺寸为20～2000nm；
所述碱化剂是尿素和脲酶的组合；
所述明胶颗粒悬浊液中明胶颗粒的体积百分比为2％～150％；
所述无机颗粒悬浊液中无机颗粒的体积百分比为2％～150％；
明胶颗粒悬浊液和无机颗粒悬浊液按照无机颗粒/明胶颗粒＝0.1～50的数量比混合。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于：所述无机颗粒表面电势为-5～-60mV。
4.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于：所述明胶颗粒表面电势为+5～+60mV。
5.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于：所述无机颗粒选自表面带负电荷的二氧化硅颗粒、硅酸镁锂纳米颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、石墨烯纳米颗粒、纳米碳管、氧化铁纳米颗粒、钛酸钡纳米颗粒中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述碱性水溶液选自浓度为5～100mM的NaOH、KOH、氨水中的一种或几种。
7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述酸性水溶液选自浓度为5～100mM的HCl、HNO3、H2SO4中的一种或几种。
8.如权利要求1～7任意一项所述制备方法得到的复合胶体凝胶。
9.如权利要求8所述复合胶体凝胶作为水溶性的、生物活性分子的载体的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：将溶解有生物活性分子的水性溶液直接与复合胶体凝胶混合，得到实现胶体凝胶的药物加载；所述生物活性分子选自具有生物活性的药物、蛋白质和信号因子中的一种。
11.如权利要求8所述复合胶体凝胶作为的活体细胞的载体的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：将悬浮有细胞的水性溶液直接与复合胶体凝胶混合，实现胶体凝胶的细胞固载；所述的细胞选自原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种。
CN201610165057.6A 2016-03-22 2016-03-22 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用 Withdrawn - After Issue CN105796478B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610165057.6A CN105796478B (zh) 2016-03-22 2016-03-22 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用
CN201811459839.6A CN109662941A (zh) 2016-03-22 2016-03-22 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610165057.6A CN105796478B (zh) 2016-03-22 2016-03-22 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811459839.6A Division CN109662941A (zh) 2016-03-22 2016-03-22 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105796478A CN105796478A (zh) 2016-07-27
CN105796478B true CN105796478B (zh) 2019-01-22

Family

ID=56454594

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811459839.6A Withdrawn CN109662941A (zh) 2016-03-22 2016-03-22 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用
CN201610165057.6A Withdrawn - After Issue CN105796478B (zh) 2016-03-22 2016-03-22 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811459839.6A Withdrawn CN109662941A (zh) 2016-03-22 2016-03-22 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN109662941A (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019012004A (es) * 2017-04-05 2020-02-12 Univ Carnegie Mellon Material de soporte de fabricacion de aditivos.
CN106983905B (zh) * 2017-05-12 2019-10-11 深圳华诺生物科技有限公司 一种可注射型自愈合止血材料及其制备方法和应用
CN107007881B (zh) * 2017-05-12 2020-11-27 深圳华诺生物科技有限公司 可用于药物加载和释放的可注射型自愈合凝胶及其制备方法和应用
CN107376008B (zh) * 2017-07-21 2019-10-22 深圳华诺生物科技有限公司 一种无机纳米颗粒-明胶核壳结构复合材料颗粒的制备方法
CN108558260B (zh) * 2018-05-24 2020-12-01 中交四航工程研究院有限公司 一种自愈合混凝土复合酶微胶囊材料及其制备方法
TWI673103B (zh) 2018-10-19 2019-10-01 國立清華大學 可注射型自組裝微球凝膠、其用途及可注射型自組裝微球凝膠的製備方法
CN111068111B (zh) * 2018-10-19 2022-03-22 胡尚秀 可注射型自组装微球凝胶、其用途及制备方法
CN109452544A (zh) * 2018-10-19 2019-03-12 福建拓天生物科技有限公司 一种复合薏米超微粉的制备工艺
CN109481393A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 合肥工业大学 一种电荷反转介导的可注射型胶体粒药物凝胶缓释植入剂及其制备方法
WO2020215307A1 (zh) * 2019-04-26 2020-10-29 深圳先进技术研究院 材料的表面改性方法及其改性后的材料和应用、医疗产品
CN110652875B (zh) * 2019-09-20 2021-12-21 三达膜科技（厦门）有限公司 一种耐磨损陶瓷微滤膜的制备方法
CN110698698B (zh) * 2019-09-29 2021-02-02 同济大学 一种壳聚糖水凝胶的制备方法
CN110665063A (zh) * 2019-10-28 2020-01-10 中国人民解放军第四军医大学 3d生物打印墨水及其制备方法、组织工程支架及其制备方法
CN113278168B (zh) * 2021-01-29 2023-03-21 大连理工大学 一种两场耦合交联的、可注射、可塑形、可打印颗粒水凝胶材料及其制备方法和应用
CN113336536B (zh) * 2021-05-31 2022-11-15 大连理工大学 一种无机非金属纳米颗粒组装的水凝胶材料及其在增材制造技术中的应用
CN113984515B (zh) * 2021-10-18 2023-06-16 同济大学 一种利用共聚焦显微镜观察水力裂缝起裂与扩展的方法
CN114921236B (zh) * 2022-05-24 2023-02-03 中国石油大学(北京) 一种基于纳米材料缔合的自修复交互网络结构凝胶及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1260686A (zh) * 1997-04-22 2000-07-19 德国城国际有限公司 含有微粒凝胶的食用组合物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7655710B2 (en) * 2002-05-22 2010-02-02 Basf Construction Polymers Gmbh Use of water-soluble polymers as auxiliary drying agents for the production of polymer dispersing agents

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1260686A (zh) * 1997-04-22 2000-07-19 德国城国际有限公司 含有微粒凝胶的食用组合物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of injectable organic inorganic colloidal composite gels made of self assembling gelatin nanospheres and calcium phosphate nanocrystals;Huanan Wang等;《Acta Biomaterialia》;20140131;第10卷;第508-519页
Gelatine silicate interactions from nanoparticles to composite gels;Thibaud Coradin等;《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》;20040501;第35卷;第53-58页
Oppositely Charged Gelatin Nanospheres as Building Blocks for Injectable and Biodegradable Gels;Huanan Wang等;《Adv. Mater.》;20110325;第23卷(第12期);第H119-H124页
Silica collagen bionanocomposites as three dimensional scaffolds for fibroblast immobilization;Martin F. Desimone等;《Acta Biomaterialia》;20101031;第6卷;第3998-4004页
胶体间相互作用及凝胶化对水性仿石涂料的影响;常雨鑫等;《北京化工大学学报(自然科学版)》;20101231;第37卷(第4期);第62-66页

Also Published As

Publication number Publication date
CN109662941A (zh) 2019-04-23
CN105796478A (zh) 2016-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105796478B (zh) 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用
Zhang et al. 3D bioprinting of graphene oxide-incorporated cell-laden bone mimicking scaffolds for promoting scaffold fidelity, osteogenic differentiation and mineralization
WO2022160518A1 (zh) 一种两场耦合交联的、可注射、可塑形、可打印颗粒水凝胶材料及其制备方法和应用
Ghanbari et al. Injectable hydrogels based on oxidized alginate-gelatin reinforced by carbon nitride quantum dots for tissue engineering
Zengin et al. Injectable, self-healing mesoporous silica nanocomposite hydrogels with improved mechanical properties
CN107007881B (zh) 可用于药物加载和释放的可注射型自愈合凝胶及其制备方法和应用
US11331414B2 (en) Method for preparing inorganic nanoparticle-gelatin core-shell composite particles
Samadian et al. A novel alginate-gelatin microcapsule to enhance bone differentiation of mesenchymal stem cells
Song et al. Engineering bone regeneration with novel cell-laden hydrogel microfiber-injectable calcium phosphate scaffold
CN113559328B (zh) 一种生物墨水及其制备方法
CN107412877B (zh) 一种磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备方法及其应用
CN111097068B (zh) 一种仿生的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3d打印支架及其制备方法
CN108295306B (zh) 一种含介孔纳米磷酸钙颗粒填料的三维打印水凝胶材料及其制备方法
CN111040205A (zh) 一种基于聚乙二醇/明胶颗粒的双网络水凝胶及其制备方法和应用
Zheng et al. Preparation of bioactive hydroxyapatite@ halloysite and its effect on MC3T3-E1 osteogenic differentiation of chitosan film
CN108525017B (zh) 一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶及其制备方法
KR20200029656A (ko) 3d 프린팅을 위한 가시광선 경화용 바이오잉크 조성물 및 이의 제조방법
CN115521627A (zh) 一种结构蛋白/透明质酸复合微纳米颗粒及颗粒水凝胶材料和应用
Du et al. Progress and prospects of nanocomposite hydrogels in bone tissue engineering
Kouhi et al. GPTMS-modified bredigite/PHBV nanofibrous bone scaffolds with enhanced mechanical and biological properties
CN114432496A (zh) 一种天然高分子有机纳米复合的可注射可二次力学增强的双网络水凝胶的制备方法
Varshosaz et al. Effect of bassorin (derived from gum tragacanth) and halloysite nanotubes on physicochemical properties and the osteoconductivity of methylcellulose-based injectable hydrogels
Tajik et al. 3D Printing of Hybrid-Hydrogel Materials for Tissue Engineering: A Critical Review
Maia et al. Engineering natural based nanocomposite inks via interface interaction for extrusion 3D printing
Seok et al. Bio-plotted hydrogel scaffold with core and sheath strand-enhancing mechanical and biological properties for tissue regeneration

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181128

Address after: 518104 Houting Community, Shajing Street, Baoan District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant after: Shenzhen Sino Biological Technology Co., Ltd.

Address before: 116000 College of life sciences, Dalian University of Technology, 2 linggong Road, hi tech park, Dalian, Liaoning

Applicant before: Wang Huanan

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
AV01 Patent right actively abandoned

Granted publication date: 20190122

Effective date of abandoning: 20201016

AV01 Patent right actively abandoned

Granted publication date: 20190122

Effective date of abandoning: 20201016

AV01 Patent right actively abandoned
AV01 Patent right actively abandoned