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CN105717209A - 辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取及其含量的定量检测方法 - Google Patents

辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取及其含量的定量检测方法 Download PDF

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CN105717209A
CN105717209A CN201610064004.5A CN201610064004A CN105717209A CN 105717209 A CN105717209 A CN 105717209A CN 201610064004 A CN201610064004 A CN 201610064004A CN 105717209 A CN105717209 A CN 105717209A
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carotenoid
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pepper
saponification
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郁继华
吕剑
李静
李�杰
王小龙
胡玉琴
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Gansu Agricultural University
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Abstract

本发明提供辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取方法，步骤如下：（1）在新鲜辣椒叶片中加入液氮充分研磨至粉末状；（2）皂化：在辣椒叶片中加入质量浓度为15?30%的KOH?甲醇皂化液，于40?80℃皂化20?60min；（3）提取：在步骤（2）制备的皂化的辣椒叶片中加入丙酮?乙酸乙酯的混合提取溶剂进行超声提取，得到类胡萝卜素粗提液；（4）将步骤（3）得到的类胡萝卜素粗提液进行后处理，得到含有类胡萝卜素的溶液。本发明还提供类胡萝卜组分的高效液相色谱检测方法，能够将辣椒叶片中10种类胡萝卜素很好的分离，并且能够同时定量测定10种类胡萝卜素的含量。

Description

辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取及其含量的定量检测方法
技术领域
本发明涉及辣椒叶片中十种类胡萝卜素组分的提取及其反相高效液相色谱含量的定量检测方法。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum. L.)，茄科辣椒属一年生草本植物，我国在四百多年前就有栽培记录，目前栽培品种多达几十种，在全国范围内均有种植，也是北方地区冬春季节设施栽培的主要蔬菜品种，北方地区冬春季节设施栽培主要受到低温弱光的影响，进而影响辣椒产量以及品质，筛选出耐弱光性及耐低温弱光性强的辣椒品种能从根本上解决问题。
类胡萝卜素是广泛存在于自然界中的一类天然色素，结构和功能多种多样，类胡萝卜素特殊的结构赋予了它们十分特殊的性质，这些性质决定了它复杂的生物学功能。类胡萝卜素可以抑癌防衰，增强免疫；研究还表明，类胡萝卜素除了是植物进行光合作用的重要辅助色素外，还有保护光合机构免遭光破坏和抗氧化等功能。颉建明等研究表明，辣椒叶片中总类胡萝卜素的含量与品种耐弱光性及耐低温弱光性具有良好的相关关系，但是决定辣椒品种耐性的主要类胡萝卜素组分尚不明确。
八氢番茄红素(Phytoene)、番茄红素(Lycopene)、α-胡萝卜素(α-carotene)、叶黄素(Lutein) 、环氧叶黄素(Lutein epoxide)、β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(Zeaxanthin)、单环氧玉米黄素(Antheraxanthin)、新黄质(Neoxanthin)、紫黄质(Violaxanthin)等是植物体内重要的光合色素，探明决定辣椒品种耐弱光性及耐低温弱光性的主要类胡萝卜素组分，既可通过分子生物学和基因工程，从分子水平上阐明辣椒品种的耐性机理，又可为筛选耐低温弱光性品种和种质资源提供依据，对今后辣椒育种具有重大的指导意义。
现有技术中，以石油醚为提取溶剂、皂化温度为80℃、皂化时间为40min、皂化液质量浓度为20%、皂化液体积为10mL、料液比为1：5，能够分离辣椒叶片中叶黄素、玉米黄素和β-胡萝卜素；现有技术中还建立了以10mL80%丙酮为提取溶剂，以6mL 200g/L的KOH-甲醇溶液为皂化液，50℃皂化30min为皂化条件的提取工艺；以C18( 250mm×4.6 mm,5μm) 色谱柱，流动相为A乙腈，B乙酸乙酯，C水，波长440nm，流速1mL/min，柱温35℃为色谱检测条件的高效液相色谱检测方法；但是这些关键技术不能用于多种类胡萝卜组份的同时分离，也不利于分离后的检测。现有技术中能够建立同时分离多种类胡萝卜素组分及其含量测定方法的报道较少。现有技术中提供了小麦中类胡萝卜素含量的超高效液相色谱测定方法，该方法能够将小麦中的叶黄素与玉米黄质彻底分开，但是该方法仅限于对叶黄素、玉米黄质、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素，4种类胡萝卜素含量的提取与测定；现有技术中还提供一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，利用了超高效液相色谱法同时对草莓果实中叶黄素、β- 胡萝卜素、β-隐黄质以及番茄红素4种类胡萝卜素含量测定，但是局限性强。目前利用反相高效液相色谱法测定类胡萝卜素的研究还很少，现有的研究中没有一种方法适用于所有的试材，而辣椒叶片中多种类胡萝卜素组分分离及其含量测定方法目前文献报道尚未见到，更没有统一的行业测定标准。因此，建立一种能够同时分离辣椒叶片中多种类胡萝卜素，以及类胡萝卜素多种组分含量进行测定，从而为辣椒品种耐性的研究提供一种检测方法，具有重要意义。
发明内容
本发明提供了辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取及其含量的定量检测方法，能够对辣椒叶片中十种类胡萝卜素同时进行提取，应用反相高效液相色谱法能够将辣椒叶片中十种类胡萝卜素组分很好的分离及含量定量测定。
本发明提供辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取方法，步骤如下：
（1）液氮研磨：在新鲜辣椒叶片中加入液氮充分研磨至粉末状；作为优选，在研磨前还加入抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚；
（2）将辣椒叶片皂化：在步骤（1）加入质量浓度为15-30%的KOH-甲醇皂化液，于40-80℃皂化20-60min；作为优选，所述KOH-甲醇皂化液的质量浓度为20%；
（3）提取：在步骤（2）制备的皂化的辣椒叶片中加入丙酮-乙酸乙酯的混合提取溶剂进行超声提取，得到类胡萝卜素粗提液；所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:(2-8)ml；所述混合提取溶剂中丙酮与乙酸乙酯的体积比为1:2；
（4）将步骤（3）得到的类胡萝卜素粗提液进行后处理，得到含有类胡萝卜素的溶液。
作为优选，步骤（2）中所述辣椒叶片与KOH-甲醇溶液的用量比值为1g：（2-6）ml。
作为进一步优选，所述辣椒叶片与KOH-甲醇溶液的用量比值优选为1g：4ml。
作为优选，步骤（2）中所述皂化条件为：55℃皂化30min。
作为优选，步骤（3）中所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:8ml。
作为优选，步骤（3）中所述超声提取的时间为10-50min，超声温度为30℃。
作为优选，所述超声提取的时间为40min。
作为优选，步骤（4）中所述后处理为将类胡萝卜素粗提液4℃下离心15min，取上清液，将上清液45℃旋转蒸发浓缩至近干。
上述各优选条件均是为了得到辣椒叶片中类胡萝卜素提取的最优条件，利于进一步提高纯度和提取率。
本发明还提供辣椒叶片中类胡萝卜素含量的定量检测方法，步骤如下：
（1）应用权利要求1-7任一所述的方法提取辣椒叶片中类胡萝卜素；
（2）用丙酮将得到的含有类胡萝卜素的溶液定容至10mL，过0.22μm有机滤膜，得到辣椒叶片类胡萝卜素待测样品；所述丙酮为色谱纯；
（3）依据下述色谱条件对待测样品进行高效液相色谱测试：色谱柱为Welch Ultimate C30高效液相色谱柱，规格为250mm×4.6mm，填料直径为5μm；流动相的柱流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为450nm；
流动相组分为：A：乙腈，B：水，C：甲基叔丁基醚和甲醇的混合液，其中，甲基叔丁基醚与甲醇体积比为1:1，D：乙酸乙酯；
流动相梯度洗脱程序为：0min～6min：B由0线性增加到10%，C保持0，D由0线性增加到10%；6min～12min：B由10%线性增加到15%，C保持0，D由10%线性增加到20%；12min～20min：B由15%线性递减到0，C保持0，D由20%线性递减到10%；20min～22min：B由0线性增加到5%，C由0线性增加到40%，D由 10%线性递减到5%；22min～30min：B由5%线性递减到0，C由40%线性增加到50%，D由5%线性增加到20%；30min～35min：A线性增加到100%；
（4）根据各单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间，确定辣椒叶片类胡萝卜素待测样品中10种类胡萝卜素的保留时间，进一步确定各种类胡萝卜素组分的峰面积，将各种类胡萝卜素组分的峰面积分别代入相应的线性回归方程中，得到辣椒叶片中相应组分的类胡萝卜素的含量。
作为优选，所述单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间分别为：八氢番茄红素保留时间33.168min、番茄红素保留时间29.231min、α-胡萝卜素保留时间34.971min、叶黄素保留时间19.183min、环氧叶黄素保留时间25.026min、β-胡萝卜素保留时间36.067min、玉米黄素保留时间20.398min、单环氧玉米黄素保留时间17.950min、新黄质保留时间9.189min、紫黄质保留时10.473min。
作为优选，所述各种类胡萝卜素组分的线性回归方程的获取方法为：
（1）制备系列浓度的类胡萝卜素标准样品；
（2）按照权利要求8中步骤（3）所示色谱条件进行高效液相色谱测试；
（3）根据各单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间，确定系列浓度类胡萝卜素标准样品中类胡萝卜素各组分的保留时间，以各组分不同浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，分别绘制类胡萝卜素各组分的线性回归方程。
本发明的有益效果为：
（1）本发明的提取方法能够将辣椒叶片中10种类胡萝卜素很好的分离，应用本发明的反相液相色谱检测方法能够同时定量测定10种类胡萝卜素的含量。
（2）本发明的方法科学可行，八氢番茄红素、番茄红素、α-胡萝卜素、叶黄素、环氧叶黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素、单环氧玉米黄素、新黄质、紫黄质10种类胡萝卜素的含量与色谱检测响应峰面积线性关系良好，10种类胡萝卜素被彻底分开，且每种物质峰与峰之间分离间隔较大，方便了鉴别样品中的类胡萝卜素组分。
（3）本发明通过高效液相色谱仪确定了十种类胡萝卜素测定的条件，八氢番茄红素保留时间33.168min、番茄红素保留时间29.231min、α-胡萝卜素保留时间34.971min、叶黄素保留时间19.183min、环氧叶黄素保留时间25.026min、β-胡萝卜素保留时间36.067min、玉米黄素保留时间20.398min、单环氧玉米黄素保留时间17.950min、新黄质保留时间9.189min、紫黄质保留时10.473min。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为标准样品中类胡萝卜素各组分的色谱图；其中，1-新黄质，2-紫黄质，3-单环氧玉米黄素，4-叶黄素，5-玉米黄素，6-环氧叶黄素，7-番茄红素，8-八氢番茄红素，9-α-胡萝卜素，10-β-胡萝卜素；
图2为辣椒叶片中类胡萝卜素各组分的色谱图；其中，1-新黄质，2-紫黄质，3-单环氧玉米黄素，4-叶黄素，5-玉米黄素，6-环氧叶黄素，7-番茄红素，8-八氢番茄红素，9-α-胡萝卜素，10-β-胡萝卜素；
图3a为标准样品中八氢番茄红素的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3b为标准样品中番茄红素的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3c为标准样品中α-胡萝卜素的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3d为标准样品中叶黄素的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3e为标准样品中环氧叶黄素的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3f为标准样品中β-胡萝卜素的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3g为标准样品中玉米黄素的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3h为标准样品中单环氧玉米黄素的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3i为标准样品中新黄质的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）；
图3j为标准样品中紫黄质的标准曲线，其中，横坐标为质量（μg），纵坐标为峰面积（×10-4）。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明所用试剂：
分析纯：乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氢氧化钾、2,6-二叔丁基对甲酚、甲基叔丁基醚；色谱纯：甲醇，乙腈，乙酯乙腈。
下述实施例中所用：
新黄质Neoxanthin、紫黄质Violaxanthin、玉米黄素Zeaxanthin、叶黄素Lutein、β-胡萝卜素β-Carotene购自美国ChromaDex公司；八氢番茄红素Phytoene、番茄红素（Lycopene）、单环氧玉米黄质（Antheraxanthin）、环氧叶黄素（Lutein epoxide）购自瑞士CaroteNature；α-胡萝卜素（α-Carotene）购自日本Wako公司；纯度均在95%以上。
辣椒叶片中类胡萝卜素的提取方法具体如下：
1）冰浴研磨，称取2.000g分装好的辣椒叶片试样，加入0.010g石英砂和0.1000g抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，研钵中加入液氮快速研磨，充分研磨得到辣椒叶片粉末；
2）皂化：将步骤1）冰浴研磨后的辣椒叶片粉末放置于50mL避光棕色试剂瓶中，加入4-12mL质量浓度为15-30%的KOH-甲醇皂化液，密封后置于40-80℃恒温水浴20-60min，然后立即用冷水冷却至室温；
3）提取：将步骤2）所得皂化后的辣椒叶片中加入16ml（料液比为1:2-8）丙酮-乙酸乙酯（V：V=1：2）的混合提取溶剂，超声提取10-50min，超声温度是30℃；
4）离心：将步骤3）所得粗提取液在低温高速离心机上4℃，8000r/min离心15min；
5）旋转蒸发：将步骤4）所得上清液在旋转蒸发仪上45℃±2℃旋转蒸发至近干，即可得到含有类胡萝卜素的溶液。
经试验，应用上述方法能够很好的分离辣椒叶片中的类胡萝卜素，10种类胡萝卜素被彻底分开，每种物质峰与峰之间分离间隔均较大。
实施例1
辣椒叶片中类胡萝卜素的提取方法具体如下：
1）冰浴研磨，称取2.000g分装好的辣椒叶片试样，加入0.010g石英砂和0.1000g抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，研钵中加入液氮快速研磨，充分研磨得到辣椒叶片粉末；
2）皂化：将步骤1）冰浴研磨后的辣椒叶片粉末放置于50mL避光棕色试剂瓶中，加入8mL质量浓度为20%的KOH-甲醇皂化液，密封后置于55℃恒温水浴30min，然后立即用冷水冷却至室温；
3）提取：将步骤2）所得皂化后的辣椒叶片中加入16ml（料液比为1:8）丙酮-乙酸乙酯（V：V=1：2）的混合提取溶剂，超声提取40min，超声温度是30℃；
4）离心：将步骤3）所得粗提取液在低温高速离心机上4℃，8000r/min离心15min；
5）旋转蒸发：将步骤4）所得上清液在旋转蒸发仪上45℃旋转蒸发至近干，即可得到含有类胡萝卜素的溶液。
实施例2
辣椒叶片中类胡萝卜素的提取方法具体如下：
1）冰浴研磨，称取2.000g分装好的辣椒叶片试样，加入0.010g石英砂和0.1000g抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，研钵中加入液氮快速研磨，充分研磨得到辣椒叶片粉末；
2）皂化：将步骤1）冰浴研磨后的辣椒叶片粉末放置于50mL避光棕色试剂瓶中，加入12mL质量浓度为15%的KOH-甲醇皂化液，密封后置于80℃恒温水浴20min，然后立即用冷水冷却至室温；
3）提取：将步骤2）所得皂化后的辣椒叶片中加入4ml（料液比为1:2）丙酮-乙酸乙酯（V：V=1：2）的混合提取溶剂，超声提取10min，超声温度是30℃；
4）离心：将步骤3）所得粗提取液在低温高速离心机上4℃，8000r/min离心15min；
5）旋转蒸发：将步骤4）所得上清液在旋转蒸发仪上43℃旋转蒸发至近干，即可得到含有类胡萝卜素的溶液。
实施例3
辣椒叶片中类胡萝卜素的提取方法具体如下：
1）冰浴研磨，称取2.000g分装好的辣椒叶片试样，加入0.010g石英砂和0.1000g抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，研钵中加入液氮快速研磨，充分研磨得到辣椒叶片粉末；
2）皂化：将步骤1）冰浴研磨后的辣椒叶片粉末放置于50mL避光棕色试剂瓶中，加入4mL质量浓度为30%的KOH-甲醇皂化液，密封后置于40℃恒温水浴60min，然后立即用冷水冷却至室温；
3）提取：将步骤2）所得皂化后的辣椒叶片中加入12ml（料液比为1:6）丙酮-乙酸乙酯（V：V=1：2）的混合提取溶剂，超声提取50min，超声温度是30℃；
4）离心：将步骤3）所得粗提取液在低温高速离心机上4℃，8000r/min离心15min；
5）旋转蒸发：将步骤4）所得上清液在旋转蒸发仪上47℃旋转蒸发至近干，即可得到含有类胡萝卜素的溶液。
实施例4
辣椒叶片中类胡萝卜素的提取方法具体如下：
1）冰浴研磨，称取2.000g分装好的辣椒叶片试样，加入0.010g石英砂和0.1000g抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，研钵中加入液氮快速研磨，充分研磨得到辣椒叶片粉末；
2）皂化：将步骤1）冰浴研磨后的辣椒叶片粉末放置于50mL避光棕色试剂瓶中，加入6mL质量浓度为25%的KOH-甲醇皂化液，密封后置于50℃恒温水浴50min，然后立即用冷水冷却至室温；
3）提取：将步骤2）所得皂化后的辣椒叶片中加入8ml（料液比为1:4）丙酮-乙酸乙酯（V：V=1：2）的混合提取溶剂，超声提取20min，超声温度是30℃；
4）离心：将步骤3）所得粗提取液在低温高速离心机上4℃，8000r/min离心15min；
5）旋转蒸发：将步骤4）所得上清液在旋转蒸发仪上44℃旋转蒸发至近干，即可得到含有类胡萝卜素的溶液。
实施例5
辣椒叶片中类胡萝卜素的提取方法具体如下：
1）冰浴研磨，称取2.000g分装好的辣椒叶片试样，加入0.010g石英砂和0.1000g抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，研钵中加入液氮快速研磨，充分研磨得到辣椒叶片粉末；
2）皂化：将步骤1）冰浴研磨后的辣椒叶片粉末放置于50mL避光棕色试剂瓶中，加入10mL质量浓度为18%的KOH-甲醇皂化液，密封后置于70℃恒温水浴30min，然后立即用冷水冷却至室温；
3）提取：将步骤2）所得皂化后的辣椒叶片中加入10ml（料液比为1:5）丙酮-乙酸乙酯（V：V=1：2）的混合提取溶剂，超声提取35min，超声温度是30℃；
4）离心：将步骤3）所得粗提取液在低温高速离心机上4℃，8000r/min离心15min；
5）旋转蒸发：将步骤4）所得上清液在旋转蒸发仪上46℃旋转蒸发至近干，即可得到含有类胡萝卜素的溶液。
实施例6 10种类胡萝卜素标准曲线的绘制
a)单个标准品溶液的配制：
分别精确称取八氢番茄红素、番茄红素、α-胡萝卜素、叶黄素、环氧叶黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素、单环氧玉米黄素、新黄质、紫黄质标准品1mg用色谱纯有机溶剂溶解并定容于25mL棕色容量瓶中，作为单个标准品储备液保存，浓度均为40μg/mL。
并分别取0.2μL混匀，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，作为混合标准品储存液，保存于-20℃冰箱待用。
b)系列浓度类胡萝卜素标准样品的配制
将步骤b）制备的10种类胡萝卜素的标准品溶液，在色谱纯有机溶剂，中混合配制成一系列浓度的类胡萝卜素标准样品，配制过程中应避免光照和高温，然后按如下色谱条件进行高效液相色谱测试。
c)依据如下色谱条件对步骤a）的单个标准品溶液和步骤b）的系列浓度类胡萝卜素标准样品进行高效液相色谱 (HPLC) 测试：高效液相色谱的仪器型号为Waters 2695，检测器为Waters2487紫外检测器，检测波长为450nm；色谱柱为Welch Ultimate C30高效液相色谱柱，规格为250mm×4.6mm，填料直径为5μm ，流动相的柱流速1.0mL/min，高效液相色谱柱的柱温30℃；样品室温度25℃，进样量20μL。
流动相：流动相组分A为乙腈，B为水，C为甲基叔丁基醚和甲醇的混合液，其中，甲基叔丁基醚：甲醇(V:V=1:1)，D为乙酸乙酯。
流动相梯度洗脱程序如表1所示。
表1 流动相梯度洗脱
表1中：0min～6min：B由0线性增加到10%，C保持0，D由0线性增加到10%；6min～12min：B由10%线性增加到15%，C保持0，D由10%线性增加到20%；12min～20min：B由15%线性递减到0，C保持0，D由20%线性递减到10%；20min～22min：B由0线性增加到5%，C由0线性增加到40%，D由 10%线性递减到5%；22min～30min：B由5%线性递减到0，C由40%线性增加到50%，D由5%线性增加到20%；30min～35min：A线性增加到100%。
e）分别记录各单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间（如图1所示，八氢番茄红素保留时间33.168min、番茄红素保留时间29.231min、α-胡萝卜素保留时间34.971min、叶黄素保留时间19.183min、环氧叶黄素保留时间25.026min、β-胡萝卜素保留时间36.067min、玉米黄素保留时间20.398min、单环氧玉米黄素保留时间17.950min、新黄质保留时间9.189min、紫黄质保留时10.473min），并根据该保留时间确定系列浓度类胡萝卜素标准样品中相应的各组分，然后测定每个浓度下八氢番茄红素、番茄红素、α-胡萝卜素、叶黄素、环氧叶黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素、单环氧玉米黄素、新黄质、紫黄质对应的峰面积；并以各组分不同浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，分别绘制类胡萝卜素各组分的线性回归方程。结果参见图3和表2。
表2 类胡萝卜素各组分的回归方程、线性范围及相关系数
x-质量(x，µg)；y-峰面积(×10-4)。
实施例7 辣椒中类胡萝卜素含量的测定方法
本领域技术人员知晓，辣椒中类胡萝卜素含量的测定方法与辣椒的品种无关，为了详细介绍本发明的方法，该实施例以陇椒5号辣椒为例进行说明。
一、辣椒叶片的采集：试验于2013年11月在甘肃农业大学园艺学院试验基地进行，供试辣椒为日光温室耐低温弱光品种：陇椒5号，育苗基质由甘肃农业大学园艺学院提供，基质的体积配比为：牛粪:玉米秸秆:草炭:蛭石=5:1:2:2，挑选颜色、粒型、大小均匀一致的辣椒种子，55℃温汤浸种30min，搅拌至室温，放在人工气候箱内催芽，露白时播种在50穴穴盘中，常规管理，待辣椒幼苗长至7-8片真叶时，采取第3-4片功能叶，每份鲜叶2.000g，用液氮快速冻干，保存于-80℃待用；
二、辣椒叶片中类胡萝卜素的提取：应用本发明的方法均能很好的将其提取，此处，采用实施例1中的方法进行提取；
三、辣椒叶片类胡萝卜素待测样品的制备：用色谱纯丙酮将得到的含有类胡萝卜素的溶液定容至10mL，过0.22μm有机滤膜，盛装在2ml棕色色谱进样瓶中，保存在-20℃待用，即得辣椒叶片类胡萝卜素待测样品。
四、以实施例6步骤c）的方法对辣椒叶片类胡萝卜素待测样品进行高效色谱测试。
五、根据各单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间，确定辣椒叶片类胡萝卜素待测样品中的10种类胡萝卜素的保留时间（如图2所示），进一步确定各种类胡萝卜素的峰面积，将各种类胡萝卜素的峰面积分别代入相应的线性回归方程中，得到辣椒叶片中相应组分类胡萝卜素的含量。
用本发明的方法，对辣椒叶片中10种类胡萝卜素的实际含量进行测定，取5份称好的样品，测定5份样品中10种类胡萝卜素平均含量，即样品中10种类胡萝卜素的实际含量。结果如表3所示。
表3 本实施例所测辣椒叶片中十种类胡萝卜素含量
实施例8 本发明方法的精密度检验
用本发明的反相高效液相色谱检测方法对样品进行测定，相同条件下对类胡萝卜素提取液进行5次重复测定，试验结果如表4，由表4可知，新黄质、紫黄质、单环氧玉米黄质、玉米黄素、环氧叶黄素、叶黄素、番茄红素、八氢番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素10种类胡萝卜素的响应时间波动在0.1min以内，响应时间的标准偏差分别为0.074、0.074、0.080、0.050、0.087、0.035、0.034、0.055、0.030、0.007，表明本发明方法的精密度非常好，可用于辣椒叶片中10种类胡萝卜素的检测。
表4 HPLC检测辣椒叶片中类胡萝卜素的精密度检验结果
实施例9 本发明方法的回收率测定
取4份样品，1份为对照，不加入标准品，其他3份分别加入低、中、高浓度的标准品，用本发明的方法进行色谱检测，每份进样5次，回收率是加标样品的含量减去不加标样品的含量再除以加入的标准样品的量来得到的，试验结果如表5所示，分别加入低含量、中含量、高含量的标准品，计算得到的样品回收率均在80%以上，并且样品中10种类胡萝卜素重复测定结果的标准偏差分别为：八氢番茄红素1.21%，番茄红素0.97%，α-胡萝卜素0.58%，叶黄素1.20%，环氧叶黄素1.87%，β-胡萝卜素1.72%，玉米黄素1.35%，单环氧玉米黄素1.99%，新黄质1.02%，紫黄质1.81%。
表5 应用HPLC检测方法辣椒叶片中类胡萝卜素的回收率检验结果
检测结果重现性检验：取5份称好的样品，按照本发明建立的反相高效液相色谱检测方法对辣椒叶片中类胡萝卜素进行测定，对本发明检测方法的重现性进行检验，试验结果表明，辣椒叶片中新黄质、紫黄质、玉米黄素、叶黄素、β-胡萝卜素、环氧叶黄素、单环氧玉米黄素、番茄红素、八氢番茄红素、α-胡萝卜素10种类胡萝卜素测定结果标准偏差均在2%范围内，符合色谱检测方法的要求。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.辣椒叶片中类胡萝卜素组分的提取方法，其特征在于：步骤如下：
（1）液氮研磨：在新鲜辣椒叶片中加入液氮充分研磨至粉末状；作为优选，在研磨前还加入抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚；
（2）皂化：在（1）中加入质量浓度为15-30%的KOH-甲醇皂化液，于40-80℃皂化20-60min；作为优选，所述KOH-甲醇皂化液的质量浓度为20%；
（3）提取：在步骤（2）制备的皂化的辣椒叶片中加入丙酮-乙酸乙酯的混合提取溶剂进行超声提取，得到类胡萝卜素粗提液；所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:(2-8)ml；所述混合提取溶剂中丙酮与乙酸乙酯的体积比为1:2；
（4）将步骤（3）得到的类胡萝卜素粗提液进行后处理，得到含有类胡萝卜素的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述辣椒叶片与KOH-甲醇溶液的用量比值为1g：（2-6）ml；
作为优选，所述辣椒叶片与KOH-甲醇溶液的用量比值为1g：4ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述皂化条件为：55℃皂化30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述辣椒叶片与混合提取溶剂的比值为1g:8ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述超声提取的时间为10-50min，超声温度为30℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述超声提取的时间为40min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述后处理为将类胡萝卜素粗提液4℃下离心15min，取上清液，将上清液45℃旋转蒸发浓缩至近干。
8.辣椒叶片中类胡萝卜素含量的定量检测方法，其特征在于：步骤如下：
（1）应用权利要求1-7任一所述的方法提取辣椒叶片中类胡萝卜素；
（2）用丙酮将得到的含有类胡萝卜素的溶液定容至10mL，过0.22μm有机滤膜，得到辣椒叶片类胡萝卜素待测样品；所述丙酮为色谱纯；
（3）依据下述色谱条件对待测样品进行高效液相色谱测试：色谱柱为Welch Ultimate C30高效液相色谱柱，规格为250mm×4.6mm，填料直径为5μm；流动相的柱流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为450nm；
流动相组分为：A：乙腈，B：水，C：甲基叔丁基醚和甲醇的混合液，其中，甲基叔丁基醚与甲醇体积比为1:1，D：乙酸乙酯；
流动相梯度洗脱程序为：0min～6min：B由0线性增加到10%，C保持0，D由0线性增加到10%；6min～12min：B由10%线性增加到15%，C保持0，D由10%线性增加到20%；12min～20min：B由15%线性递减到0，C保持0，D由20%线性递减到10%；20min～22min：B由0线性增加到5%，C由0线性增加到40%，D由 10%线性递减到5%；22min～30min：B由5%线性递减到0，C由40%线性增加到50%，D由5%线性增加到20%；30min～35min：A线性增加到100%；
（4）根据各单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间，确定辣椒叶片类胡萝卜素待测样品中10种类胡萝卜素的保留时间，进一步确定各种类胡萝卜素组分的峰面积，将各种类胡萝卜素组分的峰面积分别代入相应的线性回归方程中，得到辣椒叶片中相应组分的类胡萝卜素的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间分别为：八氢番茄红素保留时间33.168min、番茄红素保留时间29.231min、α-胡萝卜素保留时间34.971min、叶黄素保留时间19.183min、环氧叶黄素保留时间25.026min、β-胡萝卜素保留时间36.067min、玉米黄素保留时间20.398min、单环氧玉米黄素保留时间17.950min、新黄质保留时间9.189min、紫黄质保留时10.473min。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述各种类胡萝卜素组分的线性回归方程的获取方法为：
（1）制备系列浓度的类胡萝卜素标准样品；
（2）按照权利要求8中步骤（3）所示色谱条件进行高效液相色谱测试；
（3）根据各单个标准品溶液中类胡萝卜素组分的保留时间，确定系列浓度类胡萝卜素标准样品中类胡萝卜素各组分的保留时间，以各组分不同浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，分别绘制类胡萝卜素各组分的线性回归方程。
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