CN105732820A - 一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法，属于蛋白纯化领域，包括以下步骤：1)破碎表达重组人胰岛素原融合蛋白的大肠杆菌菌体，收集包涵体；2)洗涤包涵体，然后使包涵体溶解、融合蛋白变性；3)蛋白复性步骤；本方法不需预先的蛋白纯化步骤，直接进行蛋白复性，最后收获高浓度的具有天然结构的重组胰岛素原融合蛋白，克服现有技术中，蛋白复性后蛋白浓度低，易发生蛋白聚集沉淀的缺陷，复性率提高至80％?90％，提高生产效率，适于工业化生产。

Description

一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法

技术领域

本发明属于一种蛋白复性方法，具体说是一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法。

背景技术

糖尿病是多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，是由于体内胰岛素绝对或相对缺乏或靶组织对胰岛素不敏感而引起的综合病症。近年来，随着人们生活水平的改善，糖尿病的发病率呈现出逐年上升的趋势，成为仅次于心血管和肿瘤的第三大致死疾病，根据国际糖尿病联盟(IDF)公布的数据，2014年全球糖尿病患者数量(20岁至79岁)达到3.87亿人，较去年增加了500万人，预计在2035年将达到5.92亿人。大量的临床实践证实，用重组人胰岛素注射液治疗糖尿病可取得理想的效果。

胰岛素原基因在许多系统如大肠杆菌，酵母，枯草杆菌及链球菌中都得到了表达，目前较多采用的表达系统为大肠杆菌表达系统。然而当外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形成不可溶，无活性的聚集体，又称包涵体，包涵体须通过体外复性操作使其形成正确的高级结构才能得到具有预期生物活性的目的蛋白。

目前重组人胰岛素原融合蛋白复性方法主要包括以下几种：

(1)稀释复性：直接加入水或缓冲液进行稀释，之后放置过夜。稀释法主要有：一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式；

(2)透析复性：不增加体积，通过逐渐降低外渗透液浓度来控制变性剂去除。

(3)柱上复性：包涵体经变性后，在色谱柱上复性。

现有蛋白复性方法存在以下技术缺陷：

(1)稀释复性：增加体积较大，变性剂稀释速度太快，不易控制，且复性时蛋白含量较低，一般2mg/mL以下，复性率在60％左右。

(2)透析复性：不适合大规模生产，无法应用到生产规模，且易形成无活性蛋白质具体。

(3)柱上复性：生产工艺复杂，且增加生产成本。

因此开发一种适于工业化生产的重组人胰岛素原融合蛋白复性方法，克服了已有工艺复性后复性蛋白浓度小、蛋白易聚集的缺陷，简化生产工艺的同时，提高蛋白复性率，提高生产效率，满足广大糖尿病患者用药的需求，不仅具有重要的经济意义，而且具有重要的社会意义。

发明内容

发明人经过深入的研究，对大肠杆菌表达重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法进行了改进。经过广泛实验，改进了溶解、还原、复性条件，最终克服了复性时蛋白浓度小、蛋白易聚集沉淀的缺陷，使重组人胰岛素原融合蛋白在较高的浓度下进行复性，简化生产工艺的同时，复性率提高至80％-90％，提高生产效率，适合工业化生产。

因此，本发明所要解决的技术问题是提供一种适于工业化生产的大肠杆菌表达重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法，以克服现有技术中存在的复性时蛋白浓度较低、生产工艺复杂、复性率较低的技术缺陷。

本发明提供一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法，包括以下步骤：

1)将表达重组人胰岛素原融合蛋白的大肠杆菌进行破碎，收集包涵体；

2)使用包涵体洗涤液对于包涵体进行洗涤，所述包涵体洗涤液为含有终浓度10-100mM Tris-HCl、1-10mM EDTA、质量比1-5％Triton-X100、1-5M尿素的溶液，该包涵体洗涤液的pH为8.5-9.5；

3)去除洗涤液后，在包涵体里加入变性剂，所述包涵体变性剂是含有终浓度10-100mM的Tris-HCl、终浓度1-10mM的EDTA、终浓度5-10M的尿素的溶液，该包涵体变性剂的pH为8-9.5；

4)加入还原剂，所述还原剂为巯基还原剂，使用终浓度为5-20mM，获得还原蛋白溶液；

5)将配好的复性缓冲液缓慢加入4)中的还原蛋白溶液中，轻微搅拌，进行重组人胰岛素原融合蛋白的复性，所述复性缓冲液的各组分终浓度分别为0.50-1.50M的尿素、1-10mM的氧化型谷胱甘肽、1-5mM的还原型谷胱甘肽、1-5mM的EDTA、终浓度1-5mM的β-巯基乙醇，调pH8-9.5，得到优化的复性蛋白溶液。

本发明的优点在于表达重组人胰岛素原融合蛋白的大肠杆菌菌体经破碎收集包涵体、洗涤、溶解，先不经纯化，直接进行变复性得到可溶且具有天然结构的重组人胰岛素原融合蛋白。重组人胰岛素原融合蛋白经变性还原后浓度为50～100mg/mL。

本发明还提供了一种复性方法，所述的破碎为机械破碎方法，优选超声破碎、高压菌体破碎或均质机破碎。

本发明还提供了一种复性方法，所述的步骤2)所述包涵体洗涤液为一种配置成终浓度50mM Tris-HCl、2mM EDTA、质量比1％Triton-X100、3M尿素的溶液，其pH调为9.0-9.5。

本发明的复性方法的洗涤优选为多次洗涤，更优选洗涤次数为2-5次，最优选2次。

用上述方法即可很轻易地除去大量非重组人胰岛素原融合蛋白。

本发明还提供了一种复性方法，步骤3)所述的包涵体变性剂为含有终浓度50mM的Tris-HCl、终浓度2mM的EDTA、终浓度为8M的尿素的溶液，该溶液的pH为9.0-9.5。用该溶液对包涵体进行溶解变性处理，有利于随后的还原剂复性处理。

本发明还提供了一种复性方法，其中，步骤4)中所述的巯基还原剂为二硫苏糖醇，使用终浓度为10mM。即，采用终浓度为10mM的二硫苏糖醇使重组人胰岛素原融合蛋白错配二硫键打开，能够得到还原蛋白溶液。

本发明还提供了一种复性方法，其中，步骤4)所述的还原蛋白溶液的蛋白浓度为50-100mg/ml。

本发明还提供了一种复性方法，其中优选步骤5)中复性缓冲液的各组分的终浓度分别为0.80M尿素、1mM的氧化型谷胱甘肽、1M的还原型谷胱甘肽、2mM的EDTA、终浓度2mM的β-巯基乙醇，调其pH为9.0-9.5。

复性缓冲液中，氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、β-巯基乙醇的存在可以加速重组人胰岛素原融合蛋白链内二硫键的交换，形成正确结构的重组人胰岛素原融合蛋白；EDTA可以防止可能存在的胰酶活性对正确折叠的重组人胰岛素原融合蛋白造成不必要的酶切，进而活性丧失；非重组人胰岛素原融合蛋白的存在可以降低重组人胰岛素原融合蛋白间相互碰撞的几率，降低沉淀产生。

以上所述重组人胰岛素原融合蛋白与天然人胰岛素原相同或不同，包括完整的人胰岛素的A链和B链，其N端加入一段序列，是本领域技术人员常用的分子生物学技术设计的融合蛋白，构成本发明的重组人胰岛素原融合蛋白，该段序列的存在可增加复性时，重组人胰岛素原融合蛋白的可溶性，使其不易聚集产生沉淀。

最后优化的复性蛋白溶液的蛋白浓度为5-10mg/ml。

本发明所述的蛋白复性方法，所涉及的各种试剂可以通过多种商业途径得到，且处理方法简单。

本发明的重组人胰岛素原融合蛋白复性方法具有如下有益的技术效果：本发明针对一种重组人胰岛素原融合蛋白，提供一种简便高效的复性方法，复性浓度由现有技术中的0.3～2mg/mL提高至5～10mg/mL，提高复性率至80％-90％，后续工艺经简单纯化即可。本发明在整个工艺中所采用的试剂可以通过多种商业途径得到，且各步骤操作简单，快速高效，所有操作过程在室温或4℃环境下进行，大大降低生产成本，适合工业化大规模重组人胰岛素的生产。

附图说明

图1：复性过程流程图；

图2：经变性还原后的重组人胰岛素原融合蛋白HPLC检测结果；

图3：经复性后可溶且具有天然结构的重组人胰岛素原融合蛋白HPLC检测结果。

具体实施方式

以下优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例已对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

实施例1

重组人胰岛素原融合蛋白的制备

步骤1：收集重组人胰岛素原融合蛋白包涵体

经大肠杆菌发酵菌体，用纯化水水洗两次，定重，每10g菌体加100mL纯化水，混匀，于均质机中900-950bar条件下破碎，菌体完全破碎后，用离心机12 000g进行离心10分钟，收集沉淀，得到的沉淀主要是包涵体，按下面方法洗涤两次，除去大部分非重组人胰岛素原融合蛋白：每10g沉淀用100mL洗涤缓冲液，含50mM Tris-HCl(pH9.0)、2mMEDTA，1％Triton-X100(质量比)、3M尿素。室温下搅拌混匀，静置30min，12 000g离心10分钟，如此两次，收集沉淀。

步骤2：重组人胰岛素原融合蛋白的溶解、还原

洗涤后的包涵体，用如下溶液溶解变性：终浓度为50mM的Tris-HCl、终浓度为2mM的EDTA、终浓度为8M的尿素，调pH9.0-9.5。包涵体全溶后，室温静止10min，加入终浓度为10mM的DTT，混匀，室温静置1小时。

步骤3：重组人胰岛素原融合蛋白的复性

将配好的复性缓冲液缓慢并轻微搅拌加至步骤2的还原液中，使各组分浓度为：终浓度0.8M的尿素、终浓度1mM的氧化型谷胱甘肽、终浓度1mM的还原型谷胱甘肽、终浓度终浓度2mM的EDTA、终浓度2mM的β-巯基乙醇、重组人胰岛素原融合蛋白浓度为5mg/mL、调pH9.0-9.5。于4℃放置，可过夜。可观察复性液中，溶液始终保持透明状，无沉淀产生。

实施例2

重组人胰岛素原融合蛋白的制备

经变性还原后的重组人胰岛素原融合蛋白，于复性缓冲液中，使蛋白浓度达到7.5mg/mL,其他各组分浓度为：终浓度0.8M的尿素、终浓度1mM的氧化型谷胱甘肽、终浓度1mM的还原型谷胱甘肽、终浓度2mM的EDTA、终浓度2mM的β-巯基乙醇，调pH9.0-9.5，于4℃放置。可观察复性液中，溶液始终保持透明状，无沉淀产生。其他操作同实施例1。经计算得重组人胰岛素原融合蛋白复性率为85.34％。

实施例3

重组人胰岛素原融合蛋白的制备

经变性还原后的重组人胰岛素原融合蛋白，于复性缓冲液中，使蛋白浓度达到10mg/mL,其他各组分浓度为：终浓度0.8M的尿素、终浓度5mM的氧化型谷胱甘肽、终浓度1mM的还原型谷胱甘肽、终浓度2mM的EDTA、终浓度3mM的β-巯基乙醇，调pH9.0-9.5，于4℃放置。可观察复性液中，溶液始终保持透明状，无沉淀产生。其他操作同实施例1。经计算得重组人胰岛素原融合蛋白复性率为82.59％。

实施例4

重组人胰岛素原融合蛋白的RP-HPLC检测

实施例1的重组人胰岛素原融合蛋白变性样品和复性样品，分别按中国药典(2015版)的方法进行RP-HPLC检测，见图2、图3。

图2为重组人胰岛素原融合蛋白包涵体经变性还原后样品的RP-HPLC图谱，其保留时间在24.25分钟附近，峰面积为7557461，百分比为42.05％；

图3为重组人胰岛素原融合蛋白复性后样品的RP-HPLC图谱，其保留时间在22.49分钟附近，峰面积为3109782，百分比为44.23％

实施例5

实施例1的重组人胰岛素原融合蛋白还原样品总蛋白定量为29131g，RP-HPLC中24.25分钟处峰面积百分比为42.05％；重组人胰岛素原融合蛋白复性样品总蛋白定量为24890g，RP-HPLC中22.49分钟处峰面积百分比为44.23％，经计算得重组人胰岛素原融合蛋白复性率为:24890×44.23％/29131×42.05％＝89.87％。

使用常规复性方法进行复性，收集包涵体后，使用洗涤液(100mM Tris、2M脲、质量比1％曲拉通)洗涤包涵体两次后，再用100mM Tris盐溶液洗涤一次，溶解于含有20mMDTT pH8.0的8M脲溶液中，使重组人胰岛素原融合蛋白浓度在20-40mg/mL，搅拌溶解两小时后离心，上清加入10倍体积的含有3-5mM胱氨酸、0.3-0.6mM半胱氨酸、pH10.5的溶液，重组人胰岛素原融合蛋白为0.3～2mg/ml，于4℃进行复性，复性时间大于48小时，复性率约60％。

因此可以看出使用本发明的重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法，复性率显著高于常规方法复性率。

Claims (9)

1.一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将表达重组人胰岛素原融合蛋白的大肠杆菌进行破碎，收集包涵体；

2)使用包涵体洗涤液对于包涵体进行洗涤，所述包涵体洗涤液是含有终浓度10-100mM Tris-HCl、1-10mM EDTA、质量比1-5％Triton-X100、1-5M尿素的溶液，该包涵体洗涤液的pH为8.5-9.5；

3)去除洗涤液后，在包涵体里加入变性剂，所述包涵体变性剂是含有终浓度10-100mM的Tris-HCl、终浓度1-10mM的EDTA、终浓度5-10M的尿素的溶液，该包涵体变性剂的pH为8-9.5；

4)加入还原剂，所述还原剂为巯基还原剂，使用终浓度为5-20mM，获得还原蛋白溶液；

5)是将配好的复性缓冲液缓慢加入4)中的还原蛋白溶液中，轻微搅拌，进行重组人胰岛素原融合蛋白的复性，所述复性缓冲液的各组分终浓度分别为0.50-1.50M的尿素、1-10mM的氧化型谷胱甘肽、1-5mM的还原型谷胱甘肽、1-5mM的EDTA、终浓度1-5mM的β-巯基乙醇，调pH8-9.5，得到优化的复性蛋白溶液。

2.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤1)中所述的破碎为超声破碎、高压菌体破碎或均质机破碎。

3.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤2)所述包涵体洗涤液为含有终浓度50mM Tris-HCl、2mM EDTA、质量比1％Triton-X100、3M尿素的溶液，该包涵体洗涤液的pH为9.0-9.5。

4.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤2)所述的洗涤为多次洗涤，优选为2-5次洗涤。

5.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤3)所述的包涵体变性剂为含有终浓度50mM的Tris-HCl、终浓度2mM的EDTA、终浓度为8M的尿素的溶液，该包涵体变性剂的pH为9.0-9.5。

6.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤4)所述的巯基还原剂为二硫苏糖醇，使用终浓度为10mM。

7.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤4)所述的还原蛋白溶液的蛋白浓度为50-100mg/ml。

8.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤5)所述的复性缓冲液的各组分终浓度分别为0.80M尿素、1mM的氧化型谷胱甘肽、1M的还原型谷胱甘肽、2mM的EDTA、终浓度2mM的β-巯基乙醇，调pH为9.0-9.5。

9.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤5)所述的优化的复性蛋白溶液的蛋白浓度为5-10mg/ml。