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CN105683392A - 树突细胞应答基因表达、物质组合物及其使用方法 - Google Patents

树突细胞应答基因表达、物质组合物及其使用方法 Download PDF

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CN105683392A
CN105683392A CN201480025302.2A CN201480025302A CN105683392A CN 105683392 A CN105683392 A CN 105683392A CN 201480025302 A CN201480025302 A CN 201480025302A CN 105683392 A CN105683392 A CN 105683392A
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R·萨蒂加
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Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
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Abstract

本发明总体上涉及用于对调控、控制或以其他方式影响一种或多种树突细胞(DC)应答的调节网络进行鉴定的组合物和方法，该一种或多种树突细胞应答是例如树突细胞成熟、一种或多种树突细胞抗病毒应答和/或一种或多种树突细胞炎性应答，并且涉及用于对在多种治疗和/或诊断适应症中调控、控制或以其他方式影响一种或多种树突细胞应答的调节网络进行探索的组合物和方法。

Description

树突细胞应答基因表达、物质组合物及其使用方法
相关申请
本申请要求了2013年3月15日提交的美国临时申请号61/787,378的权益，将其通过引用以其全文结合在此。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的先锋拨款(PioneerGrant)DP1OD003958-01；美国国立卫生研究院授予的先锋拨款5DP1OD003893-03；美国国立卫生研究院授予的基因组学科学精英中心拨款(CentersofExcellenceinGenomicsScienceGrant)1P50HG006193-01；美国国家人类基因组研究所(NationalHumanGenomeResearchInstitute)授予的拨款1P01HG005062-01；和美国国立卫生研究院授予的拨款1F32HD075541-01下进行的。美国政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明总体上涉及用于对调控、控制或以其他方式影响一种或多种树突细胞(DC)应答(例如，树突细胞成熟、一种或多种树突细胞抗病毒应答和/或一种或多种树突细胞炎性应答)的调节网络进行鉴定的多种组合物和多种方法，以及用于对在多种治疗和/或诊断适应症中调控、控制或以其他方式影响一种或多种树突细胞应答的调节网络进行探索的多种组合物和多种方法。
发明背景
尽管其重要性，控制树突细胞应答(包括抗病毒应答，炎性应答，T细胞和B细胞的成熟、募集)的分子回路依然大部分未知或未细化。在树突细胞中重建调节网络的最近研究集中于跨细胞群的测量，这些测量可能未能跨整个群探测信号和/或可能不能区分仅在某些细胞亚群表达的一个或多个信号。因此，对于更好地理解调控、控制或以其他方式影响树突细胞应答的网络和用于在多种治疗和诊断方法中探索此网络的手段存在需要。
发明概述
本发明提供了用于调控一种或多种树突细胞应答的多种组合物和多种方法。如在此所使用，术语“调控”包括上调或以其他方式增加一种或多种基因的表达；下调或以其他方式降低一种或多种基因的表达；抑制或以其他方式降低一种或多种基因产物的表达、活性和/或功能；中和或以其他方式钝化一种或多种基因产物的表达、活性和/或功能；和/或增强或以其他方式增加一种或多种基因产物的表达、活性和/或功能。
如在此所使用，术语“调控树突细胞应答”包括调控多种树突细胞功能和/或活性中任一项，包括通过非限制性举例的方式，控制或以其他方式影响调节树突细胞突变的网络；控制或以其他方式影响调节树突细胞免疫应答的网络；控制或以其他方式影响调节树突细胞的抗病毒免疫应答的网络，例如，树突细胞的抗病毒免疫应答，包括核心抗病毒应答和/或二级抗病毒应答；控制或以其他方式影响调节树突细胞的炎性免疫应答(例如，诱导的炎性应答和/或尖峰炎性应答)的网络；控制或以其他方式影响调节树突细胞的Toll样受体(TLR)应答的网络；控制或以其他方式影响调节T细胞和B细胞募集的网络；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节一种或多种TH1细胞应答的DC促进；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节一种或多种TH2细胞应答的DC诱导；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节对D的下游的任何细胞的DC诱导、冲击或其他作用；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节T细胞(包括调节性T细胞(Treg)、Th17细胞、记忆T细胞以及其他T细胞)的DC诱导；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节DC表型的转变(例如，在成熟的和未成熟的表型之间和/或在DC的亚群之间)；操纵或以其他方式影响树突细胞的至少一种功能或生物活性；操纵或以其他方式影响树突细胞对病原体驱动T细胞极化作用的控制；和/或操纵或以其他方式影响细胞因子、趋化因子以及由DC分泌的其他分子的产生。
本发明提供了调控一种或多种树突细胞应答的多种调控剂。合适的调控剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
本发明提供了一系列的基因标签，包括“核心抗病毒(CoreAntiviral)”基因标签、“二级抗病毒(SecondaryAntiviral)”基因标签、“成熟”基因标签、“致炎(InducedInflammatory)”基因标签、和“尖峰炎性(SharpPeakedInflammatory)”基因标签。这些标签通过对跨单细胞的基因表达值进行聚簇来鉴别，例如，单细胞的一致性组。在一些实施例中，这些标签根据先前鉴定的标签显著细化并且改进。在一些实施例中，这些标签产生不存在于细胞群测量中或不能在其中可靠地检测到的信号。
在应答的树突细胞最早期中诱导“核心抗病毒”基因标签。在群体水平上“成熟”基因标签看起来类似于“致炎”基因标签，但是使用单细胞分析，确定“成熟”基因标签仅表达于细胞亚群。“成熟”基因标签负责允许树突细胞募集T细胞和B细胞，由此桥接先天性和获得性免疫系统之间的间隙。
这些基因是许多适应症的靶标，例如，在移植和其他治疗适应症中用于治疗和/或诊断免疫应答、用于监测免疫应答(例如，炎症)和/或用于疫苗开发。
在一些实施例中，该一种或多种标签基因是选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A(即，表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A)中列出的那些。
选择希望的靶基因或靶基因的组合，并且在确定树突细胞应答期间所选择的一种或多种靶基因是否过表达或低表达之后，取决于所希望的成熟和/或功能结果使用适合的拮抗剂或激动剂。合适的拮抗剂和/或激动剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
这些调控剂被用来调控一种或多种靶基因或一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达，这一种或多种靶基因已被鉴定为响应于树突细胞相关的干扰的基因。这些靶基因是例如通过使树突细胞与调控剂接触，并且监测对一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达的作用(如果有的话)来鉴定的。在一些实施例中，该一种或多种标签基因是选自在表1-5A中列出的那些。该调控剂可以直接作用于一种或多种靶基因或一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达，和/或该调控剂可以间接作用于一种或多种靶基因或一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达，该间接作用是通过调控已知与该一种或多种靶基因相关联的基因或基因产物的表达、活性和/或功能。
在一些实施例中，该靶基因是肿瘤坏死因子受体(TNFR)。在一些实施例中，该调控剂改变TNFR的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该调控剂改变与TNFR相关联的基因(如通过非限制性举例的方式，来自在表6中所示的那些中的基因)的表达、活性和/或功能。
在一些实施例中，该靶基因是一种包含Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域的衔接蛋白(TIRAP)。在一些实施例中，该调控剂改变TIRAP的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该调控剂改变与TIRAP相关联的基因(如通过非限制性举例的方式，来自在表7中所示的那些中的基因)的表达、活性和/或功能。
在一些实施例中，该靶基因是Stat1。在一些实施例中，该调控剂改变Stat1的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该调控剂改变与Stat1相关联的基因(如通过非限制性举例的方式，来自在表8中所示的那些中的基因)的表达、活性和/或功能。
在一些实施例中，该靶基因是干扰素产生调节物(IFNR)。在一些实施例中，该调控剂改变IFNR的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该调控剂改变与IFNR相关联的基因(如通过非限制性举例的方式，来自在表9中所示的那些中的基因)的表达、活性和/或功能。
在一些实施例中，该靶基因是来自以下在表10、表11或表12中所列的那些中的一种或多种基因。在一些实施例中，该调控剂改变该一种或多种靶基因的表达、活性和/或功能。
在一些实施例中，本发明提供了鉴定与树突细胞应答相关的基因或遗传因子的一种方法，该方法包括：a)使树突细胞与树突细胞应答的抑制物或增强树突细胞应答的药剂接触；和b)鉴定基因或遗传因子，该基因或遗传因子的表达由步骤(a)调控。在一些实施例中，该方法还包括c)扰动在步骤b)中在已经与树突细胞应答的抑制物或增强树突细胞应答的药剂接触的树突细胞中鉴定的基因或遗传因子的表达；和d)鉴定由步骤c)调控其表达的一种基因。在一些实施例中，该拮抗剂和/或激动剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。
在一些实施例中，本发明提供了调控一种或多种树突细胞应答的方法，该方法包括使树突细胞与如下的药剂接触，该药剂调控选自在表1或表1A中列出的那些中的一种或多种基因或一种或多种基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，本发明提供了调控一种或多种树突细胞应答的方法，该方法包括使树突细胞与如下的药剂接触，该药剂调控选自在表2或表2A中列出的那些中的一种或多种基因或一种或多种基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，本发明提供了调控一种或多种树突细胞应答的方法，该方法包括使树突细胞与如下的药剂接触，该药剂调控选自在表3或表3A中列出的那些中的一种或多种基因或一种或多种基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，本发明提供了调控一种或多种树突细胞应答的方法，该方法包括使树突细胞与如下的药剂接触，该药剂调控选自在表4或表4A中列出的那些中的一种或多种基因或一种或多种基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，本发明提供了调控一种或多种树突细胞应答的方法，该方法包括使树突细胞与如下的药剂接触，该药剂调控选自在表5或表5A中列出的那些中的一种或多种基因或一种或多种基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，该方法诊断受试者体内的免疫应答，包括检测选自表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并将检测到的水平与标签基因或基因产物表达、活性和/或功能的对照水平比较，其中该检测到的水平和该对照水平之间的差异表示该受试者体内免疫应答的存在。在一些实施例中，该免疫应答是自身免疫应答。在一些实施例中，该免疫应答是炎症应答，包括与自身免疫应答相关的一种或多种炎症应答和/或与传染性疾病或其他基于病原体的障碍相关的一种或多种炎症应答。
在一些实施例中，本发明提供了一种监测受试者体内免疫应答的方法，包括在第一时间点检测一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物(例如，选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因)的表达、活性和/或功能的水平，在第二时间点检测一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物(例如，选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因)的表达、活性和/或功能的水平，并且将该第一检测的表达、活性和/或功能的水平与该第二检测的表达、活性和/或功能的水平比较，其中在检测的该第一和第二水平之间的变化表示在该受试者体内免疫应答的变化。在一些实施例中，该免疫应答是自身免疫应答。在一些实施例中，该免疫应答是炎症应答。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，该方法诊断受试者体内的异常树突细胞应答，包括检测选自表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并将检测到的水平与标签基因或基因产物表达、活性和/或功能的对照水平比较，其中该检测到的水平和该对照水平之间的差异表示该受试者体内异常树突细胞应答的存在。在一些实施例中，该异常树突细胞应答是自身免疫应答。在一些实施例中，该异常树突细胞应答是炎性应答，包括与自身免疫应答相关的一种或多种炎性应答和/或与传染性疾病或其他基于病原体的障碍相关的一种或多种炎性应答。在一些实施例中，该异常树突细胞应答是该树突细胞募集T细胞和B细胞的能力改变。在一些实施例中，该异常树突细胞应答是不存在应答。在一些实施例中，该异常树突细胞应答是在树突细胞应答的减少。在一些实施例中，该异常树突细胞应答是在树突细胞应答的增强。
在一些实施例中，本发明提供了一种监测受试者体内异常树突细胞应答的方法，包括在第一时间点检测一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物(例如，选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因)的表达、活性和/或功能的水平，在第二时间点检测一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物(例如，选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因)的表达、活性和/或功能的水平，并且将该第一检测的表达、活性和/或功能的水平与该第二检测的表达、活性和/或功能的水平比较，其中在检测的该第一和第二水平之间的变化表示在该受试者体内树突细胞应答的变化。在一些实施例中，该树突细胞应答是自身免疫应答。在一些实施例中，该树突细胞应答是炎性应答。在一些实施例中，该树突细胞应答是该树突细胞募集T细胞和B细胞的能力。
用于在此提供的任何这些组合物和方法中使用的一种或多种合适的调控剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“核心抗病毒”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表1和1A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“一种或多种核心抗病毒调控剂”。
例如，在一些实施例中，该核心抗病毒调控剂是激酶，如通过非限制性举例的方式，选自下组的激酶，该组由以下各项组成：MAPK1、EIF2AK2、TBK1、PLK4、IKBKE、PLK2、MAP3K7、CHUK、JAK1、CRKL、MKNK2、TYK2、RPS6KB2、IKBKB、MKNK1、NEK7、PIK3R2、IKBKG、RIPK2、MAP2K6、MET、RPS6KB1、MARK2、DGKA、以及BUB1B。
例如，在一些实施例中，该核心抗病毒调控剂是跨膜受体、哺乳动物内源性化学药物、化学药物如化学激酶抑制物药物或其他化学药物(例如化学试剂、毒药或其他化学药物)、生物药物或其任何组合。合适的核心抗病毒调控剂包括在此描述的那些中的任何。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“二级抗病毒”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表2和2A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“二级抗病毒调控剂”。
例如，在一些实施例中，该二级抗病毒调控剂是激酶、跨膜受体、非哺乳动物内源性化学药物、化学药物如化学激酶抑制物药物或另一种化学药物(例如化学试剂、毒药或其他化学药物)、或其任何组合。合适的二级抗病毒调控剂包括在此描述的那些中的任何。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“成熟”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表3和3A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“成熟调控剂”。
例如，在一些实施例中，该成熟调控剂是激酶、跨膜受体、哺乳动物内源性化学药物、非哺乳动物内源性化学药物、化学药物如化学激酶抑制物药物或另一种化学药物(例如化学试剂、化学毒药或其他化学药物)、生物药物、或其任何组合。合适的成熟调控剂包括在此描述的那些中的任何。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“峰炎性”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表4和4A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“峰炎性调控剂”。
例如，在一些实施例中，该峰炎性调控剂是激酶(例如通过非限制性举例的方式，激酶)、跨膜受体、哺乳动物内源性化学药物、非哺乳动物内源化学药物、化学药物如化学激酶抑制物或另一种化学药物(例如化学试剂、毒药或其他化学药物)、生物药物、或其他调控剂，或其任何组合。合适的峰炎性调控剂包括在此描述的那些中的任何。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“致炎”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表5和5A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“致炎调控剂”。
例如，在一些实施例中，该致炎调控剂是激酶、跨膜受体、哺乳动物内源性化学药物，是非哺乳动物内源化学药物、化学药物如化学物激酶抑制物或另一种化学药物(如通过非限制性举例的方式，化学试剂、化学毒药或其他化学药物)、生物药物、或其任何组合。合适的峰炎性调控剂包括在此描述的那些。
本领域的普通技术人员将理解这些调控剂具有多种用途。例如，这些调控剂被用作治疗剂，如在此描述的。这些调控剂可以在筛选测定、诊断试剂盒中用作试剂或作为诊断工具，或者这些调控剂可以用于竞争测定以产生治疗性试剂。
附图简要说明
图1A-1H是一系列的图表和图解，描绘了LPS刺激的BMDC的单细胞的RNA-Seq揭示广泛转录组异质性。这些图的彩色版可以在以下中找到：沙列克(Shalek)等人，“单细胞转录组学揭示了免疫细胞中表达和剪接的双峰性(Single-celltranscriptomicsrevealsbimodalityinexpressionandsplicinginimmunecells)”.自然(Nature)498(7453):236-40(2013)；doi:10.1038/nature12172。图1a-1c描绘了两个10,000细胞群重复(图1a)之间、两个单细胞(图1b)之间、以及‘平均’单细胞和群体测量(图1c)之间转录表达水平的相关(x&y轴：对数标度TPM+1)。皮尔逊相关系数(r)被标记在左上角。图1d、1e描绘了实例转录物。显示了在各单细胞(y轴上“1”)和三个群体重复(y轴上“10,000”)中针对三个非可变基因(图1d)和四个可变基因(图1e)的RNA-Seq读取密度。图1f-1h描绘了代表性转录物的RNA-FISH。显示了来自针对较低变化基因Il6(顶部图，n＝3193个细胞)和较高变化基因Cxcl1(底部图，n＝3193个细胞)的RNA-FISH染色的显微照片(log过滤，(图1f，图1g))和表达水平分布(图1h)。细胞边界是通过浅灰色轮廓表示。
图2A-2C是一系列图表和图解，描绘了跨单细胞的表达水平的双峰式变化。这些图的彩色版可以在以下中找到：沙列克(Shalek)等人，“单细胞转录组学揭示了免疫细胞中表达和剪接的双峰性(Single-celltranscriptomicsrevealsbimodalityinexpressionandsplicinginimmunecells)”.自然(Nature)498(7453):236-40(2013)。图2a描绘了以宽范围的表达水平的细胞间变化。显示了单细胞表达平均值(μ，X轴)和单细胞可变性(标准偏差，σ，Y轴)之间的关系。蓝色虚(即，上部)线指示平均表达水平的理论最大标准偏差(实例1)；灰色虚(即，下部)线表示常数Fano因子(σ/μ＝0.25)。免疫应答和持家基因分别被标记为品红色和绿色；浅蓝色阴影区域表示单细胞平均TPM<250。值得注意的是，甚至在高平均表达水平，BMDC应答元件显示出实质的可变性(左)，而hESC(拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012))(右)不会。图2b描绘了522个最高度表达的基因的细胞间变化。对于每个基因(行，通过Fano因子从低(顶部)至高(底部)分选)和每个表达水平类(列)，显示了细胞的数目(强黄色：18细胞；黑色：0细胞)，在这些细胞中该基因以该类限定的水平表达。这些基因是基于它们的平均单细胞表达水平选择(TPM>250，白色区域((图2a))。灰色虚线表示(图2a)中突出显示的常数Fano因子(0.25)。图2c描绘了281个低可变性基因(顶部)和241个高度可变的基因(底部)的平均表达概率密度分布。
图3A-3D是一系列图表和图解，描绘了单细胞之间的同种型使用方面的变化。这些图的彩色版可以在以下中找到：沙列克(Shalek)等人，“单细胞转录组学揭示了免疫细胞中表达和剪接的双峰性(Single-celltranscriptomicsrevealsbimodalityinexpressionandsplicinginimmunecells)”.自然(Nature)498(7453):236-40(2013)。图3a描绘了在单个细胞之间具有显著剪接差异的基因的实例。显示了针对两个说明性基因座(各具有两个不同的同种型(底部))18个单细胞(1，蓝色)和3个群体重复(10K，灰色)中每个的RNA-Seq读数密度。图3b示出了在单个细胞(蓝色直方图，顶部)中和在这些群体(灰色直方图，底部)中高表达的基因(单细胞TPM>250)的可变剪接外显子的外显子包含情况的分布(剪接百分比(PercentSplicedIn)(PSI)得分，X轴)。单细胞显示出向着一个具体同种型表达的强偏倚。图3c描绘了在Irf7的剪接变化的RNA-FISH验证。左：RNA-Seq读数密度(仅显示了其中该转录物被表达的细胞)。彩色框标记通过RNA-FISH分析的外显子。右：来自针对该转录物的两个组成型(‘组成型’或‘ConA’)区域(组成型区域A：青色(C)；组成型区域B：品红色(M))以及一种可变剪接的外显子(‘特异性’：橙色(O))用探针进行的同时杂交的RNA-FISH图像。白色箭头突出针对Irf7具有类似高的表达水平，但是针对该可变剪接的外显子是相反偏好的两个细胞。直方图：这两个组成型区域(右顶部和右底部图)是在相似水平(底部直方图，从0.5偏离是由于探针设计如所预期的)检测到，而该可变外显子(中间右图)示出了在单个细胞中包括或排除的偏倚(顶部分布图)。图3d表明对于针对基因Acpp的互斥的最后外显子的可替代调节获得类似的结果。
图4A-4F是一系列图表和图解，描绘了对在单细胞mRNA表达水平的共变的分析如何揭示不同成熟度状态和抗病毒细胞回路。这些图的彩色版可以在以下中找到：沙列克(Shalek)等人，“单细胞转录组学揭示了免疫细胞中表达和剪接的双峰性(Single-celltranscriptomicsrevealsbimodalityinexpressionandsplicinginimmunecells)”.自然(Nature)498(7453):236-40(2013)。图4a描绘了632个LPS诱导基因的PCA。显示了每个细胞(点)对前两个主组分的贡献。PC1(X轴)将3个‘半-成熟’细胞(正方形)与15个‘正在成熟’细胞(三角形)区分。浅灰色三角形表示最成熟的细胞。图4b描绘了诱导的基因的聚簇相关性矩阵。左：示出了632个LPS诱导的基因(行，列)中的每对基因的单细胞表达谱之间的皮尔逊相关系数(r，紫色：负相关；黄色：正相关)。这三个突出显示的簇在左侧连同一些代表性基因座作了注记。右：每个基因(行)在PC1(左)和PC2(右)上的投射得分(绿色：高；蓝色：低)。PC1将半-成熟与正在成熟的BMDC区分；PC2映射到一个抗病毒基因簇。图4c通过RNA-FISH描绘了相关性确认。显示了基于RNA-FISH，当同时对每对的成员染色时，两对基因(Irf7-Stat2，Irf7-Ifit1)之间的关系。皮尔逊相关系数的平方(r2)和测量细胞的数目被表示在左上角。图4d-4f描绘了干扰素反馈回路中Irf7如何传播可变性。显示了在各个未成熟单BMDC(列)中，来自该抗病毒簇(‘抗病毒’行)的八个基因、连同八个非可变免疫应答基因(‘非可变应答’行)的每个的表达水平，在用LPS刺激4h的野生型(WT)(n＝36)(图4d)，Irf7-/-(n＝47)(图4e)，以及Ifnr-/-(n＝18)(图4f)BMDC中使用单-细胞qRT-PCR测量。
图5是一个图，描绘了LPS刺激的单BMDC之间mRNA表达上的整体相关性。显示了18个单个细胞中每个、单细胞平均数和各有10,000个细胞的三个群体(行，列)的全局表达谱之间的皮尔逊相关系数。所有相关性都以对数-标度表达谱计算。单细胞(S)12，13，以及16是半-成熟，而9和16是最成熟，对应于在图4a中的浅灰色三角形。
图6是一系列图，描绘了对于25种不同转录物，单细胞RNA-Seq和RNA-FISH之间的一致性。显示了在18个细胞的单细胞RNA-Seq中(左，蓝色)和在平均1600个细胞的单细胞RNA-FISH(右，红色)中25种转录物中每个的基因表达水平的分布。
图7是一个图，描绘了跨所有细胞的鲁棒LPS应答。显示了来自综合基因组学查看器(IntegrativeGenomicsViewer)的针对每个单细胞(蓝色))和群体平均数(灰色)中关键应答基因(列，基因名称在底部)的水平的RNA-Seq读数的轨迹。这些基因包括关键趋化因子和趋化因子受体(Ccl3、Ccl4、Ccrl2)、细胞因子(Cxcl2)、以及LPS应答的其他重要组分(Tank，Cflar)。
图8是一系列图，描绘了来自其他细胞类型的单细胞RNA-Seq的基因表达方面的变化。显示了在小鼠胚胎干细胞(左)和小鼠胚胎成纤维细胞(右)中单细胞表达平均值(μ，X轴)和单细胞可变性(标准偏差，σ，Y轴)之间的关系。这些图形显示先前公开的单细胞RNA-seq数据的一个再分析(哈什姆肖尼(Hashimshony)，T.，瓦格纳(Wagner)，F.，谢尔(Sher)，N.&柳井(Yanai)，I.CEL-Seq：通过多路复用线性扩增的单细胞RNA-Seq(CEL-Seq:Single-CellRNA-SeqbyMultiplexedLinearAmplification).细胞报告(CellReports)，doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003)。持家基因是绿色的。在这两种情况下，发现相比于LPS刺激的BMDC(图2a)在单细胞基因表达方面实质上更小的可变性。
图9A-9D是一系列图表和图解，描绘了在三个单细胞中唯一性mRNA分子的定量。图9a描绘了一种修饰的实验方案。SMARTerIIA寡聚物被修饰，在逆转录过程中将一个随机的四核苷酸条形码引入到每个mRNA分子上。示出了修饰的寡聚物(条形码是通过NNNN表示)的结构。这个条形码通过PCR扩增和文库制备被保留。图9b描绘了一个IGV截图，显示了对于三个条形码化的单细胞cDNA文库(蓝色)连同三个10,000细胞复制实验(灰色)在一个基因座处的读数密度。两个单细胞排他地表达两个同种型中的一个。图9c描绘了映射到转录物的5’端的读数的详细检查。这81个读数代表23个唯一性条形码，确认了所观察到的剪接结果不单纯归因于一种或几种分子的随机扩增。图9d描绘了对于这三个条形码化的单细胞文库，单细胞TPM(X轴，对数标度)和唯一性鉴定的条形码(Y轴，对数标度)之间的关系。仅对由至少一个唯一性条形码表示的基因进行绘图。浅蓝色阴影区域代表单细胞TPM<250，该阈值在整个研究中使用。单细胞基因表达的两个可替代定量整体上是良好相关的(0.82<R<0.86)并且对于高度表达的基因显示一种紧密线性关系(TPM>250)。
图10A-10C是一系列图和一个表，描绘了基于这3个条形码化的单细胞文库在单细胞之间同种型表达方面的变化。图10a描绘了IGV截图，显示6个可变剪接的基因的读数密度。对于每个基因，该可变剪接的外显子以橙色加框。图10b是一个表，示出了对在图10a中显示的每个转录物计数的唯一性分子条形码的数目。图10c描述了对于在单细胞中(蓝色直方图，顶部)和群体(灰色直方图，底部)中通过至少15个条形码表示的基因中的可变剪接的外显子而言的外显子包含情况的分布(PSI得分，X轴)。结果高度类似于跨18个细胞(单细胞TPM>250；图3)的高度表达的基因的剪接分析。单细胞展现出朝着一个同种型或其他同种型的一种强的偏斜。
图11是一个图表，描绘了在单细胞中Irf7的剪接变化的RNA-FISH验证。显示了Irf7转录物的比率的跨细胞分布，这些Irf7转录物展示了相对于较短的组成型探针(品红色，图3c)的同种型特异性Irf7探针(橙色，图3c)。该分布与当计算该特异性探针与较长的组成型探针(图3c)的比率时所获得者是类似地双峰的。
图12是一个图表，描绘了展示半-成熟的和正在成熟的细胞之间的分离的IGV截图。这些基因具有对于PC1非常高的(阳性)或低的(阴性)投射得分。在右侧的一个黑色竖条突出显示了表达成熟的以及正在成熟的标记两者的两个细胞，表明它们事实上是正在成熟的细胞中最成熟的。
图13A-13E是一系列图，描绘了通过RNA-FISH确认共变模式。显示了通过RNA-FISH同时测量的转录物对的表达水平的关系(对数(计数+1))。图13a描绘了Ccr7(更多地在正在成熟的细胞中表达)以及Il1b(更多地在半-成熟细胞中表达)的表达水平不强烈相关(皮尔逊r2＝0.12，n＝812)。图13b描绘了Stat4(更多地在半-成熟细胞中表达)以及Serpinb9(更多地在半-成熟细胞中表达)的表达水平更强烈相关(皮尔逊r2＝0.28，n＝573)。图13c描绘了Cxcl10和Tnf(两者都更多地在正在成熟的细胞中表达)的表达水平轻度相关(皮尔逊r2＝0.18，n＝511)。图13d描绘了Ccl22和Irf8(两者都在半-成熟细胞中表达)显示出中等相关性(皮尔逊r2＝0.26，n＝1110)。图13e描绘了Stat1(抗病毒，对两者都不是特异的)和Cxcl1(炎性，对两者都不是特异的)非常弱地相关(皮尔逊r2＝0.07，n＝631)。
图14是一个图表，描绘了LPS刺激的单个BMDC通过单细胞qRT-PCR聚簇为两个不同群体。显示了来自46个单个细胞(列)的每个中50个基因(行)的单细胞qRT-PCR(富鲁达)的归一化表达水平(红色：高；蓝色：低，标度在顶部)。这些细胞是基于其表达谱(树状图，顶部)通过层次凝聚聚簇而聚簇的并且形成两个主要簇(半-成熟的和正在成熟的，底部)。
图15是一个图表，描绘了亚群体之间的关键标记表达水平的差异，这些亚群体对于不同的半-成熟的和正在成熟的细胞表面标记是阳性和阴性的。显示了针对每个标记(X轴)阳性和阴性分选的细胞之间通过qRT-PCR测量的10个标记基因(条，颜色图标，右)的每个的差异性表达水平(Y轴)。基于在RNA-Seq数据中区分‘正在成熟’(红)和‘半-成熟’(蓝)亚群体的能力选择这些标记。
图16A和16B是一系列图，描绘了13个基因的一种标签沿着LPS应答时程的单细胞qPCR表达谱分析。图16a描绘了在未刺激的BMDC中和在LPS刺激后2h、4h、和6h，在每个细胞(列)中每个基因(行)的表达水平。该基因标签由以下各项组成：九个抗病毒簇基因、两个均匀地诱导的基因、和两个持家对照。图16b描绘了在每个时间点(列)表达每个基因(行)的细胞的百分比。如果在富鲁达生物标记(FluidigmBioMark)上一个基因的表达高于23的Ct，则细胞被评分为对于该基因是阳性的。虽然一些免疫应答基因，Cxcl10和Clec4e，在所有细胞中并跨时间点持续被均匀地诱导，表达这些抗病毒簇基因的细胞的百分比以时间依赖性方式增加。
图17A和17B是一系列照片和图，描绘了RNA-FISH和免疫荧光共染色。图17a描绘了针对Stat1蛋白(绿色)、Stat1mRNA(品红色)、和Ifit1mRNA(白色)的共染色图像的一个实例。图17b描绘了在暴露于LPS0小时(顶部)、2小时(中间)或4小时(底部)之后，Ifit1mRNA(黑色)和Stat1(红色)、pStat1(灰色)、和Stat2(绿色)蛋白(总荧光水平，左直方图；平均荧光水平，中间；和核定位百分比，右)的水平的分布。虽然在所有情况下总体蛋白质水平在整个时程中增加，但发现了在Stat1、pStat1、以及Stat2的诱导方面的实质变化。当pStat1的转变在早期最明显时，Stat1水平逐渐升高。同时，Stat2到2h处显示出强的细胞核定位，随后从2至4h显示强诱导。到4小时处，蛋白水平更均匀并且核易位不太明显。
图18A和18B是一系列图，描绘了Stat蛋白和Ifit1mRNA表达之间的相关性。图18a描绘了代表性散点图，示出了在4hLPS刺激之后Stat蛋白(Y轴)和IfitmRNA水平(X轴)之间的相关性。顶行：Stat1，中间行：pStat1；底行：Stat2。左列：总蛋白荧光；中间列：平均蛋白荧光；右列：核蛋白的百分数。图18b描绘了热点图，示出了在暴露于LPS0小时(顶部)、2小时(中间)、或4小时(底部)之后，不同的测量参数之间的相关性(r2；蓝色＝0；红色＝1)。
图19是一个图解，描绘了针对所鉴定的抗病毒回路的一个简单模型。X的表示扰动的点。Ifn反馈驱动Irf7和Stat2的表达。Irf7的表达的可变性传播到抗病毒基因(如Ifit1)的表达的可变性。Stat2同样被牵涉，虽然它与Irf7的关联不能由当前实验建立。
图20是一个图表，描绘了剪接因子Srsf3和Srsf7的‘毒物’盒外显子的剪接模式。显示了在每个单个细胞(‘1’，蓝色)和群体平均数(‘10,000’，灰色)中，针对编码各自已知具有可变剪接的毒物盒外显子(虚线框)的剪接因子Srsf3和Srsf7的两个基因的RNA-Seq读数密度。每个基因的已知注释同种型显示在底部。在顶部以橙色突出显示的一种细胞S13，仅表达包含这些‘有毒’外显子的Srsf3和Srsf7同种型。对于每个基因，11个细胞排他地表达该可替代性同种型。
图21是一个图表，描绘了长非编码(lnc)RNA的表达变化。显示了在每个单独的细胞(‘1’，蓝色))和群体平均数(‘10,000’，灰色)中，针对三个先前注释的lncRNA基因的RNA-Seq读数密度。在群体水平(Gas5，左)相对高度表达的lncRNA在单细胞水平双峰式表达。在群体(Gm8773，2810025M15Rik)方面低表达的或不可检测到的两个lncRNA实际上在一些单个细胞中显著表达。
图22是一系列图，描绘了针对3’偏倚的质量控制。显示了对于6个单细胞(顶部两行)和所有三个10,000群体(底行)，在从5’(左)至3’(右)的每个归一化转录物位置处的归一化RNA-Seq覆盖的绘图。这些单细胞和这些群体两者都显示少许3’偏倚。
图23是一系列照片，描绘了在不存在LPS刺激的情况下(左)和在LPS刺激4h之后(右)，免疫应答基因Cxcl1(顶部)和Cxcl10(底部)的RNA-FISH。尽管在刺激之前以可忽略的水平表达，Cxcl10以及Cxcl1被LPS强烈诱导。
图24A-24E是一系列图表和图解，描绘了用病原体组分刺激的骨髓源性树突细胞(BMDC)的微流体启用型单细胞RNA-Seq。图24a描绘了BMDC的扫描电子显微照片(比例尺：25μm)。图24b描绘了Toll样受体(TLR)网络的一种简化示意图，该网络用于通过TLR2感测PAM3CSK(PAM，来自革兰氏阳性细菌)，通过TLR4感测脂多糖(LPS，来自革兰氏阴性细菌)，和通过TLR3感测多聚肌苷酸：多聚胞苷酸(PIC，聚(I:C)，即病毒RNA的合成模拟物)。图24c描绘了在C1芯片(CAD绘图，底部)上单BMDC(顶部，细胞以紫色画圈)的微流体捕获。图24d描绘了主组分(PC)分析，对来自全部三个刺激和时间点的样品进行计算，针对LPS-刺激的细胞(左)和前三种PC(右)的LPS刺激的细胞评分的分布。图24e描绘了在BMDC群(左列)以及单个BMDC(右列)内，用PAM(绿色)、LPS(黑色)、以及PIC(品红色)刺激后0h、1h、2h、4h、以及6h，在BMDC中诱导的基因(行)的时程表达谱。在最右的是到前3种主组分(PC)(PC1、PC2、和PC3，列)上的基因投射得分；底部上的是每个细胞(列)对前三种PC(PC1、PC2、和PC3，行)的贡献。
图25A-25D是一系列图，描绘了单细胞的时间依赖性行为。图25a描绘了在用PAM(顶部，绿色)、LPS(中间，黑色)、以及PIC(底部，品红色)刺激之后每个时间点(在顶部标记)，对于三个基因(来自图24e中的三个簇中的每个)看到的实例单细胞表达分布。分布是按比例的以具有相同的最大高度。单个细胞被绘制为每个分布下的条。图25b-d描绘了在用LPS(顶部)、PIC(针对“核心”抗病毒簇Id(图25b))或PAM(针对“峰”炎性簇(图25c)和“持续”炎性(图25d)簇)刺激的BMDC中，对于三个模块的每个(有标签的，顶部)，所有它组成基因在2h(左)和6h(右)的波图。X轴：表达水平，ln(TPM+1)；Y轴：基因；Z轴：单细胞表达密度。基因是在2h(“峰”炎性)或6h(“核心”抗病毒，“持续”炎性)LPS时间点从最低至最高平均表达值进行排序。
图26A-26L是一系列图，描绘了刺激过程中变化方面的动态改变。图25a呈现了用来描述单细胞表达分布的三个参数的一个示意性描写，从左至右：μ，针对具有可检测到的表达水平的细胞的平均RNA丰度水平；σ，针对具有可检测到的表达的细胞的表达方面的分散；和α，具有可检测到的表达的所有细胞的比例(在ln(TPM+1)>1)。图25b描绘了在LPS刺激后不同时间点所测量的TNF表达分布(黑色)的拟合(灰色)的实例。图25c描绘了在每个时间点(X轴)对TNF估计的μ、σ2、和α(Y轴，左至右)的值的改变。μ和σ2的单位是ln(TPM+1)。图25d是一个最大似然估计α。显示了当考虑表达以对数正态分布方式分布并且任何偏差是归因于技术检测限制的一种空模型时，在LPS刺激后的不同时间点TNF的表达分布(黑色，左)，和用来确定αMLE(绿色，右)的匹配似然函数(点蓝线)。图25e和25f描绘了表达和H3K27ac结合之间的关系取决于α，而不取决于μ。绘图显示了平均启动子读数密度(强度；黑色高；白色低；比例尺，底部)，针对H3K27ac(LPS2h，顶部)、H3K27ac(Unstim，中间)和H3K4me3(2hLPS，底部)基因，对应于群体表达(Y轴)的10分位数类的每一个以及α(图25e，X轴)或μ(图25f，X轴)的10分位数类的每一个。在控制具有可检测的表达水平的单一细胞的百分比(α；图25e，中间)之后，表达与H3K27ac(图25e，顶部、中部)之间的总群体相关性大部分消失，但是针对H3K4Me3水平的这种依赖性仍然保持(图25e，底部)。相比之下，控制μ(图25f)不消除表达水平和K27ac之间的依赖性，因为在μ(垂直条)的单一范围内，群体表达水平和K27ac之间的相关性被维持，表明μ本身不是这种关系的潜在决定因素。图25k描绘了条形图，显示了仅针对免疫应答基因的平均表达水平和K27ac之间的相关性的p值，如是(红色)或当控制μ(蓝色)或者α(绿色)。图25h描绘了在每个模块中α和μ的动态改变。条形图显示针对每个模块(顶部：核心抗病毒；中间：峰炎性；底部：持续炎性)，在每个过渡(X轴)处，在不同条件(在顶部标记的)下仅在α(通过似然比检验，P<0.01，蓝色)、仅在μ(威尔科克森检验，P<0.01，绿色))、或两者(每个检验独立地，浅蓝色)上具有显著变化的基因的比例(Y轴)。在每个模块和条件下，该比例被计算为占该模块中基因总数的比例，这些基因在该应答时程中至少一个时间点是显著双峰式的(通过一个似然比检验)并且在两条件下在至少10个细胞中表达。这个数目被标记在每个条的顶部上。
图27A-27F是一系列图表和图解，描绘了IFN-β反馈驱动“核心”抗病毒靶标的表达的异质性。图27a描绘了针对Rsad(顶部)和Stat2(底部)在用LPS(左，黑色)或IFN-β(右，红色)刺激2h之后的单细胞表达分布。图27b描绘了波图，显示了在用LPS(左)或IFN-β(右)刺激2h时在该“核心”抗病毒簇(Y轴；如在图25b的顺序)中的每一个基因的表达的分布。尽管在用LPS2h时大部分基因的表达是双峰式的，在用IFN-β2h时(类似于在图25b中的4hLPS时间点)大部分是单峰式表达的。图27c描绘了针对每个LPS刺激的细胞(0h、1h、2h、4h、和6h)和用IFN-β刺激2h的细胞(最右侧)的“核心”抗病毒得分(Y轴)。两个“早熟”细胞(黄色星形)在1hLPS具有异常高的抗病毒得分。(d)在1hLPS来自“核心”(簇Id，左)和二级(簇Ic，右)抗病毒簇的基因的表达的正态分位数绘图。这两个“早熟”细胞(黄色星形)表达异常高的水平的“核心”抗病毒基因(左)，而不是二级基因(右侧)。图27e描绘了RNA-荧光原位杂交(RNA-FISH)确认了对于Ifnb1(品红色)和Ifit1(青色)两者都是正的罕见的早期应答物(箭头；黄色星形)的存在。灰色：细胞轮廓。比例尺：25μm。图27f呈现了文氏图(Venndiagram)，显示了通过RNA-FISH，在1hLPS刺激(P<10-25，相等比例的检验)后Ifnb1(品红色)和Ifit1(青色)两者的检测(>5个拷贝)的一致性。
图28A-28E是一系列图表和图解，描绘了细胞间信号传导的微流体阻断影响抗病毒和炎性模块中的应答异质性。图28A描绘了细胞间通讯的实验阻断。左：C1芯片；右：芯片上刺激，随后通过微流体阀(红色条)致动，在单独腔室密封这些细胞，阻止细胞间信号传导。图27b描绘了在来自芯片上(左；无细胞间信号传导)和管内(右)刺激的单细胞(列)中“核心”抗病毒(Id，顶部行)和“峰”炎性(IIIc，底部行)模块中的基因(行)的表达。颜色代表按比例的表达值(z-得分)。图27c描绘了针对来自芯片上(左，蓝色；无旁分泌信号传导)或管内(右；黑色)4hLPS刺激中“核心”抗病毒(顶部)和“峰”炎性(底部)簇的单个代表性基因的基因表达分布。图27d描绘了针对单个细胞，“核心”抗病毒(顶图，Y轴)、“峰”炎性(中图，Y轴)、以及“持续”炎性(底图，Y轴)得分的小提琴图(violinplot)，(从左到右)：LPS0h、LPS1h、LPS2h、LPS4h、LPS6h，“芯片上”未受刺激的，“芯片上”LPS4h，在0h添加了GolgiPlug(布雷菲德菌素A)的LPS4h，在1h添加了GolgiPlug的LPS4h，在2h添加了GolgiPlug的LPS4h，用Ifnar-/-BMDC的LPS4h，以及用Stat1-/-BMDC的LPS4h。在1hLPS具有异常高的抗病毒得分的两个“早熟”细胞(图27)被表示为黄色星形。
图29A和29B是一系列图表和图解，描绘了群体水平旁分泌信号传导增强和协调“核心”抗病毒应答，同时在制止和去同步“峰”炎性应答。图29a是一种基因网络模型，显示了正IFN-β信号传导如何诱导抗病毒应答并且降低其异质性，而同时激活负旁分泌反馈环路，可能包括IL-10，这制止“峰”炎性簇并且增加其异质性。图29b是一个细胞群模型，显示了正和负旁分泌反馈如何改变跨细胞的抗病毒(品红色)和炎性(绿色)基因表达可变性。灰色表示没有表达。
详细说明
本发明总体上涉及用于对控制树突细胞应答(包括核心抗病毒应答、二级抗病毒应答、成熟、致炎应答以及尖峰炎性应答)的调节网络进行鉴定的多种组合物和多种方法，以及用于对在多种治疗和/或诊断适应症中控制一种或多种树突细胞应答的调节网络进行探索的多种组合物和多种方法。
在此提供的研究使用单细胞核酸分析(确切地说，单细胞RNASeq)以对应答于各种病原性组分的单个树突细胞(DC)中的mRNA进行谱分析。使用单细胞RNASeq谱分析方法提供了许多优点，例如，通过非限制性举例的方式，更清楚的标签，将抗病毒回路与成熟回路的分开，并且细化在细胞群鉴定的标签。
单细胞RNA-Seq提供了一种用于理解看似相同的细胞之间的基因表达变化的程度、基础和功能的无偏方法。然而，满足这个希望需要用于跨不同实验条件对许多细胞进行谱绘制和分析的高通量工作流程。本披露提供了一种基于微流体的方法以从用三种病原性组分刺激的1,700只初级小鼠树突细胞(DC)制备单细胞RNA-Seq文库。在以可检出水平表达给定mRNA转录物的细胞的比例和这些表达细胞内的转录物水平方面发现了暴露于相同刺激的单个细胞之间的实质性变化。不同基因模块特征在于不同的时间异质性谱。具体来说，抗病毒基因的“核心”模块是在非常早期由一些“早熟”细胞表达的并且然后在稍后的时间点在所有细胞中变得有活性。通过在密封的微流体室中单独地刺激细胞，分析来自敲除小鼠的DC，并且调控分泌以及细胞外信号传导，经由干扰素-介导的旁分泌信号传导传播和协调这种应答。令人惊讶地，防止细胞间通讯也实质性地降低了一个峰值的、早期诱导的炎性模块的表达的可变性，表明旁分泌信号传导另外阻遏该炎性程序的一部分。在此提供的组合物和方法突出了细胞间通讯在控制细胞异质性方面的重要性并且显示多细胞群用以建立复杂动态应答的通用策略。
首次使用这个分析发现了针对不同应答元件的一系列细化基因标签，在此称为“核心抗病毒”基因标签、“二级抗病毒”基因标签、“成熟”基因标签、“致炎”基因标签、和“炎性尖峰”基因标签。这些标签是表达于单细胞的一致性组中的基因。这些基因标签中的每个提供于下表1-5中。
在应答的树突细胞最早期中诱导“核心抗病毒”基因标签。在群体水平上“成熟”基因标签看起来类似于“致炎”基因标签，但是使用单细胞分析，确定“成熟”基因标签仅表达于细胞亚群。“成熟”基因标签负责允许树突细胞募集T细胞和B细胞，由此桥接先天性和获得性免疫系统之间的间隙。
表1.核心抗病毒标签基因
ADAR IFI44 PML
AI607873 IFIH1 PRIC285
AK172683 IFIT1B PTTG1
AW112010 IFIT2 PYHIN1
BST2 IFIT3 RNASET2A
CA13 IFITM3 RSAD2
CASP11 IGTP RTP4
CD274 IIGP1 SAMD9L
CD69 IL15 SERPINA3
CMPK2 IL15RA SLCO3A1
CXCL10 IRF7 SLFN13
DAXX IRGC SLFN5
DDX58 IRGM SLFN9
DDX60 ISG15 SP100
DHX58 ISG20 SP140L
DTX3L MITD1 STAT1
E030037K03RIK MNDA STAT2
EIF2AK2 MOV10 TAP1
ETNK1 MS4A4A TOR3A
FAM26F MX1 TREX1
GBP2 NLRC5 TRIM5
GBP4 NT5C3 UBA7
GBP6 OAS1 USP18
GM4951 OAS2 USP25
GVINP1 OAS3 XAF1
H2-T10 OASL ZBP1
HERC6 OASL2 ZNFX1
IFI16 PARP12 ZUFSP
IFI204 PARP9
IFI35 PHF11
表1A.核心抗病毒标签基因的亚群
ADAR GVIN1 OASL213 -->
AI607873 H2-T10 PARP12
AK172683 HERC6 PARP9
AW112010 I830012O16RIK PHF11
BST2 IFI203 PTTG1
CAR13 IFI204 PYHIN1
CASP11 IFI205 RNASET2A
CD274 IFI35 RTP4
CD69 IFI44 SAMD9L
CMPK2 IFI47 SERPINA3G
D14ERTD668E IFIH1 SLCO3A1
DAXX IFITM3 SLFN5
DDX58 IGTP SLFN8
DDX60 IRGM1 SLFN9
DHX58 IRGM2 SP100
DTX3L MITD1 SP140
E030037K03RIK MNDAL TAP1
EIF2AK2 MOV10 TOR3A
ETNK1 MPA2L TREX1
FAM26F MS4A4C TRIM30A
GBP2 MX1 TRIM30D
GBP3 NLRC5 UBA7
GM12250 NT5C3 USP18
GM14446 OAS1A XAF1
GM4902 OAS1G ZBP1
GM4951 OAS2 ZNFX1
GM5431 OAS3 ZUFSP
GM8979 SLFN13 TRIM5
CA13 GBP6 GVINP1
IFI16 IFIT1B MNDA
MS4A4A OAS1 PRIC285
SERPINA3
表2.二级抗病毒标签基因
2810474O19RIK HEATR5B RNF135
ADAP2 IFI27L2A SAMHD1
AFTPH IL18BP SETDB2
AIDA IRF9 SGCB
AIM1 KIAA0040 SLAMF7
AIM2 KIAA0317 SLC25A2214 -->
AK142678 KIAA1715 SLFN12
AK163331 KYNU SPRED1
AKT3 LAP3 STARD3
ALDH1B1 LGALS9 STXBP3
AP3M2 MIER3 TBC1D13
APOBEC3 MINPP1 TCF4
AZI2 MKIAA1823 TDRD7
BBX MLKL TFG
BC147527 MTHFR TLR3
BFAR NAA25 TMCC3
C19orf12 NMI TMEM140
CASP7 NOD1 TMEM67
CCDC25 P2RY14 TNFSF8
CCND2 PARP11 TOR1AIP1
CCNJ PARP8 TOR1AIP2
CH25H PCGF5 TRIM25
DCK PELI1 TRIM34
FBXW12 PFKP TRIM5
FGL2 PLA2G16 UBE2L6
FNDC3A PPA1 VCAN
FRMD4A PPHLN1 VCPIP1
G530011O06RIK PPM1K WARS
GBP6 PRPF38A WHSC1L1
GNB4 PSMB9 XKR8
GYPC RASA4 XRN1
H2-T23 RIN2 ZC3HAV1
H2-T24 RNF114 ZNF800
表2A.二级抗病毒标签基因的亚群
1110018G07RIK GNB4 RNF114
1600014C10RIK GYPC RNF135
2810474O19RIK H2-T23 SAMHD1
3110001I22RIK H2-T24 SETDB2
4930523C07RIK HEATR5B SGCB
9230105E10RIK IFI27L2A SLAMF7
ADAP2 IL18BP SLC25A22
AFTPH IRF9 SLFN1
AIDA KYNU SPRED115 -->
AIM1 LAP3 STARD3
AIM2 LGALS9 STXBP3A
AK142678 LNP TBC1D13
AK163331 MIER3 TDRD7
AKT3 MINPP1 TFG
ALDH1B1 MKIAA1823 TMCC3
AP3M2 MLKL TMEM140
APOBEC3 MTHFR TMEM67
AZI2 NAA25 TOR1AIP1
BC147527 NOD1 TOR1AIP2
BFAR P2RY14 TRIM25
CASP7 PARP11 TRIM34
CCDC25 PARP8 TRIM5
CCNJ PCGF5 UBE2L6
CH25H PFKP VCAN
DCK PLA2G16 VCPIP1
FBXW17 PPA1 WARS
FNDC3A PPM1K WHSC1L1
FRMD4A PRPF38A XKR8
G530011O06RIK PSMB9 XRN1
GBP4 RASA4 ZC3HAV1
GBP6 RIN2 ZFP800
GBP9 FBXW12 KIAA0040
C19orf12 KIAA1715 PPHLN1
KIAA0317 SLFN12
表3.成塾标签基因
AKNA ETS2 PGAP2
APOL7C ETV3 PLAT
APPL1 EXOC3L4 PPP1CB
ARL5C FAM129A PVR
BATF FAM177A1 PVRL2
BC035044 GPR85 RAB8B
BCL2L1 H2-Q7 REL
BIRC3 HSD17B11 RHOB
BLNK IL12B RND3
CCL22 IL23A SAMSN1
CCR7 IL4I1 SEMA6D16 -->
CD72 IRF8 SERPINB9
CD80 ITGA4 SRGN
CD83 KTELC1 ST3GAL1
CD86 LACC1 STAT3
CDKN1A MKIAA0769 STAT5A
CHAC2 MMP25 SWAP70
CRLF3 NFKBIB TBC1D1
CSF1 NUDT17 TIMP1
DENND5A OSGIN2 TMEM39A
EBI3 PALM2 TNIP3
EIF2C3 PDZK1IP1 VCAM1
表3A.成熟标签基因的亚群
1200009I06RIK EIF2C3 PPP1CB
9030625A04RIK ETS2 PVR
AKNA ETV3 PVRL2
APOL7C FAM129A RAB8B
APPL1 FAM177A REL
BC035044 GPR85 RHOB
BCL2L1 H2-Q7 RND3
BIRC3 HSD17B11 SAMSN1
BLNK IRF8 SEMA6D
CCL22 ITGA4 SERPINB9
CCR7 KTELC1 SERPINB9B
CD72 MKIAA0769 SRGN
CD80 MMP25 ST3GAL1
CD83 NFKBIB STAT3
CD86 NUDT17 SWAP70
CDKN1A NUP62-IL4I1 TBC1D1
CHAC2 OSGIN2 TIMP1
CRLF3 PALM2 TMEM39A
CSF1 PDZK1IP1 TNIP3
DENND5A PGAP2 VCAM1
EBI3 EXOC3L4 FAM177A1
IL4I1 LACC1
表4.致炎标签基因
6330409N04RIK H2-M2 PROCR17 -->
A130040M12RIK HCK PTGS2
ACPP IL1B PTPRJ
ACSL1 IL1RN RAB10
AOAH IL27 RAB32
B3GNT2 IL6 RHBDF2
BCL2A1 INHBA RNF19B
C15orf48 IRG1 RPS6KA2
CALCRL ITGA5 SAA3
CAV1 ITGAV SBDS
CCL3 JAK2 SDC4
CCL4 KPNA3 SH3BP5
CCL5 LCN2 SLC15A3
CD14 LMO4 SLC2A6
CD200 MAPKAPK2 SLC7A11
CD38 MARCKSL1 SLC7A2
CD40 MARCO SLFN2
CERS6 MET SOD2
CFLAR MFLJ00294 SQSTM1
CLEC4E MKIAA1673 ST3GAL5
CLIC4 MMP14 TAGAP
CXCL16 MTPN TANK
CXCL3 NAMPT TARM1
DCBLD2 NFKB1 TLR1
EHD1 NFKB2 TNFRSF1B
ELL2 NOS2 TNFSF15
FAM102B OLR1 TRAF1
FPR2 PARP14 TXNRD1
GADD45B PIK3R5
GBP5 PLEK
GM14005 PPAP2B
GPR84 PPP4R2
表4A.致炎标签基因的亚群
6330409N04RIK GM14005 PPAP2B
A130040M12RIK GPR84 PPP4R2
AA467197 H2-M2 PROCR
ACSL1 HCK PTPRJ
AOAH IL1B RAB1018 -->
B3GNT2 IL1RN RAB32
BCL2A1A IL27 RHBDF2
BCL2A1B IL6 RNF19B
BCL2A1C IRG1 RPS6KA2
BCL2A1D ITGA5 SAA3
CALCRL ITGAV SBDS
CAV1 JAK2 SDC4
CCL5 KPNA3 SLC15A3
CD14 LASS6 SLC2A6
CD200 LCN2 SLC7A11
CD38 MAPKAPK2 SLC7A2
CFLAR MARCKSL1 SLFN2
CLEC4E MFLJ00294 SOD2
CLIC4 MKIAA1673 SQSTM1
CXCL16 MMP14 ST3GAL5
CXCL3 MTPN TAGAP
DCBLD2 NAMPT TANK
EHD1 NFKB1 TARM1
ELL2 NOS2 TLR1
FAM102B OLR1 TNFRSF1B
FPR2 PARP14 TNFSF15
GADD45B PIK3R5 TRAF1
GBP5 PLEK TXNRD1
C15orf48 CERS6
表5.尖峰炎性标签基因
ADORA2B IRAK-2 PTX3
AK150559 IRAK3 RALGDS
AK163103 KLF7 RASA2
ARG2 LCP2 RASGEF1B
ARHGEF3 LDLR RBM7
BCL2L11 LZTFL1 RCAN1
C1orf55 MALT1 RELA
C5AR1 MCOLN2 RFFL
CCRL2 MPP5 SERTAD2
CD44 NCK1 SGMS2
CDC42EP4 NFKBIA SLC16A10
CLCN7 NFKBID SLC25A2519 -->
CLEC4D NFKBIE SLC25A37
CPD NFKBIZ SLC39A14
CXCL2 NLRP3 SOCS3
CXCL3 NRP2 SPATA13
DDHD1 NUP54 TGM2
DUSP16 NUPR1 TLR2
F10 ORAI2 TNF
FAM108C1 OSBPL3 TNFAIP2
FAM20C PDE4B TNFAIP3
FLRT3 PILRA TNIP1
FPR1 PIP5K1A top1
GRAMD1B PLAGL2 TREM1
H1F0 PLEKHO2 TRIM13
HCAR2 PLK2 TSHZ1
ICOSL PLSCR1 ZC3H12C
IL1A PSTPIP2 ZEB2
IL36G PTAFR ZSWIM4
INSIG1 PTPRE
表5A.尖峰炎性标签基因的亚群
ADORA2B IRAK3 PTX3
AK150559 KLF7 RALGDS
AK163103 LCP2 RASA2
ARG2 LDLR RASGEF1B
ARHGEF3 MALT1 RBM7
BC031781 MCOLN2 RCAN1
BCL2L11 MPP5 RELA
C5AR1 NCK1 RFFL
CCRL2 NFKBIA SERTAD2
CD44 NFKBID SGMS2
CDC42EP4 NFKBIE SLC16A10
CLCN7 NIACR1 SLC25A25
CLEC4D NLRP3 SLC25A37
CPD NRP2 SLC39A14
DDHD1 NUP54 SPATA13
DUSP16 NUPR1 TGM2
F10 ORAI2 TLR2
FAM108C OSBPL3 TNFAIP2
FAM20C PDE4B TNFAIP320 -->
FLRT3 PILRA TNIP1
FPR1 PIP5K1A top1
GRAMD1B PLAGL2 TREM1
H1F0 PLEKHO2 TRIM13
ICOSL PLSCR1 TSHZ1
IL1F9 PSTPIP2 ZEB2
INSIG1 PTAFR ZSWIM4
IRAK-2 PTPRE
选择希望的靶基因或靶基因的组合，并且在确定树突细胞应答期间所选择的一种或多种靶基因是否过表达或低表达之后，取决于所希望的成熟和/或功能结果使用适合的拮抗剂或激动剂。合适的拮抗剂和/或激动剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
这些调控剂被用来调控一种或多种靶基因或一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达，这一种或多种靶基因已被鉴定为响应于树突细胞相关的干扰的基因。这些靶基因是例如通过使树突细胞与调控剂接触，并且监测对一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达的作用(如果有的话)来鉴定的。在一些实施例中，该一种或多种标签基因是选自在表1-5A中列出的那些。该调控剂可以直接作用于一种或多种靶基因或一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达，和/或该调控剂可以间接作用于一种或多种靶基因或一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达，该间接作用是通过调控已知与该一种或多种靶基因相关联的基因或基因产物的表达、活性和/或功能。
在一些实施例中，该靶基因是肿瘤坏死因子受体(TNFR)。在一些实施例中，该调控剂改变TNFR的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该调控剂改变与TNFR相关联的基因(如通过非限制性举例的方式，来自在以下表6中所示的那些中的基因)的表达、活性和/或功能。在表6中加下划线的基因是当TNFR不存在(例如，敲除)时被上调的基因，并且未加下划线的基因是当TNFR不存在(例如，敲除)时被下调的基因。
表6.
CCL5 PNRC1 AKNA CAV1 MTHFR
ETV3 CHD1 TRIM34 MLKL FAM53C
BLNK GBP9 CXCL10 AK178429 SLC7A11
SRGN BTG2 ARL5C EGR2 TMEM140
MCMBP TMEM39A OSGIN2 AZI2 9030425E11RIK
IRF8 ARID5B DENND5A A130040M12RIK VCL
MARCKSL1 EIF2C3 RSAD2 PLEKHF2 TLR3
PVRL2 CST7 SEPW1 TRAF1 MKIAA1994
IFIT2 RPS6KA2 IFIT1 G530011O06RIK MAF
KTELC1 DLGAP4 FBXW17 DUSP1 SAMSN1
CCND2 BCL2A1A SMIF RELA TLR621 -->
9030625A04RIK PIK3AP1 RBMS2 SLFN9 AK138792
CDKN1A IFIT3 GRAMD1B LDLR NAA25
ISG15 CSF1 EPSTI1 FSTL1 AK172683
GLIPR2 FAM129A BCL2A1C NFKB2 ZCCHC2
CD86 1110038F14RIK HERC6 SERPINB9 CD14
SDC4 RNF19B TRMT61B A430084P05RIK F830016B08RIK
TNFSF8 BC006779 NCOA7 MKIAA0696 FILIP1L
IFIH1 KLF7 CCL4 SAMD9L RALGDS
CD80 BCL2A1B TRA2A NFKB1 TNFAIP2
IFI27L2A ISG20 CLU LY6A A230046K03RIK
IIGP1 TMEM219 CCRN4L MAP3K8 TSHZ1
D14ERTD668E HMGN3 TARM1 RBM7 TLR7
GBP4 MTPN 5031414D18RIK 2310004I24RIK SPATA13
STAT5A APPL1 MFSD7 H2-T10 AK050909
AK163331 MITD1 1110018G07RIK LRRK2 INSIG1
RGS1 ICOSL OPTN PDZK1IP1 PTGS2
LAP3 TMCO3 BATF2 EIF2AK2 H3F3B
CCL22 DYNC1I2 RANBP2 PLK2 SLC7A2
SWAP70 CDYL2 IFNB1 MGAT4A FOSL2
EBI3 IL13RA1 SNX10 IRG1 DAB2
AA467197 CLN3 TRIM13 RTP4 CALCRL
SLC2A6 ALDH1A2 STAT3 1810029B16RIK SPIC
RNASET2A KATNA1 ST8SIA4 PLEKHO2 ACSL1
FAM26F WDR37 RBM43 SAA3 SOD2
SLFN5 AY096003 CASP7 GCNT2 IL1RN
P4HA1 ARHGEF3 IL6 EHD1 CAR4
IL27 IL23A CISH IL20RB IL1F9
NUP62-IL4I1 AK200837 GM6548 SLFN3 PTGES
E030037K03RIK PMAIP1 UBE2Q2 RNF214 6330409N04RIK
OAS3 NUPR1 TRIM5 FABP3 DRAM1
SLCO3A1 IFI205 TNIP3 STAT1 PLEK
4930523C07RIK REL FAM177A PIK3R5 LY75
PGAP2 HK3 WARS EGR1 SLC39A2
KLRK1 DUSP16 IRF1 DENND3 FLRT3
F10 AK052414 ZFP800 CFLAR SOCS3
PTX3 TMEM67 TRIM25 GYK CLEC4E22 -->
MMP25 PALM2 LNP RCAN1 SQSTM1
CIAPIN1 MERTK ZUFSP PIP5K1A PDE4B
IFT172 RHOB CD180 GPD2 CXCL3
PNP LRCH3 RAP1B SERPINA3G MT2
BIRC3 BCL2A1D IER3 ITGA5 MET
CXCL16 CD47 MTMR14 IL12RB2 HSPA5
CD72 LCN2 CD83 PPP1R15A AOAH
ATF3 9230105E10RIK DENND4A ASCC3 TGM2
HIST3H2A MXD1 CMPK2 NCK1 NPY
DHX58 GM6644 CCL2 C5AR1 MFLJ00294
ITGA4 AP3M2 MINA ST3GAL1 2310016C08RIK
IRF7 UBR4 LY6C2 IRF9 TNFRSF1B
RASA4 D1ERTD622E EXPI PTTG1 MAPKAPK2
LNPEP MMP13 1190002H23R IK PTPRJ SLC16A10
ASB13 PROCR FCGR1 PARP14 AK217941
IL12B MNDAL DDX60 TIFA TNF
NOS2 5730508B09RIK STAT2 VWA5A PDPN
PPP1CB JAK2 TNFSF9 HK2 CD44
PRDX1 GBP5 STXBP3A MPP1 CXCL2
SP100 RILPL2 P2RY13 AFF1 CCRL2
TDRD7 NFKBIZ CCL7 LMO4 PTPRE
PAPD4 H2-T23 IFI203 HIF1A MARCO
RASGEF1B DTX3L PFKFB3 SLPI IL1B
1600014C10RIK GNG12 FAM46C GM8979 SGK1
H1F0 NOTCH2 ALDH1B1 LY6I
CCR7 CAML TLE3 2010106G01RIK
MINPP1 SEMA6D RAB10 FBXL3
在一些实施例中，该靶基因是一种包含Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域的衔接蛋白(TIRAP)。在一些实施例中，该调控剂改变TIRAP的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该调控剂改变与TIRAP相关联的基因(如通过非限制性举例的方式，来自在以下表7中所示的那些中的基因)的表达、活性和/或功能。在表7中加下划线的基因是当TIRAP不存在(例如，敲除)时被上调的基因，并且未加下划线的基因是当TIRAP不存在(例如，敲除)时被下调的基因。表7.
LYZ1 TLR3 GBP9 DDHD1 ARHGEF3
SGK1 DENND1B ST8SIA4 AW112010 BTG1
PRDX1 PMP22 UBC CD72 APPL123 -->
ACSL1 FAM20C FOSL2 ANKRD17 MTPN
MET FAM102B MPP1 NOS2 MFLJ00294
PDPN BATF2 PRDM1 CD47 NFKB2
CLEC4D PTAFR GTPBP2 LDLR IL1A
PTPRE TIFA FAM53C DLGAP4 CD40
9030425E11RIK PYHIN1 LRRK2 RELA FBXL3
MMP13 EPSTI1 JHDM1D MINA ITGA5
LY6C2 CD274 PLK2 EXT1 4930523C07RIK
MCOLN2 A430084P05RIK CRBN ANKRD57 SWAP70
DENND3 F10 ISG20 SDC4 G530011O06RIK
SLPI 1810029B16RIK MALT1 WARS CXCL1
RSAD2 SLC16A10 PLEKHN1 PPP4R2 SH3BP5
CD38 DDX60 LRCH1 CHAC2 NFKBIE
1190002H23RIK OAS2 MCA32 CAR13 2310004I24RIK
SLC7A8 THBS1 PTGES SLC25A22 PIK3R5
ZCCHC2 NAA25 PSMB10 LZTFL1 NFKBIA
FCGR1 PHC2 WHSC1L1 AK139528 DNAJB6
LY6A VCL MPA2L FBXO11 BIRC3
MT2 BST2 H3F3B AK138792 BCL2L11
IRG1 CLEC4E SLFN1 HSPA5 ICOSL
PPAP2B MXD1 TGM2 JAK2 A230046K03RIK
IFIT3 HCK AK178429 SLFN2 INSIG1
RALGDS CCL2 SLC20A1 GYPC DUSP16
EGR2 MX2 XRN1 CXCL3 PDZK1IP1
PTX3 IER3 TMEM67 TMCO3 IRF8
LY6I VWA5A MS4A4C PTTG1 LMO4
SLFN5 MFSD7 DNAJB4 SBDS MTDH
GPR141 PARP10 SGMS2 WDR37 SOCS3
HIF1A SAMHD1 MITF FLRT3 ST3GAL1
E030037K03RIK IL1F9 UPP1 PELI1 CD83
CD180 PSTPIP2 NUB1 RNF19B NFKB1
FABP3 RGS14 BPAG1 PGAP2 PVRL2
SGMS1 FCGR4 IL18BP CSF1 SEMA6D
STAT1 AK200837 IRF7 UBXN2A KYNU
P4HA1 MNDAL ZNFX1 TNIP1 BCL2A1A
C5AR1 PLEKHO2 PNPT1 OSGIN2 EIF2C3
CMPK2 NOTCH2 AK050909 JUNB DENND4A
CALCRL FAM26F IL12RB2 H1F0 IL23A24 -->
CAV1 OPTN DNAJC13 1200009I06R IK CCNG2
FOS STXBP3A GTF2B RAB8B NFKBIB
FAM46C IFI203 SETDB2 MTMR14 BATF
CFB CCRL2 SLFN10-PS FGL2 PALM2
SLC7A2 H2-T24 ISG15 KPNA3 EBI3
STK38L AK042010 LY75 CD86 MMP25
HK3 TMEM219 BC006779 BTG2 PNRC1
GM14446 TAP2 USP12 MARCKSL1 CCND2
GPD2 IFIT1 NT5C3 TET2 FILIP1L
IFIT2 GM6644 SGCB BC035044 EHD1
KLF3 MERTK CASP7 H2-Q7 SAMSN1
CST7 MEF2A TRIM5 SLC39A14 AY096003
SLC25A37 6330409N04RIK NMI BCL2L1 BCL2A1D
CLCN7 OSBPL3 ZFP800 HSD17B11 CISH
CASP1 LAP3 F830016B08 RIK AA467197 NUP62-IL4I1
IL15RA PLAUR CCL4 CCR7 CCL3
JARID2 DYNC1H1 ZUFSP RNF214 TBC1D1
EGR1 P2RY13 DENND5A ETV3 9030625A04RIK
IRF1 TXNRD1 HEATR5B AK139487 CCL17
D1ERTD622E ARFGEF1 RABGEF1 MARCO PPP1CB
SNX10 LRP12 TNFAIP3 HIST1H4D TRAF1
CXCL10 PNP ZSWIM4 PMAIP1 BLNK
I830012O16RIK SAMD9L AK150559 TNIP3 CD80
2310016C08RIK OASL1 TIMP1 AK052414 TNFSF15
DRAM1 1110038F14RIK ST3GAL5 CXCL16 REL
MKIAA1994 MLKL MKIAA1823 GM6377 BCL2A1B
NPY FRMD4B TSHZ1 RGS1 PDE4B
FBXO30 ARG2 MAX SEC24B FAM177A
SLFN3 GNG12 PTPRJ ARF4 FAM129A
ADAP2 IGTP PPA1 2010106G01R IK KTELC1
HIST3H2A P2RY14 ARL5C CD14 RND3
FPR1 RNF34 ITGA4 CD200 TMEM39A
MDM2 CD44 AMN1 A630001G21R IK GADD45B
IL1RN ASB13 LYRM1 TMCC3 PTGS225 -->
PLEKHF2 GVIN1 IL27 TAPBPL NFKBIZ
TLR7 ALDH1B1 GM14047 SRGN CCL22
SPATA13 ZCCHC6 TOR1AIP1 IL18 STAT5A
LGALS3BP OAS1G ZBP1 TAGAP IL1B
XAF1 RASA4 FAM108C GPR85 IL6
IFI205 IRAK3 RNF2 IFI27L2A BCL2A1C
DAB2 GBP4 FBXW17 CFLAR IL12B
1600014C10RIK MAMLD1 TREM1 CXCL2
MMP14 SVCT2 IL15 NCK1
NRP2 GBP6 TNFAIP2 MS4A6C
OLR1 HIPK2 SMIF AKNA
在一些实施例中，该靶基因是Stat1。在一些实施例中，该调控剂改变Stat1的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该调控剂改变与Stat1相关联的基因(如通过非限制性举例的方式，来自在以下表8中所示的那些中的基因)的表达、活性和/或功能。在表8中加下划线的基因是当Stat1不存在(例如，敲除)时被上调的基因，并且未加下划线的基因是当Stat1不存在(例如，敲除)时被下调的基因。
表8.
RSAD2 PTTG1 DCK ST3GAL1 RBM7
IFIT2 OAS1G RHBDF2 MAMLD1 H2-M2
IFI204 USP25 IRF1 TIFA F10
CMPK2 IGTP TMEM2 FAS RASA2
IFIT1 SETDB2 H2-T10 SCARF1 ICOSL
IFI203 PML CCL3 NDRG1 TSHZ1
PYHIN1 CCL4 PRPF38A MED21 IRG1
RTP4 DHX58 TMCC3 CCNL1 THBS1
TRIM30D LAP3 MOV10 SLC7A11 SLC16A10
USP18 GBP3 AFF1 IL12RB2 GPR84
IFI47 EHD4 CFLAR 2310016C08RIK MEF2A
MNDAL NMI AZI2 SGMS2 PPP1R15A
GM12250 ETNK1 MS4A6D SLC25A25 CXCL2
IFI27L2A CD69 ADAP2 SLC7A2 CCR7
SLFN8 TOR1AIP1 A230046K03RIK INPP5B TRAF1
SLFN5 MTHFR STARD3 CDYL2 9030425E11RIK
IRGM1 CASP11 GBP9 SLC25A37 SERPINB9
OAS1A TREX1 IL18 SVCT2 TNIP1
NT5C3 IRF9 XKR8 IL1A MT2
IFI205 ATF3 RNF114 CD44 SAMSN126 -->
OASL2 FRMD4A TFG SPIC PRDX1
PARP14 2810474O19RIK GM5431 top1 1200009I06RIK
GM4951 GM14446 SGCB FAM129A LRRK2
MX1 TMEM106A TMEM140 AP4B1 RPS6KA2
GM8979 PNP CISH TNF TREM1
IFIT3 IL27 FBXW17 TRMT61B TNFSF9
XAF1 LGALS9 UBA7 PVR MMP14
AI607873 SLFN9 IRF8 GPR85 CXCL3
AK172683 SLFN1 AK138792 HIPK2 MFLJ00294
GM4902 DDHD1 MLKL EHD1 MARCKSL1
AA467197 NOS2 MITD1 NFKBIA TIMP1
TRIM30A AIDA SMG7 ARHGAP31 TLR6
D14ERTD668E IFI44 AK035387 NFKBID STK38L
IL15 FNDC3A MPP1 AMN1 PTAFR
IRF7 9230105E10RIK NAMPT 3110043O21RIK EGR1
CXCL10 IL18BP KATNA1 PIK3AP1 BPAG1
AK217941 G530011O06RIK ISG20 SKIL KLF7
IFITM3 KYNU TIPARP CD83 RNASET2B
ZBP1 SAT1 TLR3 DNAJB4 IRF4
DDX58 AK142678 MITF GTF2B TXNRD1
GBP2 MS4A6C OSM CCRN4L NLRP3
H2-T23 SP140 TGIF1 SERPINB2 ACSL1
MPA2L TRIM34 CST7 CALCRL SERPINB9B
HERC6 I830012O16RIK SMIF CLCN7 MMP13
IIGP1 BC147527 PPP1CB BRAF LY6I
DAXX CCND2 CFB LY6A CLEC4D
LGALS3BP BC006779 RNF2 PLAGL2 ST8SIA4
EIF2AK2 AFTPH MCMBP SLC39A14 BC035044
PARP9 RASA4 AOAH PLA2G4A ZSWIM4
TAP1 FGL2 ARHGEF3 EBI3 IER3
SLAMF7 ISG15 CCL22 LMO4 ATXN7L1
STAT2 GBP4 INTS12 RAB20 CD14
BST2 CLIC4 NCOA7 NUDT17 ALDH1A2
AW112010 SLC25A22 1600014C10RIK METRNL FOSL2
GVIN1 AIM1 FOS SGK1 GPD2
SP100 ADAR MPP5 PSTPIP2 CLEC4E
STAT1 MINPP1 1810029B16RIK FAM108C SGMS1
GBP6 PPM1K ETS2 PPP1R10 UBE2Q2
SAMD9L FAM46A NUP54 LASS6 SERPINB6B
MX2 CD274 MET CRBN CAR2
ZUFSP F830016B08RIK MCOLN2 P2RY13 EGR2
IFIH1 SGK3 AK178429 BC031781 GRAMD1B
TRIM5 REL HIST3H2A IFRD1 KLF3
BCL2A1B PLEKHF2 SLC3A2 HMGN3 CIAPIN1
E030037K03RIK TMEM184B PPP2R5A RALGDS SPATA13
IFI35 GNB4 ARID5B JARID2 IRAK3
MS4A4C LARP1 RNF19A PLSCR1 APOL7C
TNFSF15 PGAP2 VWA5A CPD NIACR1
DTX3L 5-Mar ANXA7 MALT1 CXCL1
PHF11 IL7R RFFL NFKBIB PTGES
TOR3A 9930111J21RIK1 PPAP2B TPR LY6C2
RND3 RIN2 MARCO MKI67 ORAI2
TRIM25 OAS2 RAB10 APBB2 CLU
IRGM2 MAFK JHDM1D FLRT3 PTPRE
PARP12 PSMB9 IFT172 TGM2 C5AR1
OAS3 CH25H RABGEF1 TARM1 LCN2
OASL1 KPNA3 NRP2 MKIAA0769 ARG2
DDX60 PCGF5 INHBA SLC20A1 SLPI
MXD1 RAP2C SNX10 AK042010 IL1F9
SAMHD1 MBNL2 PLK3 GNG12 PTX3
RNASET2A PARP11 TNFAIP2 DUSP16 CD38
NLRC5 FAM26F BIRC6 PILRA GM6644
ZNFX1 4930523C07RIK PPP4R2 BHLHE40 SAA3
BCL2A1D PELI1 FPR2 FPR1 SOD2
在一些实施例中，该靶基因是干扰素产生调节物(IFNR)。在一些实施例中，该调控剂改变IFNR的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该调控剂改变与IFNR相关联的基因(如通过非限制性举例的方式，来自在以下表9中所示的那些中的基因)的表达、活性和/或功能。在表9中加下划线的基因是当IFNR不存在(例如，敲除)时被上调的基因，并且未加下划线的基因是当IFNR不存在(例如，敲除)时被下调的基因。
表9.
ACSL1 IRG1 OSM FNDC3A LGALS3BP
RPS6KA2 SGK1 APBB2 HSPA5 PRPF38A
SLPI SERPINB9B GTF2B IL18 TMCC3
PTPRE MFSD7 LCP2 XRN1 9030625A04RIK
PTX3 KTN1 SLC3A2 SAT1 VCAN28 -->
LYZ1 TIFA JARID2 P4HA1 OAS1G
PMP22 IFNB1 RCAN1 USP25 BC147527
CXCL2 LY6C2 TMEM167B TMEM184B HERC6
IER3 ARG2 FLRT3 BCL2A1D CD47
CLEC4E CCL7 MDM2 F830016B08RIK APOBEC3
CXCL1 PIP5K1A VCAM1 AZI2 AW112010
MALT1 RGL1 TLR1 SLFN2 MXD1
LMO4 NUP54 ZCCHC2 MINPP1 IGTP
TXNRD1 HIF1A CCNL1 ATF3 BC013712
IFRD1 SH3BP5 KLF7 LARP1 PGAP2
TNF PLAT MFLJ00294 SP140 SETDB2
9030425E11RIK 6330409N04RIK INPP5B UBE2L6 PML
CD38 GRAMD1B FAM102B AK142678 ZNFX1
EGR2 MMP14 3110043O21RIK BFAR LAP3
BC031781 PPFIA1 NFKBIA TRIM5 PARP12
SLC20A1 FAM46C TNFAIP2 IRF8 GBP3
INHBA GPR84 TRIM13 TFG ADAP2
METRNL 1200009I06RIK CRBN KPNA3 GVIN1
PLK2 ST8SIA4 PSTPIP2 ZC3H7A SLFN9
1190002H23RIK PLEKHO2 PLAGL2 P2RY14 EIF2AK2
ZSWIM4 RFFL GCNT2 NAMPT KYNU
LRP12 DNAJB4 THBS1 IKZF1 IRGM2
CXCL3 SLC7A2 AK200837 NUB1 ZUFSP
CCL2 FAM108C TPR MYD88 AI607873
FABP3 ARHGAP31 NFKB1 FAM26F MPA2L
RASA2 OLR1 ZEB2 AFF1 A230046K03RIK
MKIAA0769 RABGEF1 CDYL2 PPM1K OAS3
ALDH1A2 F10 MED21 9930111J21RIK1 IFI204
SPIC HIPK2 STK38L EHD4 MX2
TSHZ1 UPP1 ARID5B BBX E030037K03RIK
MT2 PVR MBNL2 SAMD9L FGL2
PPP1R15A IRAK-2 TLR6 ETV3 DTX3L
PRDX1 SQSTM1 APPL1 UBA7 MS4A6C
MET TLR2 CHAC2 PLEKHF2 PARP14
FBXO30 AK217941 DCBLD2 CCDC86 IFI35
MMP13 PLA2G4A RNASET2B TCF4 1110018G07RIK
PDPN CD200 FRMD4B IL15RA IL12B
CLEC4D IL20RB H3F3B KTELC1 TOR3A
CD44 H2-M2 OSBPL3 I830012O16RIK NLRC529 -->
MCOLN2 DENND3 GTPBP2 LNPEP TOR1AIP1
SGMS1 RNASET2A AK163331 DYNC1I2 AK172683
TNFAIP3 JHDM1D RNF114 ISG15 ETNK1
ADORA2B CLCN7 BIRC3 MTHFR LGALS9
2310016C08RIK ELL2 TNIP3 RND3 MS4A4C
RALGDS RNF19A ISG20 GBP4 ZBP1
SPATA13 LASS6 MORC3 5730508B09RIK GBP2
ORAI2 IFT172 KATNA1 TAGAP SLFN5
TNIP1 H2-Q7 FRMD4A SLAMF7 CCND2
RBM7 SLC39A14 PSMB10 STXBP3A PTTG1
BPAG1 UBE2Q2 ANKRD17 RNF19B TRIM25
top1 RAB12 TLR3 CD86 NMI
MAPKAPK2 CAV1 BTG2 CD14 DHX58
AK050909 LCN2 AK035387 PCGF5 GM8979
OPTN ANXA7 CCL22 GNB4 STAT1
TNFSF9 PPP4R2 AIDA CPNE3 DDX58
NUPR1 FPR1 NFKB2 PARP11 TAP1
CLU PTAFR SERPINA3G IFI205 PHF11
PPAP2B CAR2 SMG7 TRAFD1 IIGP1
NRP2 MKIAA0694 BCL2A1B AFTPH STAT2
EGR1 DENND5A ZFP800 IFI44 CXCL10
SAA3 TGM2 BCL2A1A ZFP36 TRIM30A
IRAK3 NFKBIB EIF2C3 IL18BP IRF7
IL1A IL12RB2 GM6548 WHSC1L1 CD69
SOD2 TIMP1 MAP2K1 ITGA5 DAXX
KLF3 ZC3H12C CEPT1 STARD3 SP100
PLAUR CCL3 GM5431 VCPIP1 XAF1
U90926 GM6377 TRIM26 MS4A6D IFIT1
MARCKSL1 CLN3 XKR8 IRF9 IFIT3
IRF4 CAR4 ITGA4 TOR1AIP2 GM4951
SLC25A37 ETS2 TAPBP DDX60 D14ERTD668E
VCL LRRK2 TLE3 ADAR IRGM1
MPP5 GNG12 RNF139 FBXW17 BCL2A1C
PLSCR1 NDRG1 FAM46A PLA2G16 SLFN8
PTGES ENC1 AK139487 SGK3 TRIM30D
A130040M12RIK TLR7 PSME2 PSMB9 IL15
P2RY13 JUNB TRA2A CD80 PYHIN1
IL1F9 SLC12A6 PPA1 5-Mar NT5C330 -->
LZTFL1 SGMS2 4930523C07RIK TNFSF15 OASL2
AK042010 NUDT17 IL10RA DCK IFI27L2A
GPD2 ITGAV NOD1 OASL1 OAS1A
SLC39A2 SLC16A10 B3GNT2 9230105E10RIK RTP4
FAM20C RNF2 MAF MITD1 GM12250
ATXN7L1 CCRL2 H2-T10 2810474O19RIK RSAD2
AP4B1 CPD AIM2 BST2 CMPK2
AK163103 OSGIN2 PNRC1 SLC25A22 IFI47
ACPP APOL7C CCNG2 PARP8 IFITM3
DAB2 AK178429 REL SAMHD1 GM4902
SERPINB6B LY6I RIN2 TREX1 USP18
CALCRL GM14047 CASP11 GM14446 MX1
GM6644 FOSL2 DENND1B BC006779 IFIT2
C5AR1 NFKBID DYNC1H1 GBP6
SERPINB2 PFKFB3 GBP9 SLFN1
MKI67 ALCAM MIER3 PARP9
RAB20 NLRP3 OAS2 IFI203
在一些实施例中，该靶基因是来自以下在表10、表11或表12中所列的那些中的一种或多种基因。在一些实施例中，该调控剂改变该一种或多种靶基因的表达、活性和/或功能。在表10、表11和/或表12中加下划线的基因是当靶基因不存在(例如，敲除)时被上调的基因，并且未加下划线的基因是当靶基因不存在(例如，敲除)时被下调的基因。
表10.
IFIT2 IRGM2 H2-T23 CLEC4E TAPBPL
MX1 SLC7A2 STAT5A GPR84 NFKBIA
IFI47 BC147527 DENND4A RHOB RBM7
TRIM30D IFIH1 GCA RAB9 RABGEF1
IL12B GVIN1 AK217941 CSF1 SOD2
GM12250 DDHD1 PLEKHF2 SMIF ETS2
PYHIN1 KTELC1 GM5431 SBDS RILPL2
BTG1 NAMPT TNFSF8 MKI67 SLC16A10
GM4951 GM14446 AK035387 CASP3 RHBDF2
IFIT3 IRF9 5-Mar PFKP TXNRD1
IFIT1 SLFN1 PDZK1IP1 GM14047 DAB2
GM4902 SAMHD1 MCMBP TLR7 BCL2L11
CMPK2 1110018G07RIK SLC25A22 GRAMD1B CCL7
IL15 FAM129A MCA32 RASA2 BHLHE40
NT5C3 IGTP PSME2 UBR4 KLF331 -->
GBP3 APOBEC3 SLC2A6 CDC42EP4 UBC
RSAD2 STAT1 PPM1K PPP1R15B NDRG1
GBP5 RIN2 GYPC PRKX UPP1
SLFN8 HK2 ZDHHC21 GNG12 FAM46C
TRIM30A MS4A6D PARP10 SPATA13 CLCN7
AW112010 CXCL16 PNP2 MMP14 TGIF1
CD40 CD80 IL6 RARS GTF2B
DTX3L H3F3B ALCAM RNF31 CDKN1A
USP18 RND3 NOD1 SLC25A25 SLC11A2
OASL2 RAB32 SNX10 CAV1 MCOLN2
GBP2 IRF8 PARP11 PI4K2A PLSCR1
SKIL ZUFSP XKR8 PENK MALT1
HERC6 9030625A04RIK GBP9 CLEC4D CCRL2
STAT2 PML P2RY14 SGK1 PTAFR
D14ERTD668E MAF CASP11 GCNT2 RGL1
IIGP1 SGK3 SERPINB9 UBE2Q2 FOSL2
XAF1 BCL2A1A CCR7 METRNL FABP3
AA467197 AK139528 GLIPR2 PLEKHN1 NLRP3
CCND2 TMCC3 STXBP3A SPIC ZFP36
PARP9 AIDA FAM177A HK3 LCP2
SLFN5 CEPT1 MORC3 BCL2L1 HIPK2
MS4A6C PPP1CB TRAFD1 MKIAA1673 IL1A
DHX58 BIRC3 RAP2C PSTPIP2 MPP5
PARP12 GBP4 9930111J21RIK1 AK200837 SERTAD2
CCL22 UBE2L6 CPNE3 AP4B1 MAPKAPK2
MS4A4C VCAN TMEM184B SOCS3 SQSTM1
DDX58 I830012O16RIK KPNA3 PPAP2B ZCCHC2
PHF11 PLA2G16 OAS1G SLC25A37 MEF2A
RTP4 TNFAIP2 CASP7 MDM2 CCL4
CXCL10 4930523C07RIK TBC1D1 SLC3A2 PLAGL2
GBP6 AI607873 ETNK1 PILRA ARG2
IFI204 FPR2 BC013712 STAT3 RPS6KA2
ADAP2 PTTG1 IFI203 ZC3H12C LRP12
JAK2 USP25 AY096003 LASS6 NUP54
SDC4 NOTCH2 TMEM67 PRDM1 NFKBID
IFITM3 NUP62-IL4I1 1600014C10RIK TLR2 HSPA5
DDX60 MINA MTHFR SLC7A8 CPEB432 -->
SLFN9 SLFN2 MINPP1 FAM53C 6330409N04RIK
KYNU BLNK NCOA7 ARHGAP31 CXCL1
NLRC5 TAGAP SGCB SGMS2 ATF3
MX2 TNFRSF1B KATNA1 VCL SLC20A1
9230105E10RIK OAS3 XRN1 SEC24B top1
CD69 PELI1 AZI2 NRP2 PMP22
PARP14 TRIM34 SAMD9L NFKBIZ NFKBIB
BCL2A1D AK139487 IL7R OSM INHBA
GM8979 IL27 ISG15 IL1F9 PLEKHO2
IFI205 ZNFX1 CCDC25 IFNB1 FAM20C
BCL2A1B OAS1A GPR141 TNFSF4 NPY
E030037K03RIK MNDAL TMCO3 TNIP1 SERPINB2
AFTPH RNASET2A GBGT1 OSGIN2 ZSWIM4
ARL5C MAP2K1 4930453N24RIK PGF PLK3
FAM102B FAM26F SERTAD3 SLC39A2 FBXO30
FGL2 CD86 PPFIA1 MET PTX3
IRF7 INSIG1 F10 TNFAIP3 PIP5K1A
OASL1 MARCKSL1 GNA13 PVR IFRD1
AK138792 IFI44 GYK A130040M12RIK MMP13
CCL5 DAXX LGALS9 PRDX1 FLRT3
NFKB1 ST3GAL5 AIM2 THBS1 IRF4
SLCO3A1 RAB8B IL20RB OLR1 GM6644
TNFSF15 BIRC6 REL MAFK 2310016C08RIK
ITGA4 EBI3 3110001I22RIK IL12RB2 PTPRE
ZBP1 BBX AK042010 TRIM13 CISH
AK142678 A230046K03RIK AKNA ARID5B DNAJB4
SP100 2010106G01RIK IRAK3 MFLJ00294 TGM2
SMG7 MTPN CD38 TNFSF9 JUNB
TCF4 NOS2 TMEM219 PDPN MT2
CD47 CD83 AK178429 MAMLD1 PLK2
NMI SP140 P2RY13 EXPI BC031781
F830016B08RIK GNB4 ELL2 9030425E11RI K CCL3
TAP1 MITD1 CD180 AK050909 TNF
PARP8 IL18BP PTGES IL1RN RALGDS
PCGF5 IKZF1 NFIL3 RCAN1 CAR2
IL15RA BST2 OLFR110 TRMT61B PLAUR
MPA2L PVRL2 PROCR RNF2 EGR2
TRIM5 OAS2 PHC2 RAB20 PPP1R15A33 -->
TOR1AIP1 MMP25 NIACR1 PIK3AP1 CXCL2
9430076C15RIK ADAR ZC3HAV1 CCRN4L IER3
UBA7 IL18 ADORA2B DUSP1 CCL2
EIF2AK2 IFI35 LY6C2 OPTN 1190002H23RI K
SAT1 PSMB9 INTS12 TNIP3
IRGM1 DRAM1 ORAI2 PTGS2
2810474O19RIK TLR3 NUB1 SLPI
TOR3A MOV10 SERPINB9B RASGEF1B
TARM1 ICOSL ARF4 SGMS1
表11.
SAA3 H1F0 DDX60 IRF4 GTF2B
MARCO TSHZ1 APOBEC3 PRKX PHC2
LMO4 TCF4 RND3 RAB9 PFKP
BCL2A1C SWAP70 SLC12A6 GBP9 RANBP2
MS4A6C MAF ARHGEF3 GCNT2 MCOLN2
HCK BC147527 BCL2A1D MTMR7 LYZ1
BLNK TRIM34 PNPT1 MEF2A AMN1
AOAH IFI205 VCAN ARL5C IL1B
NUP62-IL4I1 PSTPIP2 DHX58 TNFSF4 EHD4
BIRC3 BC013712 BC006779 6330409N04RIK ZCCHC2
MX1 PPP1CB ORAI2 SLC11A2 NAA25
9030625A04RIK SEMA6D ZC3H7A NFKB2 IFI203
TRIM30A TARM1 GM14005 LRRK2 MXD1
AW112010 AK139528 IRGM2 SCO1 NPY
MMP14 JAK2 SLFN5 SMIF REL
FPR2 OAS1A CFB SGK1 CSF1
DRAM1 UBA7 ITGAV CLEC4D SERPINA3G
STAT2 GM12250 TMEM106A FAM53C IL23A
EBI3 PARP10 MITF HSPA5 PIP5K1A
SLFN8 MINA ARFGEF1 HK2 CCL17
USP18 IRAK3 MKI67 NCK1 MNDAL
OSBPL3 UBXN2A BST2 ZC3HAV1 TNIP3
ST3GAL5 IRF9 NUDT17 SERPINB2 MDM2
IKZF1 AIDA FNDC3A CCNG2 BHLHE40
SLCO3A1 DYNC1I2 TAPBP GNA13 UBE2Q2
SNX10 ZEB2 PYHIN1 CHD1 OPTN34 -->
GPR141 TLR1 PPM1K H2-Q7 4930453N24RI K
MYD88 TRIM30D NAMPT TTC39B H3F3B
LASS6 IFIT1 JHDM1D STAT5A 9030425E11RI K
PIK3R5 FILIP1L CCND2 GOLGA3 SAT1
NFKB1 MTMR14 TAGAP OSGIN2 OSM
CPD AK139487 GNG12 METRNL FBXL3
CD38 INPP5B NRP2 HK3 RNF2
STAT1 PCGF5 CAR13 PTPRE PENK
A230046K03RIK 3110043O21RIK CHAC2 PLA2G4A LRP12
RAB10 SLFN9 NLRC5 SGCB 3110001I22RI K
FAM129A XRN1 MS4A6B SLC3A2 RALGDS
RAB32 ADAR SP100 SAMHD1 KLF6
IL12B TNFRSF1B NUP54 FCGR1 FBXO30
BATF IFI47 PARP8 ANKRD57 GM14047
SLC16A10 MFSD7 P2RY14 LYRM1 RPS6KA2
DTX3L DDHD1 IFI35 IQSEC2 SLC39A2
FPR1 PVRL2 FAM46A IL18BP ARG2
STXBP3A C5AR1 GBP3 ANXA7 MAFK
TNIP1 CLN3 D14ERTD668E SLC7A11 DNAJB4
GPR84 CASP7 IL13RA1 FOS SLC20A1
1200009I06RIK MAP2K1 GLIPR2 NFIL3 MET
PARP9 DENND4A CLEC4E HIF1A MMP13
SLC2A6 PSME1 FBXW17 PLEKHN1 MT2
PSMB10 TLR2 CMPK2 SLC15A3 CCRN4L
ICOSL CCL5 CCR7 CASP3 FABP3
PALM2 ATXN7L1 CXCL3 PLEKHO2 TNF
CCDC86 MS4A4C TRIM25 BPAG1 IL1RN
TMCC3 ZBP1 PPP4R2 PTX3 SLPI
CXCL16 DNAJB6 TET2 IFT172 EGR1
HERC6 CLIC4 F10 CIAPIN1 SQSTM1
FAM102B EPSTI1 SLC39A14 DCK ATF3
IRGM1 TBC1D1 MKIAA0694 RCAN1 CDKN1A
PSME2 MX2 SP140 SERPINB9B PPP1R15A
ACPP BC035044 ANKRD17 OLR1 FAM46C
AK150559 IL6 CD69 TRIM13 AK05090935 -->
CD40 H2-M2 KYNU BBX IFRD1
SAMSN1 SH3BP5 PLAT SGMS1 TGIF1
NMI PNP SEPW1 MKIAA1673 NLRP3
RTP4 TBK1 SOCS3 PMAIP1 FOSL2
LCN2 IRF7 SLC25A22 FAM82A2 NDRG1
TOR1AIP1 RNF114 MED21 ARID5B LAP3
GBP5 APOL7C RNF34 CD274 CCL7
IL18 EHD1 PTTG1 INSIG1 RGS1
PARP14 CLCN7 IL15RA TIPARP CXCL1
MARCKSL1 DDX58 LRCH1 SLFN1 A130040M12RI K
TRAF1 GPD2 RNASET2B top1 DUSP1
AKNA IGTP AFTPH AP4B1 BTG1
FAM20C TBC1D13 TFG ISG20 A430084P05RI K
PTPRJ TMEM39A TNFSF9 CARHSP1 CAR4
NCOA7 TRIM26 RNF135 MIER3 ZFP36
GPR85 FAS TLE3 TGM2 PMP22
USP25 LY6C2 PNRC1 SERTAD2 BC031781
IFITM3 PGAP2 CCNL1 TIMP1 SRGN
SGK3 PPP1R15B AK163331 SLFN3 NFKBID
TOR3A MKIAA1994 RNF19A PROCR ZSWIM4
KTELC1 FTSJD2 DENND3 VCAM1 UPP1
ZNFX1 ZUFSP SLFN2 I830012O16RIK JUNB
GADD45B PLAGL2 IL12RB2 H2-T24 CCL4
2010106G01RIK XAF1 PPAP2B UBC CAR2
OASL2 1110038F14RIK MCMBP PRDM1 EGR2
TAPBPL IL15 BRAF BTG2 RABGEF1
GBP2 UBE2L6 NFKBIB RASGEF1B H2-T23
TAP1 PSMB9 MFLJ00294 MERTK IL1A
MTDH LARP1 TLR3 RNF139 DAB2
EIF2C3 AK138792 THBS1 IL1F9 PTGS2
CD47 EIF2AK2 PDE4B RGL1 CISH
RELA MCA32 PFKFB3 SCARF1 CXCL2
PARP12 CD83 DENND1B GM6377 FLRT3
IFIH1 ARMC8 SBDS TMEM67 CCL2
IRAK-2 SEC24B RAB20 HIST3H2A PLK336 -->
PILRA DAXX ARF4 AK052414 PDPN
TNFSF15 MKIAA0769 AA960436 RFFL CCL3
ITGA4 BCL2A1B NOD1 IFI27L2A IER3
CCL22 GTPBP2 GNB4 CPEB4 G530011O06RI K
TRAFD1 AK217941 TREM1 OAS3 2310016C08RI K
TNFAIP2 LZTFL1 EXPI 2810474O19RIK INHBA
MS4A6D PDZK1IP1 CH25H RHOB PRDX1
KPNA3 MDFIC ETS2 A630001G21RIK PLAUR
TIFA ETNK1 CD80 HIPK2 1190002H23RI K
KLF7 MTPN LY75 IL7R PLK2
TREX1 ZDHHC21 STAT3 WARS
表12.
MX1 UBA7 DENND1B GNA13 AMN1
GBP3 BC147527 BIRC3 MCOLN2 SBDS
IFIT3 BC006779 XAF1 ITGAV CD14
IL15 GBP6 CCR7 NFKBID H2-T23
APOBEC3 ACSL1 INPP5B ARID5B SLC15A3
CXCL10 ZUFSP 9230105E10RIK SERPINB9B CAV1
GM12250 GM4951 PLEKHF2 top1 CCL7
ITGA4 FGL2 SERPINA3G RHOB BCL2L11
PYHIN1 ZBP1 P2RY14 LCP2 NFIL3
ADAP2 NOTCH2 TMEM39A GCNT2 DNAJB4
SNX10 RIN2 FCGR1 UPP1 TRIM13
GBP5 RTP4 MXD1 ALCAM ETS2
D14ERTD668E 9030625A04RIK BLNK MAMLD1 FABP3
CMPK2 APOL7C CPNE3 BRAF HSPA5
PSMB10 NCOA7 PML NDRG1 MET
AW112010 D1ERTD622E ETV3 NLRP3 CAR4
STAT1 RAB32 KATNA1 RGS1 TREM1
GM4902 PCGF5 DHX58 CDKN1A IL1A
GBP2 HERC6 TAGAP U90926 ZSWIM4
IRF1 MX2 5730508B09RIK APPL1 IL1RN
SLFN8 XRN1 RAP2C MFLJ00294 CPEB4
TRIM30D PARP9 STXBP3A SERTAD2 TRMT61B37 -->
GPR141 KYNU CD38 UBE2Q2 SLC3A2
ZNFX1 PIK3R5 EHD4 MAP3K8 LZTFL1
I830012O16RIK DDHD1 SGK3 TLR6 CCRN4L
EPSTI1 SETDB2 TRAFD1 SLC12A6 SLPI
BCL2A1C TBC1D1 TOR3A SLC25A25 OSGIN2
MS4A6C H1F0 GBP4 TNFSF4 CCL2
IFI205 TOR1AIP1 JAK2 TET2 RABGEF1
NLRC5 RAB10 C5AR1 RNF2 INSIG1
TBC1D13 PARP12 MNDAL 6330409N04RI K CCL17
USP18 LRCH1 RBM43 DCBLD2 OSM
IFIT2 IFITM3 TAPBPL LRP12 H2-T24
BC013712 MMP14 DDX60 DUSP1 ARL5C
IKZF1 DDX58 BBX NFKBIB CAR2
IIGP1 PTPRJ SLC25A22 FSTL1 CXCL3
FPR2 SLFN2 TMEM2 RAB20 IRF4
PHF11 E030037K03RIK DRAM1 SCO1 MMP13
TRIM30A PSME1 RAB8B 4930453N24RI K PLK2
GM14446 NT5C3 SERPINB9 OLFR110 MDM2
FAM26F EXT1 AIM1 EGR1 CCL4
PARP10 FAM129A TIFA MAFK FLRT3
IFIT1 GVIN1 FNDC3A FBXL3 CISH
STAT2 CCL5 TLR3 CHAC2 FOSL2
FILIP1L FPR1 AKNA VNN3 PPP1R15A
A230046K03RIK MITF TMCC3 SPIC BC031781
RSAD2 IL27 FOS GM14047 ATF3
MARCKSL1 PPM1K SP100 IFRD1 PRDX1
UBE2L6 DENND3 FRMD4A IFNB1 NPY
NMI PARP8 RALGDS UBC BTG2
1600014C10RIK TOR1AIP2 MTPN BPAG1 1190002H23RIK
IL15RA GM8979 RCAN1 GTF2B SRGN
CD40 SLFN9 CSF1 TTC39B EGR2
DTX3L MYD88 CXCL1 RND3 DAB2
IGTP PSME2 MTMR7 NUP54 PDPN
PARP14 OASL1 GM6644 TGIF1 PTPRE
SLFN5 MOV10 MPP5 ARG2 CXCL2
CD69 IFI203 FAM53C METRNL PTGS238 -->
IFI47 EIF2AK2 H3F3B JUNB BTG1
LASS6 AK150559 NIACR1 IER3 IL1F9
HCK GLIPR2 2310004I24RIK SLC39A2 G530011O06RIK
SLC2A6 SERPINB6B MKIAA1673 EXPI IL1B
OASL2 FBXW17 NFKB2 TIMP1 A130040M12RIK
DAXX MAF PPP4R2 SLC20A1 FBXO30
TAP1 SWAP70 PIP5K1A PLEKHN1 SQSTM1
IRGM2 SVCT2 HK3 FAM46C PROCR
IRF8 ZC3HAV1 SLC39A14 SLC11A2 PLK3
AK217941 CCND2 GRAMD1B A430084P05RI K CCL3
PSMB9 CD47 MINA RPS6KA2 PLAUR
IRGM1 MPA2L MKI67 CARHSP1 2310016C08RIK
INHBA
在此提供的技术的灵敏度允许检测和定义密切相关的细胞亚群。这些技术允许鉴定基因应答模块，例如，标签，其在不同的细胞亚群中选择性地被诱导。单细胞之间的相关分析有用于重建细胞回路和鉴定这些模块的调节物。
最近的分子研究已经揭示，甚至当衍生自一个“同质的”群时，单个细胞可以展现出基因表达、蛋白水平、和表型输出方面的显著差异(斯宾塞(Spencer)，S.L.，高德特(Gaudet)，S.，阿尔贝克(Albeck)，J.G.，伯克(Burke)，J.M.&佐尔格(Sorger)，P.K.在TRAIL-诱导的凋亡中非遗传来源的细胞间可变性(Non-geneticoriginsofcell-to-cellvariabilityinTRAIL-inducedapoptosis).自然459,428-432,doi:10.1038/nature08012(2009)；科恩(Cohen)，A.A.等人.单个癌细胞应答于一种药物的动态蛋白质组学(DynamicProteomicsofIndividualCancerCellsinResponsetoaDrug).科学(Science)322,1511-1516,doi:10.1126/science.1160165(2008)；聂佩尔(Niepel)，M.，斯宾塞(Spencer)，S.L.&佐尔格(Sorger)，P.K.非遗传细胞-至-细胞可变性和药理学后果(Non-geneticcell-to-cellvariabilityandtheconsequencesforpharmacology).化学生物学目前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)13,556-561,doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015(2009)；莎曼(Sharma)，S.V.等人.在癌细胞亚群体中的一种染色质介导的可逆药物耐受状态(Achromatin-mediatedreversibledrug-tolerantstateincancercellsubpopulations).细胞141,69-80,doi:10.1016/j.cell.2010.02.027(2010)；加斯科因(Gascoigne)，K.E.&泰勒(Taylor)，S.S.长时间暴露于抗有丝分裂药物之后癌症细胞展示出深度系间和系内变化(Cancercellsdisplayprofoundintra-andinterlinevariationfollowingprolongedexposuretoantimitoticdrugs).癌症细胞(Cancercell)14,111-122,doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002(2008)，具有重要的功能性结果(斯宾塞(Spencer)，S.L.，高德特(Gaudet)，S.，阿尔贝克(Albeck)，J.G.，伯克(Burke)，J.M.&佐尔格(Sorger)，P.K.在TRAIL-诱导的凋亡中非遗传来源的细胞间可变性(Non-geneticoriginsofcell-to-cellvariabilityinTRAIL-inducedapoptosis).自然459,428-432,doi:10.1038/nature08012(2009)；莎曼(Sharma)，S.V.等人.在癌细胞亚群中的一种染色质介导的可逆药物耐受状态(Achromatin-mediatedreversibledrug-tolerantstateincancercellsubpopulations).细胞141,69-80,doi:10.1016/j.cell.2010.02.027(2010)；加斯科因(Gascoigne)，K.E.&泰勒(Taylor)，S.S.长时间暴露于抗有丝分裂药物之后癌症细胞展示出深度系间和系内变化(Cancercellsdisplayprofoundintra-andinterlinevariationfollowingprolongedexposuretoantimitoticdrugs).癌症细胞14,111-122,doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002(2008)；费尼曼(Feinerman)，O.等人.通过效应子以及调节性T细胞的IL-2应答的单细胞量化揭示了在免疫应答中的关键的可塑性(Single-cellquantificationofIL-2responsebyeffectorandregulatoryTcellsrevealscriticalplasticityinimmuneresponse).分子系统生物学(MolecularSystemsBiology)6,1-16,doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2010.90(2010))。然而，有关细胞异质性的现有研究已典型地同时测量了仅小数目的预先选定的RNA(于(Yu)，M.等人.胰腺循环肿瘤细胞的RNA测序暗示在转移中的WNT信号传导(RNAsequencingofpancreaticcirculatingtumourcellsimplicatesWNTsignallinginmetastasis)，自然487,510-513,doi:10.1038/nature11217(2012)；拉杰(Raj)，A.，里夫金(Rifkin)，S.A.，安徒生(Andersen)，E.&范奥德纳德(VanOudenaarden)，A.基因表达上的可变性引起不完全外显率(Variabilityingeneexpressionunderliesincompletepenetrance)，自然463,913-918,doi:10.1038/nature08781(2010))或蛋白(斯宾塞(Spencer)，S.L.，高德特(Gaudet)，S.，阿尔贝克(Albeck)，J.G.，伯克(Burke)，J.M.&佐尔格(Sorger)，P.K.在TRAIL-诱导的凋亡中非遗传来源的细胞-至-细胞可变性(Non-geneticoriginsofcell-to-cellvariabilityinTRAIL-inducedapoptosis).自然459,428-432,doi:10.1038/nature08012(2009)；科恩(Cohen)，A.A.等人.单个癌细胞应答于一种药物的动态蛋白质组学(DynamicProteomicsofIndividualCancerCellsinResponsetoaDrug).科学(Science)322,1511-1516,doi:10.1126/science.1160165(2008)；聂佩尔(Niepel)，M.，斯宾塞(Spencer)，S.L.&佐尔格(Sorger)，P.K.非遗传细胞-至-细胞可变性和药理学后果(Non-geneticcell-to-cellvariabilityandtheconsequencesforpharmacology).化学生物学目前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)13,556-561,doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015(2009)；莎曼(Sharma)，S.V.等人.在癌细胞亚群中的一种染色质介导的可逆药物耐受状态(Achromatin-mediatedreversibledrug-tolerantstateincancercellsubpopulations).细胞141,69-80,doi:10.1016/j.cell.2010.02.027(2010)；加斯科因(Gascoigne)，K.E.&泰勒(Taylor)，S.S.长时间暴露于抗有丝分裂药物之后癌症细胞展示出深度系间和系内变化(Cancercellsdisplayprofoundintra-andinterlinevariationfollowingprolongedexposuretoantimitoticdrugs).癌症细胞14,111-122,doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002(2008)；达列尔巴(Dalerba)，P.等人.在人结肠肿瘤中的转录异质性的单细胞分解(Single-celldissectionoftranscriptionalheterogeneityinhumancolontumors).自然生物技术(NatureBiotechnology)29,1120-1127,doi:10.1038/nbt.2038(2011)；本多尔(Bendall)，S.C.&诺兰(Nolan)，G.P.跨人造血连续统一体的差异免疫和药物应答的单细胞质谱流式细胞术(Single-CellMassCytometryofDifferentialImmuneandDrugResponsesAcrossaHumanHematopoieticContinuum).科学(Science)(纽约，NY)332,677-678,doi:10.1126/science.1206351(2011)，因为基因组谱方法(本多尔(Bendall)，S.C.&诺兰(Nolan)，G.P.跨人造血连续统一体的差异免疫和药物应答的单细胞质谱流式细胞术(Single-CellMassCytometryofDifferentialImmuneandDrugResponsesAcrossaHumanHematopoieticContinuum).科学(Science)(纽约，NY)332,677-678,doi:10.1126/science.1206351(2011)；阿尔特舒勒(Altschuler)，S.J.&吴(Wu)，L.F.细胞异质性：这些差异有影响么？(CellularHeterogeneity:DoDifferencesMakeaDifference？)细胞141,559-563,doi:10.1016/j.cell.2010.04.033(2010)；卡里斯凯(Kalisky)，T.，布莱内(Blainey)，P.&奎科(Quake)，S.R.在单细胞水平的基因组分析(GenomicAnalysisattheSingle-CellLevel).遗传学年度综述(Annualreviewofgenetics)45,431-445,doi:papers2://publication/doi/10.1146/annurev-genet-102209-163607(2011)；卡里斯凯(Kalisky)，T.&奎科(Quake)，S.R.单细胞基因组学(Single-cellgenomics).自然方法(NatureMethods)8,311-314(2011))不能被应用至单细胞直到最近(伊斯兰(Islam)，S.等人.通过高度多重RNA-seq表征单细胞转录景观(Characterizationofthesingle-celltranscriptionallandscapebyhighlymultiplexRNA-seq).基因组研究(GenomeResearch)，doi:papers2://publication/doi/10.1101/gr.110882.110(2011)；唐(Tang)，F.等人.RNA-Seq分析以捕获单细胞的转录组景观(RNA-Seqanalysistocapturethetranscriptomelandscapeofasinglecell).自然－实验手册(NatureProtocols)5,516-535,doi:10.1038/nprot.2009.236(2010)；唐(Tang)，F.等人.单细胞的mRNA-Seq全转录组分析(mRNA-Seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecell).自然方法(NatureMethods)6,377-382,doi:10.1038/nmeth.1315(2009)；拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012)；哈什姆肖尼(Hashimshony)，T.，瓦格纳(Wagner)，F.，谢尔(Sher)，N.&柳井(Yanai)，I.CEL-Seq：通过多路复用线性扩增的单细胞RNA-Seq(CEL-Seq:Single-CellRNA-SeqbyMultiplexedLinearAmplification).细胞报告(CellReports)，doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003)。这里，单细胞RNA-Seq被用来研究一种模型哺乳动物系统，由脂多糖(LPS)刺激的骨髓源性树突细胞(BMDC)的应答中的异质性。广泛的，并且先前未观察到，双峰变化发现于RNA转录物的丰度和剪接模式两者上，这独立地通过所选择的转录物的RNA-荧光原位杂交验证。具体地，数百关键免疫基因跨单个细胞双峰式表达，出人意料地甚至针对在群体平均值非常高表达的基因。此外，跨单细胞的剪接模式证明先前未观察到的异质性水平：对于在群体水平的具有多个剪接同种型的基因，单个细胞显示向着主要表达一个具体同种型的偏向。如由在此提供的实例所示，这些细胞间差异通过在细胞状态和细胞回路使用两者方面的异质性驱动。虽然一些双峰性反映密切相关但又不同的已知成熟度状态的BMDC的存在，其他双峰模式甚至存在于相同成熟度状态的细胞中，反映了在其他方面相同的细胞之间的关键调节回路的使用方面的差异。例如，鉴定了137个高度可变又被共调节的抗病毒应答基因的一种模块。使用来自敲除小鼠的BMDC，在此呈现的研究证明，这个抗病毒模块的双峰性可以通过涉及主抗病毒转录调节物Stat2和Irf7的一种干扰素回路传播。这个研究证明了无偏单细胞基因组在揭露细胞之间的广泛功能多样性以及在解密细胞状态和回路方面的能力和希望。
以上分析提供一种概念验证，证明了在相同的条件和总状态下跨单细胞的转录物之间的共变如何可有助于鉴定和装配调节回路，其差别使用促进显著的细胞异质性。确切地说，在该可变的回路(图19)中，需要干扰素信号传导来诱导Stat2和Irf7，这进而起作用以诱导可变的抗病毒簇基因。然而，这些实验不决定性地确定该回路的那种组分引起所观察到的异质性本身。一种令人信服的可能性是，上游噪声是自该干扰素信号传导途径首先到Stat2和Irf7并且然后到靶基因而传播的。这一假设是被在Stat蛋白水平和核定位方面所观察到的变化支持的。它还被最近的研究支持(赵(Zhao)，M.，张(Zhang)，J.，法特纳尼(Phatnani)，H.，朔伊(Scheu)，S.和马尼亚蒂斯(Maniatis)，T.干扰素-？基因的随机表达(StochasticExpressionoftheInterferon-？Gene)，PLoS生物学(PLoSbiology)10,e1001249(2012)；艾泊斯托卢(Apostolou)，E.&塔诺斯(Thanos)，D.病毒感染诱导NF-κB-依赖性染色体间关联介导单等位基因IFN-β基因表达(VirusInfectionInducesNF-kappaB-dependentinterchromosomalassociationsmediatingmonoallelicIFN-betageneexpression).细胞(Cell)134,85-96(2008)；兰特(Rand)，U.等人.多层次随机性和旁分泌信号传播塑造类型I干扰素应答(Multi-layeredstochasticityandparacrinesignalpropagationshapethetype-Iinterferonresponse).分子系统生物学(MolecularSystemsBiology)8,doi:10.1038/msb.2012.17(2012))，证明了在哺乳动物细胞中在病毒复制过程中Irf7的过表达减少Ifn-β产生方面的异质性并且Irf7易位与在病毒刺激下的Ifnβ产生有关。值得注意的是，也观察到与Irf7和Stat2的水平强烈相关的干扰素刺激的基因(例如，Isg15)和干扰素-诱导的蛋白质的表达的可变性。这未在以均匀Ifn-β刺激进行的先前研究中观察到(赵(Zhao)，M.，张(Zhang)，J.，法特纳尼(Phatnani)，H.，朔伊(Scheu)，S.和马尼亚蒂斯(Maniatis)，T.干扰素-β基因的随机表达(StochasticExpressionoftheInterferon-βGene)，PLoS生物学10,e1001249(2012))，支持以下假设：干扰素反馈的可变性驱动下游异质性。
相似的策略可以潜在地被用来探索剪接方面的双峰性的后果。甚至仅看18个细胞，针对其同种型具有不同的功能性后果的基因观察到双峰剪接模式的有趣实例。例如，已知剪接调节物Srsf3和Srsf7各自包含“毒物盒外显子”，当包括时，其针对经由无义介导的衰变进行的降解靶向RNA(安科，M.L.等人.两种SR蛋白的RNA结合景观揭示独特的功能和与多个RNA类别的结合(TheRNA-bindinglandscapesoftwoSRproteinsrevealuniquefunctionsandbindingtodiverseRNAclasses).基因组生物学(GenomeBiology)13,doi:10.1186/gb-2012-13-3-r17(2012))。虽然这些外显子在群体水平非常弱地表达，单细胞中的一个(细胞S13，图20)在高水平排他地表达有毒的同种型(对于Srsf3和Srsf7两者，11个细胞排他地表达其他的)。由于Srsf3本身负责在负反馈环路增加其自身的毒物盒外显子的包含(安科，M.L.等人.两种SR蛋白的RNA结合景观揭示独特的功能和与多个RNA类别的结合(TheRNA-bindinglandscapesoftwoSRproteinsrevealuniquefunctionsandbindingtodiverseRNAclasses).基因组生物学(GenomeBiology)13,doi:10.1186/gb-2012-13-3-r17(2012))，S13可能在事实上代表了最高水平的Srsf3活性。当装备有较大数量的细胞时，相关性分析可以被用来鉴定Srsf3的潜在靶标。同时，在其他调节基因中的剪接差异可以进一步增强表达多样性：例如，通过Irf7的不同同种型编码的蛋白质-在细胞中双峰式剪接(图3c)-在体外差异激活干扰素-应答基因(宁(Ning)，S，乎耶(Huye)，L.E.&帕加诺(Pagano)，J.S.通过一种独立于干扰素信号传导的途径调节IRF7启动子的转录活性(RegulationoftheTranscriptionalActivityoftheIRF7PromoterbyaPathwayIndependentofInterferonSignaling).生物化学杂志(JournalofBiologicalChemistry)280,12262-12270(2005))。这些实例表明在剪接方面的异质性可以代表应答编码的另一个潜在层面。
在此提供的研究发现BMDC对LPS刺激的转录应答方面的广泛双峰性，反映在基因表达、可变剪接、以及调节回路活性上。在基因表达中，发现双峰式表达的数百转录物编码关键免疫蛋白(包括以群体平均值高表达的那些)。虽然一些基因的变化是归因于在不同成熟状态的少数亚群，但其他的则反映了抗病毒调节回路的双峰活性。跨单细胞的共变可以帮助剖析可能在群体规模测量上难以区分的细化的功能基因模块。具体地，在最近的群体-规模研究中(加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞(MolecularCell)47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))，鉴定了一大簇的808个“晚期诱导的”LPS基因，其富集成熟基因连同由STAT蛋白控制的抗病毒基因。单独基于群体-水平数据，这两个亚群不能被梳理开，但是来自单一时间点的单细胞数据清楚地辨别它们为表达于不同单细胞。类似地，在单细胞之间的可变剪接中发现的出人意料并且普遍的偏移修正了这一过程的分子视图。两种现象都还允许对于每个细胞作为一个“扰动系统”进行处理用于重建细胞回路(安吉洛(Angelo)，K.等人.在僧帽细胞中网络联盟和感官处理的生物物理标签(Abiophysicalsignatureofnetworkaffiliationandsensoryprocessinginmitralcells).自然(Nature)488,375-378,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature11291(2012)；萨克斯(Sachs)，K.，佩雷兹(Perez)，O.，佩尔(Pe’er)，D.&等人.因果蛋白-信号转导网络来源于多参数单细胞数据(Causalprotein-signalingnetworksderivedfrommultiparametersingle-celldata).科学(Science)(纽约，NY)(2005))。确实，即使以来自仅18个单细胞的数据且聚焦在诱导的基因上，在此处的这些研究证明一种‘概念验证’：在一个干扰素-驱动的抗病毒回路中不同调节物如何可以因果性连接于它们的共变靶标，该回路随后在敲除模型中被验证。最后，尽管许多这些分析集中于高度表达的基因以去除扩增噪声的可能影响，该数据还揭示更适度表达转录物中的显著双峰性，例如大的非编码RNA(图21)。这个观察表明一个吸引人的可能性，即这些转录物在群体中的较低表达水平(卡碧丽(Cabili)，M.N.等人.人类大的基因间非编码RNA的综合注解揭示了全球特性和特定亚类(IntegrativeannotationofhumanlargeintergenicnoncodingRNAsrevealsglobalpropertiesandspecificsubclasses).基因&发育(Genes&development)25,1915-1927(2011))可能是以下因素的结果：小数目的细胞以高水平表达它们而不是所有的细胞在低水平表达它们，尽管另外的技术改进对于解开这两个假设是将是必需的(图9)。这样，单细胞测量应有助于这些转录物的发现、注解、以及分析。
将这些结果与其他单细胞RNA-Seq数据集比较表明，所分析的组织的来源(体外与离体)、单个细胞的生物状况(稳态与动态应答)、以及在细胞微环境中的异质性所有都可能影响在任何单个系统内的单细胞异质性的程度。当应用于复杂组织-例如未分选的骨髓，不同发育阶段的胚，异质性肿瘤，以及罕见临床样品时(斯宾塞(Spencer)，S.L.，高德特(Gaudet)，S.，阿尔贝克(Albeck)，J.G.，伯克(Burke)，J.M.&佐尔格(Sorger)，P.K.在TRAIL-诱导的凋亡中非遗传来源的细胞间可变性(Non-geneticoriginsofcell-to-cellvariabilityinTRAIL-inducedapoptosis).自然459,428-432,doi:10.1038/nature08012(2009)；托德(Todd)，R.&马戈林(Margolin)，D.H.单细胞诊断的挑战:基因表达的分析(Challengesofsingle-celldiagnostics:analysisofgeneexpression).分子医学趋势(TrendsMol.Med.)8,254-257(2002))-通过单细胞基因组学看到的可变性可以帮助确定新细胞分类方案，鉴定过渡性状态，发现先前未认识到的生物区分，并且对区分它们的标记进行作图映射。满足这种潜在性将需要新的策略来解决在单细胞基因组学中固有的高水平的噪声–归因于微量的输入材料的技术方面的，以及例如归因于RNA转录的短暂突发的生物方面的(谷口(Taniguchi)，S.等人.在单细胞中以单分子灵敏度量化大肠杆菌蛋白质组和转录组(QuantifyingE.coliProteomeandTranscriptomewithSingle-MoleculeSensitivityinSingleCells).科学(Science)329,533-538,doi:10.1126/science.1188308(2010)；蔡(Cai)，L.，达拉勒(Dalal)，C.K.&艾勒威兹(Elowitz)，M.B.频率调控的核定位突发坐标基因调节(Frequency-modulatednuclearlocalizationburstscoordinategeneregulation).自然455,485-490,doi:nature07292[pii]10.1038/nature07292(2008))。将实验制备上的技术进展与新颖的计算途径联合的未来研究使得能够进行基于数百或数千单细胞的分析以重构细胞内回路，列举和重新定义细胞状态和类型，并且根本上转变对基因组规模的细胞决断的理解。
在此提供的研究还使用了一种微流体系统来产生并且分析超过2,000个SMART-Seq(拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782，doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012))单细胞骨髓树突细胞(BMDC)RNA-Seq文库。BMDC是用于研究单细胞应答的一种有吸引力的系统，因为它们是初级的、有丝分裂后的，并且应答于病原性组分，引出强的针对炎性和抗病毒细胞因子的生理学上相关的转录程序，这些细胞因子在群体水平被很好地表征(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)；谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测回路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits)，细胞147,853-867，doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011)；加伯(Garber)，M.等人，一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012)；竹内(Takeuchi)，O.&阿基拉(Akira)，S.模式认知受体和炎症(PatternRecognitionReceptorsandInflammation).细胞140,805-820，doi:10.1016/j.cell.2010.01.022(2010)；沙列克(Shalek)，A.K.等人，纳米线介导的递送使能够进行主要免疫细胞的功能性访问：慢性淋巴细胞白血病分析的应用(Nanowire-mediateddeliveryenablesfunctionalinterrogationofprimaryimmunecells:applicationtotheanalysisofchroniclymphocyticleukemia).纳米通讯(NanoLett.)12(12):6498-504.doi:10.1021/nl3042917(2012))。最初，在刺激前并且在用LPS、PAM3CSK、和聚I:C(分别来自革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和病毒RNA合成模拟物)刺激之后的四个时间点(1、2、4、6h)对BMDC进行谱绘制。从这些不同的快照中，检查了单细胞噪声的时间和应答-特异性结构。为了评估跨刺激和时间点的单细胞变化方面的改变，开发并使用一个新的巢式统计模型以参数化每个基因的单细胞表达分布。虽然每个病原体组分在群体水平激活不同时间程序，但单个应答细胞也在每个应答内展示出显著可变的行为。在炎性回路中，发现了两个时间上不同的表达异质性模式：一些回路早期被强烈同步并随时间移相，而其他的是嘈杂地诱导的。同时，抗病毒基因回路嘈杂地发生并且随着时间变得紧密同步。
特别地，在此呈现的研究发现了在群体测量中掩蔽的早熟“早期抗病毒应答物”的一个罕见群体，并且假设它们的应答遍及该群体经由旁分泌信号传导扩增。为了测试这个假设，在密封的微流体腔室中每个细胞被单独地刺激，并且发现大多数细胞未能诱导关键抗病毒应答基因。然而，出人意料地，该炎性应答在这些分离的细胞中没那么易变，证明针对不同回路细胞内通讯可以限制和增加噪声。对缺少该干扰素受体的DC的分析重演了这些发现中的许多，表明干扰素反馈对于协调该抗病毒应答连同炎性应答中的交叉抑制和噪声是必需的。最后，对针对由该模型指定的关键细胞内调节物缺失的DC进行测试以验证控制这一过程的关键回路组分。这个研究证明了如何利用跨单细胞的可变性用于重建细胞间和细胞内回路，并且用于理解基因组规模上的细胞决断。
本披露的这些组合物和方法使用了一种基于微流体的方法来制备超过1,700个SMART-Seq单细胞RNA-Seq文库，采样了BMDC对不同病原体组分和相关扰动的动态应答。(参见例如，拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人，来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782，doi:10.1038/nbt.2282(2012))。区别基因模块特征在于不同的时间可变性谱，来源于在以可检出水平表达给定mRNA转录物的细胞的比例方面和这些可检出表达的细胞内的mRNA水平方面的变化。该BMDC群的平均时间应答来源于在单细胞水平的潜在的非同步又连续的过程：在每个采样时间点，并且对于每个模块，一些细胞比时间连续体上的其他者更‘超前’。具体来说，发现了在群体测量中掩蔽的一些“早熟”细胞，其产生干扰素并且早期激活一种核心抗病毒模块。无意于受理论约束，认为这些早熟细胞负责通过干扰素-介导的旁分泌信号传导驱动该群体中的抗病毒应答。
为了理解旁分泌信号传导在协调群体应答方面的作用，在此提供的研究开发了新的实验方法来单独地刺激在密封的微流体室内的细胞，阻止细胞间通讯。这阻滞了在稍后的时间点该抗病毒应答的扩散和协调，表明这些“早熟”细胞在起始和协调的天然群体应答方面发挥着至关重要的作用。此外，发现干扰素受体缺陷的、或用一种分泌抑制物(布雷菲尔德菌素A，‘GolgiPlug’)或一种蛋白质合成抑制物(放线菌酮)处理的BMDC被LPS刺激时未能诱导“核心”抗病毒应答基因。出人意料地，抑制旁分泌信号传导或仅干扰素信号传导还导致以一种早期、尖峰诱导模式表达炎性应答基因模块的细胞的比例显著增加，突出了动态群体-水平正和负旁分泌反馈环路如何能够促进和限制免疫应答的变化。
在BMDC群内的单个细胞的行为在免疫应答期间是高度动态的，数字和模拟变化跨不同的时间点、刺激和模块改变。这些模式-在群体水平测量中被掩蔽-揭示了如下原理，细胞群如何可以使用细胞内和细胞间控制策略来协调复杂的动态应答。在此处呈现的在不同时间点以及刺激上获得的单细胞谱数据集和相关的统计分析以及物理、遗传和生物化学扰动提供了用于解析这些细胞内和细胞间控制策略的必需输入和方法。
首先，单细胞表达分布的统计分析揭示在动态应答期间在可检出水平表达具体转录物的细胞的比例连同表达细胞内mRNA水平两者都变化。这两个功能的相互作用可以编码时间应答谱的丰富多样性。例如，晚期-诱导的“核心”抗病毒基因在早期时间点表现出非常弱的平均表达，但在几个“早熟”细胞中高度表达。相比之下，“峰”炎性基因的进行性制止反映了表达这些转录物的细胞的比例的变改变，而不是所有细胞中在表达方面的均匀逐渐减少。这种行为的普遍性挑战用于回路重建的常规计算途径，这些途径倾向于隐含地将群体表达谱的改变仅仅归于细胞内事件。相反，这些观察表明细胞群可以产生复杂平均应答，不仅通过复杂的细胞内回路(这对所有细胞是普遍的)，而且还有异质单一细胞之间的细胞间反馈机制。表征多个应答程序(图26f)的双峰性的早期改变可以表明产生快速免疫应答的最有效的方式是使更多细胞执行给定任务而不是使任何细胞更有效地执行。
这样的细胞间控制策略的重要性的一个实例是如下发现：旁分泌信号传导在建立单细胞行为的一些不同的时间模式方面起着至关重要的作用。具体地，在此的研究已覆盖一个小数目的“早熟”细胞，这些细胞早在LPS刺激1h之后表达Ifnb1以及“核心”抗病毒基因，并且通过分泌IFN-β帮助激活其他细胞中的“核心”抗病毒基因以协调该群体应答。注意的是，这些细胞不区别于该群体的其余部分，除了在该“核心”抗病毒模块中大约一百个基因的表达。
在此呈现的实验数据表明所观察到的“早熟”细胞很可能是致敏的引发物，它们在促成有效且及时的群体应答中是至关重要的。首先，在添加LPS后不同时间点抑制分泌的布雷菲德菌素A(GolgiPlug)实验表明，早期(在1h左右)分泌了作用于“核心”抗病毒应答的关键旁分泌信号。更重要的是，“芯片上”隔离实验显示，在没有来自这些“早熟”细胞的旁分泌信号情况下，甚至在4h的孵育后，仅一小部分(20％)的细胞可以通过它们本身启动对LPS的削弱的“核心”抗病毒应答。因此，这些数据表明“早熟”细胞可以表示处于特殊的、可能随机定义的表观遗传学状态的细胞，其早在1h的时候致敏以便应答于LPS表达Ifnb1。旁分泌信号传导(包括干扰素-介导的通讯)还起作用以在稍后的时间点制止一个亚群的诱导的基因(“峰”炎性)。总之，这些观察表明在“芯片上”、敲除和化学调节实验中观察到的抗病毒和炎性途径之间的交叉抑制的一个模型(图29)。在这个模型中，来自小数目的细胞的抗病毒反馈诱导来自一个细胞亚群的抗炎细胞因子的表达和分泌，其进而衰减附近细胞的炎性应答。重要的是，这种模型还表明靶向不同应答亚群之间的平衡的可替代治疗策略，而不表现均匀的过量细胞外信号分子(例如，IFN-β)(参见例如，邦舍罗(Banchereau)，J.&帕斯夸尔(Pascual)，V.在系统性红斑狼疮和其他自身免疫疾病中的I型干扰素(TypeIInterferoninSystemicLupusErythematosusandOtherAutoimmuneDiseases).免疫(Immunity)25,383-392，doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2006.08.010(2006)；霍尔(Hall)，J.C.&罗斯(Rosen)，A.I型干扰素：在自身免疫性上在疾病扩增中的关键参与者(TypeIinterferons:crucialparticipantsindiseaseamplificationinautoimmunity).风湿病学自然评论(NatureReviewsRheumatology)6,40-49,doi:http://dx.doi.org/10.1038/nrrheum.2009.237(2010))。
用于选择标签基因的自动化程序
本发明还提供了确定在各种治疗和/或诊断适应症中有用的基因标签的方法。这些方法的目标是选择将提供关于感兴趣的过程的消息的基因一个小标签。基本概念是不同类型的信息可能引起整个基因组(>20k基因)的“空间”向相关基因的亚群的不同划分。这一策略被设计为最佳覆盖这些划分(考虑到对标签大小的约束)。例如，在这一策略的一些实施例中，存在两个类型的信息：(i)时间表达谱；以及(ii)功能性注释。第一信息来源将这些基因划分为多组共表达基因。该信息来源将这些基因划分为多组共功能基因。然后选择一小组的基因，使得存在所希望数目的来自每个组的代表，例如，来自每个共表达组的至少10个代表和来自每个共功能组的至少10个代表。使用多个来源的信息(并且因此旨在“覆盖”多个划分)的问题在计算机科学的理论中被称为集合-覆盖(Set-Cover)。虽然这个问题不能被最优地解决(由于它的Nβ-硬度)，但它可以近似到一个小因素内。在一些实施例中，所希望数目的来自每组的代表是一个或多个，至少2个、5个或更多个，10个或更多个，15个或更多个，20个或更多个，25个或更多个，30个或更多个，35个或更多个，40个或更多个，50个或更多个，60个或更多个，70个或更多个，80个或更多个，90个或更多个，或100个或更多个。
本途径的一个重要特征是，它可被给定该标签的大小(并且然后找出在该约束下它可能的最佳覆盖)；或覆盖的所希望水平(并且然后选择可以满足该覆盖需求的最小标签大小)。
这个程序的一个示例性实施例是选择在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中呈现的不同基因标签。
标签基因的用途
本发明提供了用于多种诊断和/或治疗适应症连同多种筛选或以其他方式鉴定治疗性分子的方法的树突细胞相关基因标签。在本发明的背景中“标签”包括但不限于核酸，连同其多态、突变、变体、修饰、亚基、片段、以及其他分析物或样品衍生的测量物。
示例性标签显示在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中，并且在此被统称为尤其“树突细胞相关基因”、“树突细胞相关的核酸”、“标签基因、”或“标签核酸”。
这些标签有用于如下方法，该方法通过如下对受试者体内的免疫应答和/或异常的树突细胞应答进行诊断、预测和/或分级：检测选自表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第一水平，并将检测到的水平与标签基因或基因产物的表达、活性和/或功能的对照水平比较，其中该检测到的水平和该对照水平的差异表示该受试者体内免疫应答和/或异常的树突细胞应答的存在。
这些标签有用于如下方法，该方法通过如下来监测受试者体内免疫应答和/或异常的树突细胞应答：在第一时间点检测选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，在第二时间点检测选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并且将该第一检测的表达、活性和/或功能的水平与该第二检测的表达、活性和/或功能的水平比较，其中检测的该第一和第二水平的变化表示在该受试者体内免疫应答和/或异常的树突细胞应答的变化。
这些标签有用于基于检测到的选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和/或5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平来鉴定处于风险或正在遭受免疫应答(例如，异常免疫应答、自身免疫应答、和/或炎性应答和/或异常树突细胞应答)的患者群体的方法。这些标签也有用于监测经历针对一种或多种异常免疫应答和/或一种或多种异常的树突细胞应答的治疗和疗法的受试者以确定该治疗或疗法的有效性。这些标签也有用于监测经历针对一种或多种异常免疫应答和/或一种或多种异常的树突细胞应答的治疗和疗法的受试者以确定该患者是否应答于该治疗或疗法。这些标签也有用于选择或修饰有效于治疗、延迟进展或以其他方式改善异常的免疫应答和/或异常的树突细胞应答的症状的疗法和治疗。在此提供的标签有用于选择处于具有促进选择治疗的准确度的疾病特定状态的一组患者。
这些标签基因也有用于监测应答于一种疗法、疫苗、移植或其他治疗性干预的患者的方法。例如，一种或多种标签基因的表达水平可以在给药前和给药后的多个时间点检测到，并且可以使用在此提供的单细胞方法对这些水平进行分析。通过确定哪些基因被表达于同类组群或其他一致组和/或哪些细胞亚群排他地表达这些基因，从业者将能够确定哪一个或哪些同类组群和/或哪一个或哪些途径负责生成免疫应答和/或异常的树突细胞应答。
本发明还包括具有结合到一种或多种标签核酸的检测试剂的试剂盒。还由本发明提供的是可以结合到一种或多种标签核酸的检测试剂(例如，寡核苷酸)的一个阵列。合适的检测试剂包括以试剂盒的形式包装在一起的特异性地识别一种或多种标签核酸(通过具有互补于这些标签核酸的一部分的同源核酸序列(如寡核苷酸序列))的核酸。这些寡核苷酸可以是这些标签基因的片段。例如这些寡核苷酸长度上可以是200、150、100、50、25、10或更少个核苷酸。该试剂盒可以包含在分开的容器中或与用于将它们结合到基质的试剂、对照配制品(阳性和/或阴性)、和/或可检测标记如荧光素、绿色荧光蛋白、罗丹明、花青染料、亚历克萨染料、荧光素酶、放射性标记等等分开包装。用于进行该测定的说明书(例如，文字、胶带、VCR、CD-ROM等)可以包括在该试剂盒中。这种测定可例如是处于以下形式：如本领域中已知的Northern杂交或夹心ELISA。该试剂盒可例如包括用于进行此处所述的任何方法的试剂和说明书，包括PCR、核酸测序等。可替代地，该试剂盒包含包括一种或多种核酸序列的核酸底物阵列。
树突细胞及其用途
树突细胞(DC)参与许多的免疫应答，包括和/或贡献于感染抗性和调控自我耐受性。DC具有控制T-细胞识别和/或应答性的能力。
DC已知用于诱导感染抗性，因为它们应答于不同病原体(例如，微生物组分)以不同方式成熟，并且因此可以启动不同宿主免疫应答。(参见例如，斯泰因曼(Steinman)&邦舍罗(Banchereau).“医学中考虑树突细胞(Takingdendriticcellsintomedicine)”.自然，卷449:419-426(2007)；doi:10.1038/nature06175)。在此提供的调控剂可以用于破坏这些免疫应答。例如，这些调控剂调控来自表1-5A的一种或多种基因的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，这些调控剂阻滞或以其他方式抑制DC成熟。在一些实施例中，这些调控剂改变或以其他方式影响DC的一种或多种功能，由此调控T-细胞应答，例如，从保护性TH1表型至非保护性TH2表型。
DC也有用于设计和创建多种疫苗适应症以通过增强免疫发生来治疗和预防感染。在这些适应症中，该疫苗可以包括一种或多种调控剂。例如，在一些实施例中，该疫苗递送一种控制或以其他方式影响树突细胞成熟的调控剂。在一些实施例中，该疫苗递送一种改变或以其他方式影响一种或多种T-细胞应答(例如，保护性TH1表型的诱导)的调控剂。
DC也有用于设计和创建对抗癌症的多种治疗性疫苗(归因于它们调节T细胞免疫的能力)(参见例如，邦舍罗(Banchereau)&波露卡(Palucka).树突细胞作为对抗癌症的治疗性疫苗(DendriticCellsasTherapeuticVaccinesAgainstCancer).自然，卷5:296-306(2005)；doi:10.1038/nril592)；还参见，波露卡(Palucka)等人，“建立树突细胞亚群以改善癌症疫苗(Buildingondendriticcellsubsetstoimprovecancervaccines)”，当前免疫学观点(CurrOpImmunol)，22:258-63(2010)；doi:10.1016/j.coi.2010.02.010)。
例如，DC被用作疫苗中的佐剂。已知未成熟DC诱导耐受性，而成熟DC诱导免疫性。未成熟DC主要作为抗原-捕获细胞起作用，而成熟DC主要作为抗原呈递细胞起作用。因此，这些调控剂可以被用来调控DC或DC群的成熟度，例如，以基于所希望的结果使成熟以及未成熟的DC之间的平衡转变。例如，在耐受性是所希望的情况下，该调控剂可被用来朝向未成熟DC表型转变，并且在免疫性是所希望的适应症中，该调控剂可以被用来朝向成熟DC表型转变。在一些实施例中，该调控剂被用来调控DC或DC群的可塑性。例如，该调控剂可以被用来使DC或DC群朝向特定DC亚群转变，例如，朝向或远离郎罕氏细胞(Langerhanscell)、间质性DC以及浆细胞样DC；或朝向DC分化的特定途径，例如，朝向或远离髓样途径和/或朝向或远离淋巴途径。
本发明提供了用于调控一种或多种树突细胞应答的多种组合物和多种方法。如在此所使用，术语“调控”包括上调或以其他方式增加一种或多种基因的表达，下调或以其他方式减少一种或多种基因的表达，抑制或以其他方式减少一种或多种基因产物的表达、活性和/或功能，和/或增强或以其他方式增加一种或多种基因产物的表达、活性和/或功能。
如在此所使用，术语“调控树突细胞应答”包括调控多种树突细胞功能和/或活性中任一项，包括通过非限制性举例的方式，控制或以其他方式影响调节树突细胞突变的网络；控制或以其他方式影响调节树突细胞免疫应答的网络；控制或以其他方式影响调节树突细胞的抗病毒免疫应答的网络，例如，树突细胞的抗病毒免疫应答，包括核心抗病毒应答和/或二级抗病毒应答；控制或以其他方式影响调节树突细胞的炎性免疫应答(例如，诱导的炎性应答和/或尖峰炎性应答)的网络；控制或以其他方式影响调节树突细胞的Toll样受体(TLR)应答的网络；控制或以其他方式影响调节T细胞和B细胞募集的网络；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节一种或多种TH1细胞应答的DC促进；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节一种或多种TH2细胞应答的DC诱导；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节对D的下游的任何细胞的DC诱导、冲击或其他作用；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节T细胞(包括调节性T细胞(Treg)、Th17细胞、记忆T细胞以及其他T细胞)的DC诱导；控制或以其他方式影响网络，这些网络调节DC表型的转变(例如，在成熟的和未成熟的表型之间和/或在DC的亚群之间)；操纵或以其他方式影响树突细胞的至少一种功能或生物活性；操纵或以其他方式影响树突细胞对病原体驱动T细胞极化作用的控制；和/或操纵或以其他方式影响细胞因子、趋化因子以及由DC分泌的其他分子的产生。
本发明提供了调控一种或多种树突细胞应答的多种调控剂。合适的调控剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“核心抗病毒”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表1和1A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“一种或多种核心抗病毒调控剂”。
例如，在一些实施例中，该核心抗病毒调控剂是激酶，如通过非限制性举例的方式，选自下组的激酶，该组由以下各项组成：MAPK1、EIF2AK2、TBK1、PLK4、IKBKE、PLK2、MAP3K7、CHUK、JAK1、CRKL、MKNK2、TYK2、RPS6KB2、IKBKB、MKNK1、NEK7、PIK3R2、IKBKG、RIPK2、MAP2K6、MET、RPS6KB1、MARK2、DGKA、以及BUB1B。
例如，在一些实施例中，该核心抗病毒调控剂是跨膜受体，如通过非限制性举例的方式，选自下组的跨膜受体，该组由以下各项组成：IFNAR1、TLR3、TLR4、IL28RA、TLR9、IFNAR2、COLEC12、SCARA3、MSR1、FCER1G、以及KIR2DS4。
例如，在一些实施例中，该核心抗病毒调控剂是哺乳动物内源性化学药物，如通过非限制性举例的方式，维甲酸，或非哺乳动物内源性化学药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的非哺乳动物内源性化学药物，该组由以下各项组成：明尼苏达沙门氏菌R595脂多糖、密执毒素、3-脱氧-2-辛酮糖酸(2)-脂质A、大肠杆菌B5脂多糖、以及巴佛洛霉素A1。
例如，在一些实施例中，该核心抗病毒调控剂是化学药物，如通过非限制性举例的方式，化学激酶抑制物药物，例如SB203580或H-7，或另一种化学药物，如化学试剂、毒药或选自下组的其他化学药物，该组由以下各项组成：脂多糖、聚rI:rC-RNA、大肠杆菌B4脂多糖、司他霉素、溴脱氧尿苷、2-氨基嘌呤、利巴韦林、CpGODN1668、姥鲛烷、咪喹莫特、地西他滨、马肠沙门氏菌血清型脂多糖、CpGODN1826、刀球肮霉素A、聚dA-dT、伊屋诺霉素、岩藻多糖、CpGODN2216、AL108、4,4'-二氨基二苯基甲烷、表没食子儿茶素-没食子酸酯、氯喹、3M-011、卡比马唑、3M-001、Pam3-Cys、罗格列酮、以及脂质A。
例如，在一些实施例中，该核心抗病毒调控剂是生物药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的生物药物，该组由以下各项组成：佩吉创(pegintron)、芳妥珠单抗和干扰素β-1a。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“二级抗病毒”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表2和2A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“二级抗病毒调控剂”。
例如，在一些实施例中，该二级抗病毒调控剂是激酶，如通过非限制性举例的方式，选自下组的激酶，该组由以下各项组成：MAPK9、EIF2AK2、CRKL、MET、TBK1、MAP3K7、以及JAK1。
例如，在一些实施例中，该二级抗病毒调控剂是跨膜受体，如通过非限制性举例的方式，选自下组的跨膜受体，该组由以下各项组成：TLR4、TLR3、以及IFNAR2。
例如，在一些实施例中，该二级抗病毒调控剂是非哺乳动物内源性化学药物，例如通过非限制性举例的方式，明尼苏达沙门氏菌R595脂多糖。
例如，在一些实施例中，该二级抗病毒调控剂是化学药物，如通过非限制性举例的方式，化学激酶抑制物药物如LFMA13，或另一种化学药物，如化学试剂、毒药或其他选自下组的化学药物，该组由以下各项组成：聚rI:rC-RNA、脂多糖、和R-WIN55,212。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“成熟”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表3和3A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“成熟调控剂”。
例如，在一些实施例中，该成熟调控剂是激酶，如通过非限制性举例的方式，选自下组的激酶，该组由以下各项组成：IKBKB、MAP2K4、PRKCD、MTOR、MAPKAPK2、PRKCB、LYN、MAPK14、DDR1、TGFBR1、PRKCA、AKT1、RAF1、SHC1、CSF1R、IRAK4、PRKCQ、SPHK1、MAP4K1、RPS6KB1、GSK3B、FES、MAP3K7、MAP3K8、SRC、CHUK、PTK2、PIK3R1、MAP2K7、MAPK9、RPS6KA5、MAPK8、BTK、EGFR、MAP2K6、PDPK1、PRKG1、FLT3、TYK2、CDK9、ACVR2B、CDK10、MAST2、MAPK11、FGFR3、PIM1、ACVRL1、FGFR2、MARK2、PBK、PLK3、MAP3K14、NME1、HIPK2、以及ERBB2。
例如，在一些实施例中，该成熟调控剂是跨膜受体，如通过非限制性举例的方式，选自下组的跨膜受体，该组由以下各项组成：CD40、TLR4、TLR9、FAS、TLR7、CD5、IL27RA、TLR2、TLR3、CD28、ICAM1、LTBR、TLR8、FCGR2A、TYROBP、TNFRSF10A、TLR5、TREM2、IGHM、CD2、TNFRSF8、IL6R、CLEC7A、CHRNA1、ITGB3、AGER、TNFRSF6B、TLR6、TNFRSF11A、TRA(又称作TRA，T细胞受体α基因座)、FCGR2B、NGFR、IGF1R、TNFRSF1A、IL1RL2、CD300C、CD86、以及MS4A2。
例如，在一些实施例中，该成熟调控剂是哺乳动物内源性化学药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的哺乳动物内源性化学药物，该组由以下各项组成：前列腺素E2、透明质酸、ATP、维甲酸、乙醇、过氧化氢、丁酸、花生四烯酸、尿酸、硫酸软骨素A、腺苷、肝素、Ca2+、组胺、L-甲硫氨酸、一氧化碳、环状AMP、月桂酸、肾上腺素、11,12-环氧二十碳三烯酸、β-雌二醇、脂氧素A4、L-谷氨酸、二氢睾酮、孕酮、犬尿酸、甲羟戊酸、5,6-环氧二十碳三烯酸、L-鸟氨酸、丙二酸、反油酸、N(ω)-羟精氨酸、二甲基甘氨酸、17-表雌三醇、D-半乳糖胺、氢化可的松、叶酸、氯高铁血红素、葡糖胺、血小板激活因子、糖基磷脂酰肌醇、棕榈油酸、和谷胱甘肽。
例如，在一些实施例中，该成熟调控剂是非哺乳动物内源性化学药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的非哺乳动物内源性化学药物，该组由以下各项组成：大肠杆菌脂多糖、脂磷壁酸、大肠杆菌B5脂多糖、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、酵母聚糖A、15-脱氧-δ-12,14-PGJ2、肽聚糖、熊果酸、神经节苷脂GD3、酵母聚糖、疟原虫色素、前列腺素A1、密执毒素、大肠杆菌血清型0127B8脂多糖、明尼苏达沙门氏菌R595脂多糖、蓖麻油酸、衣霉素、以及芹菜素。
例如，在一些实施例中，该成熟调控剂是化学药物，如通过非限制性举例的方式，化学激酶抑制物药物，例如SB203580、渥曼青霉素(wortmannin)、PD98059、SP600125、Sb202190、U0126、LY294002、AG490、KN93、双吲哚马来酰亚胺I、Ro31-8220、星孢素、Bay11-7082、H89、Go6976、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478、PD169316、Pp1、8-溴鸟苷3’,5’-环状单磷酸酯、1-邻-十六烷基-2-邻-甲基-外消旋-甘油、肉豆蔻酰化PKCζ假底物肽抑制物、KT5926、以及8-氯苯基硫代-腺苷3’,5’-环单磷酸酯。
例如，在一些实施例中，该成熟调控剂是化学药物，如通过非限制性举例的方式，另一种化学药物，如化学试剂、化学毒药或选自下组的其他化学药物，该组由以下各项组成：脂多糖、ssRNA40、N-硝基-L-精氨酸甲酯、咖啡酸苯乙基酯、S-亚硝基谷胱甘肽、W7、大肠杆菌B4脂多糖、乙酸肉豆蔻佛波醇、CpGODN2006、CpGODN1826、聚rI:rC-RNA，ATP-γ-S、辛伐他汀、EGTA、制霉菌素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、3M-001、曲尼司特、毒胡萝卜素、Pam3-Cys-Ser-Lys4、DETA-NONOate、瑞喹莫德、CpGODN1668、马肠沙门氏菌血清型脂多糖、3-甲基腺嘌呤、莫拉丁酯、CpG寡核苷酸、R5020、洛伐他汀、西罗莫司、布拉地新、表没食子儿茶素-没食子酸酯、美法仑、3M-011、伊马替尼、zVAD-FMK、Pam3-Cys、阿司匹林、博来霉素、地塞米松、萨菲菌素A、甲氧沙林、硼替佐米、喜树碱、单磷酰脂质A、3M-002、紫杉醇、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯、镍、曲古霉素A、二十二碳六烯酸、姜黄素、葡聚糖硫酸盐、白藜芦醇、毛喉素、苏拉灭、姥鲛烷、7-乙基-10-羟基-喜树碱、Ni2+、曲伐沙星、菲啶、苔藓抑素1、UCN-01、长春碱、依托泊苷、放线菌酮、奥沙利铂、[Lys15,Arg16,Leu27]VIP(1-7)GRF(8-27)、氟伐他汀、环格列酮、烟碱、二十碳五烯酸、罗格列酮、伊屋诺霉素、己酮可可碱、尼氟灭酸、[Ac-His1,D-Phe2,Lys15,Arg16,Leu27]VIP-(3-7)-GRF-(8-27)、米菲司酮、胶毒素、夫拉平度、坦螺旋霉素、鱼藤酮、GCS1-100、咪达唑仑、1-α,25-二羟基维生素D3、地西他滨、3,3’-二吲哚甲烷、A23187、恩替司他、齐多夫定、胞苷酰-3’-5’-鸟苷、粉防己碱、丙戊酸、顺铂、托瑞米芬、米帕林、维生素E、伏立诺他、GW3965、异丁基甲基黄嘌呤、氟维司群、Sn50肽、氯倍他索丙酸盐、D609、苯、埃坡霉素B、精胺一氧化氮复合物、甲基硒酸、去铁胺、曲格列酮、1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、帕立骨化醇、砷、咪喹莫特、GLP-2-1-(7-34)-酰胺、S-(2,3-双棕榈酰氧基丙基)-半胱氨酸-GDPKHPKSF、9-顺式-视黄酸、镉、舒林酸硫化物、咖马林、13-顺式-视黄酸、呋喃妥因、N-Ac-Leu-Leu-正亮氨酸、达西司特、Ro41-5253、甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮、雷洛昔芬、西立伐他汀、帕比司他、漆黄素、三硝基苯磺酸、CpGODN2216、赭曲霉素A、氧化偶氮甲烷、表儿茶素酸丙酯、佛波醇酯、MALP-2s、S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺、咯利普兰、乳胞素、活性氧种类、四氯化碳、佛波醇12,13-二癸酸盐、聚乙二醇、二异丙醇亚硝胺、N(1)-甲脒基-1,7-二氨基庚烷、阿地白介素、4-羟基泰莫西芬、沙利度胺、阿霉素、萝卜硫素、甲硝基亚硝胍、SU6656、CGS21680、柔红霉素、ω-N-甲基精氨酸、林西多明、法舒地尔、5-氟尿嘧啶、己烯雌酚、吗啡、丝裂霉素C、利巴韦林、S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺、原钒酸钠、Am580、泼尼松龙、氯喹、半乳糖苷神经酰胺-α、吉西他滨、9,10-二甲基-1,2-苯并蒽、BAPTA-AM、甲泼尼龙、吲哚美辛、CP-55940、多西他赛、美金刚、熊果苷、莫克雌醇、2,2,2-三氯乙醇、达鲁舍替、阿那曲唑、哌立福辛、二膦酸酯、甲芬那酸、谷胱甘肽乙酯、长春氟宁、聚肌苷酸、斯帕磷酸、类视黄醇、长春新碱、非那西汀、脂质A、二甲基亚硝胺、木黄酮、2-脱氧葡萄糖、吡格列酮、O6-苄基鸟嘌呤、铍精硫酸盐、苯并(a)芘7,8-二氢二醇、甲基两性霉素B、瑞司瓜特、O-(氯乙酰基氨基甲酰基)烟霉醇、蒂法他汀(dephostatin)、阿曲生坦、替吡法尼、米酵菌酸、那他霉素、10-去氨基甲酰基丝裂霉素(decarbamoylmitomycin)C、苯妥帝尔、氰化钾、3,4-亚甲二氧基苯丙胺、(-)-没食子儿茶素没食子酸酯、1β,25-二羟基维生素D3、17-α-炔雌醇、水杨酸、3-去氮腺嘌呤、以及多西环素。
例如，在一些实施例中，该成熟调控剂是生物药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的生物药物，该组由以下各项组成：环孢菌素A、血蓝蛋白、依那西普、菌肠毒素B、罗米地新、阿达木单抗、干扰素β-1b、阿托西班、以及去纤苷。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“峰炎性”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表4和4A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“峰炎性调控剂”。
例如，在一些实施例中，该峰炎性调控剂是激酶，如通过非限制性举例的方式，选自下组的激酶，该组由以下各项组成：IRAK4、CHUK、IKBKG、IKBKB、MAP2K1、MARK2、MAP3K14、TBK1、IRAK3、TGFBR2、LYN、EIF2AK2、MAPK8、KIT、RIPK2、PRKCA、CDK9、SPHK1、PRKCD、EGFR、MAP3K7、TXK、MAP3K8、MAPKAPK2、MAPK10、IRAK2、IKBKE、RAF1、JAK2、ADRBK1、TEK、MAPK9、MET、MAPK14、ITK、BMPR2、FLT3、PRKD1、TYK2、PRKCQ、MERTK、MAPK1、AKT2、MAPKAPK5、JAK1、以及PIK3CG。
例如，在一些实施例中，该峰炎性调控剂是跨膜受体，如通过非限制性举例的方式，选自下组的跨膜受体，该组由以下各项组成：TLR4、IL28RA、IFNAR1、FAS、TLR7、CD14、TLR3、TNFRSF1A、TLR5、CD40、ICAM1、TLR9、SIGIRR、MSR1、IL10RA、FCGR2B、FCGR2A、IL27RA、TLR2、CD28、PLAUR、MARCO、UNC5B、THBD、IFNGR1、IL10RB、CD86、IL1R1、FCGR1A、IL1RL1、IL6R、TNFRSF18、RARRES2、TNFRSF1B、EPOR、TRA、IL17RA、TRB(又称作TRB，T细胞受体β基因座)、以及CD300C。
例如，在一些实施例中，该峰值炎性调控剂是哺乳动物内源性化学药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的哺乳动物内源性化学药物，该组由以下各项组成：透明质酸、β-雌二醇、前列腺素E2、尿酸、神经保护蛋白D1、血小板激活因子、硬脂酸、维甲酸、十六烷酸、孕酮、D-鞘氨醇、精胺、氢过氧化物、白三烯D4、氢化可的松、月桂酸、脂肪酸、11,12-环氧二十碳三烯酸、鹅去氧胆酸、亚麻酸、ATP、石胆酸、脂质、花生四烯酸、醛、棕榈酸甲酯、L-胱氨酸、L-酒石酸、精氨酸、丁酸、D-葡萄糖、L-鸟氨酸、1,4-葡聚糖、牛磺石胆酸、球形三酰神经酰胺、蜡酸、D-赤式-C16-神经酰胺、二甲基甘氨酸、22(R)-羟基胆固醇、L-三碘甲腺原氨酸、甲羟戊酸、醇、β-胡萝卜素、以及D-半乳糖胺。
例如，在一些实施例中，该峰炎性调控剂是非哺乳动物内源性化学药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的非哺乳动物内源性化学药物，该组由以下各项组成：明尼苏达沙门氏菌R595脂多糖、大肠杆菌B5脂多糖、酵母聚糖、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、大肠杆菌血清型0127B8脂多糖、脂磷壁酸、大肠杆菌脂多糖、肽聚糖、密执毒素、甘露聚糖、角叉菜聚糖、泛醌9、布雷菲德菌素A、聚胺、甘露糖化脂阿拉伯甘露聚糖、异槲皮苷、环状糊精、环匹阿尼酸、2-巯基乙酸酯、巴菲霉素A1、疟原虫色素、脂阿拉伯甘露聚糖、MALP-2R、水飞蓟提取物、多糖、15-脱氧-δ-12,14-PGJ2、佛波醇12,13-二丁酸酯、紫丁香甙、异丁胺、以及葡糖醛木甘聚糖。
例如，在一些实施例中，该峰炎性调控剂是化学药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的化学激酶抑制物，该组由以下各项组成：SP600125、U0126、SB203580、LY294002、PD98059、PP1、渥曼青霉素(wortmannin)、Bay11-7082、Go6976、PS-1145、JAK抑制物I、默克(Merck)C、双吲哚马来酰亚胺I、和酪氨酸磷酸化抑制剂B56。
例如，在一些实施例中，该峰炎性调控剂是另一种化学药物，如化学试剂、毒药或选自下组的其他化学药物，该组由以下各项组成：脂多糖、马肠沙门氏菌血清型脂多糖、曲伐沙星、瑞喹莫德、地塞米松、放线菌酮、三硝基苯磺酸、MALP-2s、大肠杆菌B4脂多糖、聚rI:rC-RNA、喜树碱、Pam3-Cys、Pam3-Cys-Ser-Lys4、CpGODN1668、CpG寡核苷酸、辛伐他汀、紫杉醇、木黄酮、肉豆蔻佛波醇乙酸酯、N-硝基-L-精氨酸甲基酯、曲安奈德、毒胡萝卜素、苦基氯化物、1-α,25-二羟基维生素D3、5-N-乙基甲酰胺基腺苷、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯、蓝肽、硫酸镁、GW3965、醋酸可的松、雷尼替丁、罗氟司特、3-甲基腺嘌呤、Ni2+、葡聚糖硫酸盐、糖皮质激素、表没食子儿茶素-没食子酸酯、臭氧、吉非贝齐、曲西立滨、法莫替丁、氨甲环酸、格雷沙星、扑热息痛、大豆黄酮、贝帕泛(bepafant)、IDN-6556、ZFA-fmk、BQ123、己酮可可碱、锌、氯喹、α-生育酚、己曲安缩松、依达拉奉、雷贝拉唑、冈田酸、CP-55940、伊屋诺霉素、咖啡酸苯乙基酯、Z-DEVD-FMK、多粘菌素B、棕榈酰基-Cys((RS)-2,3-二(棕榈酰氧基)-丙基)-Ala-Gly-OH、胞苷酰-3'-5'-鸟苷、BQ-788、美法仑、N-乙酰基-L-半胱氨酸、司他霉素、25-羟基胆固醇、布拉地新、A23187、舒尼替尼、乳胞素、放线菌素D、甲泼尼龙、二十二碳六烯酸、SR144528、维生素E、克拉霉素、沙美特罗、美伐他汀、溴脱氧尿苷、CpGODN1826、单磷酰基脂质A、2,4-二硝基氟苯、伏立诺他、TO-901317、红霉素、米索前列醇、PD184352、马来酸二乙酯、氯化铵、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶、博来霉素、阿仑膦酸、小白菊内酯、甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮、硝苯地平、罗格列酮、地昔帕明、伊洛马司他、烟碱、13-顺式-视黄酸、曲古霉素A、顺式-尿刊酸、罗苏伐他汀、麦考酚酸、环磷酰胺、8-溴-cAMP、二十碳五烯酸、雌激素、油酰基-雌酮、8-环戊基-1,3-二丙基黄嘌呤、卡替洛尔、N-甲酰基-Nle-Leu-Phe、NSC270012、达塞曲匹、MK2206、GSK2118436、地塞米松/妥布霉素、脱氧精胍菌素、RP48740、磷霉素、NSC95397、杆菌肽、替罗非班、地塞米诺、咯利普兰、姜黄素、双氯芬酸、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、活性氧种类、ω-N-甲基精氨酸、他克莫司、匹立尼酸、丙戊酸、硫代乙酰胺、顺铂、丙基硫氧嘧啶、5-氮杂胞嘧啶核苷、半乳糖苷神经酰胺-α、二磷酰基脂质A、庆大霉素C1、CpGODNM362、PF-251802、PF-4308515、GTS21、化合物48/80、维斯纳力酮、乙二醛、2,4-二硝基氰硫苯、依那普利拉、海藻糖二霉菌酸酯、双-pom-pmea、BAPTA-AM、白藜芦醇、S-亚硝基谷胱甘肽、洛伐他汀、以及氯丙嗪。
例如，在一些实施例中，该峰炎性调控剂是生物药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的生物药物，该组由以下各项组成：环孢菌素A、菌肠毒素B、赖诺普利、阿昔单抗、以及埃替非巴肽。
在一些实施例中，该调控剂被用来调控来自“致炎”基因标签的一种或多种基因(例如，来自在表5和5A中列出的那些中的一种或多种基因)的表达。这些调控剂在此被称为“致炎调控剂”。
例如，在一些实施例中，该致炎调控剂是激酶，如通过非限制性举例的方式，选自下组的激酶，该组由以下各项组成：CHUK、IKBKB、TBK1、MAP2K1、MAPK1、LYN、IKBKG、MAP3K8、IKBKE、MAP3K7、NEK7、AKT1、GSK3B、MAPKAPK2、INSR、LRRK2、PRKCB、JAK2、CARD11、MET、MAPK9、IRAK4、MAPK14、EGFR、MAP3K14、RET、MAP2K4、PIK3R1、RIPK2、PRKCE、MAPK8、MAP2K6、ERBB2、CSF1R、PLK4、PLK2、PRKCD、SPHK1、MAPK11、EIF2AK3、PIK3CA、MERTK、SYK、KDR、MARK2、JAK1、以及RAF1。
例如，在一些实施例中，该致炎调控剂是跨膜受体，如通过非限制性举例的方式，选自下组的跨膜受体，该组由以下各项组成：TLR4、TLR3、IFNAR1、TLR9、CD40、IL28RA、TNFRSF1A、TLR2、CD14、MRC1、CD244、NCR1、KLRC4-KLRK1/KLRK1、FAS、FCER1G、IL1R1、LEPR、PGRMC1、MSR1、TNFRSF18、Klra4(包括其他的)、ITGB3、IL4R、FCGR2A、TNFRSF1B、TREM2、NCR3、TLR5、TLR7、ICAM1、TLR8、IGF1R、FCER2、IL6R、AGER、CD28、IL11RA、ITGB1、SIGLEC7、TYROBP、以及GFRA1。
例如，在一些实施例中，该致炎调控剂是哺乳动物内源性化学药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的哺乳动物内源性化学药物，该组由以下各项组成：ATP、前列腺素E2、孕酮、透明质酸、β-雌二醇、超氧化物、月桂酸、尿酸、十六烷酸、过氧化氢、维甲酸、组胺、苄胺、聚(ADP-核糖)、乙醇、油酸、谷胱甘肽、一氧化碳、胆固醇、鞘氨醇-1-磷酸酯、精氨酸、N-乙酰葡糖胺、睾酮、磷脂酸、烟酰胺、UDP、一氧化氮、神经节苷脂GD1a、γ-亚麻酸、8-氧代-7-氢去氧鸟苷、褪黑激素、醇、D-半乳糖胺、神经节苷脂、铁、白三烯D4、白三烯C4、5’-甲基硫腺嘌呤、甘氨鹅脱氧胆酸钠、亚油酸、神经保护蛋白D1、氢化可的松、氯化钠、肝素、前列腺素E1、4-苯基丁酸、环状AMP、脂肪酸、鹅去氧胆酸、UTP、胆钙化醇、脂氧素A4、凝血噁烷A2、酰基-辅酶A、香叶酰香叶酰焦磷酸酯、花生四烯酸、甲醛、牛磺酸、前列腺素D2、L-谷氨酸、大麻素、2-甲氧雌二醇、高级糖基化终产物、D-葡萄糖、墨蝶呤、香草酸、D-赤式-C16-神经酰胺、瓜氨酸、甲羟戊酸和β-胡萝卜素。
例如，在一些实施例中，该致炎调控剂是非哺乳动物内源性化学药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的非哺乳动物内源性化学药物，该组由以下各项组成：肽聚糖、明尼苏达沙门氏菌R595脂多糖、大肠杆菌血清型0127B8脂多糖、大肠杆菌脂多糖、酵母聚糖、磷脂、巴菲霉素A1、木犀草素、大肠杆菌B5脂多糖、角叉菜聚糖、熊果酸、芹菜素、2-环己烯-1-酮、脂磷壁酸、格尔德霉素、锰、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、异甘草素、环状糊精、苄基异硫氰酸酯、白皮杉醇、柚皮素、疟原虫色素、前列腺素A1、厚朴酚、孕甾-4,17-二烯-3,16-二酮、脂阿拉伯甘露聚糖、D-半胱氨酸、8-异戊二烯基山柰酚、芥子酸、(S)-去甲乌药碱(norcoclaurine)、烟曲霉素、15-脱氧-δ-12,14-PGJ2、胆汁酸、前列腺素J2、异亮氨酸、以及人参皂苷Rg1。
例如，在一些实施例中，该致炎调控剂是化学药物，例如通过非限制性举例的方式，选自下组的化学激酶抑制物，该组由以下各项组成：Bay11-7082、PD98059、U0126、SB203580、LY294002、JAK抑制物I、1L-6-羟甲基-手性肌醇2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八基碳酸酯、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1296、渥曼青霉素(wortmannin)、Ro31-8220、SC68376、PS-1145、SP600125、PP2/AG1879酪氨酸激酶抑制物、AG490、PP1、双吲哚马来酰亚胺I、酪氨酸磷酸化抑制剂AG127、除莠霉素、Go6976、Sb202190、H89、卡弗他丁C、Rp-cAMPS、Tpl2激酶抑制物、CGP77675、Ro31-7549、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1288、8-溴鸟苷3’,5’-环单磷酸酯、SB220025、AR-12、厄尔布他汀(erbstatin)、KT5926、酪氨酸磷酸化抑制剂47、以及星形孢菌素。
例如，在一些实施例中，该致炎调控剂是另一种化学药物，例如通过非限制性举例的方式，化学试剂、化学毒药或选自下组的其他化学药物，该组由以下各项组成：脂多糖、聚rI:rC-RNA、瑞喹莫德、CpG寡核苷酸、大肠杆菌B4脂多糖、脂质A、CpGODN1826、Pam3-Cys-Ser-Lys4、地塞米松、CEP-1347、乙酸肉豆蔻佛波醇、罗格列酮、马肠沙门氏菌血清型脂多糖、环格列酮、MALP-2s、三硝基苯磺酸、CpGODN1668、CGS21680、甲基2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸酯、放线菌酮、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯、妥替尼、硫酸亚铁、溶血磷脂酰胆碱、Pam3-Cys、吡啶甲酸、他克莫司、阿司匹林、葡聚糖硫酸盐、四氯化碳、白藜芦醇、2-氨基嘌呤、姜黄素、博来霉素、3-甲基腺嘌呤、GW3965、喜树碱、甲氨蝶呤、硼替佐米、塞来考昔、三丁酸甘油酯、香烟烟雾、花生酰基三氟甲烷、辛伐他汀、硫代乙酰胺、表没食子儿茶素-没食子酸酯、脂低聚糖、两性霉素B、曲安奈德、吡格列酮、制霉菌素、3M-002、过氧化亚硝酸盐、S-(2,3-双棕榈酰氧基丙基)-半胱氨酸-GDPKHPKSF、鱼油、吲哚美辛、水杨酸、亚砷酸盐、匹立尼酸、槲皮素、小白菊内酯、芬维A胺、紫杉醇、A23187、替莫唑胺、回氯二苯二氧、阿托伐他汀、二十二碳六烯酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、兰索拉唑、芸香苷、利莫那班、硒、异丙肾上腺素、放线菌素D、ATP-γ-S、长春碱、布拉地新、桂皮醛、泰姆泊尔(tempol)、沙利度胺、托泊替康、己烯雌酚、氟伐他汀、13-顺式-视黄酸、蛋白酶体抑制物PSI、次氮基三乙酸酯酸铁、N-Ac-Leu-Leu-正亮氨酸、依托泊苷、麦考酚酸、氯喹、鞣酸、雷贝拉唑、3M-011、毛喉素、冈田酸、阿霉素、SB216763、2’,3’-二醛ATP、NCX-4040、辣椒平、5-氨基水杨酸、六甲氧基黄酮、甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮、皮质类固醇、3M-001、细胞松弛素D、顺铂、隐丹参醌、亚甲基蓝、L-N6-(1-亚氨基乙基)-赖氨酸、硝普盐、N-乙酰基鞘氨醇、米菲司酮、5-氮杂胞嘧啶核苷、替米沙坦、依布硒啉、前列腺素、辣椒素、多西环素、SR144528、胡椒碱、普伐他汀、羰基氰化物m-氯苯基腙、丙酮酸乙酯、克仑特罗、醋硫葡金、他莫昔芬、米诺环素、TGAL共聚物、大麻二酚、Sn50肽、苯并(a)芘、水飞蓟宾、1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、尼美舒利、罗非考昔、异丁基甲基黄嘌呤、马来酸二乙酯、曲尼司特、双嘧达莫、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶、氟维司群、咪喹莫特、17-α-炔雌醇、三氟柳、甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮、卡托普利、氟替卡松、漆黄素、烟碱、苄氧羰基-Leu-Leu-Leu醛、顺式-尿刊酸、岩藻多糖、N-硝基-L-精氨酸甲酯、木黄酮、氧化偶氮甲烷、表儿茶素酸丙酯、伊屋诺霉素、曲格列酮、NS-398、西立伐他汀、别嘌呤醇、8-氯腺苷、AZD8055、氯苯那敏、二乙基硫代氨基甲酸酯、LY311727、BN50730、1-(1-丙三氧基)十二碳-1,3,5,7,9-五烯、二过氧(吡啶甲酸)氧钒酸酯、乙基香草醛、苄硝唑、CE-2072、奥西那林基硫酸钠、n-6二十二碳五烯酸、AGN194204、胆碱非诺贝特、二十碳五烯酸、氯沙坦钾、万古霉素、苔藓抑素1、尿烷、雌激素、甲泼尼龙、U73122、二甲双胍、苯扎贝特、双氯芬酸、青石棉、香草乙酮、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、活性氧种类、SU6656、2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸、司马沙尼、链佐星、绿茶多酚、S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺、5-N-乙基甲酰胺基腺苷、乳胞素、N-(3-(氨基甲基)苄基)乙脒、己酮可可碱、坦螺旋霉素、醋酸甲羟孕酮、萝卜硫素、普萘洛尔、α-生育酚、熊果苷、反式-桂皮醛、橘皮苷、西他列汀、des-Arg(10)-胰激肽、赖氨酸氯尼辛、巴菲霉素A、大豆异黄酮、羟基基团、马立马司他、齐留通、布美他尼、奥沙西泮、美他司他、非洛地平、γ生育酚、吡拉明、微囊藻素、环氧二十碳三烯酸、瑞芬太尼、昆布多糖、氟尼缩松、布洛芬、9,10-二甲基-1,2-苯并蒽、吗啡、匹马吉定、zVAD-FMK、和S-亚硝基谷胱甘肽。
例如，在一些实施例中，该致炎调控剂是生物药物，如通过非限制性举例的方式，选自下组的生物药物，该组由以下各项组成：环孢菌素A、英利昔单抗、干扰素β-1a、NF-κB诱饵、菌肠毒素B、芳妥珠单抗、阿那白滞素、血蓝蛋白、葡萄籽提取物、以及依那西普。
调控剂的用途
应当理解的是，根据本发明给予治疗实体是与合适的载体、赋形剂、和被结合到配制品中以提供改进的转移、递送、耐受性等的其他药剂一起给予的。许多适当的配制品可以发现于所有药物化学家已知的处方集:雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)(第15版，马克出版公司(MackPublishingCompany)，伊斯顿(1975))，特别是其中布劳格(Blaug)，西摩(Seymour)的第87章。这些配制品包括例如粉剂、糊剂、软膏、胶冻剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的泡囊(例如LipofectinTM)、DNA轭合物、无水吸收糊剂、油包水和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半-固体凝胶、和包含碳蜡的半-固体混合物。任何上述混合物可以适合于根据本发明的治疗和疗法，条件是配制品中的活性成分未被该配制品灭活，并且该配制品与给药的途径是生理相容的且可忍受的。还参见鲍德里克(Baldrick)P.“药物赋形剂开发:临床前指导的需要(Pharmaceuticalexcipientdevelopment:theneedforpreclinicalguidance)”，调节毒理学与药理学(Regul.ToxicolPharmacol)32(2):210-8(2000)，王(Wang)W.“固体蛋白药物的冻干和开发(Lyophilizationanddevelopmentofsolidproteinpharmaceuticals)”，国际药学期刊“Int.J.Pharm.”203(1-2):1-60(2000)，查曼(Charman)WN“脂质、亲脂性药物、以及口服药物递送-一些应急概念(Lipids,lipophilicdrugs,andoraldrugdelivery-someemergingconcepts)”，药物科学杂志(JPharmSci.)89(8):967-78(2000)，鲍威尔(Powell)等人，“用于肠胃外配制品的赋形剂的概略”PDA药物科学技术杂志(PDAJ.PharmSciTechnol.)52:238-311(1998)以及其中针对有关药物化学家熟知的配制品、赋形剂和载体的另外信息的引文。
本发明的包括调控剂的治疗配制品是用于治疗或减轻与免疫相关障碍、异常免疫应答、和/或肿瘤病症(如，例如，癌症)相关联的症状。本发明还提供了治疗或减轻与免疫相关障碍或异常免疫应答相关联的症状的方法。一个治疗方案是通过使用标准方法来鉴定患有(或具有发展的风险)免疫相关障碍或异常免疫应答的受试者(例如，人类患者)来进行的。例如，调控剂在治疗自身免疫疾病和/或炎性障碍中是有用的治疗工具。在某些实施例中，考虑调控剂的用途是例如对抗某些病原体和其他传染病。调控剂在不同的移植适应症中也是有用的治疗工具，例如，防止、延迟或以其他方式缓和移植物的移植排斥和/或延长存活。调控剂也有用于具有展示异常树突细胞应答的遗传缺陷的患者。
调控剂也有用于疫苗和/或作为疫苗佐剂，针对自身免疫障碍、炎性疾病、增殖障碍(包括癌症)等。用于治疗这些类型的障碍的佐剂的组合适合于与自身免疫性中涉及的来自靶向的自身抗原的多种多样的抗原(即自身抗原，例如髓磷脂碱性蛋白；炎性自身抗原例如淀粉样肽蛋白，或移植抗原例如同种抗原)组合使用。该抗原可以包括源自蛋白质的肽或多肽，连同以下各项中任一项的片段：糖类、蛋白质、多核苷酸或寡核苷酸、自身抗原、淀粉样肽蛋白、移植抗原、过敏原、或其他大分子组分。在一些情况下，超过一种抗原被包括在该抗原组合物中。
自身免疫疾病包括，例如，获得性免疫缺陷综合征(AIDS，它是具有自身免疫组分的一种病毒疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫阿狄森氏病、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫内耳疾病(AIED)、自身免疫淋巴组织增综合征(ALPS)、自身免疫血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、口炎性腹泻-疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、波峰综合征、克罗恩病、迪戈斯病、皮肌炎-幼年、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯蒂尔病)、幼年类风湿关节炎、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌病、多肌炎和皮肌炎、原发性血中丙球蛋白贫乏、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病(进行性系统性硬化症(PSS)，也称为系统性硬化症(SS))、舍格伦氏综合征、僵人综合征(stiff-mansyndrome)、系统性红斑狼疮、高安(Takayasu)动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风以及韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)。
在一些实施例中，调控剂有用于在受试者中治疗具有一种炎性组分(如异常炎性应答)的自身免疫疾病、延迟其进展、或以其他方式改善其症状。在一些实施例中，调控剂有用于治疗已知与异常树突细胞应答相关的自身免疫疾病。
炎性障碍包括例如慢性和急性炎性障碍。炎性障碍的实例包括阿尔茨海默病、哮喘、特应性变态反应、过敏症、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血病、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病和呼吸机诱导肺损伤。
与这些免疫相关障碍相关联的症状包括例如炎症、发热、全身不适、发热、通常定位于发炎区域的疼痛、快速脉搏速率、关节疼或疼痛(关节疼痛)、快速呼吸或其他异常呼吸模式、寒战、错乱、定向障碍、烦乱、眩晕、咳嗽、呼吸困难、肺感染、心脏衰竭，呼吸衰竭，水肿、体重增加、黏脓性复发、恶病质、喘鸣、头痛、和腹型症状，如，例如腹痛、腹泻或便秘。
确定治疗的有效性是与用于诊断或治疗特定免疫相关障碍的任何已知方法相关联。该免疫相关障碍的一种或多种症状的缓解表明调控剂赋予临床益处。
如果实现多个实验室或临床目的中任一个，给予到患有免疫相关障碍或异常免疫应答的患者的调控剂被认为是成功的。例如，如果与该免疫相关障碍或异常免疫应答相关联的症状中一个或多个得以减轻、减少、抑制或不进展到一个另外的即更差的状态，则将调控剂给予至患者被认为是成功的。如果免疫相关障碍或异常免疫应答进入缓解或不进展到一个另外的即更差的状态，则将调控剂给予至患者被认为是成功。
治疗有效量的调控剂总体上涉及实现治疗目的所需的量。需要给予的量还将取决于该调控剂针对其特异性靶标的特异性，并且将还取决于所给予的调控剂从自由体积耗尽的速率,其他受试者经该自由体积被给药。
可以给予处于药物组合物形式的调控剂用于治疗多种疾病和障碍。提供了涉及制备此类组合物的原则和考虑连同组分选择的指导，例如，于雷明顿：药物科学与实践(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy)，第19版(阿方索(Alfonso)R.真纳罗(Gennaro)等人编辑)麦克出版公司(MackPub.Co.))，伊斯顿，Pa：1995；药物吸收增强：概念、可能性、限制、和趋势(DrugAbsorptionEnhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,AndTrends)，哈伍德学术出版社(HarwoodAcademicPublishers)，兰霍恩(Langhorne)，Pa.，1994；以及肽和蛋白递送(胃肠外科学上的进展(AdvancesInParenteralSciences)，第4卷)，1991，M.德克尔(Dekker)，纽约。
当使用基于多肽的调控剂时，特异性地结合至该靶标并且保留治疗功能的最小片段是优选的。这类片段可以化学地合成和/或通过重组DNA技术产生(参见，例如马拉斯科(Marasco)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90:7889-7893(1993))。该配制品还可以含有对于正在治疗的具体特定适应症必要的一种以上的活性化合物，优选为具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。可替代地，或另外地，该组合物可以包括增强其功能的一种药剂，如，例如一种细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子适当地以有效于预期目的的量组合存在。
在此引用的所有出版物和专利文献通过引用结合在此，就像特别并且单独地表明每一个这样的出版物或文献将通过引用结合在此。出版物和专利文献的引用并不预期为承认任何文献是相关现有技术，它也并不构成对相关现有技术的内容或日期的任何承认。本发明现在已经通过书面说明书的方式描述，本领域的人员将认识到，本发明可以实践于多种实施例，并且前面的说明和以下的实例是为了说明的目的，而非限制之后的权利要求。
实例
以下实例(包括所进行的实验和所实现的结果)仅是出于说明性目的而提供并且不应被解释为限制本发明)。
实例1：材料和方法
细胞培养、分选、和裂解：如先前描述制备来自6-8周龄雌性B6小鼠的骨髓源性树突细胞(BMDC)的培养物(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)；谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测回路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits).细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))。在9天的体外培养中，将这些细胞如先前所述(Ibid)用脂多糖(LPS，英杰公司)刺激4h，转移细胞至在冰上的一个15mL锥形管，添加5μM钙黄绿素AM和5μM乙锭均二聚物(EthD-1，英杰公司(Invitrogen))，并且然后将单钙黄绿素-阳性、EthD-1-阴性细胞分选到96-孔板的单个孔中，每个孔含有补充有1％2-巯基乙醇(凯杰公司(Qiagen)，巴伦西亚，加利福尼亚州)的5μlTCL缓冲液。在离心之后，将这些板在-80℃立即冷冻。从孵化器移除和裂解之间经过的总时间是小于15分钟。在cDNA合成之前，将这些细胞在冰上进行解冻，并且用2.2xRNACleanSPRI珠粒(贝克曼库尔特基因组公司(BeckmanCoulterGenomics)，丹弗斯，马萨诸塞州)纯化它们而不进行最终洗脱。将带有捕获的RNA的珠粒进行空气干燥并且立即处理用于cDNA合成。没有细胞的孔也被制备为阴性对照，并从作为群体样品的10,000个细胞的全体提取总RNA(参见下文)。
cDNA合成和扩增：SMARTer超低RNA试剂盒(克罗泰克公司(Clontech)，山景城，加利福尼亚州)被用来制备扩增的cDNA。将1μl的12μM3’SMART引物(5’5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)N-1N(N＝A、C、G、或T；N-1＝A、G、或C)，SEQIDNO:273)，1μl的H2O以及2.5μl的反应缓冲液添加到RNA-捕获珠粒。通过吸移将这些珠粒良好混合。将该混合物在72℃下加热3分钟并且然后将其放置在冰上。用这种RNA引物混合物通过如下来合成第一链cDNA：添加2μl的5x第一链缓冲液、0.25μl的100mMDTT、1μl的10mMdNTP、1μl的12μMSMARTerIIA寡聚(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX(X＝在专利性SMARTer寡聚序列中的未公开碱基)，SEQIDNO:274)、100USMARTScribeRT、以及10URNA酶抑制物，总体积为10μl，并在42℃下孵育90分钟，随后在70℃10分钟。将该第一链cDNA通过如下进行纯化：添加25μl的室温AMPureXPSPRI珠粒(贝克曼库尔特基因组公司(BeckmanCoulterGenomics)，丹弗斯，马萨诸塞州)，通过吸移混合均匀，在室温下孵育8分钟。将上清液在建立良好分离之后从这些珠粒去除。所有的以上步骤是在一个无PCR产物的洁净室中进行。将cDNA通过如下进行扩增：添加5μl的10x优势2PCR缓冲液(Advantage2PCRBuffer)、2μl的10mMdNTP、2μl的12μMISPCR引物(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT，SEQIDNO:275)、2μl的50x优势2聚合酶混合物、以及39μlH2O，总体积为50μl。进行PCR：在95℃持续1分钟，随后是在95℃15秒、在65℃30秒钟、和在68℃6分钟，21个循环的，随后另一个在72℃10分钟以用于最终延伸。将扩增的cDNA通过添加90μl的AMPureXPSPRI珠粒并用80％乙醇洗涤来纯化。对于分子计数(参见Kivioja,T.等人.使用唯一的分子标识符对绝对数目的分子计数(Countingabsolutenumbersofmoleculesusinguniquemolecularidentifiers)，自然方法(NatureMethods)9,72-74,doi:10.1038/nmeth.1778(2011)(如在图9和10中的)，将该SMARTerIIA寡聚物替换为定制RNA寡核苷酸(包含四个随机碱基(带条码的SMARTerIIA寡核物：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTNNNNrGrGrG-3’，SEQIDNO:276)。
cDNA剪切和文库构建：将纯化缓冲液(克罗泰克公司(Clontech))添加到该扩增的cDNA中来形成76μl的总体积。将cDNA在100μl管中剪切：10％工作循环(DutyCycle)，5％强度(Intensity)和200次循环/突发(Cycles/Burst)，在频率扫掠模式(CovarisS2机器，沃本，马萨诸塞州)持续5分钟。用2.2体积AMPureXPSPRI珠粒纯化该剪切的cDNA。
如所述的制备用于亿明达测序的索引双末端文库(参见莱文(Levin)，J.Z.等人.链特异性RNA测序方法的综合比较分析(Comprehensivecomparativeanalysisofstrand-specificRNAsequencingmethods)，自然方法(NatureMethods)7,709-715(2010)，有下述修饰。第一，对于每个文库使用一种不同的索引衔接子(包含8-碱基条形码)。第二，将连接产物通过使用两轮的0.7体积的AMPureXPSPRI珠粒清洗(第一轮起始体积在100μl)进行尺寸选择。第三，用Phusion高保真DNA聚合酶与GC缓冲液和2M甜菜碱进行PCR。第四，55℃被用作在用通用索引引物(正向引物5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(SEQIDNO:277)、反向引物5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQIDNO:278))的PCR中的退火温度。第五，进行12个循环的PCR。第六，使用两轮的1.0体积的AMPure珠粒去除PCR引物。
群体对照和阴性对照：对于阳性(群体)对照，从10,000个细胞中使用PrepEaseRNA旋转试剂盒(SpinKit)(昂飞公司(Affymetrix)，圣克拉拉，加利福尼亚州)分离13.85ng的总RNA如通过生物分析仪(BioAnalyzer)(安捷伦(Agilent)，圣克拉拉，加利福尼亚州)测量的。1ng的总RNA被用在以上过程中，除了仅12个循环被用在该cDNA扩增步骤中。对于阴性对照，所有以上过程是在含有TCL缓冲液的孔中从零分选细胞开始进行。在亿明达文库构建的最终PCR中使用18个循环。
读数修剪和映射：在逆转录过程中，该SMART聚合酶分别添加短(SMARTerIIA寡聚物)和长(SMART引物寡聚物)衔接子到针对起源于该转录物的5’和3’端的片段的第二次读取的开始。在映射读数之前，将这些衔接子序列使用Btrim64(命令行参数-l1-e100-v1-b28-a-100)来去除。从大约三分之一的第二读数修剪掉衔接子序列。使用Tophatv1.4.1以默认参数将修剪过的读数映射到mm9版本的小鼠基因组(特拉普内尔(Trapnell),C.，帕彻尔(Pachter)，L.&扎尔茨贝格(Salzberg)，S.L.TopHat：发现与RNA-Seq的剪接结点(TopHat:discoveringsplicejunctionswithRNA-Seq)，生物信息学(Bioinformatics)25,1105-1111,doi:10.1093/bioinformatics/btp120(2009))。使用基因组映射以可视化综合基因组查看器中的数据(罗宾逊(Robinson)，J.T.等人.综合基因组查看器(Integrativegenomicsviewer)，自然生物技术(NatureBiotechnology)29,24-26,doi:10.1038/nbt.1754(2011))，并且计算一组文库品质度量，如下所述。
在与未修剪的读数大约相等的比率来映射其中短衔接子(5’末端)被修剪的读数。然而，其中长衔接子(3’末端)被修剪的读数经常包含聚A伸延(甚至在修剪之后)，并且以极低比率(<1％)映射。由于这些读数应起源于该转录物的3’端，这种低映射百分比导致来自该转录物的3’端的读数的缺失。这种缺失可以抵消3’覆盖偏倚，该覆盖偏倚是SMART方案的一个副产物(参见下文)(拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012))。
量化唯一性mRNA分子：当加工其中该SMARTer寡聚物被修饰以包括一个四核苷酸随机条形码序列的这三个单细胞文库时，将含有该SMARTerIIA寡聚物的读数分离并且如上所述修剪。然后修剪4个另外的碱基(对应于条形码)并且维持用于后面的处理。将修剪过的读数映射到如上所述的小鼠mm9基因组。对于每个基因，然后将映射到正确链上的外显子序列的这些读数的子集进行鉴定，并且检索到它们的原始四核苷酸条形码。对针对每个基因的条形码的唯一数进行计数，并且将其用作单细胞基因表达的一个替代定量。对于所有三种细胞提供唯一性分子条形码计数和TPM估计值两者。
文库质量度量：使用皮卡德工具版本1.42(picard.sourceforge.net)来计算文库质量度量，包括基因组映射比率、每种转录物的覆盖度变异系数、每一文库中核糖体RNA的比例、和位置覆盖偏倚。相比于先前报告，在此数据中观察到更少的3’偏倚(拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012))，可能归因于以上指出的文库构建上的差异(图22)。
表达水平计算：基于UCSC已知基因转录组(藤田(Fujita)，P.A.等人.UCSC基因组浏览器数据库：更新2011(TheUCSCGenomeBrowserdatabase:update2011)，核酸研究(NucleicAcidsResearch)，doi:10.1093/nar/gkq963(2010))建立领结(Bowtie)指数(兰米德(Langmead)，B.，特拉普内尔(Trapnell)，C.，波普(Pop)，M.&扎尔茨贝格(Salzberg)，S.短DNA序列至人类基因组的超快和记忆有效的比对(Ultrafastandmemory-efficientalignmentofshortDNAsequencestothehumangenome)，基因组生物学10,doi:10.1186/gb-2009-10-3-r25(2009))，并且使用领结v0.12.7(命令行选项-q--phred33-quals-n2-e99999999-l25-I1-X1000-a-m200)将双末端读数直接与这个指数进行比对。接着，对这些比对以默认参数运行RSEMv1.11(里(Li)，B.&杜威(Dewey)，C.RSEM：在有或没有参照基因组的情况下来自RNA-Seq数据的准确转录定量(RSEM:accuratetranscriptquantificationfromRNA-Seqdatawithorwithoutareferencegenome)，BMC生物信息学12,doi:10.1186/1471-2105-12-323(2011))来评估表达水平。对于各基因，将RSEM的基因水平表达估计(τ)乘以1,000,000以获得转录物/百万(TPM)评估。为了转化表达水平到对数空间(log-space)，取ln(TPM+1)。当计算“平均”单细胞表达水平时，来自18个单细胞中每个的TPM水平首先被平均，并且然后这个平均估计值被转化到对数空间。
将相同程序应用到先前公开的数据集(加伯(Garber)，M.等人，一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))，该数据集由在BMDC的LPS刺激之后的RNA-Seq时程组成。此数据集被用以鉴定632个基因的一个集合，这些基因在LPS刺激后4h在该群体中与刺激前相比被诱导至少两倍。在图2a、图2d、和图4b中对这些基因进行了分析。
RNA荧光原位杂交(FISH)：针对25种不同mRNA转录物，使用RNA-FISH探针(帕诺米奇斯公司(Panomics)原位测量表达水平。简言之，在Cd11c(美天旎生物科技公司(MiltenyiBiotech))上在第8天体外分选BMDC，并放置在聚-l-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。次日早晨，如先前描述将一些细胞用LPS刺激(阿米特(Amit)，I.等人.对哺乳动物转录网络介导病原体应答的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)；谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测回路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits).细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))。在固定之前十分钟，将细胞培养基替换为Alexa-350麦胚凝集素(WGA，英杰公司(Invitrogen))在HBSS中的1:500稀释物。随后，将细胞固定并且根据制造商的建议染色。固化过夜后，将加载Slowfade(英杰公司(Invitrogen))的盖玻片使用配备有Metamorph软件的落射荧光显微镜(奥林巴斯(Olympus)以x、y、以及z在60x放大倍数(1.42NA，油浸渍)进行光栅扫描。平均起来，对每个样品取100个单独的3维堆叠。对于所有样品，进行四色成像以获得以下信息：激发(ex)405nm-WGA&DAPI染色；ex488nm，ex546nm，ex647nm-分别地，探针1、2、和3。
将所获得的图像以两相进行处理。首先，细胞分析器(CellProfiler)(卡彭特(Carpenter)，A.等人.细胞分析器：用于鉴定和量化细胞表型的图像分析软件(CellProfiler:imageanalysissoftwareforidentifyingandquantifyingcellphenotypes)，基因组生物学7,doi:10.1186/gb-2006-7-10-r100(2006))被用来针对使用UV滤光片组(ex405nm)获取的图像的每个堆叠确定细胞数目和位置。鲜明染色的核区域(DAPI)被用于鉴定单个细胞核，并且然后用作用于从黯淡膜轮廓(WGA)确定每个细胞的范围的种子。然后使用该软件，针对每个成像位置提取单个细胞的位置和范围。接着，对于每个彩色通道，使用先前描述的分析软件包在Matlab中对各个mRNA进行鉴定和计数(拉杰(Raj)，A.，范登伯格(VanDenBogaard)，P.，里夫金(Rifkin)，S.A.，范奥德纳德(VanOudenaarden)，A.&泰亚吉(Tyagi)，S.使用多个单标记的探针对单个mRNA分子成像(ImagingindividualmRNAmoleculesusingmultiplesinglylabeledprobes).自然方法(NatureMethods)5,877-879,doi:10.1038/nmeth.1253(2008))。然后使用细胞分析器(CellProfiler)的输出将鉴定的mRNA分配到单个细胞。也使用Matlab进行最终的分析和绘图。将所展示的RNA-FISH图像进行假性上色并使用AdobePhotoshop叠加。
对于所有RNAFISH直方图，将计数进行归类(n＝50)并在Matlab中用具有5个类(bin)的一个窗口平滑化。作为对照，也分析未用LPS刺激的BMDC以确保诱导的基因RNA-FISH探针的特异性(图23)。
对于剪接分析，定制RNA鱼探针(fishprobe)(帕诺米奇斯公司(Panomics))被设计为Irf7或Acpp，如下：
两个组成型Irf7探针之间的bDNA的数目上的差异导致稍微更好的结合以及因此对于组成型探针B更高的计数。作为一个结果，该度量-探针A计数/(探针A计数+探针B计数)(用在图3c中的直方图中)-是正态分布的，平均值为～0.45(代替～0.5)。在组成型探针B上绘制同种型-特异性探针给出了一个相似的曲线(比较图3c与图15)。如果对于组成型探针(Irf7)计数的mRNA的数目为至少5或如果可变外显子计数的总和为至少5，则仅包括一种细胞。对于Acpp，n＝615个细胞；对于Irf7，n＝490。
免疫荧光(IF)测量：直接在RNA-FISH染色之后如先前所述进行IF共染色(谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.描绘病毒-感测线路的TLR信号传导组分的系统发现(SystematicdiscoveryofTLRsignalingcomponentsdelineatesviral-sensingcircuits)，细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011)；沙列克(Shalek)，A.K.等人.在初级免疫细胞中的纳米线介导的基因沉默：鉴别在慢性淋巴细胞性白血病中的患者特异性应答(Nanowire-MediatedGeneSilencinginPrimaryImmuneCells:IdentificationofPatient-SpecificResponsesinChronicLymphocyticLeukemia)，审阅中(2012))。都以1:200使用的Stat1、pStat1、以及Stat2抗体是从圣克鲁斯生物技术公司获得。平均和总荧光水平连同定位到核的荧光的百分比是从落射荧光显微镜图像使用如以上的单个细胞和它们的核的位置和范围定量的(图17&18)。对于所有蛋白直方图，将计数进行分类(n＝100)并在Matlab中用具有5个类的一个窗口平滑化。单平面和3维扫描得到类似的结果(数据未示出)。
单细胞qRT-PCR：使用单细胞至Ct(Single-Cell-to-Ct)试剂盒(Ambion)以微小修饰制备单BMDC用于qRT-PCR。即，单个BMDC被分选到推荐的裂解缓冲液体积四分之一，并且所有后续步骤都按比例以匹配。在特异靶扩增之后，通过将0.5μL外切核酸酶I、0.25μL外切核酸酶I反应缓冲液、以及1.75μL水添加到每个样品中，涡旋，离心，并且加热到37℃持续30分钟进行外切核酸酶I消化(NEB)。在持续15分钟的一个80℃热灭活后，将样品在缓冲液TE中1:5稀释。使用96x96基因表达芯片(富鲁达生物标记(FluidigmBiomark))分析单细胞、阴性对照、以及群体对照(使用提取的总RNA等效地制备)(达列尔巴(Dalerba)，P.等人.在人结肠肿瘤中的转录异质性的单细胞分解(Single-celldissectionoftranscriptionalheterogeneityinhumancolontumors).自然生物技术(NatureBiotechnology)29,1120-1127,doi:10.1038/nbt.2038(2011))。
Fano因子计算：Fano因子(归一化的标准差)计算为跨各单细胞的基因表达值(对数空间)的标准偏差和平均单细胞表达水平(对数空间，参见上文)的比率。在图2a、b中的灰色虚线表示0.25的常数Fano因子，并且概括地将高度表达的基因分为两组可变和非可变基因，如以下在表S3中显示的。这两个基因集合的功能富集分析(参见下文)对所使用的Fano因子阈值的小变化(在0.2和0.3之间)是高度鲁棒性的。
表S3.基于细胞群中的平均值高度表达的基因
在图2a中的蓝色虚线代表对于给定其单细胞平均值的18个单细胞的最大理论标准偏差。当这些细胞在(μ+log(2))/2的值左右完美双峰式分布时，这个理论最大值发生并且通过关系：σ最大＝sqrt(18/17)*(μ+log(2))/2)表示。
可变/非可变基因集合的功能富集：使用DAVIDv6.7来进行非可变高度表达的基因集合的功能富集(GO注解)。(黄(Huang)，D.W.，谢尔曼(Sherman)，B.T.&伦皮奇(Lempicki)，R.A.)生物信息学富集工具:朝向大基因列表的全面功能分析的路径(Bioinformaticsenrichmenttools:pathstowardthecomprehensivefunctionalanalysisoflargegenelists).核酸研究(NucleicAcidsResearch)37,1-13,doi:10.1093/nar/gkn923(2009)；黄(Huang)，D.W.，谢尔曼(Sherman)，B.T.&伦皮奇(Lempicki)，R.A.)使用DAVID生物信息学资源的大基因列表的系统性且整合性分析(SystematicandintegrativeanalysisoflargegenelistsusingDAVIDbioinformaticsresources).自然－实验手册(NatureProtocols)4,44-57,doi:10.1038/nprot.2008.211(2009))。522个高度表达的基因的完整列表被用作背景集合。对于图2a和表S3，两个列表合并以便形成一个持家基因集合。该第一列表是在GO注释中定义的一个核糖体亚基蛋白集合(黄(Huang)等人，核酸研究(NucleicAcidsResearch)2009；黄(Huang)等人，自然-实验手册(NatureProtocols)2009)并且第二列表是取自从凯杰公司(Qiagen)网站下载的常用小鼠持家基因的表格。
相关矩阵以及主组分分析(PCA)：在R中使用prcomp函数进行针对632个诱导的基因的PCA。每个基因的表达值被转化为跨单细胞具有零均值和单位方差以便适当地比较跨该群体中具有不同总丰度的基因的可变性模式。
基于对数标度(但非转化的)基因表达估计来计算一个相关矩阵，并使用k-均值对该矩阵进行聚簇。选择基于“肘方法(elbowmethod)”的具有五个簇的参数(迪代(Diday)，E.分类和数据分析上的新方法(Newapproachesinclassificationanddataanalysis)，(施普林格出版社(Springer-Verlag)，1994))(数据未显示)，但强富集的抗病毒簇(及其与PC2的高程度重叠)的鉴定对于k-均值的参数选择或随机性是高度鲁棒性的。
在632个基因的集合中，对来自之前工作的抗病毒基因靶标集合(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009))进行注解。针对相同刺激的(在4h)BMDC集合，从“启动子ChIP峰”的先前定义集合注释Stat2靶标(加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))。使用一个以R的超几何检验，使用632个诱导基因的全集合作为背景集合，进行簇特异性富集分析。
群体荧光激活细胞分选(FACS)分析和定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)：将BMDC用LPS刺激4h。在分选之前十五分钟，将细胞用来自生物传奇公司(Biolegend)的11种抗体中每种进行染色，这定义半-成熟(S)或正在成熟的(M)细胞：Cd83(S)、Cd273(S)、Ccr7(S)、Cd40(S)、Cd201(S)、Cd137(S)、Cd68(M)、Cd120b(M)、Cd53(M)、Cd88(M)、以及Cd16/32(M)。将对所测试的表面标记中每一种是阳性或阴性的1,000个细胞的三个组在100μL的补充有1％2-巯基乙醇的缓冲液TCL中进行分选。然后使用RNeasy迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从20个样品中的每个提取总RNA，并且使用SensiscriptRT(凯杰公司(Qiagen))来制备cDNA，如先前所述(沙列克(Shalek)，A.K.等人.作为用于将生物分子递送到活细胞的通用平台的垂直硅纳米线(Verticalsiliconnanowiresasauniversalplatformfordeliveringbiomoleculesintolivingcells).美国科学院论文集(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences)107,1870-1875,doi:10.1073/pnas.0909350107(2010))。然后相对于GAPDH使用qRT-PCR分析不同转录物的群体范围表达水平，如先前所述(沙列克(Shalek)，A.K.等人，作为用于将生物分子递送到活细胞的通用平台的垂直硅纳米线(Verticalsiliconnanowiresasauniversalplatformfordeliveringbiomoleculesintolivingcells).美国科学院论文集(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences)107,1870-1875,doi:10.1073/pnas.0909350107(2010))(图15)。用于qRT-PCR的引物呈现在以下表S6中。
表S6.基因列表，针对富鲁达单细胞qPCR代码集的PCR引物对
剪接分析：下载～67,000个先前注释的可变剪接事件(外显子跳跃(skippedexon)，互斥的剪接事件)的集合(Wang(王)，E.T.等人.在人组织转录组中的替代同种型调节(Alternativeisoformregulationinhumantissuetranscriptomes).自然456,470-476,doi:10.1038/nature07509(2008))。用默认参数运行MISO(卡茨(Katz)，S.，王(Wang)，E.T.，艾罗尔迪(Airoldi)，E.M.&伯奇(Burge)，C.B.用于鉴定同种型调节的RNA测序实验的分析和设计(AnalysisanddesignofRNAsequencingexperimentsforidentifyingisoformregulation)，自然方法(NatureMethods)7,1009-1015,doi:10.1038/nmeth.1528(2010))来估计针对单细胞的每个的和群体重复的每次事件的剪接百分比(percentsplicedin)(PSI)。在待通过MISO进行分析的任何的样品中绝大部分的事件没有以充分的深度表达。对于剩余4,338个事件，应当注意的是衍生自10,000个细胞重复的PSI估计值紧密相关(平均r＝0.91)。针对三个群体重复的PSI值被平均并且将这些分析的剩余者集中在322个基因中的352个“可变剪接”事件(20％<群体PSI平均<80％)(28个基因具有至少两个可变剪接事件)。
然后检查跨单细胞的这352个可变剪接事件的PSI分布(图3b)。为了确保仅检查来自高度表达的转录物的可靠剪接事件，仅考虑针对单细胞/剪接事件对的PSI估计，其中该可变剪接基因以高水平表达(单细胞TPM>250)，在该水平之内考虑单细胞。这导致来自79个基因的89个唯一性可变剪接事件。在应用这种过滤器后，对跨单细胞的PSI估计值的直方图进行绘图(图3b，顶部)。图3b(底部)示出了针对来自图3b(顶部)的相同的89个剪接事件来自前10,000-细胞重复的PSI估计值的直方图。
小鼠：对于在此提供的高通量实例，6-8周龄的雌性C57BL/6野生型(wt)，Tnfrsf1a-/-xTnfrsf1b-/-(Tnfr、Irf1-/-、Tirap-/-、Il1rn-/-、Ikbke-/-、Cxcr2-/-、Egr1-/-、Fas-/-、NZBWF1/J和Ifnβ1-eYFP报告基因小鼠获得自杰克逊实验室(JacksonLaboratory)(巴尔港，ME)。Stat1-/-和129/Sv对照小鼠购自泰康利公司(Taconic)(哈得逊(Hudson)，NY)。Irf7-/-骨髓(BM)是由马萨诸塞大学医学院的凯特·菲茨杰拉德(KateFitzgerald)提供。Ifnr-/-BM是由麻省综合医院的尼尔哈科恩(NirHacohen)提供的。ZFP36-/-(TTP-/-)和对照BM是由NIH/NIEHS的佩里布莱克希尔(PerryBlackshear)提供的。Ifnar1-/-(IfnrKO)骨髓尼尔哈科恩(麻省综合医院)；Il27-/-(Il27rKo)骨髓如由维贾伊克罗(VijayKuchroo)(布里格姆和妇女医院(BrighamandWomen’sHospital))提供。
所有动物都容纳并且维持在剑桥的MIT，马萨诸塞州(IUCAC协议：0609-058015)的常规无病原体设施中。所有实验是根据由MIT动物保护委员会(剑桥，马萨诸塞州)概述的指导方针进行的。
细胞培养、分选、和裂解：对于在此提供的高通量实例，如先前描述以很少修饰，制备来自6-8周龄雌性B6小鼠的骨髓源性树突细胞(BMDC)的培养物(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)；谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测线路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits)，细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))。即，在补充有10％DMSO的纯胎牛血清中以5百万(M)个细胞/mL，将分离的骨髓冷冻下来。对于每次运行，如前所述解冻并且培养一个单一小瓶(Ibid)。在体外培养的第9天，将这些细胞用抗-Cd11c抗体(美天旎生物科技公司)进行标记并进行流量分选，保留阳性细胞的前10％。随后，这些细胞旋转减慢并且在15mL锥形管中以2x105个细胞/mL的浓度再悬浮于补充有相关刺激物的培养基中并且放置在具有微开的帽的孵化器中。如先前描述的使用刺激剂–PAM3CSK(英杰公司)，聚(I:C)[PIC](恩佐生命科学(EnzoLifeSciences)，10μg/mL)、LPS(英杰公司，100ng/mL)、以及干扰素-β(Ifn-β)(R&D系统，1000个单位/mL)(Ibid)。在特定的时间点之前45分钟，细胞旋转减慢，以3x105M个细胞/mL的浓度再悬浮于补充有赫斯特(Hoechst)34580染料(生命科技公司(LifeTechnologies)，根据制造商的建议)的完全培养基中，与C1悬浮试剂(富鲁达)7:3混合，并且加载到C1微流体芯片。加载之后，将C1微流体芯片的捕获端口中的每个针对细胞的存在进行光学检查。存在于每个腔室中的细胞的数目是通过对核的数目进行计数来确定的。平均单细胞捕获率是72(平均)±13(标准差)/芯片。具有两个或更多个细胞的腔室的平均数目是8±7。虽然在所呈现的分析中未自动过滤出(即，通过计算分析)罕见的多捕获事件，通过手动检查证实任何特定发现(例如，‘早熟细胞’)，以确保没有涉及细胞双联或其他细胞捕获。类似地，明确证实了赫斯特(Hoechst)34580的添加不改变在此提供的系统中的基因表达。
全转录组扩增：在细胞分离后，将细胞裂解并且进行SMART-Seq(参见拉姆斯科尔博(Ramskold)，2011)。使用SMARTer超低RNA试剂盒(SMARTerUltraLowRNAKit)制备全转录组扩增产物(WTA)用于亿明达测序(克罗泰克公司(Clontech))，连同以如下修饰在C1上运行mRNA-Seq实验方案：
细胞裂解混合物：
组成 母液浓度 体积
C1加载试剂 20X 0.60ul
SMARTer试剂盒RNA酶抑制物 40x 0.30ul
SMARTer试剂盒3’SMART CDS引物II A 12μM 4.20ul
SMARTer试剂盒稀释缓冲液 1X 6.90ul
循环条件I：
a)72℃，3min
b)4℃，10min
c)25℃，1min
逆转录(RT)反应混合物：
循环条件II：
a)42℃，90min
b)70℃，10min
PCR混合物：
循环条件III：
a)95℃，1min
b)5个循环：
i)95℃，20s
ii)58℃，4min
ii)68℃，6min
c)9个循环：
i)95℃，20s
ii)64℃，30s
ii)68℃，6min
d)7个循环：
i)95℃，30s
ii)64℃，30s
ii)68℃，7min
e)72℃，10min
文库制备和RNA-Seq：从C1芯片收获WTA产物，并且根据制造商的建议，以微小修饰使用NexteraXTDNA样品制备试剂盒(亿明达公司(Illumina))来制备cDNA文库。即，以四分之一的所建议体积运行反应，并且将标签化(tagmentation)步骤延长至10分钟。在该PCR步骤之后，将所有96个样品进行聚池而不进行文库归一化，用0.9xAMPureXPSPRI珠粒(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))清洗两次，并且在缓冲液TE中洗脱。最后，将聚池的文库使用Quant-ITDNA高-灵敏度测定试剂盒(英杰公司(Invitrogen))进行定量，使用高灵敏度DNA芯片(安捷伦(Agilent))检查，并且在MiSeq(亿明达公司(Illumina))上运行。最后，将样品使用HiSeq2000或HiSeq2500进行深入地测序。
群体对照的RNA-Seq：根据制造商的建议，通过使用RNeasyplus微小RNA试剂盒(RNeasyplusMicroRNAkit)(凯杰公司(Qiagen))提取总RNA而产生群体对照。随后，将1μL在水中的RNA添加至2μL的裂解反应混合物，使用循环条件I(如上文)进行热循环。接着，添加4μL的RT反应混合物并且将该混合物使用循环条件II(如上文)进行热循环。最后，将1μL的总RT反应添加至9μL的PCR混合物并且将该混合物使用循环条件III(如上文)进行热循环。将产物进行定量，稀释至0.125ng/μL，并且如以上制备、清洁和测试文库。
RNA荧光原位杂交(RNA-Fish)：使用来自帕诺米奇斯公司(Panomics)的探针如先前所述进行针对Ifit1、Tnf、Il6、B2m、以及Ifnb1的RNA-FISH(图27)(参见例如，沙列克(Shalek)，A.K.等人.“单细胞转录组学揭示了免疫细胞中表达和剪接的双峰性(Single-celltranscriptomicsrevealsbimodalityinexpressionandsplicinginimmunecells)”.自然498,236-240,doi:10.1038/nature12172(2013))。
芯片上细胞分离和模拟：为了阻断细胞间通讯，在捕获之后在C1芯片中刺激单BMDC。首先，在加载这些细胞之前，将C1芯片用C1阻断试剂进行预阻断，并且然后用完全培养基阻断2h。然后，加载未刺激的BMDC并且然后用补充有适当的刺激物的完全培养基洗涤。在引入混有刺激物的(stimulus-laced)完全培养基后，将该芯片在37℃维持在该C1系统内，直到特定测定时间点之前30分钟(即，针对4h刺激时间点持续3.5小时)。然后将细胞在芯片上用含有赫斯特(英杰公司(Invitrogen))的培养基洗涤，并且将该芯片从该C1系统中去除、显像并且如以上在4h运行。在室温下30分钟的间隔(相当于我们对加载“管内”样品的定时)用于裂解之前的细胞洗涤(15分钟)、成像(5分钟)、以及试剂负载(10分钟)。最后，模拟“芯片上”实验是如上通过加载如上的细胞进行的并且然后引入如上的无LPS完全培养基。
细胞因子添加，GolgiPlug，以及放线菌酮实验：如所述在200ng/mL添加重组IL-4(美天旎公司(MiltenyiBiotec))、IL-6(美天旎公司(MiltenyiBiotec))、IL-10(R&D系统)、IL-12(美天旎公司(MiltenyiBiotec))、IL-15(美天旎公司(MiltenyiBiotec))、IL-27(R&D系统公司)、IL-35(AdipoGen公司)。在不同时间点以1:1,000稀释添加GolgiPlug(BD生物科学公司(BDBiosciences))。最后，在刺激的时候或在标准的4hLPS对照期间以100μg/mL从500x乙醇母液添加放线菌酮。
加工RNA-Seq数据：如先前所述的处理原始测序数据(沙列克(Shalek)，自然(Nature)2013)，除了不需要修剪SMARTer短和长衔接子序列，这归因于Nextera文库制备(参见例如，拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:10.1038/nbt.2282(2012)。将短测序读数与UCSCmm9转录组进行比对(参见例如，藤田(Fujita)，P.A.等人.UCSC基因组浏览器数据库：更新2011(TheUCSCGenomeBrowserdatabase:update2011).核酸研究(NucleicAcidsResearch),doi:10.1093/nar/gkq963(2010)。这些比对被用来评估转录组比对率，并且也被用作RSEMv1.12中的输入(李(Li)，B.&杜威(Dewey)，C.RSEM：在有或没有一个参照基因组的情况下来自RNA-Seq数据的准确转录物定量(RSEM:accuratetranscriptquantificationfromRNA-Seqdatawithorwithoutareferencegenome).BMC生物信息学12,doi:10.1186/1471-2105-12-323(2011))，以针对在所有样品中的所有UCSCmm9基因定量基因表达水平(转录物/百万；TPM)。以Tophatv.1.41进行基因组映射作图(特拉普内尔(Trapnell)，C.，帕彻尔(Pachter)，L.&扎尔茨贝格(Salzberg)，S.L.TopHat:发现与RNA-Seq的剪接结点(TopHat:discoveringsplicejunctionswithRNA-Seq)，生物信息学(Bioinformatics)25,1105-1111,doi:10.1093/bioinformatics/btp120(2009))，并且将所得到的比对用来计算基因组映射作图率、rRNA污染、以及3'和5'位置偏倚(皮卡德工具(PicardTools))。未在至少1％的所有单细胞中以可观的水平(ln(TPM+1)>1)表达的所有基因被舍弃，对于所有其他分析留下10,313个基因。
确定簇和主组分(PC)之间的统计学上显著的关联：为了确定哪个模块与由这些PC所限定的数据中的可变性的主要来源显著相关，一种最近开发的统计上的重新取样方法(钟(Chung)，N.C.&斯托里(Storey)，J.D.驱动系统变异的变量的统计显著性(Statisticalsignificanceofvariablesdrivingsystematicvariation).arXiv,doi:uuid/22B6DA41-E02D-423F-87BC-211091235A51(2013))被用来确定与前三种PC相关的基因。简言之，通过独立地零化每个基因对前三种PC的贡献，并且检查由修饰的PC解释的变化上的改变，针对每个免疫应答基因计算F-统计量。然后，排列矩阵中小数目的随机行(n＝5)，并且针对这些合成空变量计算F-统计量。将这个程序再重复1,000次以产生一组空统计量。为了评估每个模块的统计显著性，进行单侧曼-惠特尼检验。
基因表达变化的拟合参数模型：在每种条件下针对每个基因通过将一系列嵌套统计模型拟合至其表达分布而估计标称参数α、σ2、和μ(图26a、b)。所有表现都集中于LPS应答，其中来自大部分模块的基因被诱导。首先，测试了免疫应答基因的单细胞表达分布是否与(μ，σ2)单峰对数正态分布相容，如先前已经使用在文献中来描述基因表达的单细胞分布(参见例如，拉杰(Raj)，A.，佩斯金(Peskin)，C.S.，德兰金纳(Tranchina)，D.，瓦尔加斯(Vargas)，D.Y.&泰亚吉(Tyagi)，S.于PLoS生物学(PLoSBiol)卷4e309(2006))。对于每种条件下的每个基因，对所有log(TPM+1)值的均值以及方差进行计算，并且拟合优度检验被用来测试这些参数的对数正态分布。仅非常少数的分布(2.5％)通过双参数模型被良好描述，主要归因于我们的单细胞数据中的零值的膨胀。
接着，通过估计针对α、σ2、以及μ的值，将每个单细胞基因表达分布参数化。每个分布对应于针对给定条件下给定基因观察到的跨单细胞的表达值。该表达阈值设定在ln(TPM+1)>1，因为观察到在0<ln(TPM+1)<1的范围中的表达水平典型地反映映射到外显子序列的极少数读数，并且这些可能表明少量的污染。因此α值被估计为如下细胞的比例，其中转录物表达在水平(ln(TPM+1)>1)被检测到。然后以所有表达值(其中ln(TPM+1)>1)的对数-空间计算均值(μ)以及方差(σ2)。使用另外的拟合优度检验评估这种三参数模型的拟合。发现分布的大多数(92％)被该三参数(μ、σ2、α)模型(p<0.01，拟合优度检验)良好描述。
实例2.用脂多糖(LPS)刺激骨髓源性树突细胞(BMCD)
为了表征基因组规模的表达可变性的程度并解密其调控和功能含义，单细胞RNA-Seq被用来研究BMDC对LPS刺激的应答中的异质性。由于若干原因，BMDC对于单细胞分析是一个有吸引力的模型系统。首先，LPS(革兰氏阴性细菌的组分和Toll样受体4的配体)是一种生理学上相关的均匀的刺激物，其使细胞应答同步并缓和时间分期(泰(Tay)，S.等人.单细胞NF-κB动力学揭示数字激活和类似信息处理(Single-cellNF-κBdynamicsrevealdigitalactivationandanalogueinformationprocessing).自然(Nature)466,267-271,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145(2010))。第二，通过LPS进行的激活引发针对炎性和抗病毒细胞因子的鲁棒转录程序，并且控制这种应答的许多组分已知来自“群体范围的”研究(竹内(Takeuchi)，O.&阿基拉(Akira)，S.模式认知受体和炎症(PatternRecognitionReceptorsandInflammation).细胞140,805-820,doi:10.1016/j.cell.2010.01.022(2010))。第三，LPS刺激应增加针对诱导的基因的mRNA和蛋白质水平之间的同步，减少针对单细胞分析的潜在混淆因子(谷口(Taniguchi)，S.等人.在单细胞中以单分子灵敏度量化大肠杆菌蛋白质组和转录组(QuantifyingE.coliProteomeandTranscriptomewithSingle-MoleculeSensitivityinSingleCells).科学(Science)329,533-538,doi:10.1126/science.1188308(2010)，李(Li)，G.-W.&谢(Xie)，X.S.在活细胞中在单个分子水平的中心法则(Centraldogmaatthesingle-moleculelevelinlivingcells).自然(Nature)475,308-315(2011))。最后，来自骨髓培养物的分化的DC是有丝分裂后的，很大程度上去除了细胞周期的影响(卡里斯凯(Kalisky)，T.，布莱内(Blainey)，P.&奎科(Quake)，S.R.在单细胞水平的基因组分析(GenomicAnalysisattheSingle-CellLevel).遗传学年度综述(Annualreviewofgenetics)45,431-445,doi:papers2://publication/doi/10.1146/annurev-genet-102209-163607(2011)；拉莫斯(Ramos)，C.A.等人.在单造血干细胞的转录曲线中的多样性证据(EvidenceforDiversityinTranscriptionalProfilesofSingleHematopoieticStemCells).PLoS遗传学(PLoSGenetics)2,e159,doi:papers2://publication/doi/10.1371/journal.pgen.0020159.st008(2006))。
将BMDC用LPS刺激并在四小时之后收获单细胞(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)；谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测回路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits).细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))(实例1)。使用SMART-Seq(拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012))，构建衍生自18个单BMDC(S1-S18)的cDNA文库，10,000个细胞的三个重复群，和两个阴性对照(空孔)。将这些文库中的每个进行测序，到27-百万读数对/样品的平均深度。如所预期的，小于0.25％的来自阴性对照文库的读数比对到小鼠基因组，并且这些样品在所有其他分析中舍弃。文库质量度量(莱文(Levin)，J.Z.等人.链特异性RNA测序方法的综合比较分析(Comprehensivecomparativeanalysisofstrand-specificRNAsequencingmethods)，自然方法(NatureMethods)7,709-715(2010))，例如与该基因组的比对率、核糖体RNA污染、和3’或5’覆盖偏倚，跨所有单细胞文库和10,000-细胞重复是相似的。对于每个样品，针对所有UCSC-注释基因计算表达水平(许(Hsu)，F.等人.UCSC已知基因(TheUCSCKnownGenes).生物信息学(Bioinformatics)(英国牛津)22,1036-1046,doi:10.1093/bioinformatics/btl048(2006))使用RSEM(李(Li)，B.&杜威(Dewey)，C.N.RSEM：在有或没有一个参照基因组的情况下来自RNA-Seq数据的准确转录物定量(RSEM:accuratetranscriptquantificationfromRNA-Seqdatawithorwithoutareferencegenome).BMC生物信息学12,323-323(2011))(实例1)，并且舍弃未在至少三个单独细胞中以可观的水平(转录物/百万(TPM)>1)表达的所有基因，保留6,313个基因用于进一步分析。
虽然群体重复的基因表达水平与彼此紧密相关(皮尔逊(Pearson)r>0.98，对数标度，图1a)，在单个细胞之间存在基因表达谱的实质变化(0.29<r<0.62，均值：0.48，图1b，图5)。尽管这种广泛的细胞间细胞变化，“平均”单细胞的表达水平-通过对所有18个单细胞的转录物表达水平平均化而衍生-与这些群体样品良好相关(0.79<r<0.81)(图1c，图5)。这个观察证实了单细胞之间观察到的显著基因表达差异一起平均以形成该群体谱。
RNA-荧光原位杂交(FISH)(不需要扩增的一种单分子成像技术)(于(Yu)，M.等人.胰腺循环肿瘤细胞的RNA测序暗示在转移中的WNT信号传导(RNAsequencingofpancreaticcirculatingtumourcellsimplicatesWNTsignallinginmetastasis).自然487,510-513,doi:10.1038/nature11217(2012)；拉杰(Raj)，A.，里夫金(Rifkin)，S.A.，安徒生(Andersen)，E.&范奥德纳德(VanOudenaarden)，A.基因表达上的可变性引起不完全外显率(Variabilityingeneexpressionunderliesincompletepenetrance).自然463,913-918,doi:10.1038/nature08781(2010))，被用以证实单细胞表达的异质性反映真正的生物学差异，而不是与少量的细胞RNA的扩增相关的技术噪声。对于25个基因，选择来覆盖宽范围的表达水平，通过RNA-FISH检测的基因表达水平上的变化紧密反射在测序数据中所观察到的异质性(图1d-h，图6)。例如，经典的持家基因(例如，β-肌动蛋白(Actb)、β-2-微球蛋白(B2m))的表达匹配单细胞RNA-Seq和RNA-FISH测量两者中的对数正态分布，这符合先前研究(本特松(Bengtsson)，M.来自胰腺郎格罕氏岛的单细胞的基因表达谱揭示了mRNA水平的对数正态分布(GeneexpressionprofilinginsinglecellsfromthepancreaticisletsofLangerhansrevealslognormaldistributionofmRNAlevels).基因组研究(GenomeResearch)15,1388-1392,doi:papers2://publication/doi/10.1101/gr.3820805(2005))。相比之下，涉及在BMDC对LPS的应答中的许多基因，尽管平均起来高度表达，显示出不会拟合对数正态分布的显著更大水平的异质性。在极端的情况下，这些基因的表达水平在单个细胞之间改变多达～1,000倍(图1e-h)。更一般地说，发现单细胞基因表达的高水平的可变性跨宽范围的群体表达水平持续(图2a)。
具体地说，522个最高度表达的基因(单细胞平均TPM>250，表S3)中281个展现出低可变性，并且它们的表达水平通过跨单细胞的对数正态分布被良好描述(RNA-Seq：图2b、c顶部，RNA-FISH(Actb，B2m)：图6)。这281个基因富集了持家基因，这些基因编码核糖体和其他结构蛋白(邦费罗尼校正的p＝1.5*10-6)。这与先前在酵母(纽曼，J.R.S.&魏斯曼(Weissman)，J.S.系统生物学：来自一者的许多因素(Systemsbiology:manythingsfromone)，自然(Nature)444,561-562(2006)；巴尔-埃文(Bar-Even)，A.等人.天然蛋白丰度的蛋白表达规模中的噪声(Noiseinproteinexpressionscaleswithnaturalproteinabundance)，自然遗传学(Naturegenetics)38,636-643(2006))和人类(拉姆(Ram)，O.等人.在人类细胞中由全基因组位置分析覆盖的染色质调节物的组合模式化(CombinatorialPatterningofChromatinRegulatorsUncoveredbyGenome-wideLocationAnalysisinHumanCells)，细胞147,1628-1639(2011))细胞中的观察结果一致，即高度表达的持家基因及‘生长’基因在细胞之间是更少可变的。
然而，令人惊讶地，大部分其他高度表达的基因表现出双峰表达模式(241个高度可变的基因中185个，图2b、c底部)：针对这些基因的mRNA水平在许多细胞中较高，但是比至少三个细胞中的单细胞平均值低至少一个数量级，其中丰度常常是非常低的或不可检测到的。这种变化是独立地通过RNA-FISH验证(例如，Cxcl1、Cxcl10、Ifit1，以及其他的：图6)，证实了其不是技术噪声的结果。这个可变集合高度富集了如下基因，所述基因在群体水平LPS刺激上至少两倍诱导(加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))(p＝2.7×10-7；超几何检验)，并且包括抗病毒和炎性应答元件两者，表明高度表达的基因中这样广泛的可变性可能是该免疫应答的一个特征。虽然双峰表达模式表征许多免疫应答转录物，一些免疫应答基因高度表达于每个细胞(图7)，证明所有细胞鲁棒地应答于LPS。这些包括关键趋化因子和趋化因子受体(Ccl3、Ccl4、Ccrl2)、细胞因子(Cxcl2)、以及LPS应答的其他重要组分(Tank)。
高度表达的转录物的这种程度的变化在先前研究中未曾观察到(伊斯兰(Islam)，S.等人.通过高度多重RNA-seq表征单细胞转录景观(Characterizationofthesingle-celltranscriptionallandscapebyhighlymultiplexRNA-seq).基因组研究(GenomeResearch)，doi:papers2://publication/doi/10.1101/gr.110882.110(2011)；唐(Tang)，F.等人.RNA-Seq分析以捕获单细胞的转录组景观(RNA-Seqanalysistocapturethetranscriptomelandscapeofasinglecell).自然－实验手册(NatureProtocols)5,516-535,doi:10.1038/nprot.2009.236(2010)；唐(Tang)，F.等人.单细胞的mRNA-Seq全转录组分析(mRNA-Seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecell).自然方法(NatureMethods)6,377-382,doi:10.1038/nmeth.1315(2009)；拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012)；哈什姆肖尼(Hashimshony)，T.，瓦格纳(Wagner)，F.，谢尔(Sher)，N.&柳井(Yanai)，I.CEL-Seq：通过多路复用线性扩增的单细胞RNA-Seq(CEL-Seq:Single-CellRNA-SeqbyMultiplexedLinearAmplification).细胞报告(CellReports)，doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003)。例如，在8种人类胚胎干细胞的已公开SMART-Seq数据集中(拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells)，自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012))(图2a))或在来自终末分化的小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞的单细胞RNA-Seq数据集中在针对高度丰富的(群体平均)基因的表达上发现少得多的异质性(哈什姆肖尼(Hashimshony)，T.，瓦格纳(Wagner)，F.，谢尔(Sher)，N.&柳井(Yanai)，I.CEL-Seq：通过多路复用线性扩增的单细胞RNA-Seq(CEL-Seq:Single-CellRNA-SeqbyMultiplexedLinearAmplification).细胞报告(CellReports)，doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003)(图8)。此外，在对数中期酵母细胞以及分裂的人类细胞系中在蛋白表达的变化的基因组规模研究中未观察到高度表达的基因中的此类双峰性(平均起来)(纽曼，J.R.S.&魏斯曼(Weissman)，J.S.系统生物学：来自一者的许多因素(Systemsbiology:manythingsfromone).自然(Nature)444,561-562(2006)；巴尔-埃文(Bar-Even)，A.等人.天然蛋白丰度的蛋白表达规模中的噪声(Noiseinproteinexpressionscaleswithnaturalproteinabundance).自然遗传学(Naturegenetics)38,636-643(2006)；西加尔(Sigal)，A.等人.在人类细胞中蛋白水平的可变性和记忆(Variabilityandmemoryofproteinlevelsinhumancells).自然444,643-646,doi:10.1038/nature05316(2006))。因此假设，所观察到的双峰性可以反映受刺激的BMDC群体中的功能重要差异。
此外，跨单细胞的剪接模式也显示先前未观察到的异质性水平：对于在群体水平具有多个剪接同种型的基因，单个细胞主要表达一种特定的同种型。使用MISO(用于计算同种型比率的一种贝叶斯框架)来计算这些样品的每个中先前注释的剪接事件的频率(剪接百分比，PSI)(卡茨(Katz)，S.，王(Wang)，E.T.，艾罗尔迪(Airoldi)，E.M.&伯奇(Burge)，C.B.用于鉴定同种型调节的RNA测序实验的分析和设计(AnalysisanddesignofRNAsequencingexperimentsforidentifyingisoformregulation)，自然方法(NatureMethods)7,1009-1015(2010))。令人惊讶地，虽然这些群体衍生的估计值是高度可重现的，单细胞在外显子包含频率上展现出显著可变性(图3a，b)。
考虑了如下可能性，即该PCR扩增步骤(文库制备方法固有的)可以潜在地导致同种型调节可变性的过高估计，特别是对于弱表达的转录物，归因于‘头奖效应(jackpoteffect)’(施如古齐(Shiroguchi)，K.，加(Jia)，T.Z.，西姆斯(Sims)，P.A.&谢(Xie)，X.S.数字RNA测序最小化序列依赖性的偏差和优化的单分子条形码的扩增噪声(DigitalRNAsequencingminimizessequence-dependentbiasandamplificationnoisewithoptimizedsingle-moleculebarcodes)，美国国家科学院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica)109,1347-1352(2012))。然而，发现甚至当该分析限于非常高度表达在单细胞内(单细胞TPM>250)的89个可变剪接外显子(0.2<群体PSI<0.8)时，仍然观察到单个细胞中剪接模式上相同的双峰性，一种或其他剪接变体的高度偏斜表达取代两者在可比水平的同时表达(图3b)。
为了进一步控制一些分子的随机过扩增可能混淆剪接分析的可能性，使用轻微修饰的SMART-Seq方案(实例1)建立三个另外的单细胞cDNA文库，其中在逆转录过程中一个四核苷酸条形码被引入到每个RNA分子上。这个条形码通过PCR扩增和文库制备保留，允许我们对呈现在该测序文库中的唯一性RNA转录物的数目进行量化(图9和实例1)。甚至当将剪接分析限制到由至少15个唯一性条形码表示的基因，相比于群体平均值，观察到单细胞中同种型表达的强偏向(图10)。
迄今为止，甚至针对单基因都很少研究剪接模式中的单细胞变化，并且从未在基因组规模进行分析。一个最近报道(韦克斯(Waks)，Z.，克莱因(Klein)，A.M.&西尔弗(Silver)，P.A.可变RNA剪接的细胞间可变性(Cell-to-cellvariabilityofalternativeRNAsplicing).分子系统生物学(MolecularSystemsBiology)7,1-12,doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2011.32(2011))使用RNA-FISH来研究两个基因中可替代性同种型的变化，并且观察到跨单细胞的较低水平的同种型可变性(不同细胞类型中不同的异质性水平)。使用荧光报告基因来定量单细胞外显子包含水平的另一项研究对于一个基因观察到高度可变的和双峰式的剪接模式(戈尔斯卡亚(Gurskaya)，N.G.等人.使用两种荧光蛋白在单细胞水平分析盒外显子的可变剪接(Analysisofalternativesplicingofcassetteexonsatsingle-celllevelusingtwofluorescentproteins).核酸研究(NucleicAcidsResearch)40,doi:10.1093/nar/gkr1314(2012))。
为了独立地验证细胞之间的同种型比率的广泛差异，设计了靶向两个基因中组成型和同种型-特异性外显子的RNA-FISH探针(Irf7和Acpp，图3c，d)(韦克斯(Waks)，Z.，克莱因(Klein)，A.M.&西尔弗(Silver)，P.A.可变RNA剪接的细胞间可变性(Cell-to-cellvariabilityofalternativeRNAsplicing)，分子系统生物学(MolecularSystemsBiology)7,1-12,doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2011.32(2011))。在单个细胞之间发现总体Irf7水平上的实质性表达可变性(如由‘组成型’探针反映的，图3c，底部和顶部图)，反映了单细胞测序结果(并且在以下进一步探索)。另外，在每个Irf7-表达细胞中，观察到向着包含或排除特定外显子的偏向(图3c，图11，中间图，例如，比较‘高’和‘低’标记细胞)。使用设计成针对Acpp检测互斥的可变最终外显子的两个探针获得类似结果(图3d)。因此，这些研究证明，剪接异质性是单细胞之间的一种常见的变化模式，即通常由在群体研究中观察到的可替代性同种型的‘同时表达’掩蔽的一种现象。
实例3.观察到的双峰性的来源和含义
在此所述的研究被设计来探索所观察到的双峰性的来源以及功能含义。在高度(平均起来)又双峰式表达的基因中免疫应答基因上的富集可以反映激活信号传导回路方面不同的功能状态(例如，细胞亚型)或随机差异(泰(Tay)，S.等人.单细胞NF-κB动力学揭示数字激活和类似信息处理(Single-cellNF-κBdynamicsrevealdigitalactivationandanalogueinformationprocessing)，自然(Nature)466,267-271,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145(2010))、启动子事件(桑切斯(Sanchez)，A.，加西亚(Garcia)，H.G.，琼斯(Jones)，D.，菲利普斯(Phillips)，R.&科恩德夫(Kondev)，J.启动子架构对基因表达中细胞间可变性的影响(EffectofPromoterArchitectureontheCell-to-CellVariabilityinGeneExpression)，PLoS计算生物学(PLoSComputBiol)7,e1001100-e1001100(2011))、或应答定时(纳赫曼(Nachman)，I.，雷格夫(Regev)，A.&拉马纳坦(Ramanathan)，S.剥析酵母减数分裂中的定时可变性(Dissectingtimingvariabilityinyeastmeiosis)，细胞131,544-556(2007))。首先，假设了该变化的至少一些可以反映体外分化的BMDC中的不同细胞状态。具体而言，先前报道了BMDC可以通过一个发育过程获取不同成熟状态，其中BMDC从抗原捕获细胞转换到抗原呈递细胞，以刺激适应性免疫系统(邦舍罗(Banchereau)，J.等人.树突细胞免疫生物学(ImmunobiologyofDendriticCells).免疫学年度评论(AnnualReviewofImmunology)18,767-811(2000))。成塾可以应答于病原体衍生配体(如LPS)发生，或作为破坏培养物中的DC簇的结果发生(江(Jiang)，A.等人.E-钙黏着蛋白介导的粘附的破坏诱导树突细胞成熟的一个功能上不同的途径(DisruptionofE-Cadherin-MediatedAdhesionInducesaFunctionallyDistinctPathwayofDendriticCellMaturation).Immunity(免疫)27,610-624,doi:papers2://publication/doi/10.1016/j.immuni.2007.08.015(2007)),两者都导致特定细胞表面标记的上调。对应答于LPS发生的细胞因子的诱导代表BMDC的一个甚至更加成熟的状态。
为了测试在免疫应答基因中的转录变化中有多少(如果有的话)是由于不同的成熟度状态，在单细胞表达谱上进行无偏主组分分析(PCA，图4a)，聚焦在对LPS的群体范围应答中至少两倍诱导的632个基因(加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))。在该数据集中发现至少两个不同细胞亚群，通过第一主组分清晰可辨(PC1，总变化的15％，图4a)。具有十五个细胞的一个组以极高水平(TPM>1,000)表达抗病毒和炎性细胞因子(包括：Tnf、Il1a、Il1b、以及Cxcl10)两者的一个集合，而具有三个细胞的一个第二组表达远远更低的(尽管可检测的)水平的这些基因中的每个(TPM<50)。其他标记，例如Ccr7、Cd83、Serpinb9、以及Ccl22，显示出相反表达模式(图4b，图12)。区分这两个组的许多基因编码细胞表面蛋白(例如，Cd83、Cd86、和Ccr7)，其先前已经被鉴定为BMDC成熟的标记。这些观察表明具有15个和3个细胞的两个亚群代表DC成熟的不同阶段：具有Cd83、Cd86和Ccr7高表达以及细胞因子低表达的细胞类似‘半成熟DC’或簇破坏的DC(江(Jiang)，A.等人.E-钙黏着蛋白介导的粘附的破坏诱导树突细胞成熟的一个功能上不同的途径(DisruptionofE-Cadherin-MediatedAdhesionInducesaFunctionallyDistinctPathwayofDendriticCellMaturation).Immunity(免疫)27,610-624,doi:papers2://publication/doi/10.1016/j.immuni.2007.08.015(2007)；卢茨(Lutz)，M.B.半成熟树突细胞对于耐受性诱导的治疗潜力(Therapeuticpotentialofsemi-maturedendriticcellsfortoleranceinduction).免疫学前沿领域(Frontiersinimmunology)3,123,doi:papers2://publication/doi/10.3389/fimmu.2012.00123(2012)),而具有高表达的细胞因子的那些表示‘正在成熟的或成熟的DC’。此外，15个成熟细胞(图12)中的两个表达较高水平的编码细胞因子和表面标记两者的转录物，表明这些细胞是最成熟的DC(图5)。
对在单细胞中半成熟的和正在成熟的BMDC的存在以若干方式进行验证。首先，将相同的半成熟/正在成熟的分组用RNA-FISH来验证(图13)，并且还以单细胞定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR：富鲁达生物标记HD(FluidigmBioMarkHD))使用选择以覆盖不同表达水平的96个基因的一种标签以及前两个主成分中每个来验证(图11，表S6)(达列尔巴(Dalerba)，P.等人.在人结肠肿瘤中的转录异质性的单细胞分解(Single-celldissectionoftranscriptionalheterogeneityinhumancolontumors).自然生物技术(NatureBiotechnology)29,1120-1127,doi:10.1038/nbt.2038(2011))。第二，基于11种细胞表面标记中每种的存在或不存在分选Cd11c+BMDC的亚群，在单细胞RNA-Seq中这些表面标记的mRNA水平区分正在成熟的和半成熟的组。然后将qRT-PCR用在每对分选的群体中以测量针对十个标记基因的mRNA水平，还在测序数据方面的区分这两个组，例如，Tnf以及Cxcl10(高度表达于正在成熟的亚群)以及Ccl22和Serpinb9(高度表达于半成熟的亚群)。实际上，对于由11种细胞表面标记中的8种分选的群体，检测到标记表达水平上预期的差异，证实了基于测序的分类(图15)。这些结果进一步验证单细胞RNA-Seq的灵敏度，说明了如何可以有效地区分密切相关又不同的成熟度状态，甚至是在相同的细胞类型中。
实例4.处于相同细胞状态的细胞中调节回路的变化的作用
由于不同成熟度状态仅解释一小部分观察到的异质性和双峰性，接着检查了处于‘相同’细胞状态的细胞(例如，15个正在成熟的细胞)中调节回路的变化的作用。推断了如果此类可变回路存在，跨单细胞在转录因子的mRNA水平和其靶标的表达之间的共变将代表潜在的调节相互作用，并且另外，将表明该调节物的表达的变化是其靶标的可变性的基础。这样一种相关途径已经成功从不同条件下测量的群体水平转录谱鉴定调节关系(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)；纳赫曼(Nachman)，I.，雷格夫(Regev)，A.&弗里德曼(Friedman)，N.在生物信息学卷20i248(2004))。这里，这些研究被设计为将其应用到相同条件下的多个单细胞。
为此，计算跨所有单细胞每对诱导的基因之间表达谱的相关性，并且鉴定以相关方式跨细胞变化的137个基因的簇(图4b)。该簇的基因高度富集了抗病毒应答的成员(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009))(137个基因中的60个，p＝2.5*10-3，超几何检验)，并且包括编码该抗病毒应答的两种已知主调节物(即Stat2和Irf7)的转录物。该簇也富集Stat2靶标，如在用LPS刺激的DC中通过ChIP-Seq先前确定的(加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))(73/137基因，p＝4.5x10-5，超几何检验)。在这个‘抗病毒簇’中的基因是通过PCA的第二主组分(PC2，8％的变化，图4a、b)强烈区分的。将这些抗病毒基因之间的相关性使用单细胞qRT-PCR(如上的相同的96基因标签)和RNA-FISH(图4c、d)进行验证。值得注意的是，该簇的基因中大部分(100/137)展现出跨细胞的双峰式表达(图2c，底部)，并且在群体水平强烈表达(13个基因TPM>250；53个基因TPM>50)。
为了进一步表征该抗病毒回路中的变化如何可以在该应答期间改变，针对未刺激的BMDC中和在LPS刺激后2h、4h、和6h的13个基因(九个抗病毒簇基因，两个均匀地诱导的基因，以及两个持家对照)的标签进行单细胞qPCR表达谱分析(图16)。表达这些抗病毒簇基因的细胞的百分比以时间依赖性的方式增加(图16)，并且这由对于抗病毒主调节物展示了高mRNA水平的细胞的比例的变化反映。相比之下，均匀地诱导的基因(Cxcl10，Clec4e)在所有细胞中2小时后被鲁棒地诱导。重要的是，编码主调节物的转录物和下游靶基因的表达水平之间的定量相关性存在于4h和6h两个时间点。
实例5.Stat2和Irf7的水平的差异
已经观察到这种抗病毒应答回路的用途在相同成熟度状态的BMDC之间是高度可变的，假设该簇的基因表达方面的双峰变化可能涉及Stat2和Irf7的水平的差异。在这种情况下，预期了扰动BMDC中的这些主调节物会导致降低的表达和其靶标的变化。为了测试这个假设，在来自Irf7敲除(Irf7-/-)小鼠的LPS刺激的细胞中，使用单细胞qRT-PCR来测量这些标签基因的表达。如所预期的，这种扰动消除可变抗病毒簇中大部分标签基因的转录，同时抗病毒应答的组成型元件相对不受影响(图4e)。然而，Stat2表达和可变性水平未受Irf7敲除的影响，这意味着Stat2可以在应答期间在Irf7上游或与之平行起作用(宁(Ning)，S，乎耶(Huye)，L.E.&帕加诺(Pagano)，J.S.通过一种独立于干扰素信号传导的途径调节IRF7启动子的转录活性(RegulationoftheTranscriptionalActivityoftheIRF7PromoterbyaPathwayIndependentofInterferonSignaling).生物化学杂志(JournalofBiologicalChemistry)280,12262-12270(2005)；乌斯曼(Ousman)，S.S.，王(Wang)，J.，&坎贝尔(Campbell)，I.L.在病毒感染过程中在中枢神经系统中的干扰素调节因子(IRF)-7和IRF-9基因表达的差异调节(Differentialregulationofinterferonregulatoryfactor(IRF)-7andIRF-9geneexpressioninthecentralnervoussystemduringviralinfection).病毒学杂志(JournalofVirology)79,7514-7527(2005))。因为Stat2和的Irf7是干扰素信号传导途径的靶标，接着对干扰素反馈对Stat2、Irf7和这些簇基因的表达和变化上的作用进行测试。的确，当对来自干扰素受体敲除(Ifnr-/-)小鼠的BMDC(达内尔(Darnell)，J.E.，Jr.，克尔(Kerr)，I.M.&斯达克(Stark)，G.R.应答于IFN和其他细胞外信号蛋白的Jak-STAT途径以及转录激活(Jak-STATpathwaysandtranscriptionalactivationinresponsetoIFNsandotherextracellularsignalingproteins).科学(Science)(纽约，N.Y.)264,1415-1421(1994)；高夫(Gough)，D.J.等人.I型和II型干扰素之间通过STAT1的调节表达的功能串扰(FunctionalcrosstalkbetweentypeIandIIinterferonthroughtheregulatedexpressionofSTAT1)，PLoS生物学8,e1000361-e1000361(2010))进行刺激，观察到Stat2和Irf7两者连同所有其他簇基因的大幅度降低的表达(图中4f)。
一种可能性是，Stat2水平的较早期的变化是在4小时抗病毒簇(包括在该Stat2转录物本身)的广泛变化的基础(经由自动调节(加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012)))。例如，虽然大多数免疫应答基因(例如，Ifit1)不表达于未受刺激的细胞中，但该Stat2转录物甚至先于LPS刺激可变地表达(图16)。在刺激之前具有高水平的Stat2的细胞可以在4h时间点最可能表达该抗病毒簇。
为了进一步检查该链路，将细胞针对Ifit1、Stat1、和Stat2mRNA以及Stat1、pStat1、和Stat2蛋白(实例1，图17和18)进行共染色，并且量化在用LPS刺激0、2、以及4小时的BMDC中的这些mRNA/蛋白水平和蛋白定位。虽然在所有情况下总体蛋白质水平在整个时程中增加，但发现了在Stat1、pStat1、以及Stat2的诱导方面的实质异质性(图17)。在2小时，所有三种蛋白显示出了其表达和核易位方面的异质性。在4小时处，蛋白水平更均匀并且核易位不太明显。Ifit1mRNA分布显示出高度相似的模式，展示出在早期时间点更双峰表达，其在4h变得更均匀。然而，在单个细胞内Stat蛋白和Ifit1mRNA水平早期不相关(0.00<r2<0.12)，并且在四个小时处仅非常微弱的相关(0.00<r2<0.28)。这可能归因于以下事实，即靶标的mRNA积累反映转录调节物的整合时空活性，这可能未通过单时间快照良好表示(蔡(Cai)，L.，达拉勒(Dalal)，C.K.&艾勒威兹(Elowitz)，M.B.频率调控的核定位突发坐标基因调节(Frequency-modulatednuclearlocalizationburstscoordinategeneregulation).自然455,485-490,doi:nature07292[pii]10.1038/nature07292(2008))。因此，在具有高Ifit1mRNA水平的细胞中，Stat蛋白可能已经离开核。验证这样一种假设需要同时实时追踪蛋白质和多种转录物(科恩(Cohen)，A.A.等人.单个癌细胞应答于一种药物的动态蛋白质组学(DynamicProteomicsofIndividualCancerCellsinResponsetoaDrug).科学(Science)322,1511-1516,doi:10.1126/science.1160165(2008)),即被在初级免疫细胞中添加内源荧光标签(沙列克(Shalek)，A.K.等人.纳米线介导的递送使得能够功能性查询初级免疫细胞：应用于慢性淋巴细胞白血病的分析(Nanowire-MediatedDeliveryEnablesFunctionalInterrogationofPrimaryImmuneCells:ApplicationtotheAnalysisofChronicLymphocyticLeukemia)，纳米快报(NanoLett)12,6498-6504,doi:papers2://publication/doi/10.1021/nl3042917(2012))并且特定地添加到该Stat蛋白的困难性显著复杂化的一项任务(迈耶(Meyer)，T.，贝吉特(Begitt)，A.&温克迈耶(Vinkemeier)，U.绿色荧光蛋白-标记减少未磷酸化STAT1的核质穿梭特异性(Greenfluorescentprotein-taggingreducesthenucleocytoplasmicshuttlingspecificallyofunphosphorylatedSTAT1).STAT1的GFP-标记(GFP-taggingofSTAT1)274,815-826,doi:papers2://publication/doi/10.1111/j.1742-4658.2006.05626.x(2007))。相反地，甚至在4h，Ifit1mRNA水平与Stat1和Stat2mRNA比与其蛋白水平更好相关(图18)。由于Stat蛋白自动调节其自身的基因表达(加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012)))，这与一个较早调节事件的假设是一致的。
实例6.高通量微流体启用的单细胞RNA-Seq
在复杂真核生物中的万亿的细胞规范地分为组织和器官，并且进一步细分为共享分子、结构和功能的类型。然而，近年来，变得越来越清楚的是甚至功能上‘相同的’细胞可能在其组分分子方面是显著不同的(谷口(Taniguchi)，S.等人.在单细胞中以单分子灵敏度量化大肠杆菌蛋白质组和转录组(QuantifyingE.coliProteomeandTranscriptomewithSingle-MoleculeSensitivityinSingleCells).科学(Science)329,533-538,doi:10.1126/science.1188308(2010)；泰(Tay)，S.等人.单细胞NF-κB动力学揭示数字激活和类似信息处理(Single-cellNF-κBdynamicsrevealdigitalactivationandanalogueinformationprocessing).自然(Nature)466,267-271,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145(2010)；拉杰(Raj)，A.&范奥德纳德(VanOudenaarden)，A.随机基因表达的单分子途径(Single-MoleculeApproachestoStochasticGeneExpression).生物物理年度评论(AnnualReviewofBiophysics)38,255-270,doi:10.1146/annurev.biophys.37.032807.125928(2009)；科恩(Cohen)，A.A.等人.单个癌细胞应答于一种药物的动态蛋白质组学(DynamicProteomicsofIndividualCancerCellsinResponsetoaDrug).科学(Science)322,1511-1516,doi:10.1126/science.1160165(2008)；阿尔特舒勒(Altschuler)，S.J.&吴(Wu)，L.F.细胞异质性：这些差异有影响么？(CellularHeterogeneity:DoDifferencesMakeaDifference？)细胞141,559-563,doi:10.1016/j.cell.2010.04.033(2010)；沃伦(Warren)，L.，布里德尔(Bryder)，D.，魏斯曼(Weissman)，I.L.&奎科(Quake)，S.R.由数字RT-PCR在单个造血祖细胞中进行的转录因子概况分析(TranscriptionfactorprofilinginindividualhematopoieticprogenitorsbydigitalRT-PCR).美国国家科学院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica)103,17807-17812,doi:10.1073/pnas.0608512103(2006)；帕泽科(Paszek)，P.等人.从细胞异质性产生的群体鲁棒性(Populationrobustnessarisingfromcellularheterogeneity).美国国家科学院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica)107,11644-11649,doi:10.1073/pnas.0913798107(2010)；斯莱克(Slack)，M.D.，马丁内斯(Martinez)，E.D.，吴(Wu)，L.F.&阿尔特舒勒(Altschuler))，S.J.表征对扰动的异质细胞应答(Characterizingheterogeneouscellularresponsestoperturbations).美国科学院论文集(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences)105,19306-19311,doi:10.1073/pnas.0807038105(2008)；聂佩尔(Niepel)，M.，斯宾塞(Spencer)，S.L.&佐尔格(Sorger)，P.K.非遗传细胞-至-细胞可变性和药理学后果(Non-geneticcell-to-cellvariabilityandtheconsequencesforpharmacology).化学生物学目前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)13,556-561,doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015(2009)；莎曼(Sharma)，S.V.等人.在癌细胞亚群体中的一种染色质介导的可逆药物耐受状态(Achromatin-mediatedreversibledrug-tolerantstateincancercellsubpopulations).细胞141,69-80,doi:10.1016/j.cell.2010.02.027(2010)；加斯科因(Gascoigne)，K.E.&泰勒(Taylor)，S.S.长时间暴露于抗有丝分裂药物之后癌症细胞展示出深度系间和系内变化(Cancercellsdisplayprofoundintra-andinterlinevariationfollowingprolongedexposuretoantimitoticdrugs).癌症细胞14,111-122,doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002(2008)并且这种异质性可能导致对外部刺激的基本上不同的应答(科恩(Cohen)，A.A.等人.单个癌细胞应答于一种药物的动态蛋白质组学(DynamicProteomicsofIndividualCancerCellsinResponsetoaDrug).科学(Science)322,1511-1516,doi:10.1126/science.1160165(2008)；聂佩尔(Niepel)，M.，斯宾塞(Spencer)，S.L.&佐尔格(Sorger)，P.K.非遗传细胞-至-细胞可变性和药理学后果(Non-geneticcell-to-cellvariabilityandtheconsequencesforpharmacology).化学生物学目前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)13,556-561,doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015(2009)；莎曼(Sharma)，S.V.等人.在癌细胞亚群体中的一种染色质介导的可逆药物耐受状态(Achromatin-mediatedreversibledrug-tolerantstateincancercellsubpopulations).细胞141,69-80,doi:10.1016/j.cell.2010.02.027(2010)；加斯科因(Gascoigne)，K.E.&泰勒(Taylor)，S.S.长时间暴露于抗有丝分裂药物之后癌症细胞展示出深度系间和系内变化(Cancercellsdisplayprofoundintra-andinterlinevariationfollowingprolongedexposuretoantimitoticdrugs).癌症细胞14,111-122,doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002(2008)；斯宾塞(Spencer)，S.L.，高德特(Gaudet)，S.，阿尔贝克(Albeck)，J.G.，伯克(Burke)，J.M.&佐尔格(Sorger)，P.K.在TRAIL-诱导的凋亡中非遗传来源的细胞-至-细胞变化性(Non-geneticoriginsofcell-to-cellvariabilityinTRAIL-inducedapoptosis).自然459,428-432,doi:10.1038/nature08012(2009))。虽然在治疗干预的情况下，此类可变性可证明有害(科恩(Cohen)，A.A.等人.单个癌细胞应答于一种药物的动态蛋白质组学(DynamicProteomicsofIndividualCancerCellsinResponsetoaDrug).科学(Science)322,1511-1516,doi:10.1126/science.1160165(2008)；阿尔特舒勒(Altschuler)，S.J.&吴(Wu)，L.F.细胞异质性：这些差异有影响么？(CellularHeterogeneity:DoDifferencesMakeaDifference？)细胞141,559-563,doi:10.1016/j.cell.2010.04.033(2010)；斯宾塞(Spencer)，S.L.，高德特(Gaudet)，S.，阿尔贝克(Albeck)，J.G.，伯克(Burke)，J.M.&佐尔格(Sorger)，P.K.在TRAIL-诱导的凋亡中非遗传来源的细胞-至-细胞变化性(Non-geneticoriginsofcell-to-cellvariabilityinTRAIL-inducedapoptosis).自然459,428-432,doi:10.1038/nature08012(2009)；斯宾塞(Spencer)，S.L.&佐尔格(Sorger)，P.K.在单细胞中对凋亡进行测量和建模(MeasuringandModelingApoptosisinSingleCells).细胞144,926-939,doi:10.1016/j.cell.2011.03.002(2011))它可能通过增加潜在群体水平应答的多样性而起着一个重要的功能作用(费尼曼(Feinerman)，O.等人.通过效应子以及调节性T细胞的IL-2应答的单细胞量化揭示了在免疫应答中的关键的可塑性(Single-cellquantificationofIL-2responsebyeffectorandregulatoryTcellsrevealscriticalplasticityinimmuneresponse).分子系统生物学(MolecularSystemsBiology)6,1-16,doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2010.90(2010)；伟宁(Veening)，J.-W.，史密斯(Smits)，W.K.，&凯珀斯(Kuipers)，O.P.在细菌中的双稳性、表观遗传学以及两头下注(Bistability,Epigenetics,andBet-HedginginBacteria).微生物学年鉴(AnnualReviewofMicrobiology)62,193-210,doi:papers2://publication/doi/10.1146/annurev.micro.62.081307.163002(2008)；洛克(Locke)，J.C.&艾勒威兹(Elowitz)，M.B.使用电影来分析在单细胞中的基因线路动力学(Usingmoviestoanalysegenecircuitdynamicsinsinglecells).自然评论(Naturereviews).微生物学(Microbiology)7,383-392,doi:10.1038/nrmicro2056(2009)；塔特泰(Thattai)，M.&范奥德纳德(VanOudenaarden)，A.在波动环境中的随机基因表达(Stochasticgeneexpressioninfluctuatingenvironments).Genetics167,523(2004)；博蒙特(Beaumont)，H.J.，加利耶(Gallie)，J.，科斯特(Kost)，C.，弗格森(Ferguson)，G.C.&雷尼(Rainey)，P.B.两头下注的实验演进(Experimentalevolutionofbethedging).自然462,90-93,doi:10.1038/nature08504(2009)；沙朗孔(Chalancon)，G.等人.基因表达噪声和调节网络构造之间的相互作用(Interplaybetweengeneexpressionnoiseandregulatorynetworkarchitecture).遗传学趋势(Trendsingenetics)：TIG28,221-232,doi:10.1016/j.tig.2012.01.006(2012))。
免疫系统是这点的一个充分确立的实例：尽管免疫细胞在其类型和功能上是众所周知地异质的(本多尔(Bendall)，S.C.&诺兰(Nolan)，G.P.跨人造血连续统一体的差异免疫和药物应答的单细胞质谱流式细胞术(Single-CellMassCytometryofDifferentialImmuneandDrugResponsesAcrossaHumanHematopoieticContinuum).科学(Science)(纽约，NY)332,677-678,doi:10.1126/science.1206351(2011)；桥本(hashimoto)，D.，米勒(Miller)，J.，&麦拉德(Merad)，M.树突细胞和巨噬细胞体内异质性(DendriticCellandMacrophageHeterogeneityInVivo).免疫(Immunity)35,323-335,doi:papers2://publication/doi/10.1016/j.immuni.2011.09.007(2011)),它们必须共同产生对原体的适当应答。理解用以编码群体水平行为的策略，连同它们失败的时间和所花费的代价是具有重大临床相关性的一个基本生物问题。最近的分子研究已经使用足够的采样证明了用以揭示通常由技术和生物噪声掩蔽的通知机制的单细胞途径的潜力(科恩(Cohen)，A.A.等人.单个癌细胞应答于一种药物的动态蛋白质组学(DynamicProteomicsofIndividualCancerCellsinResponsetoaDrug).科学(Science)322,1511-1516,doi:10.1126/science.1160165(2008)；阿尔特舒勒(Altschuler)，S.J.&吴(Wu)，L.F.细胞异质性：这些差异有影响么？(CellularHeterogeneity:DoDifferencesMakeaDifference？)细胞141,559-563,doi:10.1016/j.cell.2010.04.033(2010)；聂佩尔(Niepel)，M.，斯宾塞(Spencer)，S.L.&佐尔格(Sorger)，P.K.非遗传细胞-至-细胞可变性和药理学后果(Non-geneticcell-to-cellvariabilityandtheconsequencesforpharmacology).化学生物学目前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)13,556-561,doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015(2009)；莎曼(Sharma)，S.V.等人.在癌细胞亚群体中的一种染色质介导的可逆药物耐受状态(Achromatin-mediatedreversibledrug-tolerantstateincancercellsubpopulations).细胞141,69-80,doi:10.1016/j.cell.2010.02.027(2010)；斯宾塞(Spencer)，S.L.，高德特(Gaudet)，S.，阿尔贝克(Albeck)，J.G.，伯克(Burke)，J.M.&佐尔格(Sorger)，P.K.在TRAIL-诱导的凋亡中非遗传来源的细胞-至-细胞变化性(Non-geneticoriginsofcell-to-cellvariabilityinTRAIL-inducedapoptosis).自然459,428-432,doi:10.1038/nature08012(2009)；费尼曼(Feinerman)，O.等人.通过效应子以及调节性T细胞的IL-2应答的单细胞量化揭示了在免疫应答中的关键的可塑性(Single-cellquantificationofIL-2responsebyeffectorandregulatoryTcellsrevealscriticalplasticityinimmuneresponse).分子系统生物学(MolecularSystemsBiology)6,1-16,doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2010.90(2010)；本多尔(Bendall)，S.C.&诺兰(Nolan)，G.P.跨人造血连续统一体的差异免疫和药物应答的单细胞质谱流式细胞术(Single-CellMassCytometryofDifferentialImmuneandDrugResponsesAcrossaHumanHematopoieticContinuum).科学(Science)(纽约，NY)332,677-678,doi:10.1126/science.1206351(2011)))。然而，这些研究中的大多数已以可供使用的试剂和已知的作用集中–出于必要性–于充分表征的标记，阻碍免疫应答的决定簇的无偏发现。
出现的单细胞基因组方法现在打开了使用基于测序的方法来前所未有详细地对单细胞的行为进行谱分析的可能性(伊斯兰(Islam)，S.等人.通过高度多重RNA-seq表征单细胞转录景观(Characterizationofthesingle-celltranscriptionallandscapebyhighlymultiplexRNA-seq).基因组研究(GenomeResearch)，doi:papers2://publication/doi/10.1101/gr.110882.110(2011)；唐(Tang)，F.等人.RNA-Seq分析以捕获单细胞的转录组景观(RNA-Seqanalysistocapturethetranscriptomelandscapeofasinglecell).自然－实验手册(NatureProtocols)5,516-535,doi:10.1038/nprot.2009.236(2010)；唐(Tang)，F.等人.单细胞的mRNA-Seq全转录组分析(mRNA-Seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecell).自然方法(NatureMethods)6,377-382,doi:10.1038/nmeth.1315(2009)；拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012)；哈什姆肖尼(Hashimshony)，T.，瓦格纳(Wagner)，F.，谢尔(Sher)，N.&柳井(Yanai)，I.CEL-Seq：通过多路复用线性扩增的单细胞RNA-Seq(CEL-Seq:Single-CellRNA-SeqbyMultiplexedLinearAmplification).细胞报告(CellReports)，doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003)。原则上，全基因组单细胞途径可能从头开始帮助确定新细胞分类方案、过渡性状态、未认识到的生物区别、分子回路、和类似物。满足这种潜能需要开发用于实现解决单细胞测量中高水平的固有噪声所需要的规模的新的实验策略(沙朗孔(Chalancon)，G.等人.基因表达噪声和调节网络构造之间的相互作用(Interplaybetweengeneexpressionnoiseandregulatorynetworkarchitecture).遗传学趋势(Trendsingenetics)：TIG28,221-232,doi:10.1016/j.tig.2012.01.006(2012)；纽曼(Newman)，J.R.S.等人.在自然(Nature)卷441840-846(2006)；曼斯凯(Munsky)，B.，诺伊特(Neuert)，G.&范奥德纳德(VanOudenaarden)，A.使用基因表达噪声来理解基因调节(UsingGeneExpressionNoisetoUnderstandGeneRegulation).科学(Science)(纽约，NY)336,183-187,doi:10.1126/science.1216379(2012)；布拉兹(Balázsi)，G.，范奥德纳德(VanOudenaarden)，A.&柯林斯(Collins)，J.J.细胞决策和生物噪声：从微生物至哺乳动物(CellularDecisionMakingandBiologicalNoise:FromMicrobestoMammals).细胞144,910-925,doi:10.1016/j.cell.2011.01.030(2011))–归因于微量的输入材料的技术方面的，以及归因于RNA转录的突发的生物方面的(谷口(Taniguchi)，S.等人.在单细胞中以单分子灵敏度量化大肠杆菌蛋白质组和转录组(QuantifyingE.coliProteomeandTranscriptomewithSingle-MoleculeSensitivityinSingleCells).科学(Science)329,533-538,doi:10.1126/science.1188308(2010)；蔡(Cai)，L.，达拉勒(Dalal)，C.K.&艾勒威兹(Elowitz)，M.B.频率调控的核定位突发坐标基因调节(Frequency-modulatednuclearlocalizationburstscoordinategeneregulation).自然(Nature)455,485-490,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature07292(2008))。
集成的微流体回路呈现出用于超越这种障碍的一个优质解决方案。的确，存在的方法论先例，用执行牵涉在微流体装置内单细胞全转录组(WTA)扩增方案中每一个步骤(谷口(Taniguchi)，S.等人.在单细胞中以单分子灵敏度量化大肠杆菌蛋白质组和转录组(QuantifyingE.coliProteomeandTranscriptomewithSingle-MoleculeSensitivityinSingleCells).科学(Science)329,533-538,doi:10.1126/science.1188308(2010)；泰(Tay)，S.等人.单细胞NF-κB动力学揭示数字激活和类似信息处理(Single-cellNF-κBdynamicsrevealdigitalactivationandanalogueinformationprocessing).自然(Nature)466,267-271,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145(2010)；宏(Hong)，J.W.，施图德(Studer)，V.，杭(Hang)，G.，安德森(Anderson)，W.F.&奎科(Quake)，S.R.具有平行构造的毫微升规模核酸处理器(Ananoliter-scalenucleicacidprocessorwithparallelarchitecture).自然出版集团(NaturePublishingGroup)22,435-439,doi:10.1038/nbt951(2004)；黄(Huang)，B.等人.对在单细胞中的低拷贝数目蛋白进行计数(CountingLow-CopyNumberProteinsinaSingleCell).科学(Science)(纽约，NY)315,81-84,doi:10.1126/science.1133992(2007)；马库斯(Marcus)，J.，安德森(Anderson)，W.&奎科(Quake)，S.微流体单细胞mRNA分离和分析(Microfluidicsingle-cellmRNAisolationandanalysis).分析化学(AnalyticalChemistry)78,3084-3089(2006)；梅林(Melin)，J.，&奎科(Quake)，S.R.微流体大规模整合：生物自动化的设计规则的演进(MicrofluidicLarge-ScaleIntegration:TheEvolutionofDesignRulesforBiologicalAutomation).生物物理和生物分子结构年度评论(AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure)36,213-231,doi:10.1146/annurev.biophys.36.040306.132646(2007)；阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009))，包括细胞捕获、成像、裂解、反向转录、以及扩增(PCR)。在本研究中，一种可商购的微流体系统(C1单细胞自动制备型系统，富鲁达)适用于制备单细胞SMART-seqmRNA转录组文库。该系统分离高达96个单个细胞，将多步分子生物学方案应用于每个分离细胞，并且然后将该反应产物输出到在芯片载体上的SBS-格式孔。SMART-Seq(拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012))然后从每个细胞产生的双链cDNA被转变为亿明达测序文库。
数千个骨髓源性树突细胞的单细胞RNA-Seq谱分析：利用了富鲁达C1单细胞自动制备型系统，与高通量组合cDNA文库构建方案组合，以从总计2000-3000个单骨髓源性树突细胞(BMDC)产生RNA-Seq备用文库(托瑞埃洛(Toriello)，N.等人.单细胞基因表达分析的集成微流体生物处理器(Integratedmicrofluidicbioprocessorforsingle-cellgeneexpressionanalysis).美国科学院论文集(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences)105,20173(2008)；谢弗里耶(Chevrier),N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测线路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits).细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011)；加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))。BMDC代表用于研究单一细胞应答的一个良好模型系统，因为它们是初级的、在群体水平充分表征的、有丝分裂后的，并且可以通过添加一种强病原性刺激物而同步(殴瑞埃洛(oriello)，N.等人.单细胞基因表达分析的集成微流体生物处理器(Integratedmicrofluidicbioprocessorforsingle-cellgeneexpressionanalysis).美国科学院论文集(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences)105,20173(2008))。检查18个‘均匀’刺激的单BMDC之间的应答可变性的先前实例不允许检查噪声及其分子决定簇的演化。此外，集中于一种刺激物阻止了回路激活以及跨不同刺激的异质性的谱分析和对比。
在此所述的研究被设计以解决这些问题。首先，在用三种不同的病原性刺激(谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测线路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits).细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))–脂多糖(LPS；革兰氏阴性细菌的组分和TLR4激动剂)、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚(I:C)，PIC；病毒样双链RNA以及TLR3激动剂)、以及PAM3CSK(PAM；细菌脂肽的合成模拟物和TLR2激动剂)激活BMDCToll样受体(TLR)信号传导之后的五个时间点(0、1、2、4、和6小时)对全基因组mRNA表达应答进行谱分析。对于每种情况，运行单C1IFC，捕获高达96个细胞(平均85％±10％)，并且还从10,000个细胞(群体对照)产生文库。在所有中，对分别应答于LPS、PIC、以及PAM的311、212、和146个细胞，连同～4000个另外的细胞(如下所述)进行谱分析。
对这些样品中的每一个测序至平均深度为1千万个读取对，并针对所有UCSC注释基因计算表达估计(转录物/百万；TPM)，利用(李(Li)，B.&杜威(Dewey)，C.N.RSEM：在有或没有一个参照基因组的情况下来自RNA-Seq数据的准确转录物定量(RSEM:accuratetranscriptquantificationfromRNA-Seqdatawithorwithoutareferencegenome).BMC生物信息学12,323-323(2011))。获得的文库具有一致性的高质量、可比于公开的SMART数据(拉姆斯科尔博(Ramskold)，D.等人.来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-lengthmRNA-Seqfromsingle-celllevelsofRNAandindividualcirculatingtumorcells).自然生物技术(NatureBiotechnology)30,777-782,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282(2012)；沙列克(Shalek)，A.K.等人，纳米线介导的递送使能够进行主要免疫细胞的功能性访问：慢性淋巴细胞白血病分析的应用(Nanowire-mediateddeliveryenablesfunctionalinterrogationofprimaryimmunecells:applicationtotheanalysisofchroniclymphocyticleukemia).纳米通讯(NanoLett.)12(12):6498-504.doi:10.1021/nl3042917(2012))。中值转录组映射率是～50％-60％，而中值基因组映射率是～70％-80％。显著比例的读数(约10％)归因于污染的不能被修剪的衔接序列而未能映射，表明这些cDNA文库比从转录组映射率看到的具有甚至更高质量。同时，3’偏倚水平比先前已经观察到的更高，但非常类似于先前从Nextera数据(可在该亿明达网站获得)所公开的那些。
在表达方面，当聚集并且与来自使用类似的方案产生的细胞群的数据相比时，这些单细胞测量紧密一致。在计算机单细胞平均RNA-Seq数据和群体测量之间的相关性较高(R＝约0.9，图24a)。这代表针对用于相同的容量-群体样品的重复的两个不同的文库构建方法之间的比较所观察到的相关性上的一个改进。(莱文(Levin)，J.Z.等人.链特异性RNA测序方法的综合比较分析(Comprehensivecomparativeanalysisofstrand-specificRNAsequencingmethods).自然方法(NatureMethods)7,709-715(2010))。这种相关性程度跨表达谱是鲁棒的。一旦大约30个细胞已经包括在其他计算机模拟单细胞平均值中，这些相关性倾向于达到稳定。
将基因基于其对在这些群体水平样品内这三个刺激物的差异性时间应答进行聚簇(图24b)。基于群体的测量与先前运行的基于微阵列的实验密切一致，并且细化(如下所述)(谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测线路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits).细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))。具体而言，该分析概括高度富集了NF-kB的靶标的若干先前发现的簇(炎性程序，簇VI、VII)、以及高度富集干扰素应答基因的不同簇(簇I、II)(图24b)。概括地，虽然抗病毒基因典型地是在群体和单细胞水平“晚期诱导”，但大部分炎性应答基因是早期尖峰式的(在1-2小时)。仍然存在一个在晚期达峰值的晚期诱导炎性基因集合(簇VI)。
实例7.在免疫应答期间细胞之间的变化
从单细胞数据细化细胞回路：从群体水平通路的这个宽泛定义，通过将基因基于其在单细胞中的表达值进行亚聚簇来研究更高分辨率结构。(黑线，图24b)。与簇分析配合，也对时程数据集中所有约800个单细胞进行无偏主组分分析(PCA)。
发现该高分辨率数据允许基因被指定到一个细化的回路集合，这些回路不能在群体水平区分。例如，虽然所有抗病毒基因在暴露于LPS和PIC后稍晚的时间点展现出群体水平诱导，观察到102个基因的一个簇(簇1D)，该簇不仅基于其总体诱导水平区分，也与单细胞亚群内的一致性表达区分(增图)。虽然在这个模块中的基因表现出抗病毒和干扰素应答基因的显著富集，簇1A-1C中的基因不表现出相似功能模式。簇1D中的基因也通过其对PCA分析中的第一主组分(PC1)的贡献而强烈区别出来。因此，簇1D被称作表示BMDC的“核心”抗病毒应答。值得注意的是，核心和非核心抗病毒基因之间的分离从群体水平测量不是显而易见的并且在先前RNA-Seq实验中未观察到(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)或微阵列(谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测线路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits).细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))。
类似地，观察到通过第二主组分(PC2)的高投射得分广泛表示的炎性程序可以分成多个不同回路。许多典型炎性标记(即，TNF、IL1A、CXCL2)表现出对LPS的“尖峰”应答(竹内(Takeuchi)，O.&阿基拉(Akira)，S.模式认知受体和炎症(PatternRecognitionReceptorsandInflammation).细胞140,805-820,doi:10.1016/j.cell.2010.01.022(2010)，簇3c)-这些基因在早期尖峰式诱导的并且在该应答中的稍后时间点被下调。相比之下，LPS和PAM(簇3b、d)之间共享的其他簇在整个时程展示出增加的诱导水平。虽然这两个簇从群体水平测量是似乎高度相似的，簇3b基因是通过第三主组分(PC3)的强投射得分被标记并且高度富集树突细胞成熟的标记，特别是细胞表面标记、受体和转运蛋白(CD83、CD86、CCR7)以及细胞因子(CCL17和CCL22)，这些标记对于与T细胞的适当通讯和T细胞激活是必需。这些基因应答于LPS被高度诱导，但仅在不同细胞亚群中。
这些细化的单细胞回路允许鉴定新的分子调节物，其在免疫应答上可能起到关键的作用。例如，虽然该“成熟”簇(通过PC3的高投射得分表示)包含许多BMDC成熟的熟知标记，在该标签中这些基因的其余部分包括富含转录因子、G蛋白偶联受体、lincRNA、和跨膜蛋白的列表，其与已知的成熟度标记的强单细胞相关性暗示它们在激活获得性免疫系统方面的作用。这些基因中的许多在BMDC成熟、或甚至在免疫应答调节中没有已表征的作用。
其他的，如转录因子IRF8和跨膜蛋白TMEM39A，已经经由未知分子机制与自身免疫疾病显著相关。类似地，“核心”抗病毒模块的细化突出显示了先前未表征的调节物的潜在作用，包括核点相关蛋白(nuclear-dotassociatedprotein)(ex.Sp100和Sp140)、染色质调节物(ex.Phf11)、推定的转录调节物(ex.Znfx1)和泛素连接酶(ex.Dtx3l)。
时间和发育异质性是由连续谱限定：主组分分析表明，而不是分离成多个不同的亚组，这些树突细胞代表细胞变化的连续景观上的单个点。例如，虽然该第一主组分基于它们的刺激时间点而广泛地分离单细胞，但在任何给定数据集内的细胞的PC1加载之间存在显著扩散(图24d)。
这在该应答的早期(1和2小时)是特别真实的，其清楚地与稍后时间点分开，因为在刺激后四小时这些细胞开始同步它们的核心抗病毒应答。然而，与抗病毒应答相反，可以看到，单细胞之间的成熟度状态上的多样性在LPS时程的持续期间稳步增加。虽然所鉴定的回路仅诱导于亚群细胞，高度可变水平的诱导导致连续范围的中间状态(图24f)。对三个刺激时程中每个、或甚至对每个单独的时间点进行分离PCA分析后，这些研究不能鉴定明确定义的离散亚群体，突出显示了在该系统中观察到的单细胞噪声的连续性质。这可能是前期已经选作为一个同质的、有丝分裂后的、和同步的免疫细胞群体的实验系统的反映。
单细胞数据的参数化：在18个单独BMDC转录组的先前分析中，在单细胞之间在单个基因表达水平观察到广泛双峰性，观察到通过RNA-Seq或RNA-FISH在每个细胞中未检测到大部分转录物。然而，当前实验的规模提供了足够的规模以开始对来自单条件的单细胞数据进行建模和参数化。因此，在此的研究尝试将一系列嵌套统计模型拟合到每个单细胞分布，起初集中致力于LPS应答基因。虽然小百分比(约5％)的转录物通过单峰对数正态分布被良好描述(通过平均值mu、和标准偏差σ参数化)，剩余者统计学上(似然比检验，P<0.01)获益于引入第三个参数(α)，该参数定义在不可忽略的水平(ln(TPM)>1)表达转录物的细胞的百分比。单细胞数据明确参数化为双峰分布允许我们将单细胞异质性分成两个组分：一个水平的可变性是通过表达转录物的细胞的百分比表示(通过α参数化，如在此提及的，这是数字噪声)，一个第二层反映表达细胞间的RNA水平方面的扩展(通过σ参数化，其在此被称为模拟噪声)。
绝大部分(约80％-90％，拟合优度测试，SM)的单细胞分布都通过这三种参数被良好描述(明确双峰式的分布)，意味着新的参数化可以被广泛应用于系统地分析单细胞噪声的改变。有趣的是，在一个LPS时间点不拟合这种三参数分布的大多数(70％-80％)转录物都通过正态分布的混合物模型被良好描述，并且还在另一个时间点不能进行拟合优度检验，表明针对这些基因多个调节的“突发状态(burstingstate)”的存在。
定量染色质水平与单细胞噪声参数一致：虽然mRNA水平和染色质状态之间的强相关性已经被良好描述(参见例如，拉姆(Ram)，O.等人.在人类细胞中通过全基因组位置分析覆盖的染色质调节物的组合构图(CombinatorialPatterningofChromatinRegulatorsUncoveredbyGenome-wideLocationAnalysisinHumanCells).细胞147,1628-1639(2011)；加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(AHigh-ThroughputChromatinImmunoprecipitationApproachRevealsPrinciplesofDynamicGeneRegulationinMammals).分子细胞47,810-822,doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012)此处的单细胞数据允许在新水平重新分析这种关系。经常用ChIP-seq测定的组蛋白标记的群体映射展示出广泛的定量范围。由于在一种DNA分子上存在或不存在染色质标记，推断了在启动子处活性标记的定量染色质测量应当与基因的数字噪声水平相关，即表达该转录物的细胞的百分比，而不是总群体表达水平。实际上，在基因的单细胞分布的α参数和在该基因的启动子上存在的K27的群体水平之间观察到一种强关系，甚至在控制群体表达水平之后。在明显的对比之后，在控制表达该转录物的细胞的百分比之后，在该群体水平mRNA表达和定量染色质水平之间没有观察到关系。这些关系对于活性染色质标记K27ac连同RNAPolII水平(但不对于H3K4me3)是鲁棒的，符合如下的先前观察：K27ac与活性转录更紧密相关。
免疫应答回路的不同异质性谱：单细胞分布的参数化被应用到分析跨实验条件的免疫应答回路的单细胞异质性方面的变化。通过检查核心抗病毒程序的结构(该程序典型地被归类为“晚期诱导”自群体研究)(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009))并鉴定先前工作中应答的快照过程中的实质性双峰性而开始本研究(谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现勾画出病毒-感测回路的轮廓(SystematicDiscoveryofTLRSignalingComponentsDelineatesViral-SensingCircuits).细胞147,853-867,doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))。在抗病毒应答中最显著的单细胞模式发生在两小时和四小时时间点之间，因为关键抗病毒基因将其表达模式跨单细胞从双峰转变为单峰。然而，数字噪声上的这个转变伴随着模拟噪声的显著降低-其中在两小时和四小时之间发生的所有参数上的最显著变化(中值σ转变＝＝0.6至0.9，p值＝3.5x10^-5)。因此，单细胞在所观察到的时程中紧密同步其抗病毒应答，在稍后时间点通过核心抗病毒基因的鲁棒且严格调节的表达而表现。
参与炎性程序的基因倾向于相比于其抗病毒对应物显示截然相反的时间异质性谱。具体地，表现出尖峰应答(簇IIIc)的基因-包括典型抗炎细胞因子如Il1a和TNF-α，在早期时间点被急剧诱导，但在该应答中稍后下调。此时间移相的确切原因是未知的，尽管交叉抑制性反馈环路和RNA降解因子可以负责产生一种峰值应答。值得注意地，观察到这些大量表达估计值的动力学几乎完全是由于在数字噪声的改变。虽然表达这些转录物的细胞的百分比在所有时间转换之间表现出显著改变，代表表达细胞的分布的参数统计学上在整个应答中未改变-包括受刺激的时间点。
炎性基因的一个不同簇(簇IIId)经该时程被不断诱导，展示出类似于该核心抗病毒簇的数字噪声模式-其中再次地，在两个和四个小时之间发生的最显著的转变。然而，与抗病毒同步相反，在此回路的模拟噪声方面没有观察到变化。因此虽然，晚期诱导的抗病毒和炎性基因显示出在LPS方面在群体水平的类似时间谱，但这两种应答在4h的时间点表现出不同异质性谱，前者类似一种紧密调节的回路而后者表现出噪声诱导。总之，这些分析突出了功能上不同的LPS应答模块的极不同的时间异质性模式，并且例示了单细胞RNA-seq区分紧密调节回路及噪声回路的能力。
单细胞噪声跨刺激物的变化：先前已经注意到，虽然PIC以及PAM分别是抗病毒和炎性途径的特异性拮抗剂，但LPS能够激活BMDC群中的两种防御程序(竹内(Takeuchi)，O.&阿基拉(Akira)，S.模式认知受体和炎症(PatternRecognitionReceptorsandInflammation).细胞140,805-820,doi:10.1016/j.cell.2010.01.022(2010))。鉴于TLR4信号传导的非特异性性质，假设免疫应答线路可能应答于一个更定向的刺激而表现不同。
例如，假设了暴露于PIC可以减少抗病毒簇的单细胞异质性。然而，据观察，抗病毒时间异质性模式在PIC时程中相比于LPS稍稍延迟。具体而言，这些核心基因在四个小时与六个小时时间点之间从双峰表达至单峰表达过渡，并且在抗病毒同步方面的延迟表明PIC事实上充当一种较弱的刺激。这些观察与先前的报导一致。
然而，炎性回路的时间可变性模式在暴露于PAM后大大不同。如在LPS应答中，尖峰应答基因展示出在早期时间点在表达细胞的百分比方面的急剧诱导。然而，这些基因倾向于在两个小时的时间点“达到稳定时期(plateau)”而不是“峰”，并且在稍后时间点未能去同步(在数字或模拟噪声方面没有统计学显著变化)。同样地，发现炎性回路开始同步(模拟噪声在T＝2小时和4h之间的显著减少，p-值＝.0014)，它们在稍后时间点的应答，类似于LPS应答过程中的抗病毒核心回路。在暴露于不同刺激物之后这些回路的改变的时间噪声模式强烈表明单细胞异质性不纯粹是不受约束的转录随机性的一种后果，相反地是在免疫应答过程中调节的一个受控现象。因此接下来的研究进一步研究了细胞内和细胞间决定簇二者在驱动单细胞可变性方面的作用。
实例8.时间噪声的环境决定簇
虽然可变水平的内部组分可以驱动应答表型的差异(谷口(Taniguchi)，S.等人.在单细胞中以单分子灵敏度量化大肠杆菌蛋白质组和转录组(QuantifyingE.coliProteomeandTranscriptomewithSingle-MoleculeSensitivityinSingleCells).科学(Science)329,533-538,doi:10.1126/science.1188308(2010)；泰(Tay)，S.等人.单细胞NF-κB动力学揭示数字激活和类似信息处理(Single-cellNF-κBdynamicsrevealdigitalactivationandanalogueinformationprocessing).自然(Nature)466,267-271,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145(2010)；拉杰(Raj)，A.&范奥德纳德(VanOudenaarden)，A.随机基因表达的单分子途径(Single-MoleculeApproachestoStochasticGeneExpression).生物物理年度评论(AnnualReviewofBiophysics)38,255-270,doi:10.1146/annurev.biophys.37.032807.125928(2009)；科恩(Cohen)，A.A.等人.单个癌细胞应答于一种药物的动态蛋白质组学(DynamicProteomicsofIndividualCancerCellsinResponsetoaDrug).科学(Science)322,1511-1516,doi:10.1126/science.1160165(2008)；阿尔特舒勒(Altschuler)，S.J.&吴(Wu)，L.F.细胞异质性：这些差异有影响么？(CellularHeterogeneity:DoDifferencesMakeaDifference？)细胞141,559-563,doi:10.1016/j.cell.2010.04.033(2010)；沃伦(Warren)，L.，布里德尔(Bryder)，D.，魏斯曼(Weissman)，I.L.&奎科(Quake)，S.R.由数字RT-PCR在单个造血祖细胞中进行的转录因子概况分析(TranscriptionfactorprofilinginindividualhematopoieticprogenitorsbydigitalRT-PCR).美国国家科学院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica)103,17807-17812,doi:10.1073/pnas.0608512103(2006)；帕泽科(Paszek)，P.等人.从细胞异质性产生的群体鲁棒性(Populationrobustnessarisingfromcellularheterogeneity).美国国家科学院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica)107,11644-11649,doi:10.1073/pnas.0913798107(2010)；斯莱克(Slack)，M.D.，马丁内斯(Martinez)，E.D.，吴(Wu)，L.F.&阿尔特舒勒(Altschuler))，S.J.表征对扰动的异质细胞应答(Characterizingheterogeneouscellularresponsestoperturbations).美国科学院论文集(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences)105,19306-19311,doi:10.1073/pnas.0807038105(2008)；聂佩尔(Niepel)，M.，斯宾塞(Spencer)，S.L.&佐尔格(Sorger)，P.K.非遗传细胞-至-细胞可变性和药理学后果(Non-geneticcell-to-cellvariabilityandtheconsequencesforpharmacology).化学生物学目前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)13,556-561,doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015(2009)；莎曼(Sharma)，S.V.等人.在癌细胞亚群体中的一种染色质介导的可逆药物耐受状态(Achromatin-mediatedreversibledrug-tolerantstateincancercellsubpopulations).细胞141,69-80,doi:10.1016/j.cell.2010.02.027(2010)；加斯科因(Gascoigne)，K.E.&泰勒(Taylor)，S.S.长时间暴露于抗有丝分裂药物之后癌症细胞展示出深度系间和系内变化(Cancercellsdisplayprofoundintra-andinterlinevariationfollowingprolongedexposuretoantimitoticdrugs).癌症细胞14,111-122,doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002(2008))，在细胞微环境中的局部差异可以提供异质性的一个外部的混淆来源(范(Fan)，R.等人.在微升数量的血液中用于蛋白质的快速多路复用分析中的集成条形码芯片(Integratedbarcodechipsforrapid,multiplexedanalysisofproteinsinmicroliterquantitiesofblood).自然生物技术(NatureBiotechnology)26,1373-1378,doi:10.1038/nbt.1507(2008)；Gómez-R.，莱拉特(Leyrat)，A.，皮罗恩(Pirone)，D.，陈(Chen)，C.&奎科(Quake)，S.，通用的完全自动化微流体细胞培养系统(Versatile,fullyautomated,microfluidiccellculturesystem).分析化学(AnalyticalChemistry)79,8557-8563(2007)；黄(Huang)，S.细胞在发育上的非遗传异质性：不仅仅噪声(Non-geneticheterogeneityofcellsindevelopment:morethanjustnoise).发育(Development)136,3853-3862,doi:papers2://publication/doi/10.1242/dev.035139(2009)；卡里斯凯(Kalisky)，T.，布莱内(Blainey)，P.&奎科(Quake)，S.R.在单细胞水平的基因组分析(GenomicAnalysisattheSingle-CellLevel).遗传学年度综述(Annualreviewofgenetics)45,431-445,doi:papers2://publication/doi/10.1146/annurev-genet-102209-163607(2011)；莱考尔特(Lecault)，V.等人.单造血干细胞增殖在微流体细胞培养阵列中的高通量分析(High-throughputanalysisofsinglehematopoieticstemcellproliferationinmicrofluidiccellculturearrays).自然方法(NatureMethods)8,581-586,doi:papers2://publication/doi/10.1038/nmeth.1614(2011)；勒韦尔(Loewer)，A.&拉哈夫(Lahav)，G.我们都是如下个体：哺乳动物细胞中的非遗传异质性的起因和后果(Weareallindividuals:causesandconsequencesofnon-geneticheterogeneityinmammaliancells).遗传学和发育当前意见(Currentopinioningenetics&amp；development)21,753-758,doi:10.1016/j.gde.2011.09.010(2011)；米利特(Millet)，L.J.，斯图尔特(Stewart)，M.E.，斯威德勒(Sweedler)，J.V.，纽素(Nuzzo)，R.G.&吉列特(Gillette)，M.U.用于在低密度培养初级哺乳动物神经元的微流体装置(Microfluidicdevicesforculturingprimarymammalianneuronsatlowdensities).芯片实验室(LabonaChip)7,987,doi:10.1039/b705266a(2007)；雷泽(Raser)，J.M.真核基因表达上随机性的控制(ControlofStochasticityinEukaryoticGeneExpression).科学(Science)(纽约，NY)304,1811-1814,doi:10.1126/science.1098641(2004))。每个BMDC的应答是通过mRNA针对细胞因子和趋化因子的表达主导，进而可以激活另外的细胞内信号传导通路。因此异质细胞间信号传导连同缓慢扩散可以容易地引起环境条件中的丰富局部多样性，迫使每个细胞计算其在不同的约束条件下的应答。
均匀干扰素刺激去除来自抗病毒应答的双峰性：先前假设了(沙列克(Shalek)，A.K.等人，纳米线介导的递送使能够进行主要免疫细胞的功能性访问：慢性淋巴细胞白血病分析的应用(Nanowire-mediateddeliveryenablesfunctionalinterrogationofprimaryimmunecells:applicationtotheanalysisofchroniclymphocyticleukemia).纳米通讯(NanoLett.)12(12):6498-504.doi:10.1021/nl3042917(2012))干扰素(IFN)信号传导的二级波的可变性负责广泛双峰性，该双峰性是在该抗病毒应答中在4h时间点观察到的。为了进一步测试这点，直接用IFN-β刺激BMDC以便提供等同使用该抗病毒反馈的所有细胞。在刺激之后2小时(相当于一个4hLPS刺激，因为IFN-β在LPS下在2小时达峰值(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)))，在该抗病毒簇的数字噪声方面观察到一个显著转变，其中关键基因从在LPS中的双峰表达分布转变到在IFN-β下的单峰表达分布。这一发现表明抗病毒基因的表达中的早期异质性可能不起因于细胞内时机差异(纳赫曼(Nachman)等人，剥析酵母减数分裂中的定时可变性(Dissectingtimingvariabilityinyeastmeiosis)，细胞(Cell)131，544-556(2007))而是起因于IFN-β暴露上的差异。这，连同在选择的细胞集合中在LPS刺激下从0至2h看到的Ifnb1mRNA表达的早期上升，表明细胞亚群事实上可以负责产生干扰素信号传导的初级波，这随着IFN-β遮蔽整个群体而最终同步该抗病毒应答。在这样一种情况下，预期的是产生IFN-β的细胞及其最近的临近者归因于自分泌和旁分泌信号传导而展现出早期抗病毒诱导。
一个稀有细胞群在早期时间点早熟地表达晚期诱导的抗病毒基因：为了支持这个假设，有趣地发现了在仅1小时LPS刺激之后展现出抗病毒应答基因的早熟表达的三个细胞。这些细胞可以通过鲁棒表达一般抗病毒标签(包括Ifit1)连同通过它们跨第二主组分的投射而明确区分。为了验证此群体的存在，进行RNA-FISH，共染色细胞用于表达Ifit1和Ifnb1。因此，这个群体存在，但它是一种罕见的群体。
旁分泌信号传导的消除显著改变细胞异质性：虽然高度暗示，“早期应答物”亚群体的发现未决定性地显示需要细胞内信号传导用于该群体中的抗病毒同步。验证这种假设需要用于分离细胞并单独地培养它们的方法。在不存在旁分泌信号传导的情况下，前者假设将表明数字抗病毒噪声的一种转变。
为了实现此，加载未刺激BMDC并且分离到C1IFC上，并且在密封的微流体腔室内单独地继续用LPS刺激每个细胞。为了紧密反射标准的刺激方案，将C1系统编程以经由IFC的洗涤端口中的一个递送混合LPS的介质并且然后在正常成像、裂解、以及cDNA合成和扩增之前将这些细胞在37℃孵育四小时。重要的是，对于这种芯片上刺激的细胞密度(1细胞/4.5nL)紧密匹配正常的管内刺激(1细胞/5nL)，这使得能够直接将这个实验与现有LPS数据比较。如最初假设的，旁分泌信号传导的不存在强烈去同步抗病毒应答。随着抗病毒基因分布从单峰(大量LPS刺激(bulkLPSstimulation))转变至双峰(芯片上刺激)，观察到数字噪声的显著地增加。值得注意的是，细胞集合-可能类似于鉴定的早期应答物，表现出核心抗病毒应答的鲁棒激活。类似地，旁分泌信号传导的消除严重限制了所有BMDC的成熟过程，在所有细胞中消除成熟标记的表达。这可能归因于已知驱动BMDC的成熟的TNF-介导的信号传导的废除。然而，在不存在旁分泌信号传导的情况下不是所有的诱导基因都行为不同：许多晚期-诱导的炎性基因未受影响，表明分离的细胞能够在微流体腔室中经历对LPS的天然应答。
为了对此进行测试，旁分泌信号传导通过分离进行消除并且然后在C1IFC内部单独地刺激BMDC4小时。为了匹配正常的激活条件，将该C1系统编程以经由IFC的洗涤端口之一递送混合LPS的介质，并且然后在正常的成像和裂解之前，将这些细胞在37℃下孵育持续该刺激的时间期。重要的是，对于该芯片上刺激(1细胞/4.5nL)的细胞密度紧密匹配正常的管内刺激(1细胞/5nL)，这使得能够直接比较两者。如最初假设的，旁分泌信号传导的不存在强烈去同步抗病毒应答。随着在一个小的细胞亚群中关键抗病毒标记的有限一致性诱导将这些抗病毒基因分布从单峰转变至双峰，观察到数字噪声的显著增加。重要的是，在不存在旁分泌信号传导的情况下不是所有的诱导基因都行为不同：许多晚期诱导的炎性基因未受影响，表明分离的细胞能够在微流体腔室中经历对LPS的天然应答。
虽然旁分泌信号传导的存在对于抗病毒同步是必需的，细胞内通讯对其他免疫应答线路具有相反的作用。令人惊讶地，在四小时的LPS刺激之后旁分泌信号传导的消除显著降低数字和模拟噪声。在旁分泌消除后典范的炎性标志物(例如TNF、Il1a、以及INHBA)都从双峰转变至单峰分布-类似它们在两小时时间点的均匀表达。因此，这些结果强烈地将旁分泌信号传导指示为这种去同步化的上游决定者，并且突出了细胞间通讯在驱动抗病毒和炎性通路两者的异质性方面广泛的并且有时相反的作用。
干扰素反馈增加炎性异质性：由于芯片上隔离实验直率地废止了所有旁分泌信号传导，则不能辨别负责以上观察到的结果的单独的旁分泌信号、或其组合。为了更特异地解决单独信号传导途径的作用，这项研究转向对具有特异性受体分子缺陷的敲除小鼠进行谱分析。为了更好地理解炎性噪声的上游来源，这项研究通过从来自TNF受体缺陷小鼠的BMDC进行谱分析而开始。与先前的发现和假设一致，TNFR-/-BMDC未展现成熟标记的诱导。然而，许多尖峰应答基因在四小时时间点在野生型和TNFR-/-BMDC中展现出高度相似的分布。当对缺乏IL1受体的BMDC进行谱分析时看到类似结果；BMDC未能成熟，但在尖峰应答基因中没有观察到一致性改变。
接下来对来自干扰素受体敲除(Ifnar1-/-)小鼠的BMDC进行谱分析。如所预期的，并且根据先前发现(沙列克(Shalek)，A.K.等人，纳米线介导的递送使能够进行主要免疫细胞的功能性访问：慢性淋巴细胞白血病分析的应用(Nanowire-mediateddeliveryenablesfunctionalinterrogationofprimaryimmunecells:applicationtotheanalysisofchroniclymphocyticleukemia).纳米通讯(NanoLett.)12(12):6498-504.doi:10.1021/nl3042917(2012))，抑制干扰素信号传导完全阻断抗病毒基因的表达。该抗病毒途径的消除是基本上完全的，没有细胞展现出任何抗病毒应答，意味着甚至“早期应答物”可能需要IfnB的自分泌信号传导以激活它们的抗病毒应答。然而，炎性“尖峰”基因再一次显示这些敲除细胞中的数字和模拟可变性两者的明显降低的水平。Ifnar1-/-与芯片上刺激的细胞紧密聚簇，并且相比于LPS，噪声的转变在两个实验之间显著相关。鉴于干扰素信号传导在诱导该抗病毒途径中的已知作用，这些发现一致地表明作为炎性应答去同步化的初级上游机构的广泛抗病毒交叉抑制。
实例9.“簇破坏”的细胞的去除
在以上这些实例中，鉴定了BMDC落入两个不同亚群体中，对应于不同的成熟度状态。BMDC成熟是一个发育过程，其中BMDC从抗原捕获细胞转换到抗原呈递细胞，以刺激适应性免疫系统(参见例如，江(Jiang)，A.等人.E-钙黏着蛋白介导的粘附的破坏诱导树突细胞成熟的一个功能上不同的途径(DisruptionofE-Cadherin-MediatedAdhesionInducesaFunctionallyDistinctPathwayofDendriticCellMaturation).免疫(Immunity)27,610-624,doi:10.1016/j.immuni.2007.08.015(2007))。成塾可以应答于病原体衍生配体(如LPS)发生，或作为破坏培养物(Ibid.)中BMDC的簇的结果发生，二者均导致特异性细胞表面标记的上调。病原体依赖性成熟在病原体暴露之后经延长的时间发生，并且细胞沿发育连续体落入数据集中(图24d、e)。
然而，不依赖于病原体的成熟(也被称为‘簇破坏’)，是培养过程的一种已知人为现象，发生在刺激之前，并且代表一个不同细胞状态。因此，为了适当测量来自一个‘均匀’群体的基因表达变化上的改变，在此提供的研究寻求从所有另外的分析去除所有簇破坏的细胞。
在18个细胞上进行PCA的先前实例中，发现该第一主组分(PC1)区分这两个细胞群。具有高PC1加载的许多基因是BMDC成熟的已知标记(江(Jiang)免疫(Immunity)2007)，例如细胞表面受体Ccr7、Cd83、以及Cd86。在病原体依赖性和不依赖于病原体的成熟通路两者中这些基因被上调，并且因此在LPS时程中都以群体水平被诱导(阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstructionofamammaliantranscriptionalnetworkmediatingpathogenresponses).科学(Science)326,257-263,doi:10.1126/science.1179050(2009)；沙列克(Shalek)，自然(Nature)2013)。在这些PC1基因中，Lyz1具有最强加载，并且是簇破坏的细胞的最佳区分物。它在15个正在成熟的(非簇破坏的)细胞中是(ln(TPM+1)>9)，但是在簇破坏的这三个细胞中完全不存在(TPM＝0)。此外，Lyz1在经历病原体依赖性成熟的两个细胞中未差异性调节，并且这在整个LPS时程中在其单细胞或群体平均水平没有明显地变化。类似地，对互补标记(Serpinb6b)进行鉴定，并且发现这种标记仅高度表达于簇破坏的细胞中，但不存在于所有其他细胞中，在LPS时程中其总表达又不会明显地改变。因此，这些标记在经历病原体依赖性的成熟的细胞中不太可能差异地调节，并且推断这些标记转录物的表达模式提供了一种用于鉴定簇破坏的细胞的方法。为了独立地证实这两个标记，对细胞进行另外的qRTPCR分析，这些细胞在刺激之前针对CD83(成熟标记)表达进行了预分选并且然后对这两个分选的亚群体(CD83+，CD83-)用LPS刺激4h。在刺激之前和之后两者，对这两个亚群体中两种mRNA的水平进行测量。这些研究成功地验证：这些标记在病原体应答方面清楚区分这两个亚群体。
使用的引物：
因此，为了严格去除所有潜在的簇破坏的细胞，从另外的分析中排除其中对于Lyz1为ln(TPM+1)<6或对于Serpinb6b为ln(TPM+1)>4的所有文库。毫不例外地对于每个实验进行这一点。
为了确保簇破坏不会联系到“核心”抗病毒模块的早期激活，证实了对于1hLPS刺激以及4hLPS“芯片上”刺激实验两者，在簇破坏标记的表达和“核心”抗病毒模块的激活之间不存在相关性。
本发明现在已经通过书面说明和实例的方式描述，本领域的人员将认识到，本发明能以多种实施例进行实践，并且以上的说明和实例是为了说明的目的，而不限制下述的权利要求。

Claims (26)

1.调控一种或多种树突细胞应答的方法，该方法包括使树突细胞或树突细胞群与一个量的调控剂接触，相比于在不存在该调控剂的情况下该树突细胞或该树突细胞群的一种或多种应答，该量足以修饰该一种或多种树突细胞应答。
2.如权利要求1所述的方法，其中该调控剂是药剂，该药剂调控一种或多种靶基因或者一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能，该一种或多种靶基因或该一种或多种产物调节选自在表1–5A中列出的那些中的一种或多种基因。
3.如权利要求2所述的方法，其中选择的是希望的基因或靶基因组合并且鉴定其为一种或多种树突细胞应答的正调节物或一种或多种树突细胞应答的负调节物。
4.如权利要求3所述的方法，其中该调控剂处于足以调控选自下组的一种或多种树突细胞应答的量，该组由以下各项组成：对调节树突细胞成熟的一种或多种基因进行调控；对调节树突细胞免疫应答的一种或多种基因进行调控；对调节树突细胞抗病毒免疫应答的一种或多种基因进行调控；以及对调节树突细胞炎性免疫应答的一种或多种基因进行调控。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中该药剂是抗体。
7.如权利要求6所述的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
8.如权利要求6所述的方法，其中该抗体是嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、或全长人类单克隆抗体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该调控剂是选自以下的一种或多种药剂：激酶、跨膜受体、化学药物、生物药物、调控激酶的药剂、调控跨膜受体的药剂、调控化学药物的药剂、以及调控生物药物的药剂。
10.一种鉴定与树突细胞应答相关的标签基因、基因标签或其他遗传因子的方法，该方法包括：
a)使树突细胞与该树突细胞应答的抑制物或增强该树突细胞应答的药剂接触；并且
b)鉴定标签基因、基因标签或其他遗传因子，它们的表达通过步骤(a)调控。
11.如权利要求10所述的方法，该方法进一步包括
c)扰动在步骤(b)中鉴定的该标签基因、基因标签或遗传因子在树突细胞中的表达，该树突细胞已与该树突细胞应答的抑制物或增强该树突细胞应答的药剂接触；并且
d)鉴定靶基因，该靶基因的表达通过步骤(c)调控。
12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中该树突细胞应答的抑制物是如下的药剂，该药剂抑制靶基因或者一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能，该靶基因或该一种或多种产物调节选自在表1-5A中列出的那些中的一种或多种基因。
13.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中增强该树突细胞应答的药剂是如下的药剂，该药剂增强靶基因或者一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能，该靶基因或该一种或多种产物调节选自在表1-5A中列出的那些中的一种或多种基因。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中该药剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。
15.一种诊断受试者体内的免疫应答的方法，该方法包括检测选自表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并将检测到的水平与标签基因或基因产物表达、活性和/或功能的对照水平比较，其中该检测到的水平和该对照水平之间的差异表示该受试者体内免疫应答的存在。
16.如权利要求15所述的方法，其中该免疫应答是自身免疫应答。
17.如权利要求15所述的方法，其中该免疫应答是炎性应答。
18.一种监测受试者体内免疫应答的方法，该方法包括在第一时间点检测选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第一水平，在第二时间点检测选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第二水平，并且将所检测的表达、活性和/或功能的第一水平与所检测的表达、活性和/或功能的第二水平比较，其中该检测的第一和第二水平的变化表示在该受试者体内免疫应答的变化。
19.如权利要求18所述的方法，其中该免疫应答是自身免疫应答。
20.如权利要求18所述的方法，其中该免疫应答是炎性应答。
21.一种诊断受试者体内的异常树突细胞应答的方法，该方法包括检测选自表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并将检测到的水平与标签基因或基因产物表达、活性和/或功能的对照水平比较，其中该检测到的水平和该对照水平之间的差异表示该受试者体内异常树突细胞应答的存在。
22.如权利要求21所述的方法，其中该异常树突细胞应答是自身免疫应答。
23.如权利要求21所述的方法，其中该免疫应答是炎性应答。
24.一种监测受试者体内异常树突细胞应答的方法，该方法包括在第一时间点检测选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第一水平，在第二时间点检测选自在表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5和5A中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第二水平，并且将所检测的表达、活性和/或功能的第一水平与所检测的表达、活性和/或功能的第二水平比较，其中该检测的第一和第二水平的变化表示在该受试者体内树突细胞应答的变化。
25.如权利要求24所述的方法，其中该异常树突细胞应答是自身免疫应答。
26.如权利要求24所述的方法，其中该异常树突细胞应答是炎性应答。
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