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CN105745224B - 用于治疗癌症的针对ly75的偶联抗体 - Google Patents

用于治疗癌症的针对ly75的偶联抗体 Download PDF

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CN105745224B CN201480058705.7A CN201480058705A CN105745224B CN 105745224 B CN105745224 B CN 105745224B CN 201480058705 A CN201480058705 A CN 201480058705A CN 105745224 B CN105745224 B CN 105745224B
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Abstract

本发明提供了结合LY75的抗体。也提供编码该抗体的核酸分子，用于表达该抗体的表达载体、宿主细胞和方法。该抗体可用于治疗癌症，包括胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。

Description

用于治疗癌症的针对LY75的偶联抗体
介绍
本发明一般涉及免疫学和分子生物学领域。更具体地，本文提供了针对LY75的抗体和其他治疗性蛋白质，编码这类抗体和治疗性蛋白质的核酸，制备单克隆抗体和其他治疗性蛋白质的方法，和治疗疾病如LY75表达/活性介导的和/或与其配体的异常表达/活性相关的癌症的方法。
背景
淋巴细胞抗原75作为内吞受体将捕获的抗原从胞外空间导向特定的抗原加工隔室并被认为导致B淋巴细胞增殖的减少。已经在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌和肺(非小细胞)癌以及多发性骨髓和许多不同亚型的淋巴瘤和白血病中观察到淋巴细胞抗原75的表达。
WO2009/061996公开了分离的结合人DEC-205(LY75)的单克隆抗体以及基于相关抗体的组合物和分子。还公开了包含抗体的药物组合物，以及使用该抗体的治疗和诊断方法。
WO2008/104806公开了用于治疗或预防癌症的能够结合LY75的亲和试剂。
发明内容
本发明提供了针对LY75的抗体、编码这类抗体的核酸、包含这类编码本发明的抗体的核酸的宿主细胞、制备抗-LY75的方法、以及治疗疾病(如LY75介导的疾病)的方法，例如，人癌症，包括胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
在一个方面中，本发明提供抗体或其抗原结合部分，其(a)结合LY75上被包含重链可变区和轻链可变区的抗体所识别的表位，该重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且该轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或(b)与包含重链可变区和轻链可变区的抗体竞争结合LY75，该重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且该轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合人LY75并且包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含选自包含SEQ ID NO:5、6和7的CDR的1、2或3个CDR，并且该轻链可变区包含选自包含SEQ ID NO:8、9和10的CDR的1、2或3个CDR。
在优选的实施方式中，所述抗体是分离抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗体结合LY75(SEQ ID No:15)并且通过表达LY75的细胞内化，在效应细胞存在下引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)响应或在效应细胞存在下引发细胞毒性T-细胞响应。
在另一个实施方式中，抗体包含本文所述的特定抗体(例如，本文中称为“LY75_A1”)的重链和/或轻链互补决定区(CDR)或可变区(VR)。因此，在一个实施方式中，该抗体包含具有SEQ ID NO:1所示序列的抗体LY75_A1的重链可变(VH)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，和/或具有SEQ ID NO:2所示序列的LY75_A1的轻链可变(VL)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在另一个实施方式中，该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含包含SEQ ID NO:5的第一vhCDR、包含SEQ ID NO:6的第二vhCDR、包含SEQ ID NO:7的第三vhCDR，该轻链可变区包含包含SEQ ID NO:8的第一vlCDR、包含SEQ ID NO:9的第二vlCDR、包含SEQ ID NO:10的第三vlCDR，任选地，其中CDR中的任意一个或多个独立地包含1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或删除。
在另一个实施方式中，本发明的抗体结合人LY75并且包括包含SEQ ID NO:1的重链可变区，和/或其保守性序列修饰。该抗体还可包括包含SEQ ID NO:2的轻链可变区，和/或其保守性序列修饰。
在其他实施方式中，本发明的抗体结合至人LY75并且包括重链可变区和轻链可变气，其分别包括SEQ ID NO:1和/或2所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰。
本发明中也包括分离抗体，其包含与任意上述序列有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或更高序列相同性的重链和轻链可变区。本发明也包括上述值的范围中间值，例如，与任意上述序列有至少80-85％、85-90％、90-95％或95-100％序列相同性的重链和轻链可变区。在一个实施方式中，该抗体包括包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、或至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的序列的重链可变区。在另一个实施方式中，该抗体包括包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、或至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的序列的轻链可变区。在另一个实施方式中，该抗体包含重链构架区序列，其包含与如SEQ ID NO:16、17、18和19所示的SEQ ID NO:1的重链可变区的构架至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，该抗体包含轻链构架区序列，其包含与如SEQ ID NO:20、21、22和23所示的SEQ ID NO:2的轻链可变区的构架至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。
本发明还包括与本发明的抗体竞争结合LY75的抗体。在具体实施方式中，该抗体与包含分别包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列或与其至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体竞争结合LY75。在另一个实施方式中，抗体与包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体(LY75_A1)竞争结合LY75。
本发明的其他抗体结合相同表位或本文所述抗体识别的LY75上的表位。在另一个特定实施方式中，抗体结合由包含分别包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列或与其有至少80％相同的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体识别的LY75上的表位。在另一个实施方式中，抗体结合至包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体(LY75_A1)所识别的LY75上的表位。
在其他实施方式中，本发明的抗体特异性结合选自SEQ ID NO:24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37的一种或多种，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种肽或其片段，其中所述片段包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续氨基酸。在另一个实施方式中，由本发明的抗体识别的表位包含选自SEQ ID NO:27、29、30、34、35、36或37的一种或多种肽，2种或更多或3种或更多种肽或其片段，其中所述片段包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续氨基酸。在另一个实施方式中，由本发明的抗体识别的表位包含选自SEQ ID NO:30、36和37的一种或多种肽，例如，2种或3种肽或其片段，其中所述片段包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明的抗体包含与本文所述的母体抗体相当的可变CDR。因此，本发明提供了包含母体抗体的变体可变区的变体抗体，其中母体抗体包含包含SEQID NO:5的第一vhCDR、包含SEQ ID NO:6的第二vhCDR、包含SEQ ID NO:7的第三vhCDR、包含SEQ ID NO:8的第一vlCDR、包含SEQ ID NO:9的第二vlCDR、包含SEQ ID NO:10的第三vlCDR，其中变体抗体在第一vhCDR、第二vhCDR、第三vhCDR、第一vlCDR、第二vlCDR和第三vlCDR的组中总共具有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，特别使用1-4个、1-3个或1-2个取代，并且其中该抗体保留对LY75的特异性结合。
本发明的抗体可以是全长，例如，任意以下同种型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。或者，抗体可以是片段，如抗原结合部分或单链抗体(例如，Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段、分离的互补决定区(CDR)或2个或更多个分离的CDR的组合)。抗体可以是任何类型的抗体，包括但不限于人、人源化、和嵌合抗体。
在其他实施方式中，本发明的抗体是免疫偶联物的形式(即，还包括共价附连的部分)。在具体实施方式中，该部分是药物，如美登木素、尾海兔素、澳瑞他汀、新月毒素、卡奇霉素、CC1065或其衍生物。在优选的实施方式中，药物部分是DM1或DM4。
在其他实施方式中，本发明的抗体还包括双特异性分子并且由此可在效应细胞存在下引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)响应，从而杀死LY75-表达细胞。
在其他实施方式中，本发明的抗体还包括双特异性分子并且由此可在效应细胞存在下引发细胞毒性T-细胞响应，从而杀死LY75-表达细胞。
在另一个方面，本发明提供编码本发明的抗体的重链和/或轻链可变区的核酸。在一个实施方式中，提供了包含编码本发明的抗体的重链或其抗原结合部分的序列的核酸。在另一个实施方式中，提供了包含编码本发明的抗体的轻链或其抗原结合部分的序列的核酸。在另一个实施方式中，提供了包含编码本发明的抗体的重链和轻链可变区的序列的核酸。
在一个实施方式中，本发明提供了结合人LY75的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含分别由包含SEQ ID NO:3和4的核酸序列、具有与前述氨基酸序列有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列或由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO:3和4不同的序列编码的重链可变区和轻链可变区。
在本发明的另一个方面，提供了包含与一个或多个调节元件可操作连接的编码本发明抗体的重链和/或轻链可变区的核酸的表达载体。
在另一个方面，本发明提供了含有编码前述抗体的核酸编码重链和/或轻链可变区或其抗原结合部分的宿主细胞。优选地，其中当宿主细胞在核酸表达的条件下生长时，宿主细胞表达所述重链和/或轻链可变区或其抗原结合部分。
在一种优选实施方式中，宿主细胞包含：(i)本发明的表达载体；或
(ii)包含编码本发明的抗体的重链的核酸序列的第一表达载体或其抗原结合部分，包含编码本发明的抗体的轻链的核酸序列的第二表达载体或其抗原结合部分。
在本发明的另一个方面，提供了制备抗体或其抗原结合部分，包括在抗体或其抗原结合部分表达的条件下培养本发明的宿主细胞并且任选地分离该抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面，提供了治疗癌症的方法，包括向有此需要的患者给予本发明的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分由表达LY75的细胞内化，所述抗体或抗原结合部分包含共价附连的药物偶联物。将理解本发明的抗体或其抗原结合部分是结合LY75的(SEQ ID No:15)。在一个实施方式中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含包含SEQ ID NO:5的第一vhCDR、包含SEQ ID NO:6的第二vhCDR、包含SEQ IDNO:7的第三vhCDR，该轻链可变区包含包含SEQ ID NO:8的第一vlCDR、包含SEQ ID NO:9的第二vlCDR、包含SEQ ID NO:10的第三vlCDR，以及共价附连的药物偶联物。
在另一个方面，提供了治疗癌症的方法，其中向有此需要的患者给予本发明的抗体或其抗原结合部分，并且其中本发明的这种抗体或其抗原结合部分在效应细胞存在下引发ADCC响应。优选地，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含包含SEQ ID NO:5的第一vhCDR、包含SEQ ID NO:6的第二vhCDR、包含SEQ ID NO:7的第三vhCDR，该轻链可变区包含包含SEQ ID NO:8的第一vlCDR、包含SEQ ID NO:9的第二vlCDR、包含SEQ ID NO:10的第三vlCDR。
在另一个方面，提供了治疗癌症的方法，其中向有此需要的患者给予本发明的抗体或其抗原结合部分，并且其中本发明的这种抗体或其抗原结合部分在效应细胞存在下引发细胞毒性T-细胞响应。优选地，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含包含SEQ ID NO:5的第一vhCDR、包含SEQ ID NO:6的第二vhCDR、包含SEQID NO:7的第三vhCDR，该轻链可变区包含包含SEQ ID NO:8的第一vlCDR、包含SEQ ID NO:9的第二vlCDR、包含SEQ ID NO:10的第三vlCDR。
在本发明的其他方面中，提供了一种或多种本发明的抗体用于治疗癌症。
还提供了一种或多种本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方式中，癌症选自下组：胰腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、白血病、骨髓瘤优选多发性骨髓瘤、和淋巴瘤。特别优选的癌症包括非霍奇金淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、膀胱癌、胰腺癌和三阴性乳腺癌。
按照本发明的另一个方面，提供了一种检测、诊断和/或筛选或监测癌症进展的方法(其中LY75在所述癌症中表达)或者提供了一种监测对象中针对所述癌症的癌症药物或治疗作用的方法，该方法包括检测能够免疫特异性结合LY75的抗体或其一种或多种片段是否存在或其水平。
优选地，癌症选自下组：胰腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、白血病、骨髓瘤优选多发性骨髓瘤、和淋巴瘤。特别优选的癌症包括非霍奇金淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、膀胱癌、胰腺癌和三阴性乳腺癌。
本发明的范围还包括含有本发明组合物(例如，抗体)及任选的使用说明的药盒。药盒还可包含至少一种其它试剂或一种或多种本发明的其他抗体。
从以下发明详述和所附权利要求书很容易了解本发明的其他特征和优点。
附图的简要说明
图1显示了LY75_A1重链(SEQ ID NO:1)、人VH 3-15种系(SEQ ID NO:11)和人JH4种系(SEQ ID NO:12)的比对。LY75_A1重链的CDR区带下划线。
图2显示了LY75_A1轻链(SEQ ID NO:2)、人VK O12种系(SEQ ID NO:13)和人JH4种系(SEQ ID NO:14)的比对。LY75_A1轻链的CDR区带下划线。
图3a显示了偶联DM1的抗-LY75单克隆抗体在HT-29中的细胞毒性活性，并且显示虽然大多数抗体结合LY75，但是仅一些显示功效。
图3b显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在HT-29中的细胞毒性活性。
图3c显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在拉吉细胞中的细胞毒性活性。
图3d显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在纳玛瓦细胞中的细胞毒性活性。
图3e显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在Karpas 299细胞中的细胞毒性活性。
图3f显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在BxPC3细胞中的细胞毒性活性。
图3g显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在HupT4细胞中的细胞毒性活性。
图3h显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在HPAFFII细胞中的细胞毒性活性。
图3i显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在EHEB细胞中的细胞毒性活性。
图3j显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在Mec-1细胞中的细胞毒性活性。
图3k显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在AML-193细胞中的细胞毒性活性。
图3l显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在HCC 70细胞中的细胞毒性活性。
图3m显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在HCC 1806细胞中的细胞毒性活性。
图3n显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在MDA-MB-468细胞中的细胞毒性活性。
图3o显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在RT4细胞中的细胞毒性活性。
图3p显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在5637细胞中的细胞毒性活性。
图3q显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在SW780细胞中的细胞毒性活性。
图3r显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在SCC-9细胞中的细胞毒性活性。
图3s显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在OE 19细胞中的细胞毒性活性。
图3t显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在OVCAR-3细胞中的细胞毒性活性。
图3u显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在SK-OV-3细胞中的细胞毒性活性。
图3v显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在MOLP-8细胞中的细胞毒性活性。
图3w显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在RPMI8226细胞中的细胞毒性活性。
图4a显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在拉吉伯基特淋巴瘤SCID小鼠异种移植模型中的功效。
图4b显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在纳玛瓦伯基特淋巴瘤SCID小鼠异种移植模型中的功效。
图4c显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在HPAFII胰腺癌无胸腺裸小鼠异种移植模型中的功效。
图4d显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在SW780人膀胱癌SCID小鼠异种移植模型中的功效。
图4e显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在MDA-MB-468无胸腺裸小鼠异种移植模型中的功效。
图4f显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体在COLO205结直肠癌无胸腺裸小鼠异种移植模型中的功效。
图5a显示了抗-LY75-mAb和偶联至MCC-DM1的抗-LY75-mAb的竞争性结合。
图5b显示了LY75_A1和偶联至MCC-DM1的抗-LY75-mAb的竞争性结合。
图6a-6j显示抗体LY75_A1对肽微整列上的LY75肽的结合的示意图。
图7显示在肽微阵列试验和肽拉下试验中抗体LY75_A1结合的肽的氨基酸比对。突出显示的肽是可能形成由抗体LY75_A1识别的表位的那些肽。
发明详述
本发明涉及与本文所列的SEQ ID No:15中所述的LY75蛋白质结合的分离抗体。
另外，本发明的LY75抗体可以是双特异性分子并且由此可在效应细胞存在下引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)响应，从而杀死LY75-表达细胞。
另外，本发明的LY75抗体可以是双特异性分子并且由此可在效应细胞存在下引发细胞毒性T-细胞响应，从而杀死LY75-表达细胞。
另外，当与表达LY75受体的细胞接触时，本发明的LY75抗体可以内化。如本文所述，LY75受体在某些癌细胞中过表达和/或差异表达，包括但不限于，肾癌、肝癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病优选急性骨髓性白血病或慢性淋巴细胞性白血病、骨髓瘤优选多发性骨髓瘤、淋巴瘤优选DLBCL B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、和肺癌。
如此，当本发明的LY75抗体偶联至药物(有时在本文中称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)时，这些ADC分子内化到癌细胞中导致细胞死亡并由此治疗肿瘤。
本发明提供了具有特定结构特征，如带特定氨基酸序列的CDR区的抗体。本文所述的是可形成亲和试剂，例如显示出对LY75结合的抗体的一组CDR。
因此，本发明提供了抗体，优选分离抗体(其如下所述包括多种熟知的抗体结构、衍生物、模拟物和偶联物)、编码这些抗体的核酸、用于制备抗体的宿主细胞、制备抗体的方法、和包含抗体和任选的药物运载体的药物组合物、包括使用抗体的治疗和诊断的方法、和抗体在治疗癌症中的用途。
LY75蛋白质
淋巴细胞抗原75作为内吞受体将捕获的抗原从胞外空间导向特定的抗原加工隔室并被认为导致B淋巴细胞增殖的减少。
根据SWISS-PROT，淋巴细胞抗原75表达于脾、胸腺、结肠和外周血淋巴细胞。已在骨髓和B淋巴细胞系中检测到该蛋白。本文所称的同种型OGTA076b和OGTA076c表达于称作霍奇金和里-施(HRS)细胞的恶性霍奇金淋巴瘤细胞中。LY75作为内吞受体将捕获的抗原从胞外空间导向特定的抗原加工隔室。其导致B淋巴细胞增殖的减少。
已经在胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌(包括三阴性)、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌和肺(非小细胞)癌以及多发性骨髓和许多不同亚型的淋巴瘤和白血病中观察到LY75的表达。
在某些情况中，本发明的抗体与来自人以外物种的LY75交叉反应。例如，为了促进临床测试，本发明的抗体可与鼠或灵长类LY75分子交叉反应。或者，在某些实施方式中，该抗体可对于人LY75有竞争特异性并且可能不显示出物种或其他类型的非人交叉反应性。
抗体
本发明提供抗-LY75抗体，一般是本文所述的治疗性和/或诊断性抗体。发现用于本发明的抗体可采用本文所述的多种模式，包括传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物，如下所述。在一个实施方式中，本发明提供含有一组本文定义的6个CDR的抗体结构(包括少量的氨基酸变化，如下所述)。
本文所用的“抗体”包括多种结构，如本领域技术人员所想的那样，在一些实施方式中含有最少一组6个本文定义的CDR；包括但不限于常规抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、人源化和/或嵌合抗体、抗体片段、工程改造的抗体(例如，带有下文所列的氨基酸修饰)、多特异性抗体(包括双特异性抗体)和其他本领域已知的类似物。
常规抗体结构单元一般包括四聚体。各四聚体一般由两对相同的多肽链构成，各对有一条“轻链”(一般分子量为约25kDa)和一条“重链”(一般分子量为约50-70kDa)。人轻链分类为κ和λ轻链。重链被归类为μ、δ、γ、α或ε，并确定了抗体的同种型，分别为IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。IgG具有多种亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚型，包括但不限于IgM1和IgM2。因此，本文所用的“同种型”表示由其恒定区的化学和抗原特性限定的免疫球蛋白的任何亚型。已知的人免疫球蛋白亚型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。应理解治疗性抗体也可包括同种型和/或亚型的任意组合的杂合体。
在许多实施方式中，本发明中使用IgG同种型，IgG1发现在多种应用中的特定用途。
各链的氨基末端部分包含约100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。在可变区中，重链和轻链的各V结构域中3个环聚集在一起形成抗原结合位点。各环称为互补决定区(下文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列中的变化是最明显的。“可变”是指可变区的某些区段在序列上在抗体间广泛变化的事实。可变区内的变化并不是均匀分布的。相反，由相对不变的延伸组成的V区称为构架区(FR)，其由被极端变化的称为“高变区”的各自长度为9-15个氨基酸或更长的较短区分隔的15-30个氨基酸组成。
每一VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR组成，从氨基端到羧基端按照以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
高变区一般包含来自轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基；Kabat等，《免疫学感兴趣蛋白质的序列》(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)，第5版，马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院公共健康服务部(Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)(1991)和/或形成高变环(例如，轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的残基26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)的那些残基；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。下面描述本发明的具体CDR。
通过本说明书，当知道可变结构域中的残基时，一般使用Kabat编号系统(大约，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)(例如，Kabat等，同上(1991))。
CDR导致抗体的抗原结合，或者更具体地，表位结合位点的形成。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体与之特异性结合的位点。表位能够由连续的氨基酸来形成或由于蛋白三级折叠而并列的不连续的氨基酸来形成。当接触变性溶剂时，由连续氨基酸形成的表位通常保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在独特空间构象中，表位一般包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。如本文所述，本领域熟知用于确定给定抗体结合哪些表位的技术(例如，表位作图)并且包括，例如，免疫印迹和免疫沉淀试验，其中测试来自LY75的重叠或连续肽与给定抗-LY75抗体的反应性。用于确定表位的空间构象的方法包括本领域和本文所述的那些技术，例如，X-射线晶体法和二维核磁共振(参见，例如，《分子生物学方法中的表位作图方案》(EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology)，第66卷，G.E.Morris编，(1996))。术语“表位作图”是指鉴定决定抗体-抗原识别的分子的过程。
各链的羧基末端部分定义为主要负责效应物功能的恒定区。Kabat等收集了重链和轻链可变区的多个一级序列。基于序列的保守程度，它们将单个一级序列分类为CDR和构架区并且制作其列表(参见《免疫学感兴趣蛋白质的序列》(SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST)，第5版，NIH publication，No.91-3242，E.A.Kabat等)。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在几个免疫球蛋白结构域。本文中“免疫球蛋白(Ig)结构域”表示具有不同的三级结构的免疫球蛋白的区域。本发明感兴趣的是重链结构域，包括，恒定重链(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的内容中，IgG同种型各自具有3个CH区。因此，IgG内容中的“CH”结构域如下：按照kabat的EU索引，“CH1”指代118-220位。按照kabat的EU索引，“CH2”指代237-340位，并且按照kabat的EU索引，“CH3”指代341-447位。
另一种类型的重链Ig结构域是铰链区。本文中的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”表示在抗体的第一和第二恒定结构域之间包含氨基酸的挠性多肽。结构上，IgG CH1结构域在EU位220处结束，并且IgG CH2结构域在残基EU位237处开始。因此对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)位，其中按照Kabat的EU索引进行编号。在一些实施方式中，例如，在Fc区的内容中，包括较低的铰链，“较低的铰链”一般是指226或230位。
本发明特别感兴趣的是Fc区。本文所用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”表示排除第一恒定区免疫球蛋白结构域并且在一些情况中排除部分铰链的包含抗体的恒定区的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的N末端柔性绞链区。对于IgA和IgM而言，Fc可包含J链。对于IgG，Fc区包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)和Cγ2(Cγ2)之间的较低的铰链区。虽然Fc区的边界可变，但人IgG重链Fc区通常被定义为羧基端包括残基C226或P230，其中编号是按照Kabat所述的EU索引进行的。在一些实施方式中，如下文更详细所述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如，以改变对一个或多个FcγR受体或FcRn受体的结合。
在一些实施方式中，该抗体是全长的。本文中的“全长抗体”表示构成抗体的天然生物形式的结构，包括可变区和恒定区，包括本所所列的一种或多种修饰。
或者，抗体可以是多种结构，包括但不限于，抗体片段、单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体偶联物”)、及各自的片段。在“抗体”的定义内包括依赖于使用一组CDR的结构。
在一个实施方式中，该抗体是抗体片段。特异性抗体片段包括但不限于，(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段，(iv)由单一可变区组成的dAb片段(Ward等，1989，Nature341:544-546，通过引用全文纳入本文)；(v)分离的CDR区，(vi)F(ab')2片段，其是包含两个连接的Fab片段的一种二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头相连，从而能连接两个结构域以形成抗原结合位点(Bird等，1988，Science 242:423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883，通过引用全文纳入本文)，(viii)双特异性单链Fv二聚体(WO 03/11161，通过引用全文纳入本文)和(ix)通过基因融合构建的“双抗体”或“三抗体”，多价或多特异性片段(Tomlinson等，2000，MethodsEnzymol.326:461-479；WO94/13804；Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448，通过引用全文纳入本文)。
嵌合和人源化抗体
在一些实施方式中，抗体可以是来自不同物种的混合物，例如，嵌合抗体和/或人源化抗体。即，在本发明中，CDR组可与除了本文序列专门描述的那些以外的构架和恒定区联用。
通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”是指组合超过一个物种的区的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或大鼠，在一些情况中)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”一般是指具有与人抗体中发现的序列交换的可变结构域构架区的非人抗体。一般而言，在人源化抗体中，除了CDR以外，完整抗体由人来源的多核苷酸编码并且除了其CDR以外与该抗体相同。其中一些或全部由非人生物体来源的核酸编码的CDR移植到人抗体可变区的β片层构架中以产生抗体，其特异性由移植的CDR决定。这类抗体的产生描述于，例如WO92/11018,Jones,1986,Nature 321:522-525,Verhoeyen等，1988,Science 239:1534-1536，其全部通过引用纳入本文。通常需要所选受体构架残基对于相应供体残基的“回复突变”以获得在初始移植的构建体中丧失的亲合力(US 5530101、US 5585089、US 5693761、US5693762、US 6180370、US 5859205、US 5821337、US 6054297、US 6407213，全部通过引用全文纳入本文)。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，一般是人免疫球蛋白的Fc，并且因此通常包含人Fc区。也可使用带有经遗传工程改造的免疫系统的小鼠生成人源化抗体。Roque等，2004,Biotechnol.Prog.20:639-654，其全文通过引用纳入本文。本领域熟知多种用于人源化和再成形非人抗体的技术和方法(参见，Tsurushita和Vasquez，2004，抗体的人源化，B细胞分子生物学(Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells)，533-545,Elsevier Science(USA)以及本文所引用的参考文献，其全部通过引用全文纳入本文)。人源化方法包括但不限于Jones等，1986,Nature321:522-525；Riechmann等，1988；Nature 332:323-329；Verhoeyen等，1988,Science,239:1534-1536；Queen等，1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等，1998,J.Immunol.160:1029-1035；Carter等，1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9,Presta等，1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O’Connor等，1998,Protein Eng 11:321-8中所述的方法，其全部通过引用全文纳入本文。人源化或减少非人抗体可变区的免疫原性的方法可包括表面重修方法，如Roguska等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973所述，其通过引用全文纳入本文。在一个实施方式中，母体抗体已经是亲合力成熟的，如本领域所知的那样。可采用基于结构的方法来进行人源化和亲合力成熟，例如USSN 11/004,590中所述。可采用基于选择的方法来使抗体可变区人源化和/或亲合力成熟，包括但不限于Wu等，1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等，1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等，1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等，2003,Protein Engineering 16(10):753-759中所述的方法，其全部通过引用全文纳入本文。其他人源化方法可包括仅移植部分CDR，包括但不限于USSN 09/810,510；Tan等，2002,J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等，2002,J.Immunol.169:3076-3084中所述的方法，其全部通过引用全文纳入本文。
在一个实施方式中，本发明的抗体可以是多特异性抗体，并且尤其是双特异性抗体，也有时称为“双抗体”。这些抗体是结合两种(或更多种)不同抗原，或相同抗原上的不同表位的抗体。以本领域已知的多种方式制造双抗体(Holliger和Winter,1993,CurrentOpinion Biotechnol.4:446-449，其通过引用全文纳入本文)，例如，化学制备或从杂合杂交瘤制备。
在一个实施方式中，所述抗体是小抗体。小抗体是最小化的抗体样蛋白质，包含连接至CH3结构域的scFv。Hu等，1996,Cancer Res.56:3055-3061，其全文通过引用纳入本文。在一些情况中，scFv可连接至Fc区，并且可包括一些或完整的铰链区。应注意小抗体包括在“抗体”的定义中，除了其没有完整的CDR组以外。
本发明的抗体一般是分离的或重组的。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”表示已经从其表达的细胞或细胞培养物中鉴定并分离和/或回收的多肽。因此，分离抗体往往是指基本没有具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如，基本没有特异性结合除LY75以外的抗原非人抗体的特异性结合LY75的分离抗体)。因此，“分离的”抗体是以非在自然中正常发现的形式发现(例如，非天然产生)的抗体。在一个实施方式中，本文限定的分离抗体包括至少一个不在“天然”产生的抗体中出现的氨基酸。该氨基酸可通过添加或取代的方式引入。将理解，引入的氨基酸可以是天然产生的或非天然产生的氨基酸。在一些实施方式中，本发明的抗体是重组蛋白质、分离的蛋白质或基本纯的蛋白质。“分离的”蛋白质不伴随至少一些在其天然状态中正常结合的材料，例如，在给定的样品中占总蛋白质的至少约5重量％、或至少约50重量％。根据环境，会理解分离的蛋白质可构成总蛋白质含量的5至99.9重量％。例如，通过使用诱导型启动子或高表达启动子以明显更高的浓度制备蛋白质，使得以增加的浓度水平制备蛋白质。在重组蛋白质的情况中，定义包括在本领域已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体，其中并不天然产生重组蛋白质。通常，将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。“分离抗体”是指基本没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，特异性结合LY75的分离抗体基本没有特异性结合除LY75以外的抗原的抗体。
具有不同特异性的分离的单克隆抗体可在充分限定的组合物中组合。因此，例如，本发明的抗体可任选地并单独地包括或排除在制剂中，如下文进一步所述。
本发明的抗-LY75抗体特异性结合LY75(例如，SEQ ID No:15)。“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异性针对”特定抗原或表位表示结合在测量上与非特异性相互作用不同。例如，可通过确定与对照分子的结合比较的分子的结合来测量特异性结合，对照分子一般是结构上相似但没有结合活性的分子。例如，可通过与靶标相似的对照分子的竞争来确定特异性结合。
针对特定抗原或表位的特异性结合可通过例如抗体展示，该抗体具有对抗原或表位至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、或者至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大的KD，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离率。一般而言，特异性结合抗原的抗体将比相对于该抗原或抗体的对照分子大20、50、100、500、1000、5,000、10000或更多倍的KD。然而，在本发明中，当给予本发明的LY75抗体的ADC时，重要的是该KD足够内化并由此导致细胞死亡，而没有明显的副作用。
同时，针对特定抗原或表位的特异性结合可通过例如抗体展示，该抗体具有相对于对照对表位大至少20、50、100、500、1000、5000、10000或更多倍的针对抗原或表位的KA或Ka，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的解离率。
评价抗体对LY75的结合能力的标准试验可在蛋白质或细胞水平上进行，并且是本领域已知的，包括，例如，ELISA、Western印迹、RIA、试验和流式细胞术分析。在实施例中详细描述了合适的试验。也可通过本领域已知的标准试验，如系统分析来评价抗体的结合动力学(例如，结合亲合力)。为了评价对拉吉或道迪B细胞肿瘤细胞的结合，拉吉(ATCC保藏号CCL-86)或道迪(ATCC保藏号CCL-213)细胞获自公开的来源，如美国典型培养物保藏中心，并且用于标准试验，如流式细胞术分析。
LY75抗体
本发明提供了结合至LY75(SEQ ID No:15)的LY75抗体，并且当与在细胞表面上表达LY75的细胞接触时可内化或在效应细胞存在时可引发ADCC响应，或者在效应细胞存在时可引发细胞毒性T-细胞响应。这些抗体在本文中称作“抗-LY75”抗体，或，为了便于描述，“LY75抗体”。
LY75抗体在与表面上表达LY75的细胞，尤其是肿瘤细胞接触后内化。即，本文限定也包含药物偶联物的LY75抗体被肿瘤细胞内化，导致释放药物和随后细胞死亡，使得能治疗显示LY75表达的癌症。可以多种方式测量本文中的内化。在一个实施方式中，本发明的LY75抗体使用标准试验如MAbZap与细胞接触，如本文所列的细胞系。本领域技术人员将明确MabZap试验代表预期用抗体-药物偶联物(ADC)所能看到的效应。在后者中，ADC将内化，由此将药物摄入细胞。毒性药物将能够杀死细胞，即，杀死靶向的肿瘤细胞。本领域技术人员易于接受的来自MabZap试验的数据代表ADC试验(Kohls,M和Lappi,D.，[2000]Biotechniques，第28卷，第1期，162-165)。
在这些体外试验实施方式中，本发明的LY75抗体与包含毒素的抗-LY75抗体一起加入；例如，LY75抗体可以是鼠或人源化的并且抗-LY75抗体可以是抗-鼠或抗-人源化的，并且含有毒素如皂草毒蛋白。在形成[本发明的LY75抗体]-[抗-LY75抗体-药物偶联物]复合物之后，该复合物内化并且释放药物(例如，皂草毒蛋白)，导致细胞死亡。仅在内化后释放药物，并因此在没有内化的情况下，细胞保持活性。如下文所述，不受任何理论限制，在治疗性应用中，抗-LY75抗体含有毒素，并且在内化后，切割抗体和毒素之间的结合，释放毒素并杀死细胞。
另外，LY75抗体在表面上表达LY75的效应细胞，尤其是肿瘤细胞存在下引发ADCC响应。
在一个实施方式中，抗体包含本文所述的特定抗体(例如，本文中称为“LY75_A1”)的重链和轻链互补决定区(CDR)或可变区(VR)。因此，在一个实施方式中，该抗体包含具有SEQ ID NO:1所示序列的抗体LY75_A1的重链可变(VH)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，和具有SEQ ID NO:2所示序列的抗体LY75_A1的轻链可变(VL)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在另一个实施方式中，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含包含SEQ ID NO:5的第一vhCDR、包含SEQ ID NO:6的第二vhCDR、包含SEQID NO:7的第三vhCDR，该轻链可变区包含包含SEQ ID NO:8的第一vlCDR、包含SEQ ID NO:9的第二vlCDR、包含SEQ ID NO:10的第三vlCDR。
在另一个实施方式中，本发明的抗体结合人LY75并且包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区，和其保守性序列修饰。该抗体还可包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区，和其保守性序列修饰。
在其他实施方式中，本发明的抗体结合至人LY75并且包括重链可变区和轻链可变气，其分别包括SEQ ID NO:1和/或2所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰。本文所用的术语保守性序列修饰是指，例如，用具有相似形式的氨基酸取代氨基酸。本领域普通技术人员熟知那些取代可被认为是保守性的。可被认为是保守性序列修饰的修饰包括，例如，糖基化。
本发明中也包括分离抗体，其包含与任意上述序列有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或更高序列相同性的重链和轻链可变区。本发明也包括上述值的范围中间值，例如，与任意上述序列有至少80-85％、85-90％、90-95％或95-100％序列相同性的重链和轻链可变区。在一个实施方式中，该抗体包括包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的序列的重链可变区。在另一个实施方式中，该抗体包括包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的序列的轻链可变区。在另一个实施方式中，该抗体包含重链构架区，其包含与如SEQ ID NO:16、17和18所示的SEQID NO:1的重链可变区的构架至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，该抗体包含轻链构架区，其包含与如SEQ ID NO:19、20和21所示的SEQ ID NO:2的轻链可变区的构架至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明的抗体是包含以下CDR的抗-LY75抗体(本文中称为“LY75_A1抗体”)和含有有限数量的氨基酸变化的变体：
本文还公开了包含本发明的CDR组的可变重链和轻链，以及全长重链和轻链(例如，也包含恒定区)。如本领域技术人员所理解，本发明的CDR组可引入鼠、人源化或人恒定区(包括构架区)。因此，本发明提供了与本文所述的SEQ ID至少约90％-99％相同的可变重链和轻链，其中90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％全部发现用于本发明。
结合与本发明的LY75抗体相同的表位的抗体
在另一个实施方式中，本发明提供结合与任意本发明的LY75单克隆抗体相同的人LY75上的表位的抗体。参考2种或更多种抗体的术语“结合至相同表位”表示这些抗体竞争结合抗原并结合同一抗原，重叠或包括氨基酸的连续或不连续区段。本领域技术人员理解术语“结合至相同表位”并不必然表示抗体精确地结合至相同氨基酸，虽然在一个实施方式中，其可如此定义。在另一个实施方式中，抗体结合的精确氨基酸可能变化。例如，第一抗体可结合至氨基酸的区段，该区段完全包含在由第二抗体结合的氨基酸区段中。在另一个示例中，第一抗体结合氨基酸的一个或多个区段，这些区段与第二抗体结合的一个或多个区段明显重叠。出于本发明的目的，这类抗体被认为“结合至相同表位”。
因此，同时，本发明在一个实施方式中包括结合LY75上的表位的抗体，该抗体包含由本文所述的特定抗体识别的表位的全部或一部分(例如，相同或重叠区或之间的区或跨越的区)。本发明还包括特异性结合选自SEQ ID NO:24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37的至少异种，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种肽或其片段的抗体，其中所述片段包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续氨基酸。在其他实施方式中，由本发明的抗体识别的表位包含选自SEQ ID NO:27、29、30、34、35、36或37的至少一种、至少两种或至少三种肽或其片段，其中所述片段包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续氨基酸。在另一个实施方式中，由本发明的抗体识别的表位包含选自SEQ ID NO:30、36和37的至少一种肽，例如，1种、2种或3种肽或其片段，其中所述片段包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续氨基酸。
本发明还包括结合相同表位的抗体和/或与本文所述的抗体竞争结合人LY75的抗体。可使用常规技术鉴定识别相同表位或竞争结合的抗体。这类技术包括，例如，免疫试验，其显示一种抗体阻断另一种抗体结合靶标抗原的能力，即，竞争性结合试验。在试验中确定竞争性结合，其中测试下的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原如LY75的特异性结合。已知多种类型的竞争性结合试验，例如：固相直接或间接放射性免疫试验(RIA)、固相直接或间接酶免疫试验(EIA)、夹心竞争试验(参见Stahli等，Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记的试验，固相直接标记的夹心试验(参见Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等，Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等，Virology 176:546(1990))；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32:77(1990))。一般而言，这种试验包括使用与固体表面结合的纯化的抗原或含有任意这些的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过确定测试免疫球存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。测试免疫球蛋白通常过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，其会抑制参考抗体与共同抗原至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-99％或更多的特异性结合。
其他技术包括，例如，表位作图法，如对抗原:抗体复合物的晶体的X-射线分析，其提供了表位的原子解析。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变体的结合，抗原序列内由于氨基酸修饰而丧失结合的位置通常被认为指示表位组分。另外，也可使用用于表位作图的计算机组合方法。这些方法依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异性短肽的能力。这些肽然后被认为是定义对应于所用抗体的表位的引导以少选肽文库。对于表位作图，还已经开发了计算机算法，其已经显示对组合不连续表位作图。
在具体实施方式中，该抗体与包含分别包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列或与其至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体竞争结合LY75。在另一个实施方式中，抗体与包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体(LY75_A1)竞争结合LY75。
本发明的其他抗体结合本文所述抗体识别的LY75上的表位。在另一个具体实施方式中，该抗体结合至包含分别包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列或与其至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体识别的LY75上的表位。在另一个实施方式中，抗体结合至包含SEQ ID NO:1和2所示的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区的抗体(LY75)所识别的LY75上的表位。
针对LY75的单克隆抗体的表征
可使用多种已知技术来表征本发明的抗体结合LY75。一般而言，最初通过ELISA来表征抗体。简言之，可用PBS中纯化的LY75来包被微量滴定板，并且然后用在PBS中稀释的不相关的蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)来封闭。在每孔中加入来自LY75-免疫小鼠的血浆的稀释物并在37℃下孵育1-2小时。用PBS/吐温20洗板，然后在37℃下与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂孵育1小时。洗涤后，板用ABTS底物发色，并在OD405处进行分析。优选地，用得到最高效价的小鼠进行融合。
可使用本文所述的ELISA试验来筛选抗体，并且由此，产生显示与LY75免疫原有阳性反应性的抗体的杂交瘤。优选以高亲合力结合至LY75的杂交瘤可然后亚克隆并进一步表征。然后选择来自保留母体细胞反应性的各杂交瘤的一个克隆(通过ELISA)用于制备细胞库，并用于抗体纯化。
为了纯化抗-LY75抗体，选择的杂交瘤可在旋转瓶、2升烧瓶或其他培养系统中生长。上清可经过滤和浓缩，然后用蛋白A-琼脂糖(新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚公司(Pharmacia,Piscataway,NJ))的亲和色谱来纯化蛋白质。在缓冲液交换成PBS之后，可通过使用1.43的消光系数的OD280或优选通过比浊分析来确定浓度。可通过凝胶电泳和通过抗原特异性方法来检验IgG。
为了确定所选抗-LY75单克隆抗体是否与独特表位结合，可用市售试剂(皮尔斯公司，伊利诺伊州罗克福德(Pierce,Rockford,IL))对每一抗体进行生物素化。可使用链霉亲和素标记的探针来检测生物素化的MAb结合。为了确定纯化的抗体的同种型，可使用本领域认可的技术来进行同种型ELISA。例如，可用10μg/ml的抗-Ig在4℃下过夜包被微孔板的孔。在用5％BSA封闭后，在环境温度下用10μg/ml的单克隆抗体或纯化同种型对照与板反应2小时。孔然后可与IgG1或其他同种型特异性偶联的探针反应。如上所述对板进行发色和分析。
为了测试单克隆抗体与表达LY75的活细胞的结合，可使用流式细胞术。简言之，表达膜结合的LY75的细胞系和/或人PBMC(在标准生长条件下生长)在4℃下与含0.1％BSA的PBS中各种浓度的单克隆抗体混合1小时。洗涤后，细胞在与一抗染色相同的条件下与荧光素标记的抗-IgG抗体反应。可通过使用光和侧向散射的FACScan设备来分析样品以门选单个细胞并且确定标记的抗体的结合。可使用采用荧光显微术的替代性试验(附加或代替)流式细胞术试验。可如上所述对细胞精确染色并通过荧光显微术检验。该方法允许单个细胞的可视化，但是可能根据抗原的密度而降低灵敏度。
可用Western印迹对抗-LY75IgG与LY75抗原的反应性进行进一步测试。简言之，制备LY75表达细胞的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝基纤维素膜，用20％小鼠血清进行封闭，并用受试单克隆抗体进行探测。用抗-IgG碱性磷酸酶检测IgG结合并用BCIP/NBT底物片(美国密苏里州圣路易斯市的西格玛化学公司(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.))显色。
用于分析各种抗-LY75抗体的结合亲合力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准试验，例如，使用BiacoreTM 2000SPR设备(瑞典乌普萨拉的比亚科国际公司(Biacore AB,Uppsala,Sweden))的BiacoreTM表面等离振子共振(SPR)分析。
在一个实施方式中，抗体特异性结合包含SEQ ID NO:15的人LY75。优选地，本发明的抗体以高亲合力结合人LY75。
优选地，本发明的抗体以5x10-8M或更低的KD结合至LY75蛋白质、以2x10-8M或更低的KD结合至LY75蛋白质、以5x10-9M或更低的KD结合至LY75蛋白质、以4x10-9M或更低的KD结合至LY75蛋白质、以3x10-9M或更低的KD结合至LY75蛋白质、以2x10-9M或更低的KD结合至LY75蛋白质、以1x10-9M或更低的KD结合至LY75蛋白质、以5x10-10M或更低的KD结合至LY75蛋白质、或以1x10-10M或更低的KD结合至LY75蛋白质。
在一个实施方式中，本发明的抗体与本文所述的特定抗-LY75抗体(例如，LY75_A1)竞争(例如，交叉竞争)结合LY75。这类竞争抗体可基于它们在标准LY75结合试验中竞争性抑制一种或多种mAb与LY75的结合的能力来鉴定。例如，可使用标准ELISA试验，其中重组人LY75蛋白质固定在平板上，抗体之一是荧光标记的并且评价无标记的抗体竞争掉标记的抗体的结合的能力。或者或另外，可使用BIAcore分析来评价抗体交叉竞争的能力。测试抗体抑制本发明的抗-LY75抗体与人LY75的结合的能力证明测试抗体可与该抗体竞争结合人LY75。
在一个实施方式中，竞争抗体是结合与本文所述的抗-LY75单克隆抗体(例如，LY75_A1)相同的人LY75上的表位的抗体。可使用标准表位作图技术，如X-射线晶体法和二维核磁共振来确定抗体是否结合至与参考抗体相同的表位(参见，例如，分子生物学方法中的表位作图方案(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology)，第66卷，G.E.Morris编，(1996))。
在一个实施方式中，竞争结合LY75和/或结合人LY75上的相同表位的抗体是人抗体。
一旦已经分离了具有本文所需性质的单一、原型抗-LY75mAb，可生成具有相同性质，例如具有相同的表位的其他mAb。例如，如本文所述，小鼠可用LY75免疫、产生杂交瘤，并且筛选所得的mAb与原型mAb竞争结合LY75的能力。也可用含有原型mAb结合的表位的LY75的较小片段来免疫小鼠。可通过，例如，筛选结合跨LY75的一系列重叠肽来定位表位。或者，可使用Jespers等，Biotechnology 12:899，1994的方法来指导选择具有相同表位并因此具有与原型mAb相似性质的mAb。使用噬菌体展示，首先原型抗体的重链与轻链(优选人)的库配对以选择LY75-结合mAb，然后新轻链与重链(优选人)的库配对以选择具有与原型mAb相同表位的(优选人)LY75-结合mAb。或者，可通过编码抗体的重链和轻链的cDNA的突变来获得原型mAb的变体。
可进行表位作图，例如，Champe等，(1995)J.Biol.Chem.270:1388-1394等所述来确定抗体是否与感兴趣的表位结合。也可使用Cunningham和Wells(1989)Science 244:1081-1085所述的“丙氨酸筛选诱变”或一些其他形式的人LY75中氨基酸残基的点诱变来确定本发明的抗-LY75抗体的功能性表位。然而，诱变研究也揭示了对LY75的总三维结构关键但并不直接参与抗体-抗原接触的氨基酸残基，并且因此可能需要其他方法来确认使用该方法确定的功能性表位。
也可通过评价抗体与包含人LY75的片段的肽的结合来确定由特异性抗体结合的表位。一系列包含LY75序列的重叠肽可合成并例如在直接ELISA、竞争性ELISA中、或芯片上筛选结合(其中评价肽防止抗体与结合微孔板壁的抗体结合的能力)。这种肽筛选方法可能不能检测一些不连续功能表位，即包括沿着LY75多肽链的主序列不连续的氨基酸残基的功能表位。
也可通过结构方法，如X-射线晶体结构确定(例如，WO2005/044853)、分子建模、和核磁共振(NMR)图谱，包括NMR确定当游离和与感兴趣抗体的复合物中结合时不稳定酰胺氢的H-D交换率来确定本发明的抗体所结合的表位(Zinn-Justin等，(1992)Biochemistry31,11335-11347；Zinn-Justin等，(1993)Biochemistry 32,6884-6891)。
关于X-射线晶体法，结晶可伴随使用本领域任意已知方法(例如，Giege等，(1994)Acta Crystallogr.D50:339-350；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189:1-23)，包括微批量(例如，Chayen(1997)Structure 5:1269-1274)、悬滴蒸汽扩散(例如，McPherson(1976)J.Biol.Chem.251:6300-6303)、接种和透析。希望使用具有至少约1mg/mL并且优选约10mg/mL至约20mg/mL的浓度的蛋白质制备物。可在含有聚乙二醇1000-20000(PEG；平均分子量的范围是约1000至约20000Da)，优选约5000至约7000Da，更优选约6000Da，浓度范围是约10％至约30％(w/v)的沉淀溶液来最佳地实现结晶。也可能需要包含蛋白质稳定化试剂，例如，浓度范围是约0.5％至约20％的甘油。在沉淀溶液中也可需要合适的盐，如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠，优选浓度范围为约1mM至约1000mM。优选将沉淀缓冲至约3.0至约5.0，优选约4.0的pH。可用于沉淀溶液的具体缓冲液可变化并且是本领域所熟知的(Scopes，《蛋白质纯化：原理和实践》(Protein Purification:Principles and Practice)，第三版，(1994)Springer-Verlag，纽约)。可用的缓冲液的示例包括，但不限于，HEPES、Tris、MES和乙酸盐。晶体可在宽的温度范围内生长，包括2℃、4℃、8℃和26℃。
抗体:抗原晶体可使用熟知的X-射线衍射技术来研究并且可使用计算机软件如X-PLOR(耶鲁大学，1992，分子模拟公司(Molecular Simulations,Inc.)发行；参见例如，Blundell和Johnson(1985)Meth.Enzymol.114&115,H.W.Wyckoff等编，学术出版社(Academic Press)；美国专利申请公开号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne(1993)ActaCryst.D49:37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A:361-423,Carter和Sweet编；Roversi等，(2000)Acta Cryst.D56:1313-1323)来精细化，其内容通过引用全文纳入本文。
本文所述的抗体竞争试验可用于确定抗体是否与另一种抗体“结合至相同表位”。一般而言，在第二抗体过量并且首先饱和所有位点的条件下，第二抗体竞争已知与表位相互作用的抗体的50％或更多、60％或更多、70％或更多，如70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多被视为该抗体“结合相同表位”。为了评价2种抗体之间竞争的说明，例如，可使用放射性免疫试验或使用针对抗体的其他标记的试验。例如，可用饱和量的偶联标记的化合物(例如，3H、125I、生物素或铷)的第一抗-LY75抗体或其抗原结合片段在相同量的第二未标记的抗-LY75抗体存在下孵育LY75抗原。然后评价在未标记的封闭抗体存在下与抗原结合的标记的抗体的量并与没有未标记的封闭抗体的情况中的结合比较。由与没有封闭抗体的情况中相比，未标记的封闭抗体存在下结合信号的百分比变化来确定竞争。因此，如果与没有封闭抗体的情况下的竞争相比，抑制50％的封闭抗体存在下的标记的抗体的结合，则2种抗体之间存在50％的竞争。因此，第一和第二抗体之间50％或更多、60％或更多、70％或更多，如70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的竞争表示第一抗体抑制第二抗体与抗原的结合(反之亦然)的50％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(与第一抗体存在下第二抗体与抗原的结合比较)。因此，第二抗体抑制第一抗体与抗原的结合的50％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多表示这2种抗体结合相同表位。
抗体修饰
本发明还提供变体抗体，有时也称为“抗体衍生物”或“抗体类似物”。即，存在多种针对本发明的抗体的修饰，包括但不限于，CDR中的氨基酸修饰(亲合力成熟)、构架区中的氨基酸修饰、Fc区中的氨基酸修饰、糖基化变体、其他类型的共价修饰(例如，用于药物偶联物的附连等)。
本文的“变体”表示通过至少一个氨基酸的修饰与母体多肽的序列不同的多肽序列。在这种情况下，母体多肽是分别列于SEQ ID No:1或2的全长可变重链或轻链，或者列于SEQ ID NO:5-10和16-21的重链和轻链的CDR区或构架区。氨基酸修饰可包括取代、插入和删除，在许多情况中优选前者。将理解氨基酸取代可以是保守性或非保守性取代，优选保守性取代。其他所述的取代可以是用天然或非天然产生的氨基酸取代。
通常，变体可包括任何数量的修饰，至少抗体的功能仍然存在，如本文所述。即，LY75_A1，例如，该抗体应仍然特异性结合人LY75。类似地，如果由Fc区生成氨基酸变体，例如，变体抗体应该保持抗体的特定应用或指示所需的受体结合功能。
这种情况中的“变体”可发生在所列的抗体CDR序列、构架区或Fc区中。
然而，通常，采用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，因为通常靶标是以最少数量的修饰改变功能。在一些情况中，存在1-5种修饰(例如，个体氨基酸取代、插入或删除)，许多实施方式中也发现使用1-2、1-3和1-4种修饰。修饰的数量可取决于修饰的区域的大小；例如，通常，在CDR区中需要较少的修饰。本领域技术人员会理解，即使在CDR区内，修饰的位置也可显著改变效果。在一个实施方式中，可在重链和/或轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的任一个中进行修饰。在另一个实施方式中，在重链和/或轻链的CDR1或CDR2中的任一个中进行修饰。在另一个实施方式中，修饰位于重链和/或轻链的CDR1。
应注意到，核酸修饰的数量可能在功能结构域内：例如，在野生型或功能改造的蛋白质中可能需要有1-5个修饰，并且在Fc区中需要1-5个修饰。变体多肽序列将优选具有与母体序列(例如，LY75_A1的可变区、恒定区、和/或重链和轻链序列和/或CDR)至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。应注意到，根据序列的大小，相同性百分比将取决于氨基酸的数量。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”表示氨基酸在母体多肽序列中的特定位置上用可能是天然或非天然产生的氨基酸的另一个氨基酸取代。例如取代S100A是指一种变体多肽，其中100位处的丝氨酸被丙氨酸替换。本文所用的“氨基酸插入”或“插入”表示在母体多肽序列中的特定位置处加入氨基酸。本文所用的“氨基酸删除”或“删除”表示在母体多肽序列中的特定位置处去除氨基酸。
本文所用的“母体多肽”、“母体蛋白质”、“前体多肽”或“前体蛋白质”表示未修饰的多肽，其随后经修饰生成变体。通常，本文的母体多肽是LY75_A1。因此，本文所用的“母体抗体”表示经修饰生成变体抗体的抗体。
本文的“野生型”或“WT”或“天然”表示在自然中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变体。WT蛋白质、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有还未经故意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本文的“变体Fc区”表示通过至少一个氨基酸的修饰与野生型Fc序列不同的Fc序列。Fc变体可以是Fc多肽本身，包含Fc变体多肽的组合物，或氨基酸序列。
在一些实施方式中，在LY75_A1的一个或多个CDR中进行一个或多个氨基酸修饰。通常，在任意单个CDR中仅取代1或2或3个氨基酸，并且一般在一组6个CDR中有不超过4、5、6、7、8、9或10个变化。然而，应理解任意CDR中的无取代、1个取代、2个取代或3个取代的任意组合可以是独立的并且任选地与任何其他取代组合。很明显，取代可以在6个CDR中的任一个中进行。在一个实施方式中，取代在重链和/或轻链的CDR1中进行。
在一些情况中，CDR中的氨基酸取代被称为“亲合力成熟”。“亲合力成熟”抗体是在一个或多个CDR中有一个或多个变化的抗体，其导致与不具有这些变化的母体抗体相比，抗体对抗原的亲合力改善。在一些情况中，虽然很少，可能需要降低抗体对其抗原的亲合力，但是这通常不是优选的。
可进行亲合力成熟使抗体对抗原的结合亲合力与“母体”抗体相比增加至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％或更多，或1、2、3、4至5倍。优选的亲合力成熟的抗体将对于靶标抗原具有纳摩尔甚至皮摩尔的亲合力。通过已知过程产生亲合力成熟的抗体。参见例如，Marks等，1992，Biotechnology 10:779-783，其描述了通过可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域该组的亲合力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变描述于：例如，Barbas等，1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Shier等，1995,Gene 169:147-155；Yelton等，1995,J.Immunol.155:1994-2004；Jackson等，1995,J.Immunol.154(7):3310-9；和Hawkins等，1992,J.Mol.Biol.226:889-896。
或者，可对本发明抗体的CDR中的一个或多个进行“沉默”的氨基酸修饰，例如，其没有明显改变抗体对抗原的亲合力。可基于多种理由进行这些，包括优化表达(如可对编码本发明抗体的核酸进行)。
因此，本发明的抗体和CDR的定义内包括变体CDR和抗体；即，本发明的抗体可在LY75_A1的一个或多个CDR中包括氨基酸修饰。另外，如下文所述，也可在CDR以外的任何区域，包括本文所述的构架区和恒定区中独立地和任选地进行氨基酸修饰。
在一些实施方式中，本发明的抗-LY75抗体由变体Fc结构域组成。如本领域所知，抗体的Fc区与多种Fc受体和配体相互作用，产生一系列称为效应功能的重要的功能活性。这些Fc受体包括但不限于，(在人中)FcγRI(CD64)包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158，与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)有关)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)、FcRn(新生受体)、C1q(参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的补体蛋白质)和FcRn(参与血清半衰期的新生受体)。合适的修饰可在一个或多个一般列出的位置上进行，例如，在美国专利申请11/841,654和本文所列的参考文献中，US 2004/013210、US 2005/0054832、US 2006/0024298、US 2006/0121032、US 2006/0235208、US2007/0148170、USSN 12/341,769、美国专利号6,737,056、美国专利号7,670,600、美国专利号6,086,875，其全部通过引用全文纳入本文，并且具体用于增加与Fc受体的结合的特定氨基酸取代。
除了上述所列的修饰以外，可进行其他修饰。例如，可通过在VH和VL结构域之间加入二硫桥来使分子稳定化(Reiter等，1996,Nature Biotech.14:1239-1245，通过引用全文纳入本文)。
另外，半胱氨酸处的修饰可特别用于抗体-药物偶联物(ADC)应用，其在下文中进一步描述。在一些实施方式中，抗体的恒定区可经工程改造以含有一个或多个特别有“巯基活性”的半胱氨酸，以允许药物部分的更特异性和控制地放置。参见例如，美国专利号7,521,541，其通过引用全文纳入本文。
另外，存在多种抗体的共价修饰，其可如下文所述进行。
本发明的范围中包括抗体的共价修饰，并且一般但并不总是在翻译后进行。例如，抗体的几种类型的共价修饰可通过使抗体的特定氨基酸残基与有机衍生剂反应而引入分子内，所述有机衍生剂能够与所选侧链或者N-或C-末端残基反应。
最常见的是，半胱氨酸残基与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)，如氯代乙酸或氯代乙酰胺反应，得到羧甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。也可通过与以下物质的反应使半胱氨酸残基衍生化：溴代三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑。
在pH 5.5-7.0下与二乙基焦碳酸酯反应以便使组氨酰残基衍生化，因为这种物质对组氨酰侧链的特异性相对较高。也可使用对-溴苯甲酰甲基溴；优选在0.1M甲胂酸钠中，pH 6.0条件下进行该反应。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有逆转赖氨酸残基电荷的作用。适用于衍生化含α-氨基的残基的其它试剂包括亚氨酸酯，如甲基吡啶亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯代氢化硼(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2,4-戊二酮和转氨酶-催化的与乙醛酸的反应。
通过与一种或多种常规试剂反应来修饰精氨酰残基，这些试剂是苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的pKa高。而且，这些试剂可能与赖氨酸基团以及精氨酸的ε-氨基发生反应。
可以对酪氨酰残基进行特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷的反应将光谱标记引入酪氨酰残基。最常见的是，利用N-乙酰基咪唑(N-acetylimidizole)和四硝基甲烷分别形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。酪氨酰残基用125I或131I碘化以制备用于放射性免疫试验的标记的蛋白质，上述氯胺T方法是合适的。
通过与碳二亚胺(R--N＝C＝N--R’)反应选择性修饰羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)，碳二亚胺中的R和R’任选地是不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，通过与铵离子反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
用双功能试剂衍生化可用于将抗体交联至水不溶性支持基质或表面以用于除了本文所述的方法以外的多种方法。常用的交联剂包括，例如，1,1-二(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸的酯、同源双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3,3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、和双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷。衍生化剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫]丙亚酰胺产生能够在光存在下形成交联的光致活化的中间体。或者，反应活性水不溶性基质如cynomolgusogen溴化物激活的糖和美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中描述的反应活性底物用于蛋白质固定，其全部通过应用全文纳入本文。
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基常常脱酰胺，分别形成谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，这些残基在弱酸性的条件下脱酰胺。这些残基的任意形式落入本发明的范围。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins:Structure and Molecular Properties)，圣弗朗西斯科的WHF公司(W.H.Freeman and Co.，San Francisco)，第79-86页(1983)，通过引用全文纳入本文)，N末端胺的乙酰化和C-末端羧基的酰胺化。
另外，如本领域技术人员所理解，标记(包括荧光、酶、磁性、放射性等，都可以加到抗体中(以及本发明的其他组合物))。
双特异性分子
在另一个方面中，本发明的特征在于包含本发明的抗-LY75抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可衍生化或连接至另一个功能性分子，例如，另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)以生成结合至少2种不同结合位点或靶标分子的双特异性分子。本发明的抗体事实上可衍生化或连接至超过一种其他功能性分子以生成结合超过2种不同结合位点和/或靶标分子的多特异性分子；这类多特异性分子也往往被本文所用的术语“双特异性分子”包括。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合等)至一种或多种其他结合分子，如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，产生双特异性分子。
因此，本发明包括包含至少一种对第一靶标表位(即LY75)的第一结合特异性和对第二靶标表位的第二结合特异性的双特异性分子。第二靶标表位可能存在于与第一结合特异性所结合的靶标蛋白质相同的靶标蛋白质上；或者第二靶标表位可能存在于第一结合特异性所结合的第一蛋白质不同的靶标蛋白质上。第二靶标表位可能存在于与第一靶标表位(即，LY75)相同的细胞上；或者第二靶标表位可能存在于呈现第一靶标表位的细胞所没有呈现的靶标上。本文所用的术语“结合特异性”是指包含至少一种抗体可变结构域的部分。
在本发明的一个实施方式中，第二靶标表位是Fc受体，例如，人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能够同时结合表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达LY75的靶标细胞的双特异性分子。这些双特异性分子使表达LY75的细胞靶向效应细胞并且引发Fc受体-介导的效应细胞活性，如表达LY75细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子生成。
在本发明的另一个实施方式中，第二靶标表位是CD3或CD5。因此，本发明包括能够同时结合表达CD3或CD5效应细胞(例如，表达CD3或CD5的细胞毒性T细胞)和表达LY75的靶标细胞的双特异性分子。这些双特异性分子使表达LY75的细胞靶向效应细胞并且引发CD3或CD5-介导的效应细胞活性，如T细胞克隆扩张和T细胞细胞毒性。在该实施方式中，本发明的双特异性抗体可具有总共2或3个抗体可变结构域，其中双特异性抗体的第一部分能够通过特异性结合至位于人免疫效应细胞上的效应抗原来招募人免疫效应细胞的活性，其中效应抗原是人CD3抗原或人CD5抗原，所述第一部分由一个抗体可变结构域组成，并且双特异性抗体的第二部分能够特异性结合至除了效应抗原例如LY75以外的靶标抗原，所述靶标抗原位于除了所述人免疫效应细胞的靶标细胞上，并且所述第二部分包含1个或2个抗体可变结构域。
在本发明的一个实施方式中，双特异性分子是多特异性的，除了抗-Fc结合特异性或抗-CD3或抗-CD5结合特异性以及抗-LY75结合特异性以外，该分子还可包括第三结合特异性。在一个实施方式中，第三结合特异性是抗-增强因子(EF)部分，例如，结合参与细胞毒性活性的表面蛋白并从而增加针对靶标细胞的免疫应答。“抗-增强因子部分”可以是抗体、功能性抗体片段或结合至给定分子，例如抗原或受体的配体，并且因此能够导致Fc受体或靶标细胞抗原的结合决定簇的效果增强。“抗-增强因子部分”可结合Fc受体或靶标细胞抗原。或者，抗-增强因子部分可结合至与第一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体。例如，抗-增强因子部分可结合至细胞毒性T-细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞，其导致针对靶标细胞的免疫响应增加)。
在一个实施方式中，本发明的双特异性分子包含在至少一种抗体、或其抗体片段，包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb或单链Fv处的结合特异性。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何小片段，如美国专利号4,946,778中所述的Fv或单链构建体，其内容通过引用纳入本文。
在一个实施方式中，通过单克隆抗体提供针对Fcγ受体的结合亲和性，其结合并不被人免疫球蛋白G(IgG)封闭。本文所用术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ-链基因中的任一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，其分为3个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方式中，Fcγ受体是人高亲合力FcγRI。人FcγRI是72kDa分子，其显示对单体IgG的高亲合力(108-109M-1)。
PCT公开号WO 88/00052和美国专利号4,954,617中描述了某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的产生和表征，其技术启示通过引用全文纳入本文。这些抗体在与受体的Fcγ结合位点不同的位点处结合FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位，并且因此，它们的结合基本不被生理水平的IgG所封闭。可用于本发明的特异性抗-FcγRI抗体是mAb 22、mAb 32、mAb44、mAb 62和mAb 197。可从美国典型培养物保藏中心中得到产生mAb32的杂交瘤，ATCC保藏号HB9469。在其他实施方式中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的产生和表征描述于Graziano,R.F等，(1995)J.Immunol 155(10):4996-5002和PCT公开号WO 94/10332。产生H22抗体的细胞系以HA022CL1的名称保藏于美国典型培养物保藏中心并且具有保藏号CRL 11177。
在其他实施方式中，通过结合至人IgA受体，例如Fc-α受体[FcαRI(CD89)]的抗体提供对Fc受体的结合特异性，其结合优选没有被人免疫球蛋白A(IgA)封闭。术语“IgA受体”旨在包括位于染色体19上的一个α-基因(FcαRI)的基因产物。该基因已知编码55至110kDa的几个替代性剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上，但不在非效应细胞群上组成型表达。FcαRI具有对IgA1和IgA2的中等亲合力(≈5×107M-1)，其在接触细胞因子如G-CSF或GM-CSF之后增加[Morton,H.C.等，(1996)CriticalReviews in Immunology 16:423-440]。已经描述了称为A3、A59、A62和A77的4种FcαRI-特异性单克隆抗体，其结合IgA配体结合结构域以外的FcαRI[Monteiro,R.C.等，(1992)J.Immunol.148:1764]。
FcαRI和FcγRI是优选的用于本发明的双特异性分子的引发受体，因为它们是(1)主要在免疫效应细胞，例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞上表达；(2)以高水平表达(例如，每个细胞5,000-100,000)；(3)细胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介导物；和(4)介导靶向它们的抗原(包括自抗原)的增强的抗原呈递。
可用于本发明的双特异性分子的抗体是鼠、人、嵌合和人源化单克隆抗体。
可通过使用本领域已知的方法偶联组成型结合特异性，例如，抗-FcR、抗-CD3、抗-CD5和抗-LY75结合特异性来制备本发明的双特异性分子。例如，可单独生成各双特异性分子的结合特异性，然后互相偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价偶联。交联剂的示例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)、和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)[参见例如，Karpovsky等，(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648]。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78,118-132；Brennan等，(1985)Science 229:81-83，和Glennie等，(1987)J.Immunol.139:2367-2375中所述的那些方法。优选的偶联剂是SATA和sulfo-SMCC，两者都可购自伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Co.(Rockford,IL))。
当结合特异性是抗体时，它们可通过2条重链的C-末端铰链区的巯基结合偶联。在特别优选的实施方式中，铰链区经修饰以在偶联之前含有奇数，优选1个巯基残基。
或者，2个结合特异性可在相同载体中编码并表达并组装到宿主细胞中。该方法是特别有用的，其中双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白。本发明的双特异性分子可以是包含单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含2个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少2个单链分子。制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203、5,455,030、4,881,175、5,132,405、5,091,513、5,476,786、5,013,653、5,258,498和5,482,858，其全部通过引用纳入本文。
本发明的抗体可以是双特异性T-细胞接合物(BiTE)。BiTE是一类人工双特异性单克隆抗体。它们导向针对癌细胞的宿主免疫系统，更具体是T细胞的细胞毒性活性。在单肽链上，BiTE一般是由不同抗体的2条单链可变片段(scFv)，或来自4种不同基因的氨基酸序列组成的融合蛋白，优选约55千道尔顿。优选地，scFv之一通过CD3受体结合至T细胞，并且其他通过肿瘤特异性分子结合至肿瘤细胞。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫试验(RIA)、FACS分析、生物测试(例如，生长抑制)、或Western印迹试验来确认。这些试验一般各自通过采用对感兴趣的复合物有特异性的标记的试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可使用例如识别并特异性结合至抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，可使用多种其他免疫试验中的任一种来检测复合物。例如，抗体可经放射性标记并且用于放射性免疫试验(RIA)中(参见，例如，Weintraub,B.，放射性免疫试验原理，放射性配体试验技术的第七训练课程(Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques)，The Endocrine Society，1986年3月，其通过引用纳入本文)。可通过一些方式检测放射性同位素，例如使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影。
糖基化
另一种类型的共价修饰是改变糖基化。在一些实施方式中，本发明公开的抗体可经修饰以包括一种或多种工程改造的糖形。本文所用的“工程改造的糖形”表示共价附连至抗体的糖组合物，其中该糖组合物在化学上与母体抗体的糖组合物不同。工程改造的糖形可用于各种目的，包括但不限于提高或降低效应功能。例如，可制备无糖基化抗体(即没有糖基化的抗体)。可改变糖基化，以(例如)提高抗体对抗原的亲合力。可通过(例如)改变抗体序列中一个或多个糖基化位点来进行这种糖修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，以消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除该位点上的糖基化。这种无糖基化可提高抗体对抗原的亲合力。这种方法还详细描述于Co等的美国专利号5,714,350和6,350,861，并且可通过在297位去除天冬酰胺来完成。
优选的工程改造的糖形的形式是无岩藻糖基化，其已经显示与ADCC功能的增加相关，大概是通过与FcγRIIIa受体更紧密的结合。在本文中，“无岩藻糖基化”表示大多数的宿主细胞中产生的抗体基本没有岩藻糖，例如90-95-98％的生成的抗体没有明显的岩藻糖作为抗体的糖部分的组分(一般在Fc区中的N297处附连)。功能上定义的无岩藻糖基化的抗体一般显示出对FcγRIIIa受体至少50％或更高的亲合力。
可通过本领域已知的多种方法来生成工程改造的糖形(等，1999,NatBiotechnol 17:176-180；Davies等，2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等，2002,J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa等，2003,J Biol Chem 278:3466-3473；US6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1，全部通过引用纳入本文；(技术[新泽西州普林斯顿的波娃公司(Biowa,Inc.,Princeton,NJ)]；糖基化工程改造技术[瑞士苏黎世的GLYCART生物技术公司(GlycartBiotechnology AG,Zürich,Switzerland)])。这些技术中许多是基于控制附连至Fc区的岩藻糖基化和/或截开型寡糖的水平，例如，通过在各种工程改造的或其他生物体或细胞系(例如，Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达IgG，通过调节参与糖基化通路的酶(例如，FUT8[α1,6-岩藻糖转移酶]和/或β1-4-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶III[GnTIII])，或通过在已经表达IgG之后调节糖。例如，西雅图遗传学公司(Seattle Genetics,Inc)的“糖工程改造的抗体”或“SEA技术”通过加入在生产期间抑制岩藻糖基化的修饰的糖发挥功能；参见例如US2009/0317869，其通过引用全文纳入本文。“工程改造的糖形”一般是指与没有糖基化技术下制备的抗体相比不同的糖或寡糖；因此抗体可包括工程改造的糖形。
或者，工程改造的糖形可指包含不同糖或寡糖的IgG变体。如本领域已知，糖基化模式可取决于蛋白质的序列(例如，特定糖基化氨基酸残基的存在与否，如下所述)，或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下文描述了特定表达系统。
多肽的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指糖部分附连至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸为酶促附连糖部分与天冬酰胺侧链的识别序列，其中X为脯氨酸以外的任意氨基酸。因此，多肽中任意这些三肽序列的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖胺或木糖之一附连到羟基氨基酸，最常见是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
给抗体添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个上述三肽序列(用于N-连接糖基化位点)而实现。也可通过向起始序列添加、取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(用于O-连接的糖基化位点)。简便起见，优选通过DNA水平的变化来改变抗体氨基酸序列，具体通过在预选的碱基处突变编码靶标多肽的DNA来生成将翻译成所需氨基酸的密码子。
另一种增加抗体上糖部分的数量的方式是通过将糖苷化学或酶促偶联至蛋白质。这些方法的优点在于：它们不需要在具有用于N-和O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。根据所用偶联方式，可将糖附连至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的游离羟基，(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或者(f)谷胺酰胺的酰胺基团。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin和Wriston，1981,CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页，两者通过引用全文纳入本文。
可在通过化学或酶促来实现去除起始抗体上存在的糖部分(例如，翻译后)。化学去糖基化需要使蛋白质接触化合物三氟甲磺酸或等价化合物。这种处理导致大多数或所有糖切割，除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)，同时保持多肽完整。化学去糖基化描述于Hakimuddin等，1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52和Edge等，1981,Anal.Biochem.118:131，两者通过引用全文纳入本文。多肽上糖部分的酶促切割可通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等，1987,Meth.Enzymol.138:350所述，其通过引用全文纳入，包括本领域已知的使用岩藻糖苷酶去除岩藻糖残基。可通过使用化合物衣霉素来防止潜在糖基化位点处的糖基化，如Duskin等，1982,J.Biol.Chem.257:3105所述，其通过引用全文纳入本文。衣霉素封闭蛋白质-N-糖苷连接的形成。
另一种类型的抗体共价修饰包括将抗体与多种非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以例如2005-2006来自Nektar治疗公司的PEG目录(PEG Catalog from Nektar Therapeutics(可获自Nektar网站)，美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337所示的方式连接，其全部通过引用纳入本文。另外，如本领域已知，可在抗体内的多个位置进行氨基酸取代以促进聚合物如PEG的加合。参见例如，美国公开号2005/0114037A1，该文献通过引用纳入本文。
在其他实施方式中，例如，在出于诊断或检测目的使用本发明的抗体中，该抗体可包含标记。本文的“标记的”指化合物有附连的至少一种元素、同位素或化学化合物以能够检测该化合物。尽管标记也包含颗粒例如磁性颗粒，通常标记分成三类：a)可以是放射性或重同位素的同位素标记；b)磁性、电、热；和c)有色或发光染料；虽然标记也包括酶和颗粒如磁性颗粒。优选的标记包括但不限于，荧光镧系复合物(包含铕和铽的那些)，和荧光标记，包括但不限于量子点，荧光素，罗丹明，四甲基罗丹明，伊红，赤藓红，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀石绿，芪，萤光黄，级联蓝(Cascade Blue)，德克萨斯红，Alexa染料、Cy染料和其他描述于Richard P.Haugland的第6版《分子探针手册》(Molecular Probes Handbook)的染料，所述手册通过引用明确纳入本文。
抗体-药物偶联物
在一些实施方式中，本发明的抗-LY75抗体与药物偶联以形成抗体药物偶联物(ADC)。通常，ADC用于肿瘤应用，其中使用抗体-药物偶联物来局部递送细胞毒性剂或细胞生长抑制剂允许将药物部分靶向递送到肿瘤中，这可允许更高的功效、更低的毒性等。Ducry等，Bioconjugate Chem.,21:5-13(2010)，Carter等，Cancer J.14(3):154(2008)和Senter，Current Opin.Chem.Biol.13:235-244(2009)等提供了这种技术的综述，其全部通过引用全文纳入本文。
因此，本发明提供与药物偶联的抗-LY75抗体。一般而言，通过共价附连至抗体来进行偶联，如下文进一步描述，并且一般依赖于接头，通常是肽键(其如下所述可经设计以在靶标位点对蛋白酶的切割敏感或不敏感)。另外，如上所述，可通过附连至抗体内的半胱氨酸来进行接头-药物单元(LU-D)的连接。如本领域技术人员所理解，每个抗体的药物部分的数量可根据反应条件变化，并且可在1:1至10:1药物:抗体中变化。如本领域技术人员所理解，实际数量是平均数。
因此，本发明提供与药物偶联的抗-LY75抗体。如下文所述，ADC的药物可以是任何数量的试剂，包括但不限于细胞毒性剂如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)，或者提供放射性同位素(即，放射性偶联物)。在其他实施方式中，本发明还提供使用ADC的方法。
用于本发明的药物包括细胞毒性药物，尤其是用于癌症治疗的那些。这类药物一般包括DNA破坏剂、抗代谢剂、天然产物及其类似物。细胞毒性剂的示例性类别包括酶抑制剂，如二氢叶酸还原酶抑制剂、和胸苷酸合酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割物、拓扑异构酶抑制剂、蒽环类抗生素药物、长春花药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒性核苷、蝶啶类药物、二炔类(diynenes)、鬼臼毒、尾海兔素、美登木素、分化诱导剂、和紫杉醇。
这些类别的成员包括，例如，紫杉醇、氨甲蝶呤、甲氨喋呤、二氯氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、美法仑、环氧长春碱、长春西定(leurosideine)、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、丝裂霉素C、丝裂霉素A、洋红霉素、氨基蝶呤、他利霉素、鬼臼及鬼臼衍生物如足叶乙甙或磷酸足叶乙甙、长春花碱、长春新碱、长春地辛、紫杉烷包括紫杉醇、多西他赛视黄酸、丁酸、N8-乙酰基亚精胺、喜树碱、卡奇霉素、埃斯培拉霉素、烯-二炔、多卡霉素A、多卡霉素SA、卡奇霉素、喜树碱、哈米特林、美登木素(包括DM1)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、和美登木素(DM4)及其类似物。
毒素可用作抗体-毒素偶联物并包括细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(例如格尔德霉素)(Mandler等(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、美登木素(maytansinoid)(EP 1391213；Liu等,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)和卡奇霉素(Lode等(1998)CancerRes.58:2928；Hinman等(1993)Cancer Res.53:3336-3342)，哈米特林(WO2004/026293；Zask等，(2004)J.Med.Chem,47:4774-4786)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机理产生其细胞毒性和细胞生长抑制作用。
也可使用抗-LY75抗体与一个或多个小分子毒素及具有毒素活性的所述毒素衍生物的偶联物，该小分子毒素例如卡奇霉素、美登木素、尾海兔素、澳瑞他汀、新月毒素和CC1065。
美登木素
适用作美登木素药物部分的美登素(Maytansine)化合物为本领域技术人员熟知并可根据已知方法从天然来源中分离、通过遗传工程技术(参见Yu等(2002)PNAS 99:7968-7973)生产或者根据已知方法合成制备美登醇和美登醇类似物。如下文所述，可通过纳入功能活性基团如巯基或胺基修饰药物用于偶联至抗体。
示例性美登木素药物部分包括具有修饰芳环的那些药物部分，例如：C-19-去氯(美国专利号4,256,746)(通过安沙菌素(ansamytocin)P2的氢化铝锂还原制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(使用链霉菌或放线菌通过去甲基化制备或使用LAH通过脱氯制备)；和C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(美国专利号4,294,757)(使用酰氯通过酰化作用制备)以及在其它位点具有修饰的那些。
示例性美登木素药物部分也包括具有修饰的那些药物部分，例如：C-9-SH(美国专利号4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5反应制备)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2Oac)(美国专利号US 4,450,254)(通过诺尔卡菌属制备)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4,364,866)(通过链霉菌属转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)(分离自滑桃树(Trewia nudlflora))；C-18-N-去甲基(美国专利号4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌属将美登醇去甲基化制备)；和4,5-脱氧(美国专利号4,371,533)(通过用三氯化钛/LAH还原美登醇制备)。
特别使用的是DM1(公开于美国专利号5,208,020，通过引用纳入本文)和DM4(公开于美国专利号7,276,497，通过引用纳入本文)。也参见5,416,064、WO/01/24763、7,303,749、7,601,354、USSN 12/631,508、WO02/098883、6,441,163、7,368,565、WO02/16368和WO04/1033272中的多个其他美登木素衍生物和方法，其全部通过引用全文纳入本文。
含有美登木素的ADC、其制备方法以及其治疗应用公开于例如美国专利号5,208,020、5,416,064、6,441,163和欧洲专利号EP 0 425 235 B1，其公开内容通过引用明确纳入本文。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)描述了包含美登木素的ADC，该美登木素称为DM1并与针对人结直肠癌的单克隆抗体C242连接。发现该偶联物对培养的结肠癌细胞有高度的细胞毒性，并在体内肿瘤生长试验中表现出抗肿瘤活性。
Chari等，Cancer Research 52:127-131(1992)描述了ADC，其中美登木素通过二硫键接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7，或与另一种结合HER-2/neu癌基因的鼠单克隆抗体TA.1偶联。该TA.1-美登木素偶联物的细胞毒性在人乳腺癌细胞系SK-BR-3中体外测试，该细胞系中每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。该药物偶联物所达到的细胞毒性水平与游离美登木素药物相似，该水平可通过增加每抗体分子的美登木素分子数目来提高。A7美登木素偶联物在小鼠中表现出较低的全身细胞毒性。
澳瑞他汀和尾海兔素
在一些实施方式中，ADC包含与尾海兔素或尾海兔素肽类似物和衍生物、澳瑞他汀(美国专利号5,635,483；5,780,588)偶联的抗-LY75抗体。尾海兔素和澳瑞他汀已显示干扰微管动力学、GTP水解以及细胞核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents andChemother.45(12):3580-3584)并具有抗癌(美国专利号5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。尾海兔素和澳瑞他汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附连至抗体(WO 02/088172)。
示例性的澳瑞他汀实施方式包括N末端连接的单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF，公开于Senter等，美国癌症研究协会会议录(Proceedings of the American Associationfor Cancer Research)，卷45，摘要号623，2004年3月28日发表，以及描述于美国专利公开号2005/0238648，其公开内容通过引用全文明确纳入本文。
示例性的澳瑞他汀实施方式是MMAE(如图10所示，其中波浪线表示共价附连至抗体药物偶联物的接头(L)；参见美国专利号6,884,869，其通过引用纳入本文)。
另一个示例性的澳瑞他汀实施方式是MMAF，如图10所示，其中波浪线表示共价附连至抗体药物偶联物的接头(L)(US 2005/0238649、5,767,237和6,124,431，其通过引用纳入本文)。
其他包含MMAE或MMAF以及各种接头组分(本文进一步描述)的示例性实施方式具有以下结构和缩写(其中Ab表示抗体且p是1至约8)：
一般基于肽的药物部分可通过形成两个或多个氨基酸和/或肽片段之间的肽键来制备。例如，这类肽键可根据液相合成方法(参见E.和K.Lübke,“The Peptides(《肽》)”，卷1，第76-136页，1965，学术出版社)来制备，该方法为肽化学技术领域熟知。澳瑞他汀/尾海兔素药物部分可根据以下方法制备：美国专利号5,635,483；美国专利号5,780,588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer DrugDesign 13:243-277；Pettit,G.R.等Synthesis,1996,719-725；Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15:859-863；和Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7):778-784。
卡奇霉素
在其他实施方式中，ADC包含与一个或多个卡奇霉素分子偶联的本发明所述抗体。例如，Mylotarg是第一种市售的ADC药物并且采用卡奇霉素γ1作为有效载荷(参见美国专利号4,970,198，其通过引用全文纳入本文)。其他卡奇霉素衍生物描述于美国专利号5,264,586、5,384,412、5,550,246、5,739,116、5,773,001、5,767,285和5,877,296，其全部通过引用纳入本文。抗生素的卡奇霉素家族能够以亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。为制备卡奇霉素家族偶联物，参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001,5,877,296(都属于美国氰氨公司(American CyanamidCompany))。可以使用的卡奇霉素结构类似物包括但不限于：γ1 I、α2 I、α2 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等，Cancer Research 53:3336-3342(1993)，Lode等，Cancer Research58:2925-2928(1998)以及前述美国氰氨公司的专利)。另一种可与抗体偶联的抗肿瘤药物是QFA，该药物是一种抗叶酸剂。卡奇霉素和QFA均有胞内作用位点且不易穿过质膜。因此，通过抗体介导的内化使细胞摄取这些试剂显著增强了其细胞毒性作用。
多卡米星
CC-1065(参见4,169,888，通过引用纳入)和多卡米星是ADC中采用的抗肿瘤抗生素家族成员。这些抗生素似乎通过小沟中腺嘌呤的N3处的序列选择性烷基化DNA来发挥作用，其引发导致凋亡的级联事件。
多卡米星的重要成员包括多卡米星A(美国专利号4,923,990，通过引用纳入)和多卡米星SA(美国专利号5,101,038，通过引用纳入)，并且大量的类似物描述于美国专利号7,517,903、7,691,962、5,101,038、5,641,780、5,187,186、5,070,092、5,070,092、5,641,780、5,101,038、5,084,468、5,475,092、5,585,499、5,846,545、WO2007/089149、WO2009/017394A1、5,703,080、6,989,452、7,087,600、7,129,261、7,498,302和7,507,420，其全部通过引用纳入本文。
吡咯并苯并二氮杂
吡咯并苯并二氮杂(Pyrrolobenzodiazepine，PBD)(Journal of MedicinalChemistry 2001,44,737-748)是具有明显细胞毒性的DNA-相互作用试剂。已经分离了该家族的13种结构，包括化合物如氨茴霉素、甲基氨茴霉素、普茴霉素(porothramycin)、普斯卡辛(prothracarcin)、斯班霉素(sibanomycin)、托马霉素、矛霉素、契卡霉素(chicamycin)A、新茴霉素A、B、和DC-81(医药化学和药物设计(Medicinal Chemistry and DrugDesign)，ISBN:978-953-51-0513-8,Ahmed Kamal等，DOI:10.5772/38869)。该家族的其他类似物已经制备并偶联至抗体，如专利号WO2011/130598和WO2011/130616中所述，其通过引用纳入。
其它细胞毒剂
可与本发明所述抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链脲霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶、描述于美国专利号5,053,394和5,770,710中统称为LL-E33288复合物的一类试剂，以及埃斯波霉素(美国专利号5,877,296)。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、分裂毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明还包括抗体与具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的ADC。
为了选择性破坏肿瘤，该抗体可包含高放射性原子。各种放射性同位素可用于生成放射性偶联抗体。示例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。
可用已知的方法将放射性或其它标记引入该偶联物。例如，可生物合成或使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成法合成该肽，所述氨基酸前体包含例如氟-19以替代氢。可通过肽的半胱氨酸残基来附连标记如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。钇-90可通过赖氨酸残基附连。可使用IODOGEN方法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57引入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(免疫闪烁法中的单克隆抗体)”(Chatal，CRC出版社(CRC Press)1989)详细描述了其它方法。
对于包含多个抗体的组合物，p代表药物载量，即每个抗体的平均药物分子数量。药物载量的范围可以是每个抗体1-20个药物(D)。可通过常规方法如质谱、ELISA实验和HPLC鉴定偶联反应制备中每个抗体的平均药物数量。也可以p的形式确定抗体-药物偶联物的定量分布。
在某些情况下，可通过诸如反相HPLC或电泳等方式将具有某一确定p值的均一抗体-药物偶联物与其它药物载量的抗体-药物偶联物分离、纯化，并鉴定。在示例性实施方式中，p是2、3、4、5、6、7或8或其分数。
可通过任何本领域技术人员已知的技术生成抗体药物偶联化合物。简而言之，抗体药物偶联化合物包含作为抗体单元的抗-LY75抗体、药物和可选的连接药物与结合剂的接头。
多种不同的反应可用于药物和/或接头与结合剂的共价附接。这可通过结合剂(例如抗体分子)的氨基酸残基的反应来实现，所述氨基酸残基包括赖氨酸的氨基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的巯基以及芳族氨基酸的不同部分。一种常用的非特异性共价附连方法是连接化合物的羧基(或氨基)基团与抗体的氨基(或羧基)基团的碳二亚胺反应。此外，已将双功能试剂(例如二醛或亚氨酸酯)用于连接化合物的氨基与抗体分子的氨基。
也可将席夫碱(Schiff base)反应用于药物与结合剂的附连。该方法涉及含有乙二醇或羟基的药物的高碘酸盐氧化，从而形成之后与结合剂反应的醛基。通过用结合剂的氨基基团形成席夫碱来发生附连。还可采用异硫氰酸盐作为偶联剂来共价附连药物和结合剂。其它技术为本领域技术人员已知并在本发明范围内。
在一些实施方式中，作为接头前体的中间体在合适条件下与药物反应。在其他实施方式中，活性基团用于药物和/或中间体上。药物和中间体之间的反应产物(或衍生药物)继而在合适条件下与本发明的抗-LY75抗体反应。
将理解也可对所需的化合物进行化学修饰以使化合物的反应对于制备本发明的偶联物的目的而言更方便。例如，官能团如胺、羟基、或巯基可在对药物的活性或其他性质有最小或可接受影响的位置处附连至药物。
接头单元
通常，抗体-药物偶联化合物在药物单元和抗体单元之间包含接头单元。在一些实施方式中，接头在胞内或胞外条件下可切割，在合适环境中切割接头后从抗体释放药物单元。例如，分泌某些蛋白酶的实体瘤可用作可切割接头的靶标；在其他实施方式中，采用胞内蛋白酶。在其它实施方式中，接头单元不可切割且例如通过抗体在溶酶体中降解来释放药物。
在一些实施方式中，接头可由胞内环境中(如，溶酶体或内体或胞膜窖(caveolea)内)存在的切割剂切割。接头可以是例如被胞内肽酶或蛋白酶切割的肽酰接头，所述酶包括但不限于溶酶体或内体的蛋白酶。在一些实施方式中，肽酰接头的长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸或更长。
切割剂可包括但不限于组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知它们均可水解二肽药物衍生物，导致在靶细胞内释放活性药物(参见例如，Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83:67-123)。肽酰接头可由表达LY75的细胞内存在的酶切割。例如，可使用由硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B切割的肽酰接头(如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:X)接头)，所述蛋白酶在癌组织中高表达。这类接头的其他示例描述于例如美国专利号6,214,345，其通过应用全文纳入本文并用于全部目的。
在一些实施方式中，可由胞内蛋白酶切割的肽酰接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见例如美国专利号6,214,345，其描述了具有val-cit接头的多柔比星的合成)。
在其它实施方式中，可切割接头具有pH敏感性，即某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感型接头可在酸性条件下水解。例如，能使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺(cis-aconitic amide)、原酸酯、缩醛、缩酮等)。(参见例如美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics83:67-123；Neville等，1989，Biol.Chem.264:14653-14661)。这类接头在中性pH条件下(例如在血液中)相对稳定，但在低于pH5.5或5.0的条件(接近溶酶体的pH)下不稳定。在某些实施方式中，可水解接头是硫醚接头(如通过酰腙键附连治疗剂的硫醚(参见例如，美国专利号5,622,929))。
在其它实施方式中，该接头在还原条件下可切割(如二硫键接头)。本领域已知多种二硫化物接头，包括例如，可用SATA(N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)甲苯)、SPDB和SMPT形成的接头。(参见例如Thorpe等，1987，Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等，刊于《免疫偶联物：放射成像和癌症治疗中的抗体偶联物》(Immunoconjugates:AntibodyConjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer)(C.W.Vogel编，牛津大学出版社(Oxford U.Press)，1987。也参见美国专利号4,880,935)。
在其它实施方式中，接头是丙二酸接头(Johnson等，1995，Anticancer Res.15:1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰接头(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
在其它实施方式中，接头单元不可切割并通过降解抗体来释放药物。(参见美国公开号2005/0238649，其通过引用全文纳入本文并用于全部目的)。
在许多实施方式中，接头是自分解型的。本文所用的术语“自分解型间隔子”是指能够将2个分开的化学部分共价连接在一起形成稳定的三联分子的双官能化学部分如果与第一部分的键被切割，则自发与第二化学部分分离。参见例如，WO 2007/059404A2、WO06/110476A2、WO05/112919A2、WO2010/062171、WO09/017394、WO07/089149、WO 07/018431、WO04/043493和WO02/083180，其涉及药物-可切割底物偶联物，其中药物和可切割底物通过自分解型接头任选地连接，并且其全部通过引用纳入本文。
通常，接头对胞外环境基本不敏感。在接头内容中，本文所用的“对胞外环境基本不敏感”表示抗体-药物偶联化合物出现在胞外环境中(如血浆中)时，抗体-药物偶联化合物样品中不超过约20％、15％、10％、5％、3％或不超过约1％的接头被切割。
可通过例如以下方法测定接头是否对胞外环境基本不敏感：将抗体-药物偶联化合物与血浆一起孵育一段时间(如2、4、8、16或24小时)，然后定量测定血浆中出现的游离药物量。
在其它非互斥实施方式中，接头促进细胞内化。在某些实施方式中，接头在与治疗剂偶联时促进细胞内化(即，在本文所述的抗体-药物偶联化合物的接头-治疗剂部分的情况下)。在其它实施方式中，接头与澳瑞他汀化合物和抗-LY75抗体偶联时促进细胞内化。
可用于本组合物和方法的各种示例性接头描述于WO 2004/010957、美国公开号2006/0074008、美国公开号20050238649和美国公开号2006/0024317(其各通过引用全文纳入本文以用于所有目的)。
药物载量
p代表药物载量，即分子中每个抗体的药物部分的平均数量。药物载量(“p”)可以是每抗体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多部分(D)，虽然通常平均是是分数或小数。一般而言，通常可使用1-4的药物载量，并且也可使用1-2的药物载量。本发明的ADC包括与1至20，例如1-15、1-10、2-9、3-8、4-7、5-6的一定范围的药物部分偶联的抗体的集合。可通过常规方法如质谱和ELISA试验鉴定来自偶联反应的ADC制品中每个抗体的平均药物部分数量。
也可以p的形式确定ADC的定量分布。在一些情况下，可通过诸如电泳的方式将具有某一确定p值的均一ADC与其它药物载量的ADC分离、纯化，并进行鉴定。
对于一些抗体药物偶联物，p可能受到抗体附连位点数目的限制。例如，当所述附连是上文示例性实施方式中的半胱氨酸巯基时，抗体可只具有一个或多个半胱氨酸巯基基团，或可只具有一个或多个可经其附连于接头的充足反应性巯基基团。在某些实施方式中，较高的药物载量(例如p>5)可能导致一些药物抗体偶联物聚集、不溶性、毒性或失去细胞通透性。在某些实施方式中，本发明ADC的药物载量范围是1-约8、约2-约6、约3-约5、约3-约4、约3.1-约3.9、约3.2-约3.8、约3.2-约3.7、约3.2-约3.6、约3.3-约3.8或约3.3-约3.7。实际上，已证明对于某些ADC，每个抗体药物部分的最佳比例可少于8并可为约2-约5。参见US2005/0238649 A1(通过引用全文纳入本文)。
在某些实施方式中，在偶联反应中与抗体偶联的药物部分少于理论最大值。例如，抗体可含有不与药物接头中间体或接头试剂发生反应的赖氨酸残基，如下所述。通常，抗体不含大量可与药物部分连接的游离且反应性的半胱氨酸巯基基团；事实上，抗体中多数半胱氨酸巯基残基以二硫桥的形式存在。在某些实施方式中，抗体可在部分或全还原条件下用还原剂(例如二硫苏糖(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP))还原以产生反应性半胱氨酸巯基基团。在某些实施方式中，抗体经历变性条件以显示反应性亲核基团，例如赖氨酸或半胱氨酸。
可通过不同方法控制ADC的载量(药物/抗体比例)，例如：(i)限制药物接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应时间或温度，(iii)部分或限制半胱氨酸巯基修饰还原条件，(iv)通过重组技术工程改造抗体的氨基酸序列，从而修饰半胱氨酸数目和位点以控制接头药物附连的数目和/或位点(例如根据本文及WO2006/034488所述制备的巯基MAb或巯基Fab(其通过引用全文纳入本文))。
应理解，一个以上亲核基团与药物接头中间体或接头试剂反应再与药物部分试剂反应时，所得产物是ADC化合物的混合物，其中分布了一种或多种与抗体附连的药物部分。每个抗体的平均药物数目可通过双ELISA抗体试验从混合物中计算，该试验对抗体有特异性并对药物有特异性。单个ADC分子可通过质谱在混合物中鉴定并通过HPLC分离，例如，疏水相互作用色谱。
在一些实施方式中，可通过电泳或色谱法从偶联混合物中分离具有单一载量值的均一ADC。
测定ADC细胞毒性作用的方法
测定药物或抗体药物偶联物是否对细胞产生细胞生长抑制和/或细胞毒性作用的方法是已知的。通常，可通过以下方法测量抗体药物偶联物的细胞毒性或细胞生长抑制活性：将表达抗体药物偶联物靶蛋白的哺乳动物细胞暴露在细胞培养基中；将细胞培养约6小时至约5天的一段时间；并测定细胞活力。可采用基于细胞的体外测试来测量抗体药物偶联物的活力(增殖)、细胞毒性和细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶活性)。
为测定抗体药物偶联物是否产生细胞生长抑制作用，可采用胸苷掺入试验。例如，96孔板上以密度为5,000细胞/孔接种的靶抗原表达癌细胞能培养72小时并在72小时期间的最后8小时中接触0.5μCi的3H-胸苷。在有和没有抗体药物偶联物的情况下测量培养物细胞中3H-胸苷的掺入。
为了测定细胞毒性，可测量坏死或凋亡(程序性细胞死亡)。坏死通常伴随着质膜通透性增加；细胞溶胀和质膜破裂。凋亡的特征通常是膜出泡、胞质浓缩和内源性核酸内切酶的激活。对癌细胞的作用表明，抗体药物偶联物可用于癌症治疗。
可通过测定细胞摄入的染料(例如中性红、台盼蓝或ALAMARTM蓝)来测量细胞活力(参加例如Page等，1993,Intl.J.Oncology 3:473-476)。在此类试验中，在含有染料的培养基中孵育细胞、洗涤细胞，并用分光光度法测定剩余染料来反映细胞对染料的摄取。也可利用蛋白质-结合染料磺基罗丹明B(SRB)测量细胞毒性(Skehan等，1990，J.Nat’l CancerInst.82:1107-12)。
或者，在定量比色测定中使用四唑盐(例如MTT)，该定量比色测定通过检测存活而非死亡的细胞来测定哺乳动物细胞的存活和增殖(参见例如Mosmann,1983,J.Immunol.Methods 65:55-63)。
可通过测量(例如)DNA片段化来定量分析细胞凋亡。已有市售的体外定量检测DNA片段化的分光光度方法。此类试验的示例包括TUNEL(检测片段化DNA中掺入的带标记核苷酸)和基于ELISA的试验，描述于Biochemica，1999，2号，第34-37页(罗氏分子生化制品公司(Roche Molecular Biochemicals))。
也可通过测量细胞形态学变化来确定细胞凋亡。例如，关于坏死，可通过检测某些染料(例如荧光染料，如吖啶橙或溴化乙锭)的摄入来测定质膜完整性的缺失。测量凋亡细胞数目的方法已描述于Duke和Cohen的《新编免疫学实验指南》(Current Protocols inImmunology)(Coligan等编，1992，第3.17.1-3.17.16页)。也可用DNA染料标记细胞(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)并观察细胞的染色质凝聚和沿内核膜的边集(margination)。可测量以确定细胞凋亡的其他形态学变化包括例如胞质凝聚、膜出泡增加和细胞缩小。
可由培养物的附连和“漂浮”的腔室(compartment)来测量凋亡细胞是否存在。例如，可通过去除上清液、胰蛋白酶消化粘附的细胞、离心洗涤步骤(例如2000rpm离心10分钟)后混合制备物并检测细胞凋亡(例如，通过测量DNA片段化)来收集两种腔室。(参见例如，Piazza等，1995,Cancer Research 55:3110-16)。
在体内，可在合适的动物模型中评价本发明的抗-LY75抗体的治疗组合物的效果。例如，可使用异种癌模型，其中将癌外植体或经传代的异种移植组织引入免疫受损动物中，例如裸小鼠或SCID小鼠(Klein等，1997，Nature Medicine3:402-408)。可通过测量肿瘤形成抑制、肿瘤消退或转移等的试验来测量功效。
用于实施上述方法的治疗组合物可配制成药物组合物，该药物组合物包含适用于所需递送方法的运载体。合适的运载体包括当与治疗组合物组合时保持治疗组合物抗肿瘤功能的任何物质，并通常与患者免疫系统无反应性。示例包括但不限于任何数量的标准药物运载体，例如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水等(参见，《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第16版，A.Osal.编，1980)。
生产本发明的抗体的方法
本发明还提供了生产公开的抗-LY75抗体的方法。这些方法包括培养含有编码本发明的抗体的分离的核酸的宿主细胞。如本领域技术人员所理解，根据抗体的性质，这可通过多种方式进行。在一些实施方式中，在本发明的抗体是全长常规抗体的情况中，例如重链可变区和轻链可变区，在一定条件下，使得抗体产生并可被分离。
本文公开了LY75_A1的可变重链和轻链(蛋白质和核酸序列)；如本领域所理解，这些可易于加强以产生全长重链和轻链。即，提供本文所列的编码VH和VK区段的DNA片段，这些DNA片段还可通过标准重组DNA技术处理，例如，以将可变区基因转化成全长抗体链基因，转化成Fab片段基因，或转化成scFv基因。在这些处理中，编码VK或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一种蛋白质，如抗体恒定区或挠性接头的另一种DNA片段。本文中使用的术语“可操作连接”旨在表示2个DNA片段连接使得由2个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框内。
编码VH的分离DNA可通过将VH-编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子可操作连接而转化成全长重链基因。鼠重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.等，(1991)，《免疫学感兴趣蛋白质的序列》(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，美国卫生和人类服务部公共卫生署，NIHPublication No.91-3242)并且可通过标准PCR扩增来获得包括这些区的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，VH-编码DNA可以可操作地连接到仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。
编码VL/VK区的分离DNA可通过可操作地连接VL-编码DNA至编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子来转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。鼠轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.等，(1991)，《免疫学感兴趣蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生和人类服务部公共卫生署，NIHPublication No.91-3242)并且可通过标准PCR扩增来获得包括这些区的DNA片段。在优选的实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，VH-和VL/VK-编码DNA片段可操作地连接至编码挠性接头的另一个片段，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3，使得VH和VL/VK序列可表达为连续单链蛋白质，而由挠性接头连接VL/VK和VH区(参见例如，Bird等，(1988)Science 242:423-426；Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等，(1990)Nature 348:552-554)。
通常，提供编码本发明的抗体的核酸。这类多核苷酸编码各重链和轻链的可变区和恒定区，虽然按照本文所述的组合物，本发明也考虑其他组合。本发明也考虑衍生自所公开的多核苷酸和与这些多核苷酸互补的核酸序列的互补寡核苷酸片段。
多核苷酸可以是RNA或DNA的形式。DNA、cDNA、基因组DNA、核酸类似物和合成DNA形式的多核苷酸在本发明的范围内。DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，可以是编码(正义)链或非编码(反义)链。编码多肽的编码序列可以与本文提供的编码序列相同，或者可以是不同的编码序列，作为遗传密码冗余或简并的结果，其序列编码与本文提供的DNA相同的多肽。
在一些实施方式中，编码本发明的抗体的核酸纳入表达载体中，其可以是染色体外的或者经设计整合到所导入的宿主细胞的基因组中。表达载体可含有任意数量的合适调控序列(包括但不限于转录和翻译控制序列、启动子、核糖体结合位点、增强子、复制起点等)或其他元件(选择基因等)，其全部可如本领域熟知的那样可操作地连接。在一些情况中，使用2种核酸并且各自放入不同的表达载体(例如，第一表达载体中的重链，第二表达载体中的轻链)中，或者它们可放入相同表达载体。本领域技术人员会理解表达载体的设计，包括调控序列的选择可能取决于这些因素，如宿主的选择，所需的蛋白质表达水平等。
一般而言，可使用任意对于所选宿主细胞而言合适的方法将核酸和/或表达引入合适的宿主细胞以产生重组宿主细胞(例如，转化、转染、电穿孔、感染)，使得核酸分子可操作地连接至一个或多个表达控制元件(例如，在载体中，在通过细胞中的过程产生的构建体中，整合到宿主基因组中)。所得的重组宿主细胞可保持在适于表达的条件下(例如，在诱导剂存在下，在合适的非人动物中，在补充合适的盐、生长因子、抗生素、营养补充剂的合适培养基中等)，从而产生编码的多肽。在一些情况中，在一个细胞中产生重链并且在另一个细胞中产生轻链。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系为本领域已知，并且包含很多获自弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC)的永生化细胞系，包括但不限于中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK 293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、和很多其他细胞系。包括但不限于细菌、酵母、昆虫和植物的非哺乳动物细胞也可用于表达重组抗体。在一些实施方式中，可在转基因动物如奶牛或鸡中产生抗体。
抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法是熟知的，例如，参见美国专利号4,816,567、4,816,397、6,331,415和7,923,221，以及《抗体工程改造》(AntibodyEngineering)，由Kontermann和Dubel编,Springer,Heidelberg,2001和2010Hayhurst和Georgiou,2001,Curr Opin Chem Biol 5:683-689；Maynard和Georgiou,2000,Annu RevBiomed Eng 2:339-76；和Morrison,S.(1985)Science 229:1202。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其包含与药学上可接受的运载体配制在一起的本发明LY75抗体或其抗原结合部分之一或组合。合适的组合物可包括本发明的抗体或免疫偶联物或双特异性分子之一或其组合(例如，2种或更多种不同的)。例如，本发明的药物组合物可包含与靶抗原不同表位结合或具有补体活性的抗体(或免疫偶联物或双特异性物)的组合。
本发明的药物组合物也可以联合治疗的方式进行给药，如与其它试剂联合给药。例如，联合治疗可包括与至少一种其他抗肿瘤药物，或抗炎或免疫抑制剂组合的本发明的抗体。可用于联合治疗中的治疗剂的示例在下文中使用本发明的抗体部分中更详细地描述。
如本文所用，“药学上可接受的运载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂，分散介质，包被，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂，等等。优选地，所述运载体适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给予(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，活性化合物，即抗体、免疫偶联物或双特异性分子可包被在材料中以防止化合物接触酸的作用或可能灭活化合物的其他天然条件。
本发明的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且没有任何不需要的毒理学影响(参见，例如，Berge,S.M.等，(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些来源于无毒性无机酸，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸和亚磷酸等的盐，以及来源于无毒性有机酸，如脂族单和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属，例如钠、钾、镁、钙等的盐，以及衍生自无毒有机胺，如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺和普鲁卡因等的盐。
本发明的药物组合物也可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
用于本发明药物组合物的水性和非水性运载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适混合物，植物油如橄榄油，以及可注射有机酯，如油酸乙酯。可通过使用涂覆材料如卵磷脂、如果是分散体则保持所需粒度、以及使用表面活性剂，来维持合适的流动性。
这些组合物还可包含辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌方法(同上)和纳入各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇和苯酚、山梨酸等确保防止微生物的出现。组合物中也可能需要包含等张剂，如糖、氯化钠等。此外，可通过加入能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的长期吸收。
药学上可接受的运载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则应考虑在本发明的药物组合物中使用这些介质或试剂。补充性活性化合物也可掺入所述组合物。
在制备和储存条件下，治疗组合物通常必须无菌和稳定。可将组合物制成适合高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其它有序结构。运载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，组合物中可优选地包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶可延长可注射组合物的吸收。
可将所需量的活性化合物和上述组分之一或其组合根据需要掺入合适溶剂后灭菌和微过滤，从而制备无菌注射液。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散剂。当制备无菌注射液制备所需的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
可与运载体材料组合后得到单一剂量形式的活性成分的量可以根据治疗的对象以及具体的给药模式而变化。可与运载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。一般而言，在100％中，该量的范围将是约0.01％至约99％的活性成分、优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分，与药学上可接受的运载体组合。
调节给药方案以提供最优的所需响应(例如，治疗响应)。例如，可给予单一推注剂量，可随时间给予分成数次的剂量或可如治疗情况的紧急性所示成比例降低或增加剂量。尤其有利的是配制成单位剂型的胃肠道外组合物以便于给药和剂量均一性。本文所用的单位剂量形式指作为单一剂量用于待治疗对象的物理离散单位，每个单位包含预定量的活性化合物与所需药物运载体，该预定量经计算能够产生所需治疗效果。本发明中剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和待实现的具体治疗效果，以及(b)复合这种活性化合物用于个体中治疗灵敏度的领域中的固有限制。
对于抗体给药，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，例如0.001至50mg/kg、0.005至20mg/kg、0.01至10mg/kg并且更通常0.01至5mg/kg的宿主体重。例如，剂量可以是0.05mg/kg体重、0.1mg/kg体重、0.3mg/kg体重、0.3mg/kg体重、0.5mg/kg体重、1mg/kg体重、2mg/kg体重、3mg/kg体重、4mg/kg体重、5mg/kg体重、6mg/kg体重、7mg/kg体重、8mg/kg体重、9mg/kg体重、10mg/kg体重、12mg/kg体重、15mg/kg体重、20mg/kg体重、25mg/kg体重、30mg/kg体重，或在0.1-20mg/kg、0.5-15mg/kg、1-10mg/kg、2-8mg/kg、3-7mg/kg、4-6mg/kg的范围内。示例性的治疗方案使得每天给药一次，每2天给药一次、每周给药一次、每2周给药一次、每3周给药一次、每4周给药一次、每月给药一次、每6周给药一次、每3个月给药一次或每3-6个月给药一次。本发明的抗-LY75抗体的优选剂量方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下给药方案来给予抗体：(i)每4周6剂量，然后每3个月；(ii)每3周；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时给予具有不同结合特异性的2种或更多种单克隆抗体，其中各抗体给予的剂量落在所示的范围内。通常多次给予抗体。单一剂量之间的间隔可以是，例如，每天、每2周、每周、每月、每3个月、每6个月或每年。间隔也可以是不规律的，如通过测量患者中针对靶标抗原的抗体的血液水平来指示。在一些方法中，调节剂量以实现约1-1000μg/ml、5-750μg/ml、10-600μg/ml、15-500μg/ml、20-400μg/ml并且在一些方法中约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。
或者，可以缓释制剂给予抗体，在这种情况中需要较低频率的给药。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。一般而言，人抗体显示出最常的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体、和非人抗体。给药的剂量和频率可根据治疗是预防性或治疗性的而变化。在预防性应用中，在一段长时间内在较不频繁的间隔中给予较低剂量。一些患者在余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要较短间隔处的较高剂量直至疾病进展降低或终止，并且优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可给予患者预防性方案。
可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，从而获得就具体患者、组合物与给药方式有效实现所需治疗应答且对患者无毒性的活性成分量。所选剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其脂、盐、酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所用特定组合物联用的其他药物、化合物和/或材料，年龄、性别、体重、病症、整体健康状况、所治疗病人的病史以及医学领域所知类似因素。
本发明抗-LY75抗体的“治疗有效剂量”优选使疾病症状的严重程度减轻、无疾病症状期的频率和持续时间增加，或预防病痛引起的损伤或失能。例如，对于LY75介导的肿瘤的治疗而言，“治疗有效剂量”优选相对于未治疗的对象抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、至少约30％、更优选至少约40％、至少约50％、甚至更优选至少约60％、至少约70％并且更优选至少约80％或至少约90％。可在预测人肿瘤中功效的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。或者，可通过检测化合物抑制细胞生长的能力来评价组合物的这种性质，如可通过本领域技术人员已知试验体外测量这种抑制。治疗有效量的治疗性化合物可降低肿瘤尺寸，或者缓解对象中的症状。本领域一般技术人员能够基于如对象大小、对象症状严重性和特定组合物或所选给药途径因素来确定此类量。
本发明的组合物可通过使用一种或多种本领域已知方法的一种或多种途径进行给药。本领域熟练技术人员应当理解，给药的途径和/或方式根据所需结果而有所不同。本发明的抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其它胃肠道外给药途径，例如通过注射或输注。本文所用术语“胃肠道外给药”代表除肠道和局部给药外的给药形式，通常通过注射，例如但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下(subcapsular)、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注给药。
或者，本发明的抗体可以通过非胃肠道外途径给药，如通过局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或外用途径给药。
可用能防止结合成员快速释放的运载体制备活性化合物，例如控释制剂，包括植入体、透皮贴剂和微囊化递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的许多方法被授予专利或者一般是本领域技术人员所知的(参见例如，缓释或控释药物递送系统(Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems)(1978)J.R.Robinson编，马塞尔-德克公司(Marcel Dekker,Inc.)纽约)。
可用本领域抑制的医疗装置来给予治疗性组合物。例如，在优选的实施方式中，可用无针皮下注射装置来给予本发明的治疗性组合物，如美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的熟知的植入物和模块的示例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控的速率分散药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的变化流动可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。这些专利通过引用纳入本文。许多其他植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方式中，可配制本发明的单克隆抗体以保证合适的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了保证本发明的治疗性化合物跨越BBB(需要的话)，可将其制成，如脂质体。关于制备脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811、5,374,548、和5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性转运至特定细胞或器官的部分，从而增强靶向药物递送(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等，(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais等，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等，(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等，(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
用途和方法
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有多种体外和体内诊断和治疗用途，包括诊断和治疗LY75介导的病症。
在一些实施方式中，这些分子可在体外或离体给予培养中的细胞，或者给予人对象，例如，体内，以治疗、防止并诊断多种病症。本文所用术语“对象”旨在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长动物、绵羊、狗、猫、奶牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。优选的对象包括患有由LY75活性介导的病症的人患者。这些方法特别适用于治疗患有与异常LY75表达相关的病症的人患者。当针对LY75的抗体以另一种试剂一起给予时，两者可以任意顺序或者同时给予。
考虑到本发明的抗体对LY75的特异性结合，本发明的抗体可用于特异性检测细胞表面上的LY75表达，而且，可用于通过免疫亲和纯化来纯化LY75。
此外，考虑到肿瘤细胞上LY75的表达，本发明的抗体、抗体组合物和方法可用于治疗患有肿瘤病症的对象，例如，由表达LY75的肿瘤细胞存在表征的病症，或用于制备用于治疗这种病症的药物，包括，例如，胃癌、肾癌、甲状腺癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、卵巢癌、肺癌、骨髓瘤、白血病、包括慢性淋巴细胞性白血病和急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、包括DLBCL、B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。如下文实施例5和7所示，LY75已经证明在抗体结合后内化，因此使得本发明的抗体以任何有效载荷作用机制使用，例如，ADC方法、放射性免疫偶联物、或ADEPT方法。
在一个实施方式中，可使用本发明的抗体(例如，单克隆抗体、抗体片段、多特异性和双特异性分子和组合物等)来检测LY75的水平、其膜表面上含有LY75的细胞的水平，其水平然后可关联至某些疾病症状。或者，一般以ADC给药的该抗体可用于抑制或阻断LY75功能，其进而可关联至某些疾病症状的防止或缓解，从而暗示LY75是疾病的介导物。这可通过使样品和对照样品在能在抗体和LY75之间形成复合物的条件下接触抗-LY75抗体来实现。抗体和LY75之间形成的任何复合物被检测并在样品和对照之间比较。
在另一个实施方式中，可初始测试本发明的抗体(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)与体外治疗性或诊断性用途相关的结合活性。例如，可使用以下实施例中所述的流式细胞试验来测试本发明的组合物。
本发明的抗体(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子、免疫偶联物和组合物)具有在LY75相关疾病的治疗和诊断中的额外应用。例如，可使用单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫偶联物来在体内或体外引发以下生物活性中的一种或多种：抑制表达LY75的细胞的生长和/或杀死该细胞；在人效应细胞存在下介导表达LY75的细胞的吞噬作用或ADCC；或阻断LY75配体与LY75结合。
在具体实施方式中，体内使用抗体(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)来治疗、预防或诊断多种LY75-相关疾病。LY75-相关疾病的示例包括代表下述疾病的人癌组织：胃癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、骨髓瘤、白血病包括慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤包括DLBCL、B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、和肺癌。
本领域熟知体内和体外给予本发明的抗体组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子以及免疫偶联物)的合适途径并且可由本领域普通技术人员选择。例如，抗体组合物可通过注射给予(例如，静脉或皮下)。使用的分子的合适剂量将取决于对象的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。
如前所述，本发明的抗-LY75抗体可与一种或其他多种治疗剂共同给予，例如，细胞毒性剂、放射性毒剂或免疫抑制剂。抗体可连接至药剂(如免疫复合物)或可与试剂分开给予。在后一种情况(分开给药)中，抗体可在药剂之前、之后或同时给予，或者可与其他已知治疗共同给予，例如抗癌治疗，例如放疗。这类治疗剂包括，抗肿瘤剂如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、和环磷酰胺羟基脲，其本身仅在对患者有毒性或亚毒性的水平下有效。顺铂每4周以100mg/kg剂量静脉内给予一次并且阿霉素每21天以60-75mg/ml剂量静脉内给予一次。其他适用于与本发明的抗体共同给药的药剂包括用于治疗癌症，例如，胃癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌或肺癌的其他药剂，如5FU和吉西他滨。本发明的抗-LY75抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共同给予提供了2种通过不同的机制作用的抗癌剂，其对人肿瘤细胞产生细胞毒性效果。这种共同给药可解决由于发展出耐药性或肿瘤细胞的抗原性变化导致的问题，这些会使它们无法与抗体反应。
靶标特异性效应细胞，例如连接至本发明的组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)也可用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞和其他含IgG-或IgA-受体的细胞。如果需要，可从待治疗的对象获得效应细胞。可以生理上可接受的溶液中的细胞悬浮液给予靶标特异性效应细胞。给予的细胞数量可以是108-109，但将根据治疗目的变化。一般而言，该量将足够获得在靶标细胞，例如表达LY75的肿瘤细胞处的定位，并且通过例如吞噬作用造成细胞杀伤。给药的途径也可变化。
用靶标特异性效应细胞的疗法可与其他技术结合进行用于去除靶向的细胞。例如，使用本发明的组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)和/或这些组合物带有的效应细胞的抗肿瘤疗法可与化疗联合使用。另外，可使用组合免疫疗法来将2种不同的细胞毒性效应群导向肿瘤细胞排斥。例如，与抗-Fc-γRI或抗-CD3连接的抗-LY75可与IgG-或IgA-受体特异性结合剂联用。
本发明的双特异性或多特异性分子也可用于调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，如通过加帽或消除细胞表面上的受体。抗-Fc受体的混合物也可用于此目的。
在补体存在下，也可使用具有补体结合位点，如结合补体的来自IgG1、-2、或-3或IgM的部分的本发明的组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子以及免疫偶联物)。在一个实施方式中，可通过加入补体或含补体的血清来补充包含带本发明的结合剂的靶标细胞以及合适效应细胞的细胞群的离体治疗。可通过结合补体蛋白质来改善包被本发明的结合剂的靶标细胞的吞噬作用。在另一个实施方式中，包被本发明的组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)的靶标细胞也可通过补体裂解。在另一个实施方式中，本发明的组合物并不激活补体。
本发明的组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子以及免疫偶联物)也可与补体一起给予。在某些实施方式中，本发明提供了包含抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。当补体靠近抗体、多特异性或双特异性分子时，这些组合物可能是优选的。或者，可分开给予本发明的抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清。
本发明的范围还有包含本发明的抗体组合物(例如，单克隆抗体、双特异性或多特异性分子、或免疫偶联物)和使用说明的试剂盒。该试剂盒还可含有一种或多种其他试剂，如免疫抑制剂、细胞毒剂或放射性毒剂、或者一种或多种本发明的其他抗体(例如，具有结合至与第一抗体不同的LY75抗原中的表位的互补活性)。
因此，用本发明的抗体治疗的患者还可给予(在给予本发明的抗体之前、同时或之后)另一种治疗剂，如细胞毒剂或放射性毒剂，其增强或增加抗体的治疗效果。
在其他实施方式中，还可用调节，例如增强或抑制Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的药剂来治疗对象，通过，例如，用细胞因子治疗对象。用多特异性分子治疗期间给予的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的组合物(例如，抗体、多特异性和双特异性分子)也可给予表达FcγR或LY75的靶标细胞，例如，用于标记这类细胞。对于这类用途，结合试剂可被连接至可被检测的分子。因此，本发明提供了用于离体或体外定位表达Fc受体，如FcγR或LY75的细胞。可检测标记可以是，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶、或酶辅因子。
在具体实施方式中，本发明提供了检测样品中LY75抗原存在的方法，或测量LY75抗原的量的方法，包括将样品和对照样品与特异性结合LY75的单克隆抗体或其抗原结合部分在抗体或其部分与LY75之间形成复合物的条件下接触。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比样品之间形成不同的复合物指示样品中存在LY75抗原。
在其他实施方式中，本发明提供用于治疗对象中LY75介导的病症的方法，例如，人癌症，包括胃癌、肾癌、甲状腺癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、卵巢癌、肺癌、骨髓瘤、白血病、包括慢性淋巴细胞性白血病和急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、包括DLBCL、B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。
在本发明的所有实施方式中，优选的癌症包括非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和三阴性乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌。
本说明书中引用的所有参考文献包括但不限于所有的文章、出版物、专利、专利申请、展示、教科书、报告、手册、宣传册、书籍、网帖、杂志文章、期刊、产品说明书等，通过引用全文纳入本说明书中。本文中参考文献的描述指导仅仅总结它们的作者所提出的论断，并没有承认任何参考文献构成现有技术并且申请人保留质疑所应用参考文献的精确性和相关性的权利。
虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思或范围的情况下作出某些改变和修改。
还通过以下实施例说明本发明，这些实施例不应构成限制。
实施例1：针对LY75-抗原的人单克隆抗体的生成
在标准过程之后，用转染全长LY75的CHO细胞免疫小鼠(xenomouse IgG1)。
通过流式细胞术在转染LY75的HEK293细胞，随后在表达LY75的HT29细胞上测试针对LY75产生的抗体的特异性。为了测试抗体结合细胞表面LY75蛋白质的能力，用表达LY75的细胞孵育抗体。细胞在FACS缓冲液(DPBS，2％FBS)中洗涤、离心并且在100μl的稀释LY75一抗(也在FACS缓冲液中稀释)中重悬。将抗体-细胞系复合物在冰上孵育60分钟，然后如上所述用FACS缓冲液洗涤2次。细胞-抗体团块在100μl的稀释的二抗(也在FACS缓冲液中稀释)中重悬并在冰上孵育60分钟。如前所述洗涤团块并在200μlFACS缓冲液中重悬。将样品加载到BD FACScanto II流式细胞仪上并且使用BD FACSdiva软件分析数据(结果未显示)。
实施例2：针对LY75的单克隆抗体的结构表征
使用标准PCR技术获得编码LY75_A1单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列并且使用标准DNA测序技术测序。
抗体序列可经诱变以回复成在一个或多个残基处的种系残基。
LY75_A1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:3和1。
LY75_A1的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:4和2。
LY75_A1重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明LY75_A1重链采用来自人种系VH3-15的VH区段和来自人种系JHJH4的JH区段。使用CDR区确定的Kabat系统对LY75_A1VH序列的进一步分析导致描绘分别如SEQ ID NO:5、6和7所示的重链CDR1、CDR2和CDR3区。LY75_A1CDR1、CDR2和CDR3VH序列与种系VH3-15和种系JHJH4序列的比对示于图1。
LY75_A1轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明LY75_A1轻链采用来自人种系VKO12的VK区段和来自人种系JKJK4的JK区段。使用CDR区确定的Kabat系统对LY75_A1VK序列的进一步分析导致描绘分别如SEQ ID NO:8、9和10所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。LY75_A1CDR1、CDR2和CDR3VK序列与种系VKO12和种系JKJK4序列的比对示于图2。
实施例3：使用针对LY75的单克隆抗体的免疫组化
使用针对LY75有特异性的人单克隆抗体，在FFPE HT-29和A549细胞团块上进行免疫组化，FFPE非霍奇金淋巴瘤和胰腺癌试验，和新鲜冷冻的淋巴瘤/白血病肿瘤，卵巢癌、胰腺癌、和乳腺癌切片和正常组织试验。
材料和方法
材料
二甲苯(X5P-1gal)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司(FisherScientific,PA,USA)。
Histoprep 100％乙醇(HC-800-1GAL)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
用于热诱导表位修复的10X柠檬酸盐缓冲液(AP9003125)来自美国马萨诸塞州的热科学公司(Thermo Scientific,MA,USA)。
热科学*Pierce*过氧化物酶抑制物(35000)来自美国马萨诸塞州的热科学公司。
无血清蛋白封闭物(X0909)来自美国加利福尼亚州的大科公司(Dako,CA,USA)。
二抗：山羊抗人IgG Fab-FITC偶联(109-097-003)来自美国宾夕法尼亚州的杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch,PA,USA)。
铬纯人IgG，全分子(09-000-003)来自美国宾夕法尼亚州的杰克逊免疫研究公司。
三抗：小鼠抗-FITC(ab10257)来自美国马萨诸塞州的阿柏堪穆公司(Abcam,MA,USA)。
纯化的人IgG同种型对照(1-001A)来自美国明尼苏达州的R&D系统公司(R&DSystems,MN,USA)。
吐温-20(BP337-100)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
丙酮(BP2403-4)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
双连接EnVision+HRP-偶联的聚合物，小鼠和兔(K4063)来自美国加利福尼亚州的大科公司。
DAB 2-溶液试剂盒(882014)来自美国纽约的英杰公司(Invitrogen,NY,USA)。
哈里斯苏木精(23-245-677)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Faramount封装介质(S302580)来自美国加利福尼亚州的大科公司。
组织切片和阵列购自美国马里兰州的美国百麦克斯公司(US Biomax Inc.)或美国马里兰州的Origene公司。
FFPE载玻片的制备：脱石蜡化和重水合
FFPE载玻片在二甲苯(2x3分钟)中脱石蜡化，然后通过1:1二甲苯:100％乙醇(1x3分钟)、100％乙醇(2x3分钟)、95％乙醇(1x3分钟)、70％乙醇(1x3分钟)、50％乙醇(1x3分钟)、和自来水(1x3分钟)重水合。
FFPE载玻片的制备：抗原修复(微波)。
在科普林氏缸内的50ml的1X柠檬酸盐缓冲液中使用微波热、高功率直至沸腾然后低功率持续10分钟来修复LY75抗原。载玻片然后放置冷却至室温另外持续15分钟，然后在自来水中洗涤3分钟。使用疏水性阻隔笔在各组织切片/TMA周围画圈并使用PBS清洗载玻片3次，每次3分钟。
FF载玻片的制备
载玻片充-80℃下的储存中移出，并在通风橱中在室温下干燥20-30分钟。载玻片在-20℃下的冰冷丙酮中固定10分钟，然后在通风橱中在室温下干燥20分钟。在PBS中洗涤并重水合载玻片，3次洗涤，每次3分钟。用疏水性阻隔笔画出切片。
抗体复合物的制备
抗-LY75一抗在无血清蛋白封闭物(SFPB)中稀释以获得比最终所需浓度大20倍的浓度(对于最终浓度1μg/mL是20μg/mL)。类似地在SFPB中制备二抗，山羊抗-人免疫球蛋白G(IgG)抗原结合片段(Fab)以产生等浓度的溶液。
在标记的管中合并等体积的一抗和二抗，并在室温下孵育3分钟，产生比所需最终浓度大10倍的一抗浓度(对于最终浓度1μg/mL是10μg/mL)。该混合物用SFPB以1:5稀释，温和混合，并在室温下孵育30分钟，产生所需最终浓度2倍的一抗浓度(对于最终浓度1μg/mL是2μg/mL)。
为了产生最终的染色复合物，在SFPB中制备1％(10μg/μL)的人IgG溶液并且向一抗/二抗混合物中加入等体积。该组合经温和混合并在室温下孵育30分钟，稀释一半的一抗/二抗浓度中的一抗，并且产生所需的最终一抗浓度(1μg/mL)。
免疫染色
同时，通过在潮湿培养箱中将组织与过氧化物酶抑制剂在室温下孵育5-10分钟来封闭内源性组织过氧化物酶活性。然后在PBS中洗涤载玻片，每次洗涤3x3分钟。在潮湿培养箱中将组织在SFPB中在室温下孵育30分钟。将最终染色复合物施加到各组织切片和/或微阵列中，并且载玻片在潮湿培养箱中在室温下孵育30分钟。然后载玻片在PBS中洗涤一次并且在PBST(PBS+0.125％吐温-20)中洗涤一次，每次洗涤3分钟。在潮湿培养箱中，三抗小鼠抗-FITC以2μg/mL浓度施加在室温下持续30分钟。切片然后在PBS中洗涤一次并在PBST中洗涤一次，每次洗涤3分钟。双连接EnVision+抗-小鼠/兔-HRP-偶联的聚合物然后施加至组织并且载玻片在潮湿培养箱中在室温下孵育30分钟。载玻片然后在PBS中洗涤一次、在PBST中洗涤一次，每次洗涤3分钟。组织在按照生产商的说明书制备的DAB溶液中在室温下孵育10分钟。载玻片然后在流动的自来水中洗涤一次持续2分钟，并在PBS中洗涤一次持续3分钟。载玻片用赫斯特在室温下复染30秒，并且用流动的自来水洗涤。载玻片在室温下干燥30分钟，并且然后使用Faramount封装介质将盖玻片封装在载玻片上。
结果
LY75_A1显示在FFPE三阴性乳腺癌样品中是阳性的，其中77％的切片显示阳性染色并且55％显示强(+++)染色。
FF正常组织中LY75的染色一般没有低的。乳腺、唾液腺和胰腺的导管上皮显示低到中等的染色，并且脾染色显示低阳性。因此，针对LY75的抗体可在一些测试的癌症并且可能在其他显示LY75表达的癌症类型中用作治疗剂和诊断剂。
实施例4：HT-29细胞中DM1-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向平板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3a所示的结果显示已知结合LY75的抗体亚群，其可诱导HT-29细胞的细胞杀伤。这表明，虽然抗体可结合LY75，但是当与DM1偶联时仅一些显示功效。然后从亚群中选择抗体用于进一步细胞毒性活性分析。
实施例5：结直肠癌细胞中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3b显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对HT-29细胞的细胞毒性活性。这些结果证明细胞毒性活性的增加与抗体浓度和与毒素偶联的其他抗-LY75抗体(选自实施例1)成比例。
实施例6：淋巴瘤细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3c显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对拉吉细胞的细胞毒性活性。图3d显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对纳玛瓦细胞的细胞毒性活性。图3e显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对Karpas 299细胞的细胞毒性活性。这些结果证明细胞毒性活性的增加与抗体浓度和与DM1和DM4偶联的其他抗-LY75抗体(选自实施例1)成比例。
实施例7：胰腺癌细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3f显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对BxPC3细胞的细胞毒性活性。图3g显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对HupT4细胞的细胞毒性活性。图3h显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对HPAFFII细胞的细胞毒性活性。这些结果证明细胞毒性活性的增加与抗体浓度和与DM1和DM4偶联的其他抗-LY75抗体(选自实施例1)成比例。
实施例8：慢性淋巴细胞性白血病细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克 隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3i显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对EHEB细胞的细胞毒性活性。图3j显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对Mec-1细胞的细胞毒性活性。这些结果证明细胞毒性活性的增加与抗体浓度和与DM1和DM4偶联的其他抗-LY75抗体(选自实施例1)成比例。
实施例9：急性单核细胞白血病细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆 抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3k显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对AML-193细胞的细胞毒性活性。这些结果证明细胞毒性活性的增加与抗体浓度和与DM1和DM4偶联的其他抗-LY75抗体(选自实施例1)成比例。
实施例10：乳腺癌细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3l显示偶联DM1和DM4的抗-LY75抗体对HCC 70(ER阴性，PR阴性和Her2阴性)细胞的细胞毒性活性。图3m显示偶联DM1和DM4的抗-LY75抗体对HCC 1806(ER阴性，PR阴性和Her2阴性)细胞的细胞毒性活性。图3n显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对MDA-MB-468细胞的细胞毒性活性。这些结果证明，细胞毒性活性的增加与抗体浓度成比例。
实施例11：膀胱癌细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。+团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3o显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对RT4细胞的细胞毒性活性。图3p显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对5637细胞的细胞毒性活性。图3q显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对SW780细胞的细胞毒性活性。这些结果证明，细胞毒性活性的增加与抗体浓度成比例。
实施例12：头颈癌细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。+团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3r显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对SCC-9细胞的细胞毒性活性。这些结果证明，细胞毒性活性的增加与抗体浓度成比例。
实施例13：食道癌细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3s显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对OE 19细胞的细胞毒性活性。这些结果证明，细胞毒性活性的增加与抗体浓度成比例。
实施例14：卵巢癌细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3t显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对OVCAR-3细胞的细胞毒性活性。图3u显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对SK-OV-3细胞的细胞毒性活性。这些结果证明，细胞毒性活性的增加与抗体浓度成比例。
实施例15：多发性骨髓瘤细胞系中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体 的功效
材料
细胞玻璃剂(非酶促细胞解离)(MT-25-056CI)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
RPMI 1640介质(MT-10-041-CM)来自美国宾夕法尼亚州的费舍尔科学公司。
Cell Titer-Glo(G7572)来自美国威斯康星州的普洛麦格公司(Promega,WI,USA)。
方法
使用细胞剥离剂解离细胞并计数。5e3细胞/孔离心成团块(用于悬浮细胞，更多可根据细胞的加倍时间使用，如10e3细胞/孔)。团块在培养基中重悬至1e5细胞/孔的浓度。
50ul/孔细胞悬浮液加入到96-孔白壁透明底平板的孔中。抗体经稀释并滴定至对应于0-20nM(2倍测试浓度)的浓度的8个点(3倍滴定)。向合适的孔中加入稀释的抗体或介质(用于未治疗的样品)(50ul/孔)。向板外侧的排和列中加入过量的介质(200ul/孔)以防止蒸发。随后将平板在37℃下孵育72小时。
从孵育器中去除平板并在室温下孵育30分钟。同时，融化Cell Titer Glo溶液。平板经轻弹并用100ul/孔的PBS洗涤1次(对于悬浮细胞，平板首先离心成团块细胞)。100ul/孔的PBS和100ul Cell titer glo加入各孔中并研磨混合。平板在黑暗中在室温下孵育15分钟，并且通过显微镜观察以确保发生高效细胞裂解。平板然后在Glomax发光计上读取。
结果
图3v显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对MOLP-8细胞的细胞毒性活性。图3w显示偶联DM1或DM4的抗-LY75抗体对RPMI8226细胞的细胞毒性活性。这些结果证明，细胞毒性活性的增加与抗体浓度成比例。
实施例16：拉吉异种移植模型中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的 功效
在皮下拉吉伯基特淋巴瘤SCID小鼠一种移植模型中测试LY75_DM1和LY75_DM4的功效。
用拉吉(人伯基特淋巴瘤)肿瘤细胞在皮下接种免疫缺陷型SCID小鼠。使肿瘤建立并且将小鼠分成5个治疗组，每组3-6只小鼠。当平均肿瘤体积达到129-132mm3的每组平均尺寸时，用以下化合物之一处理各组，在所示的剂量下静脉内给予：组1(载剂；磷酸盐缓冲盐水(PBS))，组2(LY75_DM1；10mg/kg)，组3(同种型对照-DM1；10mg/kg)，组4(LY75_DM4；5mg/kg)，组5(同种型对照-SPBDDM4；5mg/kg)。一周后给予第二次给药。监测体重(BW)，频繁检测小鼠的健康和不良副作用，并且每周2次测量肿瘤。当其肿瘤达到2000mm3的肿瘤体积终点或在60天之后(无论哪个先达到)时，处死小鼠。从ADC-处理对于PBS-处理的小鼠中肿瘤生长延迟(TGD)、至终点时间(TTE)中值的增加并且从卡普兰-迈耶生存曲线的差异的对数秩分析确定功效。达到终点的前5只载剂处理的对照小鼠对肿瘤取样，肿瘤经甲醛固定和石蜡包埋处理。
结果
图4a显示与对照相比，LY75_DM1和LY75_DM4各自在拉吉伯基特淋巴瘤SCID小鼠异种移植模型中证明明显的抗肿瘤活性和明显延长的存活；然而，5mg/kg LY75_DM4的给药明显比10mg/kg LY75_DM1的给药更有效，导致6只小鼠中的5只有完全但短暂的肿瘤消退。所有处理都是良好耐受的，并且没有观察到毒性的临床迹象。这些数据表明针对LY75(例如LY75_DM1和LY75_DM4)的ADC在治疗人非霍奇金淋巴瘤癌症患者中提供临床益处的潜力。
实施例17：纳玛瓦异种移植模型中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体 的功效
在皮下纳玛瓦伯基特淋巴瘤SCID小鼠异种移植模型中测试LY75_DM1和LY75_DM4的功效。
用纳玛瓦(人伯基特淋巴瘤)肿瘤细胞在皮下接种免疫缺陷型SCID小鼠。使肿瘤建立并且将小鼠分成5个治疗组，每组6只小鼠。当平均肿瘤体积达到114mm3的每组平均尺寸时，用以下化合物之一处理各组，在所示的剂量下静脉内给予：组1(载剂；磷酸盐缓冲盐水(PBS))，组2(LY75_DM1；10mg/kg)，组3(同种型对照-DM1；10mg/kg)，组4(LY75_DM4；5mg/kg)，组5(同种型对照-SPBDDM4；5mg/kg)。监测体重(BW)，频繁检测小鼠的健康和不良副作用，并且每周2次测量肿瘤。当其肿瘤达到2000mm3的肿瘤体积终点或在60天之后(无论哪个先达到)时，处死小鼠。从ADC-处理对于PBS-处理的小鼠中肿瘤生长延迟(TGD)、时间至终点(TTE)中值的增加并且从卡普兰-迈耶生存曲线的差异的对数秩分析确定功效。达到终点的前5只载剂处理的对照小鼠对肿瘤取样，肿瘤经甲醛固定和石蜡包埋处理。
结果
图4b显示与对照相比，LY75_DM1和LY75_DM4各自在纳玛瓦异种移植模型中证明明显的抗肿瘤活性和存活延长；然而5mg/kg LY75_DM4的给药明显比10mg/kg LY75_DM1的给药更有效，导致肿瘤体积的简短降低。所有处理都是良好耐受的，并且没有观察到毒性的临床迹象。这些数据表明针对LY75(例如LY75_DM1和LY75_DM4)的ADC在治疗人非霍奇金淋巴瘤癌症患者中提供临床益处的潜力。
实施例18：胰腺癌异种移植模型中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体 的功效
在皮下HPAFII胰腺癌无胸腺裸小鼠异种移植模型中测试LY75_DM1和LY75_DM4的功效。
用HPAFII(人胰腺癌)肿瘤细胞皮下接种免疫缺陷型的无胸腺裸小鼠。使肿瘤建立并且将小鼠分成5个治疗组，每组6只小鼠。当平均肿瘤体积达到约114mm3的每组平均尺寸时，用以下化合物之一处理各组，在所示的剂量下静脉内给予：组1(载剂；磷酸盐缓冲盐水(PBS))，组2(LY75_DM1；10mg/kg)，组3(同种型对照-DM1；10mg/kg)，组4(LY75_DM4；5mg/kg)，组5(同种型对照-SPBDDM4；5mg/kg)。监测体重(BW)，频繁检测小鼠的健康和不良副作用，并且每周2次测量肿瘤。当其肿瘤达到2000mm3的肿瘤体积终点或在90天之后(无论哪个先达到)时，处死小鼠。从ADC-处理或PBS-处理的小鼠中处理对肿瘤体积的影响并且从卡普兰-迈耶存活曲线中的差异的对数秩分析中确定功效。从载剂处理的对照小鼠中取样肿瘤并且通过甲醛固定和石蜡包埋处理。
结果
图4c显示与对照相比，LY75_DM1和LY75_DM4在HPAFII无胸腺裸小鼠异种移植模型中显示显著并且类似强效的抗肿瘤活性和存活延长。所有处理都是良好耐受的，并且没有观察到毒性的临床迹象。这些数据表明针对LY75(例如LY75_DM1和LY75_DM4)的ADC在治疗人胰腺癌患者中提供临床益处的潜力。
实施例19：膀胱癌异种移植模型中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体 的功效
在皮下SW780人膀胱癌SCID小鼠异种移植模型中测试LY75_DM1和LY75_DM4的功效。
用HPAFII(人胰腺癌)肿瘤细胞皮下接种免疫缺陷型的无胸腺裸小鼠。使肿瘤建立并且将小鼠分成5个治疗组，每组6只小鼠。当平均肿瘤体积达到约114mm3的每组平均尺寸时，用以下化合物之一处理各组，在所示的剂量下静脉内给予：组1(载剂；磷酸盐缓冲盐水(PBS))，组2(LY75_DM1；1mg/kg)，组3(LY75_DM1；2.5mg/kg)、组4(LY75_DM1；5mg/kg)、组5(LY75_DM4；1mg/kg)、组6(LY75_DM4；2.5mg/kg)、组7(LY75_DM4；5mg/kg)、组8(同种型对照-SPBDDM4；5mg/kg)。监测体重(BW)，频繁检测小鼠的健康和不良副作用，并且每周2次测量肿瘤。当其肿瘤达到2000mm3的肿瘤体积终点或在90天之后(无论哪个先达到)时，处死小鼠。从ADC-处理或PBS-处理的小鼠中处理对肿瘤体积的影响并且从卡普兰-迈耶存活曲线中的差异的对数秩分析中确定功效。从载剂处理的对照小鼠中取样肿瘤并且通过甲醛固定和石蜡包埋处理。
结果
图4d显示与对照相比，LY75_DM1和LY75_DM4在SW780无胸腺裸小鼠异种移植模型中显示显著并且类似强效的抗肿瘤活性和存活延长。所有处理都是良好耐受的，并且没有观察到毒性的临床迹象。这些数据表明针对LY75(例如LY75_DM1和LY75_DM4)的ADC在治疗人膀胱癌患者中提供临床益处的潜力。
实施例20：乳腺癌异种移植模型中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体 的功效
在皮下MDA-MB-468无胸腺裸小鼠异种移植模型中测试LY75_DM1和LY75_DM4的功效。
用MDA-MB-468(人三阴性乳腺癌)肿瘤细胞皮下接种免疫缺陷型无胸腺裸小鼠。使肿瘤建立并且将小鼠分成7个治疗组，每组10只小鼠。当平均肿瘤体积达到167mm3的每组平均尺寸时，用以下化合物之一处理各组，在所示的剂量下静脉内给予：组1(载剂；20mM琥珀酸钠，pH 5.0，6％海藻糖，0.04％聚山梨酯)，组2(LY75_DM1；5mg/kg)，组3(LY75_DM1；10mg/kg)，组4(LY75_DM4；5mg/kg)，组5(LY75_DM4；2.5mg/kg)，组6(LY75_DM4；1mg/kg)，组7(同种型对照-DM4；5mg/kg)。监测体重(BW)，频繁检测小鼠的健康和不良副作用，并且每周2次测量肿瘤。在肿瘤接种后82天处死小鼠。从ADC-处理对比PBS-处理的小鼠中抗肿瘤活性(处理组中平均肿瘤尺寸/对照组中平均肿瘤尺寸x 100)和平均至终点时间(TTE)的增加来确定功效。在接种后71天从载剂处理的对照小鼠中的5个最大肿瘤取样，通过甲醛固定和石蜡包埋处理。
结果
图4e显示与对照相比，LY75_DM1和LY75_DM4各自证明在MDA-MB-468裸小鼠异种移植模型中的显著抗肿瘤活性。LY75_DM4观察到剂量依赖性活性，其中2.5和5mg/kg比1mg/kg强效得多。在5mg/kg下，LY75_DM1和LY75_DM4有相似效果。10和5mg/kg的LY75_DM1以及5和2.5mg/kg的LY75_DM4观察到平均肿瘤体积的持续消退。所有处理都是良好耐受的，并且没有观察到毒性的临床迹象。这些数据表明针对LY75(例如LY75_DM1和LY75_DM4)的ADC在治疗人三阴性乳腺癌患者中提供临床益处的潜力。
实施例21：结直肠癌异种移植模型中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗 体的功效
在皮下COLO205结直肠癌无胸腺裸小鼠异种移植模型中测试LY75_DM1和LY75_DM4的功效。
用COLO205(人结直肠癌)肿瘤细胞皮下接种免疫缺陷型的无胸腺裸小鼠。使肿瘤建立并且将小鼠分成5个治疗组，每组6只小鼠。当平均肿瘤体积达到117mm3的每组平均尺寸时，用以下化合物之一处理各组，在所示的剂量下静脉内给予：组1(载剂；磷酸盐缓冲盐水(PBS))，组2(LY75_DM1；10mg/kg)，组3(同种型对照-DM1；10mg/kg)，组4(LY75_DM4；5mg/kg)，组5(同种型对照-DM4；5mg/kg)。首次之后12天给予第二剂量。监测体重(BW)，频繁检测小鼠的健康和不良副作用，并且每周2次测量肿瘤。当其肿瘤达到1000mm3的肿瘤体积终点或在60天之后(无论哪个先达到)时，处死小鼠。从ADC-处理对于PBS-处理的小鼠中肿瘤生长延迟(TGD)、时间至终点(TTE)中值的增加并且从卡普兰-迈耶生存曲线的差异的对数秩分析确定功效。达到终点的前5只载剂处理的对照小鼠对肿瘤取样，肿瘤经甲醛固定和石蜡包埋处理。
结果
图4f显示与对照相比，LY75_DM1和LY75_DM4在COLO205结直肠癌无胸腺裸小鼠异种移植模型中显示类似适度的抗肿瘤活性和存活延长。所有处理都是良好耐受的，并且没有观察到毒性的临床迹象。这些数据表明针对LY75(例如LY75_DM1和LY75_DM4)的ADC在治疗人结直肠癌患者中提供临床益处的潜力。
实施例22：猕猴中DM1-偶联的和DM4-偶联的抗-LY75单克隆抗体的毒性
研究中分配6只雄性猴，2只猴/组。通过15分钟静脉内输注以0mg/kg/剂(PBS，载剂)、5mg/kg/剂(LY75_DM4，可切割)或10mg/kg/剂(LY75_DM1，不可切割)2次(在第1天和第29天)给予载剂(PBS)、LY75_DM4(可切割)或LY75_DM1(不可切割)。在给药开始之前(第1天)，并且在每次给药之后第1、2、3、7、14、21和28天收集血样用于毒代动力学评价。在给药开始之前(第1天)，并且在每次给药之后第1、3、7、14、21和28天收集用于临床病理学分析的血样(第一次给药后第28天也用作第二次给药的给药前时间点)。在第57天处死所有研究动物并进行尸检，之后进行最后的血液收集。从各抽血中分离的血浆经分离、冷冻并运输至牛经生物治疗公司(Oxford BioTherapeutics,Inc.)以用于通过ELISA分析ADC浓度。
处理相关的临床病理学发现包括温和再生性贫血和血液白细胞概况，最明显在嗜中性粒细胞计数中的瞬时减少。在用5mg/kg LY75_DM4处理的2只动物，和10mg/kg LY75_DM1处理的2只动物中的一只中都观察到贫血。在所有动物中观察到计数上在给药后一周达到最低点并且快速恢复的严重的嗜中性白细胞减少症；绝对嗜中性粒细胞计数的最低点在LY75_DM4处理的动物中更低。对APTT和PT凝结参数没有测试品相关的影响。血清化学变化包括在给予5mg/kg LY75_DM4和10mg/kg LY75_DM1之后AST、CK、LDH(在各处理组中2只动物中的1只)和球蛋白的瞬时增加。另外，仅在LY75_DM4处理的动物中观察到肝特异性酶ALT的瞬时增加。血清化学参数增加的幅度和/或短持续时间表明它们并非不良的。没有测试品相关的尿检发现。在尸检时检查后的4周恢复期之后，在绝对和相对器官重量中没有发现治疗相关的全面病理学发现或变化。仅在甲状腺(滤泡中胶体形态变化)和肾(外皮质区中扩张的小管)中的组织病理学发现被分级为严重性最小的；与其他研究参数的变化不相关；并且，不是不良的并且是毒理学显著的。结论:用2剂量的5mg/kg LY75_DM4或10mg/kg LY75_DM1的重复给药处理在猕猴中良好耐受。在4周恢复期后，所有处理相关的毒性发现都是可逆的。
实施例23：通过竞争性荧光激活的细胞分选(FACS)结合分析的LY75_A1表位表征
方法
用细胞剥离剂(Cellgro，目录号MT-25-056CI)从组织培养烧瓶中剥离COLO205细胞(ATCC，目录号CCL-222)。细胞在FACS缓冲液(PBS+2％FBS)中洗涤并重悬，用生长培养基中和，并计数。细胞以50000个细胞/孔接种在V底96-孔板中。用FACS缓冲液(PBS(费舍尔，目录号SH30028-03)+2％FBS)洗涤细胞一次。以250nM开始向孔中加入LY75_A1的抗-LY75-mAb(选自实施例1)并且连续稀释3倍并施加到相应孔中，在冰上持续45分钟。需要单一或多个染色步骤的测试孔适当地置于FACS缓冲液中以确保对于所有测试条件同时完成最终的染色。2个孔未在FACS缓冲液中染色用作对照。
在用封闭抗体孵育之后，细胞在FACS缓冲液中洗涤2次。细胞在含有偶联MCC-DM1的抗-LY75-mAb(1nM)的FACS缓冲液中重悬并在冰上孵育45分钟。如上所述洗涤细胞，并在加了1ug/ml小鼠抗-美登素抗体的FACS缓冲液中重悬，并在冰中孵育45分钟。如上所述洗涤细胞并在含2ug/ml山羊抗-小鼠κRPE的FACS缓冲液中重悬。细胞在冰上孵育45分钟，然后如上所述洗涤。细胞以200ul/孔在FACS缓冲液中重悬。使用Guava EasyCyte Plus HT流式细胞仪(96孔板模式)确定各样品的平均荧光强度并且使用Guava Cytosoft分析原始数据。
结果
图5a显示用抗-LY75-mAb-MCC-DM1封闭减少了抗-LY75-mAb的结合。对LY75_A1与COLO205细胞结合的分析显示LY75_A1不能阻断抗-LY75-mAb-MCC-DM1的结合(参见图5b)。因此可以确定，抗-LY75-mAb和LY75_A1是非竞争性抗体并且LY75_A1识别与其他抗-LY75抗体识别的不同且独特的LY75表位。
实施例24通过肽微阵列试验的LY75_A1的表位表征
方法
由德克萨斯州休斯顿市的LC科学公司(LC Sciences,Houston TX)进行肽微阵列合成，简言之，该方法包括以下步骤：合成跨全长LY75蛋白质的残基216-1666的具有1个氨基酸重叠的LY75蛋白质的连续8聚体肽并固定在微阵列芯片上。该芯片包含三组，使得能三次重复进行实验。用LY75_A1寻址微阵列以鉴定抗体结合哪些肽。结合试验在以下条件下进行：
包含三次重复的连续肽的微阵列在4℃下用1mL的结合缓冲液洗涤20分钟。其然后在4℃下用结合缓冲液(pH 7.0)中的1μg/mL LY75_A1孵育2小时。在4℃下用0.5mL的洗涤缓冲液再次洗涤阵列30分钟，然后在4℃下用结合缓冲液(pH 7.0)中的25ng/mL抗-人IgGAlexa 647孵育1小时。该阵列再次在4℃下用0.5mL的洗涤缓冲液洗涤30分钟。
然后在635nm和PMT 500下扫描阵列，并且记录信号强度。如果其在至少2/3的重复中存在，则肽被分类为可检测的。重复的平均信号强度被报告为最终信号强度。
结果
如图6所示，抗体LY75_A1显示出对阵列上的多种肽的特异性结合。LY75_A1结合所看到的最大信号是25000(标尺1-65535)，阵列上所有点的平均信号是约885。3000的信号强度被设为非特异性结合的背景截止点。基于看到的抗体结合信号强度的水平，鉴定了形成LY75_A1表位的潜在序列。这些区域示于图6a–6j和SEQ ID NO:22-31。
实施例25LY75_A1肽拉下试验
方法
1.1拉下试验
通过珠上胰蛋白酶水解(美国普洛麦格公司)来消化重组LY75蛋白质。使用C18捕获柱(赛默飞世尔科学有限公司(Thermo Fisher Scientific))回收所得的消化肽。纯化的肽然后用200μl交联LY75_A1抗体的蛋白A珠在4℃下过夜孵育。第二天，收集未结合的肽并且用1ml的PBS两次洗涤珠。通过将在100μl的PBS中在90℃下加热珠持续5分钟来从它们上洗脱抗体结合的肽。重复该洗脱步骤。
1.2质谱
通过使用配备有nanoACQUITY UPLC BEH 130C18柱，75μm x 250mm(186003545)和LTQ Orbitrap Velos(赛默飞世尔科技公司)的沃特斯(Waters)nanoACQUITY UPLC系统通过液相色谱-质谱分析样品。在120分钟内使用从3％增加至35％乙腈的300nl/分钟梯度对肽进行洗脱。在Orbitrap中以400-2000m/z质量范围之间的60000分辨率获得全扫描质谱。在各循环中，选择20个强度最高的肽用于使用该仪器上安装的纳米喷雾离子源在线性离子阱中进行CID MS/MS扫描。
1.3肽的氨基酸序列分析
通过Mascot软件(矩阵科学公司(Matrix Science))对由LTQ Orbitrap Velos生成的原始数据进行加工，该软件使用Mowse算法(Curr Biol.1993年6月1日；3(6):327-3)以通过对由Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)、IPI(www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html)和SwissProt(http://www.uniprot.org)组成的序列数据库以及污染蛋白序列进行检索来推断峰列表的氨基酸序列。肽鉴定的标准包括胰蛋白酶消化，最多2个缺失的切割位点和多个生物和化学修饰(氧化的甲硫氨酸、由MMTS或碘乙酰进行的半胱氨酸修饰和丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化)。将具有0.05％或更低的期望值、28或更高的离子评分的秩为1的肽加载至我们的OGAP数据库中。
1.4LY75结合肽的区分
鉴定LY75的过程使用了通过对天然产生的人蛋白进行质谱(如上文所述)而经实验获得的肽序列，该质谱用于鉴定和组织公开的人基因组序列中的编码外显子。将这些经实验确定的序列与数据库比较，该数据库通过加工和整合肽质量、肽签名、EST和公共结构域基因座序列数据(如国际专利申请WO2009/087462所述)来编译。
结果
使用抗体LY75_A1的肽拉下试验的结果示于下表1和图7。在拉下试验和微阵列试验中在肽洗脱液1a和1b中鉴定到的肽被认为是形成表位的最可能候选物。
表1肽微阵列和肽拉下实验的比较。
表1显示在肽微阵列试验中并且在洗脱液1a和1b肽拉下试验中同时鉴定到多种重叠的LY75肽区。这些区被认为最可能含有抗体LY75_A1所识别的表位，因为同时通过2种采用的技术测得它们被LY75_A1结合。

Claims (29)

1.一种结合LY75的分离抗体或其抗原结合部分，所述抗体包含：
a）重链可变区，包含：
i）SEQ ID NO: 5所示第一vhCDR；
ii）SEQ ID NO: 6所示第二vhCDR；和
iii）SEQ ID NO: 7所示第三vhCDR；和
b）轻链可变区，包含：
i）SEQ ID NO: 8所示第一vlCDR；
ii）SEQ ID NO: 9所示第二vlCDR；和
iii）SEQ ID NO: 10所示第三vlCDR。
2.如权利要求1所述的分离抗体或其抗原结合部分，包含具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所述的分离抗体或其抗原结合部分，还包含共价附连的药物部分，所述药物是美登木素。
4.如权利要求3所述的分离抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述药物是选自DM4和DM1的美登木素。
5.如权利要求1或2所述的分离抗体，其特征在于，所述抗体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）。
6.如权利要求5所述的分离抗体，其特征在于，所述抗体是对Fc受体的结合增加和/或ADCC效力增加的工程改造的抗体。
7.一种包含前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，和一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或运载体的药物组合物。
8.一种编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的重链的核酸与一种编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的轻链的核酸的组合。
9.一种表达载体或表达载体的组合，包含可操作地连接至一个或多个调控元件的编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的重链的核酸和可操作地连接至一个或多个调控元件的编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的轻链的核酸。
10.一种宿主细胞，包含：
（i）一种表达载体，包含可操作地连接至一个或多个调控元件的编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的重链的核酸和可操作地连接至一个或多个调控元件的编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的轻链的核酸；或
（ii）包含可操作地连接至一个或多个调控元件的编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的重链的核酸的第一表达载体和包含可操作地连接至一个或多个调控元件的编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的轻链的核酸的第二表达载体。
11.一种制备抗体或其抗原结合部分的方法，包括在所述抗体或其抗原结合部分表达的条件下培养权利要求10所述的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的制备抗体或其抗原结合部分的方法，还包括分离所述抗体或其抗原结合部分。
13.用于癌症治疗的如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分被表达LY75的细胞内化。
15.如权利要求13或14所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或抗原结合部分包含共价附连的药物偶联物，所述共价附连的药物偶联物是美登木素。
16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述美登木素是DM4。
17.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）。
18.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述癌症选自下组：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、白血病，骨髓瘤和淋巴瘤。
19.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述癌症选自：急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤（MALT）、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。
20.如权利要求18或19所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述癌症选自膀胱癌、胰腺癌、三阴性乳腺癌和DLBCL。
21.如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分被表达LY75的细胞内化。
23.如权利要求21或22所述的用途，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分包含共价附连的药物偶联物，所述共价附连的药物偶联物是美登木素。
24.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述美登木素是DM4。
25.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述抗体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）。
26.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述癌症选自下组：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、白血病，骨髓瘤和淋巴瘤。
27.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述癌症选自：急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤（MALT）、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。
28.如权利要求26或27所述的用途，其特征在于，所述癌症选自膀胱癌、胰腺癌、三阴性乳腺癌和DLBCL。
29.用于治疗或用作药物的如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
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