CN105682674A - 用于治疗和预防黄斑变性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于治疗黄斑变性的组合物和方法。所述方法利用IL17抑制剂，如IL17受体，以及包含与多聚化结构域融合的IL17受体的融合蛋白，和编码该融合蛋白的重组病毒载体。

Description

用于治疗和预防黄斑变性的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求保护2013年4月17日提交的美国临时专利申请No.61/813,014的权益，其在本文以其全文通过提述并入。

序列表

本申请包含将以ASCII形式经由EFS-Web提交的序列表，且其在本文以其全文通过提述并入。

技术领域

本发明一般地涉及用于治疗和预防黄斑变性的方法。具体地，本发明与使用白细胞介素-17的抑制剂用于治疗或预防年龄相关性黄斑变性的方法相关。

发明概述

年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人中中央不可逆失明的首要原因。AMD的早期临床表现涉及碎片的视网膜下堆积(玻璃疣)。逐渐发展伴随显著的黄斑细胞变性和萎缩的地图状萎缩(geographicatrophy，GA)，或新生血管性AMD(nAMD)，其中在疾病末期伴随脉络膜新生血管的发生以试图拯救变性的视网膜。黄斑视网膜色素上皮细胞(RPE)变性后感光细胞萎缩时导致失明。(Curcio等,InvestOphthalmol.Vis.Sci.(1996)37:1236-1249.

发病机理取决于年龄、环境和遗传风险因子，但对疾病发作负责的分子机制仍在很大程度上未知。最为突出的已知遗传因子是存在于免疫调节补体因子H(CFH)基因内的错义突变(Edwards等,Science(2005)308:421-424)。在该发现之后，许多研究已鉴别了与疾病相关的活性补体蛋白。补体组分C5a血清水平在AMD患者血清(Hecker等,HumMolGenet(2010)19:209-215；Reynolds等,InvestOphthalmolVisSci(2009)50:5818-5827；Scholl等,PLoSOne(2008)3:e2593)和AMD玻璃疣(Nozaki等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(2006)103:2328-2333)两者中都有显著升高。C5a在人CD4⁺T淋巴细胞中刺激白细胞介素-17A(IL17A)的产生(Liu等,JTranslMed(2011)9:111)且该IL17A细胞因子已知驱动慢性炎症以及自身免疫和神经退行性疾病，包括多发性硬化和阿尔茨海默氏病(Hu等,Neurology(2010)75:2079-2086)。因此，这些数据将在AMD患者中观察到的增加的IL17A蛋白血清水平与玻璃疣中增强的补体表达关联在一起(Liu等,JTranslMed(2011)9:111)。此外，已报到IL17受体C(IL17RC)基因在具有不同(discordant)疾病的双胞胎和兄弟姐妹中以及在大型群体中的区别性低甲基化表明IL17A通路为该疾病中的关键成员(Wei等,CellReports(2012)2:1151-1158)。尽管IL17A存在于AMD患者血清中，但其是否与视网膜变性相关仍未知。

本发明是基于对IL17抑制剂可用于治疗黄斑变性的意外发现。IL17A，一种促炎性细胞因子，在焦视网膜变性中发挥至关重要的作用。与年龄匹配的对照相比，IL17A和IL17RC转录物及蛋白在AMD患者黄斑中显著升高，且具有重组IL17A的ARPE-19细胞系的治疗降低了细胞生存力，引起胞浆脂质的积聚并诱导细胞凋亡。

Ccl2^-/-/Cx3cr1^-/-/Crb1^rd8(DKO/rd8)小鼠是进行性焦视网膜变性(Chan等,OphthalmicRes(2000)40:124-128；Tuo等,InvestOphthalmolVisSci(2007)48:3827-3836)的模型。DKO/rd8小鼠发展出两种不同的病变类型：(1)“AMD样”表现为RPE和感光细胞内节和外节(IS、OS)的变性和(2)影响内和外核层(INL和ONL)神经元的“营养不良”rd8-相关病变。DKO/rd8病理表现为补体系统和视网膜小胶质细胞的异常调节(Ross等,Exp.EyeRes.(2008)86:675-683；Shen等,InvestOphthalmolVisSci(2011)52:2897-2904)，其为AMD病理的关键性免疫组分。惊讶的是，本申请的发明人已证实降低或抑制IL17活性在治疗DKO/rd8小鼠中有效。通过编码可溶性IL17受体的腺相关病毒载体的玻璃体内注射中和IL17显著改善感光细胞和RPE变性。已发现视网膜变性是MAPK依赖性的，因为IL17抑制预防Erk1/2和p38磷酸化。因此，表明IL17在感光细胞和RPE变性中起关键作用因此可用于治疗黄斑变性。

因此一些方面，本发明针对用于在哺乳动物受试者中治疗黄斑变性的方法。在实施方案中，所述方法涉及将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至受试者患病眼。在实施方案中，所述方法涉及将包含重组腺相关病毒的组合物施用至受试者的患病眼，其中所述重组腺相关病毒包含编码IL17抑制剂的核酸。

一些方面，本发明针对用于在哺乳动物受试者中治疗或降低视网膜变性(例如焦视网膜变性)的方法。在实施方案中，所述方法涉及将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至受试者的患病眼。在实施方案中，所述方法涉及将包含重组腺相关病毒的组合物施用至受试者的患病眼，其中所述重组腺相关病毒包含编码IL17抑制剂的核酸。在实施方案中，所述受试者具有黄斑变性。

一些方面，本发明针对用于在哺乳动物受试者中治疗或降低视网膜色素上皮细胞(RPE)变性、RPE应激或RPE损伤的方法。在实施方案中，所述方法涉及将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至受试者的患病眼。在实施方案中，所述方法涉及将包含重组腺相关病毒的组合物施用至受试者的患病眼，其中所述重组腺相关病毒包含编码IL17抑制剂的核酸。在实施方案中，所述受试者具有黄斑变性。

一些方面，本发明针对用于在哺乳动物受试者中治疗或降低感光细胞变性的方法。在实施方案中，所述方法涉及将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至受试者的患病眼。在实施方案中，所述方法涉及将包含重组腺相关病毒的组合物施用至受试者的患病眼，其中所述重组腺相关病毒包含编码IL17抑制剂的核酸。在实施方案中，所述感光细胞变性在感光细胞的内节(IS)中。在实施方案中，所述感光细胞变性在感光细胞的外节(OS)中。在实施方案中，所述感光细胞变性在感光细胞的内节和外节(IS/OS)中。在实施方案中，所述受试者具有黄斑变性。

一些方面，本发明针对用于在哺乳动物受试者的患病眼中降低脂褐素或糖原沉积的方法。在实施方案中，所述方法涉及将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至所述受试者的患病眼。在实施方案中，所述方法涉及将包含重组腺相关病毒的组合物施用至受试者的患病眼，其中所述重组腺相关病毒包含编码IL17抑制剂的核酸。在实施方案中，所述受试者具有黄斑变性。

一些方面，所述方法针对用于在哺乳动物受试者患病眼中降低[2,6-二甲基-8-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-1E,3E,5E,7E-辛四烯]-1-(2-羟乙基)-4-[4-甲基-6(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)1E,3E,5E,7E-己三烯]-吡啶(A2E)的方法。在实施方案中，所述方法涉及将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至所述受试者的患病眼。在实施方案中，所述方法涉及将包含重组腺相关病毒的组合物施用至受试者的患病眼，其中所述重组腺相关病毒包含编码IL17抑制剂的核酸。在实施方案中，所述受试者具有黄斑变性。

一些方面，本发明针对在哺乳动物受试者的患病眼中用于降低线粒体损伤的方法。在实施方案中，所述方法涉及将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至所述受试者的患病眼。在实施方案中，所述方法涉及将包含重组腺相关病毒的组合物施用至受试者的患病眼，其中所述重组腺相关病毒包含编码IL17抑制剂的核酸。在实施方案中，所述受试者具有黄斑变性。

在上述方面和实施方案的任一项中，所述方法可涉及将包含重组腺相关病毒(rAAV)的病毒粒子的组合物施用至所述受试者的患病眼，其中所述重组腺相关病毒(rAAV)的病毒粒子具有编码IL17抑制剂的核酸(即所述重组载体在rAAV病毒粒子中)。

在上述方法和实施方案的任一项中，所述组合物可进一步包含眼科可接受的载剂。

在上述方面和实施方案的任一项中，所述组合物以治疗上有效的量施用。

在上述方面和实施方案的任一项中，所述IL17抑制剂可以是能够结合并调节IL17活性的IL17受体。

在上述方面和实施方案的任一项中，所述IL17抑制剂可以是IL17A抑制剂(例如IL17A受体)。

在一些实施方案中，所述IL17受体(例如IL17A受体)是可溶性受体。

在上述方面和实施方案的任一项中，所述IL17抑制剂可以是包含IL17受体和多聚化结构域的融合蛋白。在实施方案中，所述多聚化结构域源自免疫球蛋白(Ig)(例如Ig重链；Ig恒定区；Ig的Fc区；Ig的CH3等等)。在实施方案中，所述多聚化结构域源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，所述多聚化结构域源自IgG1重链的恒定区。

在实施方案中，当所述融合蛋白表达时，产生所述融合蛋白的多聚体。在一些实施方案中，所述多聚体是同型二聚体。

在一些实施方案中，所述IL17抑制剂是IL17A抑制剂，如能够结合并调节IL17A活性的IL17A受体。

在一些实施方案中，所述载体/核酸编码融合蛋白，其包含：

(a)所述IL17A受体；和

(b)免疫球蛋白恒定区多聚化结构域，

其中当所述融合蛋白表达时，产生融合蛋白的多聚体。

在进一步的实施方案中，所述多聚体是同型二聚体。

在额外的实施方案中，所述多聚化结构域包含IgG的CH3结构域，或其活性片段，如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的多聚化结构域。

在其他额外的实施方案中，所述多聚化结构域来自IgG1重链的恒定区。

上述方法的其他实施方案中，所述IL17受体是可溶性IL17受体。

在其他实施方案中，所述融合蛋白包含图3B(SEQIDNO:4)的氨基酸序列或其活性变体，其中所述活性变体与图3B(SEQIDNO:4)的所述序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在上述任何方面和实施方案中，所述重组载体可以是重组病毒，如重组腺相关病毒的病毒粒子或重组腺病毒。

在上述任何方面和实施方案中，所述黄斑变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)，如干性AMD。

在任何上述的方面和实施方案中，所述组合物可以玻璃体内施用。

一些方面，本发明针对包含编码IL17抑制剂的多核苷酸的重组载体在制造用于治疗黄斑变性的药物中的用途。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：

(a)所述IL17A受体；和

(b)免疫球蛋白恒定区多聚化结构域，

其中当所述融合蛋白表达时，产生所述融合蛋白的多聚体。

在一些实施方案中，所述IL17受体是可溶性IL17受体。

在进一步的实施方案中，所述融合蛋白包含图3B(SEQIDNO:4)的氨基酸序列或其活性变体，其中所述活性变体与图3B(SEQIDNO:4)的所述序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

一些方面，所述发明针对用于治疗或降低患病眼中黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤的组合物，其包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物(例如，用于本文描述的任一方法中使用)。

一些方面，本发明针对用于治疗或降低患病眼中的黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤的组合物，其包含含有编码IL17抑制剂的核酸的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子(例如，用于本文描述的任一方法中使用)。

在任何上述的方面和实施方案中，所述组合物包含治疗上有效的量的重组载体或rAAV病毒粒子。

一些方面，本发明针对编码IL17抑制剂的重组载体用于本文描述的任一方法的用途。

一些方面，本发明针对包含编码IL17抑制剂的核酸的rAAV病毒粒子用于治疗或降低患病眼中的黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤的用途(例如，依照本文描述的任一方法)。

一些方面，本发明针对包含本文描述的任一组合物的试剂盒。

一些方面，本发明针对包含本文描述的任一重组载体的试剂盒。

一些方面，本发明针对包含本文描述的任一rAAV病毒粒子的试剂盒。

上述方面中，所述试剂盒可进一步包含用于使用所述组合物、重组载体或rAAV病毒粒子在治疗或降低患病眼中的黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤的使用说明(例如，依照本文描述的任一方法)。

任何上述的方面和实施方案中，所述试剂盒包含治疗上有效的量的组合物、重组载体或rAAV病毒粒子。

一些方面，本发明针对包含本文描述的任一组合物的制品。

一些方面，本发明针对包含本文描述的任一重组载体的制品。

一些方面，本发明针对包含本文描述的任一rAAV病毒粒子的制品。

在任何上述的方面和实施方案中，所述rAAV病毒粒子可包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12血清型衣壳。在相关的实施方案中，所述rAAV病毒粒子包含具有AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12ITR的重组载体。

在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子包含AAV2血清型衣壳，且任选地，所述病毒粒子包含具有AAV2ITR的重组载体。

本发明的这些和其他实施方案基于本公开内容对于本领域的技术人员来说将可轻易发生。

附图简述

图1A-1B(SEQIDNOS:1和2)展示代表性的人IL17rA的全长核苷酸序列(图1A)和对应的氨基酸序列(图1B)。

图2是融合构建体的示意图，其包含可溶性IL17rA，所述IL17rA与人IgG1免疫球蛋白的Fc区的CH3结构域经由九个Gly残基(sIL17R-9gly-CH3)接头连接。

图3A和3B(SEQIDNOS:3和4)显示图2描述的sIL17RA-9gly-CH3构建体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。

图4是质粒pCBA2-int-BGHsIL17R-9G-CH3的图示。

图5A和5B展示sIL17R与小鼠(图5A)和人(5B)IL17A的结合。结合以sIL17Rvs.OD吸收的pM浓度表示。

图6A-6D展示IL17A和IL17RC在病理性人AMD组织中高度表达。图6A展示黄斑部脉络膜扣状体(macularchoroidalbutton)中IL17A表达的qRT-PCR定量。图6B展示黄斑中IL17A的表达。图6C展示黄斑中IL17RC的表达。图6D展示IL17A和IL17RC蛋白在黄斑节中的免疫组化检测。同型对照仅用第二抗体染色。GA＝地图状萎缩；nAMD＝新生血管AMD，总计＝GA+nAMD；GCL＝神经节细胞层；IPL＝内网层；INL＝内核层；OPL＝外网层；ONL＝外核层；IS/OS＝内/外节；RPE＝视网膜色素上皮细胞。*:P<0.05；**:P<0.005；***:P<0.0005

图7展示用IL17A稀释处理48h的细胞的MTT生存力测试。

图8展示用IL17F稀释处理48h的细胞的MTT生存力测试。

图9A和9B展示IL17A的细胞类型依赖效果。图9A展示用IL17A稀释对肾COS-7细胞处理48小时的MTT测试的结果。图9B展示通过qRT-PCR评估的ARPE-19和COS-7间IL17RA和IL17RC的相对表达。

图10A-10F展示IL17A敲低显著改善AMD样病灶。图10A展示C57BL6N和C57BL/6J小鼠的组合对比DKO/rd8，视网膜Il17a转录物作为年龄的函数的qRT-PCR量化。图10B展示接受sIL17R-对比接受EV-视网膜的眼底结果。图10C展示来自相同小鼠的sIL17R和EV眼中A2E浓度的配对比较。图10D展示sIL17R-vs-EV视网膜中代表性的组织病理学发现。与EV(星号)相比sIL17R保存了感光细胞IS/OS且保持了ONL的厚度。EV视网膜额外展示了RPE变性。图10E展示EV而非sIL17RRPE(上左和右)中观察到大量的脂褐素。线粒体(m)在EVRPE(下左)中不良且混乱分散但在sIL17RRPE(下右)表现良好且线性排列。EVRPE展示了大量的空泡，未消化的OS和不良的基础内折(下左)。图10F展示通过蛋白质免疫印迹的MAPK-依赖的视网膜变性。蛋白分离前EV和sIL17R神经视网膜用50ng/mlIl17a离体处理2小时。*：P<0.05；**：P<0.005：****:P<0.00001。

图11展示在2个月的年龄相比C57BL/6N视网膜在DKO/rd8中较高的表达。使用来自每个种系(strain)的3只小鼠的6份视网膜。

图12A-12C展示sIL17R在视网膜中的检测。图12A展示sIL17R蛋白的ELISA检测。图12B展示视网膜Il17a的qRT-PCR测量且图12C展示Il16mRNA，*：P<0.05；n.s.＝不显著。

图13展示病灶计分的小鼠内配对比较，空载体(EV)对比sIL17R(来自40只小鼠的共计80只眼)；对角线右侧的全部点表明sIL17R-处理的眼相比其对应对侧表现更佳。

图14A和14B展示注射2个月后sIL17R相对EV视网膜中较低的Il17rc转录物表达。图14A描述qRT-PCR的结果且图14B展示末期凝胶。

发明详述

除非另外表明，本发明的实践将采用化学、生化、重组DNA技术和免疫学领域内的常规方法。这些技术在文献中已详尽解释。参见，例如FundamentalVirology,2ndEdition,vol.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe,eds.)；HandbookofExperimentalImmunology,Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwelleds.,BlackwellScientificPublications)；T.E.Creighton,Proteins:StructuresandMolecularProperties(W.H.Freeman和Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishers,Inc.,currentaddition)；MethodsInEnzymology(S.Colowick和N.Kaplaneds.,AcademicPress,Inc.)；MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook等,4^thed.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,2012)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel,等eds.,2003)；系列丛书MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.)；PCR2:APracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Tayloreds.,1995)；Antibodies,ALaboratoryManual(Harlow和Lane,eds.,1988)；CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechniqueandSpecializedApplications(R.I.Freshney,6^thed.,J.Wiley和Sons,2010)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；MethodsinMolecularBiology,HumanaPress；CellBiology:ALaboratoryNotebook(J.E.Cellis,ed.,AcademicPress,1998)；IntroductiontoCellandTissueCulture(J.P.Mather和P.E.Roberts,PlenumPress,1998)；CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,eds.,J.Wiley和Sons,1993-8)；geneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos,eds.,1987)；PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullis等,eds.,1994)；CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan等,eds.,1991)；ShortProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等,eds.,J.Wiley和Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:APracticalApproach(D.Catty.,ed.,IRLPress,1988-1989)；MonoclonalAntibodies:APracticalApproach(P.Shepherd和C.Dean,eds.,OxfordUniversityPress,2000)；UsingAntibodies:ALaboratoryManual(E.Harlow和D.Lane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999)；TheAntibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,eds.,HarwoodAcademicPublishers,1995)；和Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology(V.T.DeVita等,eds.,J.B.LippincottCompany,2011)。

本文引用的全部出版物、专利和专利申请，无论在上文还是下文，在此处以其全文通过提述并入。

1.定义

在对本发明的描述中，将采用下列术语且其意在如下文表明的进行界定。

必须注意的是，除非他处清楚表明，如本说明书和附加的权利要求使用的单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数参照物。因此，举例来说，参照“一种白细胞介素受体”包括两种或多种这样的受体的混合物等等。

如本文使用，“年龄相关性黄斑变性”或“AMD”包括早期、中期和晚期AMD且包括干性AMD如地图状萎缩和湿性AMD(也称为新生血管性或渗出性AMD)两者。

术语“白细胞介素-17受体”(IL17r)或编码它的核苷酸序列分别指无论来源的衍生自任何IL17受体的蛋白或核苷酸序列。如本文使用的术语指能够与相应的配体结合并调节其活性的分子，如在任何已知的IL17活性测试中所测量，包括本文进一步描述的那些，如可降低或抑制IL17产生的那些。代表性的人IL17rA的全长核苷酸序列和相应的核酸序列示于图1A-1B(SEQIDNOS:1和2)。然而，如本文定义的白细胞介素受体不限于描述的序列，这是由于已知数种这样的受体且在物种间这些受体将发生变化。

具有或不具有信号序列的全长蛋白和其片段，以及具有对天然序列的修饰如缺失、添加和取代(无论在性质上保守或非保守)的蛋白，都意在用于本文的使用，只要所述蛋白保持预期的活性。在本发明的上下文中，将这种活性变体和片段认为是IL17受体。修饰可以是故意的，如通过定点诱变或可以是意外的，如通过产生所述蛋白的宿主的突变，或由PCR扩增的错误导致。相应地，与亲本序列基本上同源的活性蛋白，例如保持调节相应的配体活性能力的具有70...80...85...90...95...98...99％等同一性的蛋白预期可用于本文使用。

“天然”多肽如白细胞介素受体序列指与源自天然的相应分子具有相同氨基酸序列的多肽。这种天然序列可从自然界分离或通过重组或合成的方式产生。术语“天然”序列具体涵盖特定分子天然发生的截断的或分泌的形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如可替换的剪接形式)和多肽天然存在的等位基因变体。在本发明的不同实施方案中，本文公开的天然分子是成熟的或包含在所附附图中展示的包含全长氨基酸序列的全长天然序列。然而，尽管一些在所附附图中公开的分子始于甲硫氨酸残基(在附图中指代为氨基酸位置1)，可采用图中位于氨基酸位置1上游或下游的其他甲硫氨酸残基作为起始氨基酸残基用于特定分子。可替换地，取决于使用的表达系统，本文描述的分子可能缺乏N-末端甲硫氨酸。

“胞外结构域”意为受体多肽的某种形式，其包括胞外结构域的全部或片段且缺乏全部或部分跨膜结构域的多肽，且还可能缺乏胞质结构域。通常，当在本发明中使用时，所述胞外结构域基本上无跨膜和胞质结构域两者。在实施方案中，胞外结构域包含少于10％的这种跨膜和/或胞质结构域、少于5％的这些结构域、少于1％或少于0.5％的这种结构域。本文描述的用于所述受体的跨膜结构域可根据本领域常规采用的用于鉴别疏水结构域的标准进行鉴定，举例来说，使用标准的疏水作图法，如使用Kyte-Doolittle技术计算的那些，Kyte等,J.Mol.Biol.(1982)157:105-132。

如上文解释，用于与本发明使用的白细胞介素受体可以或可以不包括天然信号序列。本文描述的白细胞介素受体信号肽的大致位置描述于说明书和相应附图中。然而，应该注意的是信号肽的C-末端边界可能发生变化，通常在如本文描述的信号肽C-末端边界的任一侧不超过约5个氨基酸。信号肽的C-末端边界根据本领域常规采用的标准鉴别，如描述于Nielsen等,Prot.Eng.(1997)10:1-6和vonHeinje等,Nucl.Acids.Res.(1986)14:4683-4690。此外，在一些情况中，还得到认可的是来自分泌多肽的信号序列的裂解不完全一致，导致多于一种的分泌种类。这些成熟的多肽(当信号肽在如本文定义的信号肽的C-末端边界任一侧不多于约5个氨基酸内裂解时)和编码它们的多核苷酸也涵盖在本发明中。

“变体”意为如本文定义的活性多肽，其具有与对应全长天然序列、缺乏信号肽的多肽、具有或不具有信号肽的多肽胞外结构域或如本文公开的全长多肽序列的任何其他片段至少约80％氨基酸序列同一性。这种多肽变体包括举例来说多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N-和/或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。在实施方案中，变体将与相应的全长天然序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性，可替换地至少约81％氨基酸序列同一性，可替换地至少约82％氨基酸序列同一性，可替换地至少约83％氨基酸序列同一性，可替换地至少约84％氨基酸序列同一性，可替换地至少约85％氨基酸序列同一性，可替换地至少约86％氨基酸序列同一性，可替换地至少约87％氨基酸序列同一性，可替换地至少约88％氨基酸序列同一性，可替换地至少约89％氨基酸序列同一性，可替换地至少约90％氨基酸序列同一性，可替换地至少约91％氨基酸序列同一性，可替换地至少约92％氨基酸序列同一性，可替换地至少约93％氨基酸序列同一性，可替换地至少约94％氨基酸序列同一性，可替换地至少约95％氨基酸序列同一性，可替换地至少约96％氨基酸序列同一性，可替换地至少约97％氨基酸序列同一性，可替换地至少约98％氨基酸序列同一性和可替换地至少约99％氨基酸序列同一性。在实施方案中，变体多肽在长度上为至少约10个氨基酸，如在长度上为至少约20个氨基酸，例如在长度上为至少约30个氨基酸、可替换地在长度上为至少约40个氨基酸、可替换地在长度上为至少约50个氨基酸、可替换地在长度上为至少约60个氨基酸、可替换地在长度上为至少约70个氨基酸、可替换地在长度上为至少约80个氨基酸、可替换地在长度上为至少约90个氨基酸、可替换地在长度上为至少约100个氨基酸、可替换地在长度上为至少约150个氨基酸、可替换地在长度上为至少约200个氨基酸、可替换地在长度上为至少约300个氨基酸或更长。变体包括性质上保守或非保守的取代。举例来说，感兴趣的多肽可包括至多约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或甚至至多约15-25或50保守或非保守氨基酸取代，或为5-50间的任何数目，只要所述分子的预期功能保持完整。

“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽部分间的同一性百分数。当两种DNA或两种多肽在分子所界定的长度上展示至少约50％、至少约75％、至少约80％-85％、至少约90％、至少约95％-98％的序列同一性、至少约99％或期间的任何百分数的同一性时，所述序列彼此“基本上同源”。如本文使用，基本上同源还指序列与特定的DNA或多肽序列显示完全同一性。

一般而言，“同一性”分别指两种多核苷酸或多肽序列中精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应性。用于确定百分数同一性的方法为本领域熟知。举例而言，百分数同一性可以由两分子间通过比对序列(计数两种比对序列间匹配的精确数目，除以较短序列的长度，并将结果乘以100)直接比较序列信息确定。很容易获得的计算机程序可用于辅助分析，如AtlasofproteinsequenceandStructureM.O.Dayhoffed.,5Suppl.3:353-358,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,DC中的ALIGN、Dayhoff、M.O.，其改编了Smith和WatermanAdvancesinAppl.Math.2:482-489,1981的局部同源性算法用于肽分析。用于确定核苷酸序列同一性的程序可在WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8(可从GeneticsComputerGroup,Madison,WI得到)获得，举例来说，BESTFIT、FASTA和GAP程序，其也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序可以制造商推荐和上文提及的WisconsinSequenceAnalysisPackage描述的缺省参数很容易地进行使用。举例来说，特定核苷酸序列对参照序列的百分数同一性可使用Smith和Waterman同源性算法以及缺省计分表和六核苷酸位置的缺口罚分确定。

在本发明的上下文中建立的百分数同一性的另一方法是使用版权属于UniversityofEdinburgh，由JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok开发并由IntelliGenetics,Inc.(MountainView,CA)分销的MPSRCH程序包。当将缺省参数用于计分表(举例来说，12的缺口开放罚分，一的缺口扩大罚分和六的缺口)时，可采用来自这个软件包套件的Smith-Waterman算法。在生成的数据中，“Match”值反映了“序列同一性”。其他用于计算序列间百分数同一性或相似性的合适的程序一般为本领域已知，举例来说，另一比对程序是BLAST，与缺省参数一起使用。举例来说，BLASTN和BLASTP可使用下列缺省参数进行使用：遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝两条；截止值＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50序列；排序＝高分数；数据库＝非冗余；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详情为本领域熟知。

可替换地，同源性可由在同源区间形成稳定双链的条件下多核苷酸的杂交确定，随后用单链特异性核酶消化，并确定消化片段的大小。基本上同源的DNA序列可在Southern杂交实验中在举例来说如针对该特定系统定义的严格条件下进行鉴定。界定合适的杂交条件在本领域的技术人员能力范围内。参见，例如Sambrook等，上文；DNACloning，上文；NucleicHybridization，上文。

术语“简并变体”意在指在其核酸序列中包含变化的多核苷酸，其编码与由所述简并变体衍生的多核苷酸编码的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。

“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是当置于合适的调节序列控制下时，在体内转录(DNA的情况中)和翻译(mRNA的情况中)成多肽的核酸分子。编码序列的边界通过在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的终止密码子确定。转录终止序列可位于编码序列的3’。

“载体”意为任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等等，当与合适的控制元件关联时，其能够复制且能够转移基因序列至细胞。因此，该术语包括克隆和表达运载体(vehicle)，以及病毒载体。

“重组载体”意为包括能够在细胞表达的包括异源核酸序列的载体。

“重组病毒载体”指包含一种或多种异源序列的重组多核苷酸载体(即非病毒来源的核酸序列)。在重组AAV载体的情况中，重组核酸的旁侧为至少一个(在实施方案中为两个)反向末端重复序列(ITR)。

“重组AAV载体(rAAV载体)”指包含一种或多种异源序列(即非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体，其旁侧为至少一个(在实施方案中为两个)AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于宿主细胞中时(所述细胞已用合适的辅助病毒转染(或其表达合适的辅助功能)且其表达AAVrep和cap基因产物(即AAVRep和Cap蛋白))，这种rAAV载体可以复制并包装入感染的病毒颗粒。当rAAV载体并入较大的多核苷酸时(例如在染色体或在另一载体如用于克隆或转染的质粒中)，则所述rAAV载体可指代为“原载体(pro-vector)”，在AAV包装功能和合适的辅助功能存在时，其可通过复制和包衣化“获救”。rAAV载体可为多种形式中的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合的、在脂质体内包衣化的和在病毒颗粒中包衣化的，特别是AAV颗粒。rAAV载体可包装入AAV病毒衣壳以生成“重组腺相关病毒颗粒(rAAV颗粒)”。

“重组病毒”意为已在基因水平改变的病毒，例如通过异源核酸构建体在颗粒中的添加或插入。

术语“转染”用于指代外源DNA由细胞的摄取，且当外源性DNA已引进细胞膜内时，细胞已“转染”。一般地，多种转染技术为本领域已知。参见，例如Graham等(1973)Virology,52:456,Sambrook等(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,Davis等(1986)BasicMethodsinMolecularBiology,Elsevier,和Chu等(1981)gene13:197。这种技术可用于将一种或多种外源性DNA分子引入合适的宿主细胞。

术语“异源”如涉及核酸序列如编码序列和对照序列，指并非正常结合在一起的序列和/或并非与特定细胞正常关联的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区是天然未发现与另一分子相关的在所述另一核酸分子内或与其附着的核酸片段。举例来说，核酸构建体的异源区可包括旁侧为天然并非与该编码序列关联的序列的编码序列。异源编码序列的另一实例是构建体，其中编码序列本身并非天然存在(例如，具有异于天然基因的密码子的合成序列)。相似地，就本发明而言，用并非天然存在于细胞中的构建体转化的细胞将认作是异源的。如本文使用的等位基因变异或天然存在的突变事件并不会产生异源DNA。

“核酸”序列指DNA或RNA序列。该术语囊括的序列包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物，如但不限于4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶(aziridinylcytosine)、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷，2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、queosine，2-硫代胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

术语DNA“控制序列”笼统指代启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等等，其共同用于受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。并非全部这些控制序列始终都需要存在，只要所选编码序列能够在合适的宿主细胞中复制、转录和翻译即可。

在本文使用的术语“启动子”为其通常含义，指代包含DNA调节序列的核苷酸区，其中所述调节序列源自能够结合RNA聚合酶并起始下游(3’-方向)编码序列转录的基因的调节序列。转录启动子可包括“诱导型启动子”(其中可操作地与启动子连接的多核苷酸序列的表达通过分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)，“阻遏型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达通过分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。

“可操作地连接”指元件的排列，其中配置如此描述的组件进而使它们发挥正常的功能。因此，可操作地与编码序列连接的控制序列能够影响编码序列的表达。控制序列无需毗邻所述编码序列，只要其发挥功能以指导其表达即可。因此，举例来说，干预性非翻译但却转录的序列可在启动子序列和编码序列间存在且启动子序列仍可认作与编码序列“可操作地连接”。

如本发明上下文使用的术语“多聚化结构域”意在指代白细胞介素受体与其直接或通过“接头结构域”连接的分子的部分。多聚化结构域可以是促进两种或多种多聚化结构域和/或白细胞介素受体结构域相互作用的多肽结构域。在实施方案中，两种包含白细胞介素受体和多聚化结构域的单体配对或交联导致同型二聚体。

举例来说，多聚化结构域可以是免疫球蛋白序列，如免疫球蛋白恒定区、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区、包含在两个或多个多聚化结构域间形成分子间二硫键的游离巯基的多肽或举例来说，例如美国专利5,731,168中描述的“突出部入腔(protuberance-into-cavity)”结构域，该专利在本文以其全文通过提述并入。突出部由例如将第一多肽界面处的小氨基酸侧链用较大侧链(举例来说酪氨酸或色氨酸)替换来构建。任选地，与突出部大小相同或相似的代偿腔通过用较小的氨基酸侧链(举例来说丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链在第二多肽的界面上生成。

因此，一些方面，多聚化结构域提供促进或允许二聚体、三聚体和来自单体结构域的类似物形成的分子的部分。一些方面，多聚化结构域是免疫球蛋白恒定区结构域。

“免疫球蛋白”(Ig)是蛋白，一般为糖蛋白，其为缺乏抗原特异性的抗体或抗体样分子。免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每挑轻链与重链通过一个共价二硫键连接，而二硫连接基的数目在不同免疫球蛋白同型重链间有所不同。每条重链和轻链还具有规律性间隔开的链内二硫桥。每条重链具有氨基(N)末端可变结构域(VH)，其后为羧基(C)末端恒定结构域。每条轻链具有可变N-末端结构域(VL)和C-末端恒定结构域；轻链的恒定结构域(CL)与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐，且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。根据免疫球蛋白多肽链的结构域界定，轻链(L)具有两个构象上相似的结构域VL和CL；且重链具有四个各自具有一个链内二硫桥的结构域(VH、CH1、CH2和CH3)。

取决于重链恒定结构域(C)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分配至不同种类。存在五种主要的免疫球蛋白种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。所述免疫球蛋白种类可进一步分为亚类(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgA1和IgA2。每条重链在一个末端具有可变结构域，其后是数个恒定结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可归为称为κ或λ的两种不同类型中的一种。

术语“Fc区”指免疫球蛋白重链的C-末端(恒定)区。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可发生变化，但人IgG重链Fc区可以从全长人IgG1在位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至的羧基末端。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定区，CH2和CH3。IgG1重链中最后的残基赖氨酸可以但不必须存在作为成熟蛋白中Fc的末端残基。一种人IgG1重链Fc区在NCBI登录号P01857中进行了定义。

人IgG1Fc区的“CH2结构域”(也称作“Cy2”结构域)通常从全长IgG的约氨基酸231延伸至约氨基酸340，但在人IgG重链Fc区为从Pro111至Lys223。

“CH3结构域”包含人IgG1Fc区的CH2结构域的C-末端的残基(即从全长IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447，但从人IgG重链Fc区的Gly224至Lys330)。

“铰链区”一般定义为从全长的人IgG1从Glu216伸展至Pro230(Burton,Molec.immunol.(1985)22:161-206)，但人IgG重链Fc区从Glu99伸展至Pro110。其他IgG同型的铰链区可以通过将第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置形成重链间S-S键与IgGl序列对齐。

Fc区的“低铰链区”通常定义为紧邻铰链区C-末端的残基段，即全长人IgG1的残基233至239。

“天然Fc区序列”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然的人Fc区序列包括但不限于人IgGlFc区(非-A和A异型)；人IgG2Fc区；人IgG3Fc区和人IgG4Fc区及其天然存在的变体。来自其他物种的天然Fc区如鼠类Fc区也已知。

“功能性Fc区”具有天然Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合，补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。这种效应器功能通常需要Fc区与结合结构域(例如本文的白细胞介素配体)结合且可使用本领域多种测试评估。Fc区可以是人Fc区，例如天然序列人Fc区如人IgG1(A和非-A异型)、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。这种序列为已知。参见PCT公开号WO01/02440，其在本文以其全文通过提述并入。

术语“转基因”指引入细胞的多核苷酸并能够转录成为RNA，且任选地，在合适的条件下翻译和/或表达。一些方面，其赋予所述转基因所进入的细胞预期的性质，或以其他方式导致预期的治疗或诊断结果(例如，转录成赋予预期治疗或诊断结果的分子)。

在提述病毒滴度中使用的术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组当量”或“基因组拷贝”指代包含重组AAVDNA基因组的病毒粒子数目，而无论其感染性或功能性。在特定载体制剂中基因组颗粒的数目可以通过如本文实施例中描述的方法或举例来说如Clark等(1999)Hum.基因Ther.,10:1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6:272-278中描述进行测量。

在提述病毒滴度中使用的术语“感染单元(iu)”、“感染颗粒”或“复制单元”指代如通过感染性中心测试(也称为复制中心测试，如举例来说McLaughlin等(1988)J.Virol.,62:1963-1973中所述)测量的有感染和复制能力的重组AAV载体颗粒。

在提述病毒滴度中使用的术语“转导单元(tu)”指代如在功能性测试中测量(举例来说描述于本文实施例或描述于例如Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124；或inFisher等(1996)J.Virol.,70:520-532中)(LFU测试)的导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数目。

“反向末端重复”或“ITR”序列是本领域熟知的术语且指代在病毒基因组末端发现的相反方向的相对短序列。

本领域熟知的术语“AAV反向末端重复(ITR)”序列为在天然单链AAV基因组的两末端都存在的大致为145-核苷酸的序列。ITR的最外部125个核苷酸可以两种不同方向的任一种存在，导致不同AAV基因组间和单AAV基因组的两末端间的异质性。最外部的125个核苷酸还包含数个较短的自身互补区(称为A、A’、B、B’、C、C’和D区)，使得链内碱基配对在ITR的该部分内发生。

“末端解析序列”或“trs”是AAVITR的D区中的序列，其通过AAVrep蛋白在病毒DNA复制过程中裂解。突变的末端解析序列难以由AAVrep蛋白裂解。

用于AAV的“辅助病毒”指允许AAV(其为缺陷型细小病毒)通过宿主细胞复制和包装的病毒。辅助病毒提供允许AAV复制的“辅助功能”。已鉴别了多种这样的辅助病毒，包括腺病毒(adenoviruse)、疱疹病毒(herpesviruse)和痘病毒(poxviruse)如牛痘病毒(vaccinia)。腺病毒涵盖多种不同的亚类，但亚类C的腺病毒类型5(Ad5)是最常用的。多种人类、非人哺乳动物和禽类来源的腺病毒为已知，且可从保藏机构如ATCC获得。疱疹病毒(herpes)家族的病毒也可从保藏机构如ATCC获得，其包括举例来说单纯疱疹病毒(herpessimplexviruse(HSV))、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrviruse(EBV))、巨细胞病毒(cytomegaloviruse(CMV))和假狂犬病毒(pseudorabiesviruse(PRV))。用于AAV复制的腺病毒辅助功能的实例包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4或f6功能。

如果感染性AAV颗粒比感染性辅助病毒颗粒的比率为至少约10²:l、至少约10⁴:l、至少约10⁶:l或至少约10⁸:l，则rAAV的制剂称为“基本上无”辅助病毒。制剂还可基本上无等效量的辅助病毒蛋白(即如果上文指明的辅助病毒颗粒杂质以破坏的形式存在，则蛋白将作为这种辅助病毒水平的结果存在)。病毒和/或细胞蛋白污染一般地可作为考马斯染色条带在SDS凝胶上观察到(例如与AAV衣壳蛋白VPl、VP2和VP3对应的那些之外的条带的出现)。

术语“调节”意为影响信号通路的水平(例如，上调、下调或以其他方式控制)信号通路的水平。在信号转导控制下的细胞加工包括但不限于特定基因的转录、正常细胞功能如代谢、增殖、分化、粘附、凋亡和存活，以及异常过程如转化、阻断分化和转移。

就本发明而言，“具有活性的”或“活性”指保持相应的天然或自然存在的多肽的生物活性(抑制性或刺激性)的白细胞介素受体多肽形式。所述活性可比在相应的天然或自然存在的多肽中观察到的更强、相等或更弱。如上文解释，活性包括在患有黄斑变性的受试者中调节IL-17信号通路的水平。

当指代核苷酸序列时，“分离的”意为所示分子在基本上无其他相同类型的生物大分子的情况下存在。因此“编码特定多肽的分离的核酸分子”指基本上无其他并非编码所述主题多肽的核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可包括一些额外的不会不利影响组合物的基本特性的碱基或部分。

贯穿本申请，就描述特定核酸分子的核苷酸序列的相对位置而言，如当特定的核苷酸序列描述为位于相对另一序列“上游”、“下游”、“3-撇(3’)”或“5-撇(5’)”，应该理解的是，所指代的是在DNA分子的“有义”或“编码”链中的序列位置，如本领域常用的那样。

术语“纯化的”指代物质(化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、多肽组合物)的分离，由此感兴趣的物质占其所在样品中的主要百分比。通常在样品中，基本上纯的组分包含样品的50％、80％-85％、90-99％，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。用于纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术为本领域已知，且包括举例来说离子交换层析、亲和层析和根据密度的沉降。

术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文可交换使用且指代脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于鼠类、啮齿类、类人猿、人、农场动物、竞技动物和宠物。

如本文提供的组合物或作用剂的术语“有效的量”或“治疗上有效的量”指代组合物或作用剂足以提供预期响应的量，如降低或抑制IL17A在眼中的产生的量，或降低、预防或减缓眼中与黄斑变性相关的生理变化的量，或降低、预防或减缓由此表现的症状的进展的量(例如感光细胞变性的降低；RPE降解的降低；RPE应激的降低；焦视网膜变性的降低；IS、OS或RPE变性病灶的降低；脂褐素沉积物的降低；糖原沉积物的降低；A2E浓度的降低；RPE损伤的降低；线粒体损伤的降低等等)。所需的精确的量在受试者之间变化，其取决于受试者的物种、年龄和一般状况，待治疗的病况的严重性和感兴趣的特定大分子、施用的模式等等。在任何个体的情况中，合适的“有效的”量可以由本领域的技术人员使用常规实验确定。参见，例如Lim,J.(2012)Age-RelatedMacularDegeneration,CRCPress,BocaRaton；Kanski等(2011)ClinicalOphthalmology:ASystematicApproach,ElsevierSaunders。

“治疗”或“进行治疗”黄斑变性包括：(1)预防疾病，即在可能暴露于疾病或有疾病倾向但尚未经历或展示疾病症状的受试者中预防疾病的进展或以较小强度导致疾病发生，(2)抑制疾病，即阻止发展、预防或减缓进展，或逆转疾病状态，(3)缓解疾病症状，即减少受试者经历的症状的数目，或(4)降低、预防或减缓眼中与黄斑变性相关的生理变化的进展。治疗包括但不限于玻璃疣积累的降低、眼中异常的血管生长、眼中异常的流体、血液和蛋白渗漏等等。治疗可通过举例来说监测眼的中心部分中感光细胞(视杆和视锥细胞)的丧失率和丧失量、通过监测视力损失率和最佳矫正视力(BCVA)、通过监测视网膜下的视网膜色素上皮细胞层(和脉络膜毛细血管)的萎缩率或萎缩量、通过监测在视网膜和脉络膜间积累的玻璃疣(细胞碎片)的量、通过监测眼中异常血管生长和监测眼中异常流体、血液和蛋白渗漏。

本文提供的范围应理解为是对于所有范围内的值的简述。举例来说，1-50的范围应理解为包括选自下组的任何数字、数字组合或亚范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

除外另外指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解相同的含义。尽管任何与本文描述相似或等同的方法和材料可用于实践和测试本发明，现仍对例示性的方法、装置和材料进行描述。本文引用的所有技术和专利公开在本文以其全文通过提述并入。本文没有应理解为是对本发明由于在先发明的优势而并非早于这些公开的承认的内容。

应该理解的是，尽管并非总是清楚表明，所有的数字指代前面都有术语“约”。还应该理解的是，尽管并非总是清楚表明，本文描述的试剂仅为例示性的且其等同为本领域已知。

2.实施本发明的模式

详细描述本发明前，应该理解的是本发明不限于特定的配制物或方法参数，因为这些当然是可以发生变化的。还应该理解的是，本文使用的技术仅出于对本发明特定实施方面描述的目的，且并非意在限制。

应该理解的是本发明不应理解为受限于本文描述的实施例。与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践，且本发明应理解为包括本文提供的申请的任何或全部以及本领域内全部等同的变化。

本发明的核心是发现使用编码IL17抑制剂(如IL17受体)的构建体的蛋白或基因疗法发挥调节相应的信号通路的作用，并显著改善与黄斑变性相关的症状/病理(例如，感光细胞和RPE变性；RPE应激；焦视网膜变性；IS、OS或RPE变性病灶；脂褐素沉积物；糖原沉积物；A2E积累；RPE损伤；线粒体损伤等等)。因此，IL17抑制剂的使用提供用于治疗和预防黄斑变性的有效技术。蛋白和基因疗法技术可单独或组合或与传统的药物联合使用。

一些方面，本发明的方法中使用的IL17抑制剂编码包括与多聚化结构域(例如免疫球蛋白恒定区多聚化结构域)直接或经由接头连接的白细胞介素受体的融合蛋白，或其活性部分。在实施方案中，使用可溶形式，例如跨膜结构域缺失或失活的形式。

受体可在多聚化结构域的上游或下游存在。纯化的融合蛋白可从构建体制备，且当在体内表达时融合蛋白可以多聚形式产生。多聚体可以是二聚体、三聚体等。在实施方案中，白细胞介素受体以同型二聚体形式存在。因此，IL17r的单体在表达时将形成同型二聚体。

为进一步理解本发明，下文提供关于黄斑变性、IL17抑制剂、受体-免疫球蛋白融合以及用于与本发明一起使用的多种基因递送方法的更加详细的讨论。

黄斑变性

如上文所释，本发明利用IL17抑制剂以治疗、预防、改善和/或预防黄斑变性或减缓黄斑变性的进展。在一些实施方案中，对处于发展出黄斑变性风险的个体施用有效的量以延迟或预防疾病。

已鉴别至少三种形式的黄斑变性。(1)萎缩性、非渗出干型AMD，也称作中心地图状萎缩，在具有黄斑变性的85-90％患者中发生。AMD的干型通常由视网膜下的视网膜色素上皮细胞层(且推测为脉络膜毛细血管)萎缩导致，且通过眼的中心部分的感光细胞(视杆和视锥细胞)的丧失引起视力丧失。额外在视网膜和脉络膜间可存在积累的细胞碎片(称为玻璃疣)。(2)湿型AMD，也称作新生血管性或渗出性AMD，代表更严重的AMD形式。湿型AMD通常由眼中异常的血管生长表征，其中有问题的血管渗漏流体和血液。其可引起视力丧失，这是由于来自脉络膜毛细血管的异常血管生长通过Bruch’s膜进入视网膜下间隙，最终导致血液和蛋白在黄斑下的渗漏。如果未治疗的话，来自这些血管的出血、渗漏和结疤最终引起不可逆地损伤感光细胞、黄斑中的结痂形成和视力相对迅速的丧失。(3)色素上皮细胞脱离(PED)相关的ARMD在少于5％的患者中发生且导致视网膜脱离。

IL17抑制剂

本发明利用IL17抑制剂例如IL17A抑制剂来调节IL17活性并由此治疗、预防、改善和/或预防黄斑变性或减缓黄斑变性的进展。

许多IL17抑制剂适于本发明方法的使用。IL17抑制剂的非限制性实例包括IL17受体；抗IL17抗体，其包括单克隆抗体、嵌合、人源化和重组抗体，如Ixekizumab、brodalumab、secukinomab、AMG827；vidoflumis；甲基强的松；姜黄素(1,7-二(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6庚二烯-3,5-二-酮)熊果酸；小分子抑制剂；肌醇磷脂3-激酶(PI3K)抑制剂；环孢素A；PDE4抑制剂；蛋白酶-1抑制剂等等。

这些以及其他分子抑制IL17的能力可使用本领域熟知的技术确定，如已知测定IL17结合和IL17信号通路抑制的测定，以及用于研究黄斑变性的动物模型的使用，如本文描述的进行性焦视网膜变性的Ccl2^-/-/Cx3cr1^-/-/Crb1^rd8(DKO/rd8)小鼠模型(Chan等,OphthalmicRes(2000)40:124-128；Tuo等,InvestOphthalmolVisSci(2007)48:3827-3836)。

一些方面，在本发明的方法中使用白细胞介素受体-免疫球蛋白融合物。融合蛋白的白细胞介素受体组分是IL17受体(IL17r)，如IL17A受体。保持与相应的配体结合并调节配体活性(如在多种测试和动物模型中任一包括本文进一步描述的那些中测量)的能力的天然分子及其片段和类似物意在用于与本发明一起使用。

用于代表性的全长人IL17A受体的核苷酸和相应的氨基酸序列分别示于图1A和1B(SEQIDNOS:1和2，分别为NCBI登录号NM_014339和NP_055154)。全长的分子包括866个氨基酸。氨基酸1-31代表信号肽。信号肽后为由289个氨基酸的胞外结构域、21个氨基酸的跨膜结构域和525个氨基酸的胞质尾组成的成熟肽。人IL17Ar的氨基酸序列与小鼠IL17Ar69％相同。

一些方面，使用了可溶的IL17r。可溶性IL17r通常包括胞外结构域或其活性部分，但缺乏跨膜结构域且任选地胞质尾，且可以或可以不包括天然或异源的信号序列。可溶性IL17r的一个实例包含信号肽和分子的胞外结构域，如由SEQIDNO:2的残基1-320代表的，或其活性部分。

来自人和其他物种的多种其他的IL17r序列和变体为已知且可在本文使用。如果期望受体的可溶形式，可使用与上文所述那些相应的结构域且可由本领域的技术人员轻易鉴定，如通过使用标准的亲水性绘图，如使用Kyte-Doolittle技术计算的那些，Kyte等,J.Mol.Biol.(1982)157:105-132。

与本发明一起使用的其他IL17r序列及其变体描述于例如美国专利号7,256,264(其在本文以其全文通过提述并入)，以及NCBI登录号NM_014339、NM_032732、NM_153461、NM_153460、EF676034、NM_018725、AF212365、AF458069、AF458067、EF676033、EF676032、AF458065、U58917(全部为人序列)；NM_008359、AK050139、AX720728、AF458066、NM_134159、AF458068、AF208108、U31993(全部为小鼠序列)；XM_603383(小牛)；XM_001489654(马)；NM_01107883(大鼠)；XR_024768(猩猩)；XM_533791(狗)。

编码用于与本发明一起使用的预期白细胞介素受体的多核苷酸可使用标准的分子生物学技术制备。举例来说，编码上文描述的分子的多核苷酸序列可使用重组方法(如通过筛选来自表达所述基因的细胞的cDNA和基因组文库或通过从已知包含该基因的载体衍生该基因)获得。感兴趣的基因还可基于已知序列合成产生而非克隆。对于特定的序列，分子可设计有合适的密码子。完整的序列随后从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装。参见例如Edge,Nature(1981)292:756；Nambair等,Science(1984)223:1299；andJay等,J.Biol.Chem.(1984)259:6311。

因此，特定的核苷酸序列可从含有预期序列的载体中获得或完全或部分使用本领域已知的寡核苷酸合成技术合成，如酌情使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见例如Sambrook，同上。获得编码预期序列的核苷酸序列的一种方法是通过退火在常规、自动多核苷酸合成仪中产生的重叠的合成寡核苷酸的互补集，随后用合适的DNA连接酶连接以及连接的核苷酸序列经由PCR的扩增。参见例如Jayaraman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:4084-4088。此外，可使用寡核苷酸引导的合成(Jones等,Nature(1986)54:75-82)、寡核苷酸引导的预先存在的核苷酸区的诱变(Riechmann等,Nature(1988)332:323-327和Verhoeyen等,Science(1988)239:1534-1536)和使用T4DNA聚合酶的缺口寡核苷酸的酶促充填(Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:10029-10033)以提供用于主题方法使用的分子。

一旦获得，编码白细胞介素受体的多核苷酸可与多聚化结构域直接或经由接头部分接。多聚化结构域可以是免疫球蛋白序列，如免疫球蛋白恒定区、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区、包含形成两个或多个多聚化结构域间的分子间二硫键的游离巯基的多肽，或举例来说，例如在美国专利5,731,168中描述的“突出部入腔”结构域，该专利在本文以其全文通过提述并入。多聚化结构域提供促进或允许来自单体结构域的二聚体、三聚体和类似物的形成。

多聚化结构域可引起至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或95％的单体融合蛋白以适于多聚体的速率迁移至非变性聚丙烯酰胺凝胶上。糖基化可影响凝胶中蛋白的迁移。尽管特定的序列示于此处，如也可使用等位基因变体的变体。典型的这种变体将与公开的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性。

可对多聚化进行测定，举例来说，使用还原性和非还原性的凝胶。多聚化还可通过检测蛋白对于其配体/受体增加的结合亲和力进行测试。BiaCore^TM表面等离子体共振测定可在该方面使用。这些测定通过测量在接近传感器芯片表面的水层中折射率的改变来检测质量的改变。

一些方面，多聚化结构域源自免疫球蛋白分子，包括但不限于来自重链、免疫球蛋白恒定区结构域、Fc区等等的区。可使用IgG1或IgG2λ重链Fc部分的序列，举例来说，仅CH3或CH3的部分，如氨基酸Gly224-Lys330(编号相对人IgG1Fc部分)或CH2和CH3结构域两者或其部分，如氨基酸Pro111-Lys330(编号相对人IgG1Fc部分)，或其部分或延伸。

免疫球蛋白分子的Fc部分可通过全抗体分子用酶木瓜蛋白酶裂解获得。可使用其他方式获得这些部分。对于IgG1λ重链蛋白序列，参见Genbank登录号Y14737。可使用其他Fc区，举例来说来自其他IgG类型和来自IgA、IgM、IgD或IgE抗体的Fc区。

如上文所释，白细胞介素受体可与多聚化结构域经由接头连接。在实施方案中，接头是多肽链。接头部分可包括举例来说3-100个氨基酸残基，如5-100个氨基酸残基、5-75个氨基酸残基、5-50个氨基酸残基、5-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基、5-10个氨基酸残基、5-9个氨基酸残基或在该范围内任何数目的氨基酸残基。有用的接头的实例包括：Gly₉(SEQIDNO:5)、Glu₉(SEQIDNO:6)、Ser₉(SEQIDNO:7)、Gly₅-Cys-Pro₂-Cys(SEQIDNO:8)、(Gly₄-Ser)₃(SEQIDNO:9)、Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:10)、Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:11)、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQIDNO:12)和Gly₉-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:13)。其他可用的多肽接头包括不同长度的多甘氨酸，包括举例来说5、7或30个残基。

接头部分还可从其他多聚物制备，如聚乙二醇。这种接头可具有10-1000、10-500、10-250、10-100或10-50乙二醇单体单元或在该范围内的任何数目的单体单元。合适的多聚物应为与由合适范围的氨基酸残基占用的大小相似的大小。在实施方案中，所述多聚物提供约10-25埃的间距。

用于多聚化结构域和接头部分的序列可如上文所述参考白细胞介素受体获得。

例示性的融合蛋白图示于图2，其序列示于3A-3B(SEQIDNOS:3和4)。如图2所示，构建体编码通过九甘氨酸序列连接至人IgG1Fc结构域的CH3结构域的可溶性人IL17r。

一旦产生，所述构建体可如下文进一步所述使用重组病毒载体递送。

基因递送技术

IL17抑制剂构建体，如上文所述的那些，可使用数种递送技术中的任一种递送至相关受试者。用于基因递送的数种方法为本领域已知。一般地，将重组载体配制成如下文所述的药物组合物并使用体内或离体转导技术引入受试者。如果离体转导，预期的受体细胞将从受试者移除，用重组载体转导并再次引入受试者。可替换地，当细胞在受试者中不会生成不合适的免疫响应时，也可使用同系(syngeneic)或异种细胞。

已对用于将转导细胞递送和引入受试者中的合适的方法进行了描述。举例来说，细胞可进行体外转导，其通过将重组载体与受试者的细胞如在合适的介质中组合，并对含有感兴趣的DNA的那些细胞使用常规的技术如Southern印迹和/或PCR或通过使用选择性标记筛选。

开发多种基于病毒的系统用于将在体内或离体将基因转入哺乳动物细胞。举例来说，逆转录病毒提供用于基因递送系统的便利的平台。可将所选基因使用本领域已知的技术插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。随后可分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。已对多种逆转录病毒系统进行了描述。参见例如美国专利号5,219,740；Miller和Rosman,BioTechniques(1989)7:980-990；Miller,A.D.,HumangeneTherapy(1990)1:5-14；Scarpa等,Virology(1991)180:849-852；Burns等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:8033-8037；andBoris-Lawrie和Temin,Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)3:102-109。复制缺陷型鼠类逆转录病毒载体广泛应用于基因转移载体。鼠类白血病逆转录病毒包括单链RNA，其与核核心蛋白复合，和由蛋白核心(gag)包住且周围是决定宿主范围的糖蛋白包膜(env)的聚合酶(pol)。逆转录病毒的基因组结构包括在5’和3’长末端重复(LTR)处包入的gag、pol和env基因。逆转录病毒载体系统利用如下事实，即包含5’和3’LTR和包装信号的最小载体足以允许载体包装和感染并整合入靶细胞，只要病毒结构蛋白在包装细胞系中是反式(intrans)提供。用于基因转移的逆转录病毒载体的根本优势包括在大多数细胞类型中的有效感染和基因表达、整合入靶细胞染色体DNA的精确单拷贝载体和逆转录病毒基因组的轻松操作。

已描述了多种腺病毒载体。与整合入宿主基因组的逆转录病毒不同的是，腺病毒保持在染色体外，因此最小化与插入诱变相关的风险(Haj-Ahmad和Graham,J.Virol.(1986)57:267-274；Bett等,J.Virol.(1993)67:5911-5921；Mittereder等,HumangeneTherapy(1994)5:717-729；Seth等,J.Virol.(1994)68:933-940；Barr等,geneTherapy(1994)1:51-58；Berkner,K.L.BioTechniques(1988)6:616-629；andRich等,HumangeneTherapy(1993)4:461-476)。用于在主题方法中使用的腺病毒载体在下文中进行详细描述。

此外，已开发多种腺相关病毒(AAV)载体系统用于基因递送。AAV载体可使用本领域已知的技术轻松构建。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公开号WO92/01070(公开于1992年1月23日)和WO93/03769(公开于1993年3月4日)；Lebkowski等,Molec.Cell.Biol.(1988)8:3988-3996；Vincent等,Vaccines90(1990)(ColdSpringHarborLaboratoryPress)；Carter,B.J.CurrentOpinioninBiotechnology(1992)3:533-539；Muzyczka,N.CurrentTopicsinMicrobiol.andImmunol.(1992)158:97-129；Kotin,R.M.HumangeneTherapy(1994)5:793-801；Shelling和Smith,geneTherapy(1994)1:165-169；andZhou等,J.Exp.Med.(1994)179:1867-1875。对AAV载体系统在下文也进行了进一步详述。

将会发现可用于递送感兴趣的核酸分子的其他病毒载体包括源自痘病毒科的那些，包括牛痘病毒(vacciniavirus)和禽痘病毒。举例来说，表达基因的牛痘病毒重组体可如下构建。首先将编码特定多肽的DNA插入合适的载体，使得其与牛痘病毒启动子毗邻且旁侧为牛痘病毒DNA序列，如编码胸苷激酶(TK)的序列。随后将该载体用于转染同时也用牛痘病毒感染的细胞。同源重组用于将牛痘病毒启动子加编码蛋白的基因插入病毒基因组。获得的TK-重组体可通过在5-溴脱氧尿苷存在下培养细胞并选择对其有抗性的斑块进行选择。

可替换地，禽痘病毒如鸡痘和金丝雀痘病毒也可用于递送基因。禽痘载体的使用特别适于人和其他哺乳动物物种，这是由于禽痘属的成员仅可在易感的禽类物种中高效复制且因此在哺乳动物细胞中并不具有感染性。用于产生重组禽痘病毒的方法为本领域已知且采用基因重组，如上文对应牛痘病毒所述。参见例如WO91/12882；WO89/03429；和WO92/03545。

分子偶联载体也可用于基因递送，如Michael等,J.Biol.Chem.(1993)268:6866-6869和Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:6099-6103中所述的腺病毒嵌合载体。

甲病毒(Alphavirus)属的成员如但不限于源自辛德毕斯(Sindbis)和森林脑炎(SemlikiForest)病毒也发现可用作用于递送编码融合蛋白多核苷酸的病毒载体。对于Sinbus病毒衍生的载体可用于本申请方法的实践的描述，参见Dubensky等,J.Virol.(1996)70:508-519；和国际公开号WO95/07995和WO96/17072。

可替换地，白细胞介素受体融合蛋白可不使用病毒载体而递送，如通过使用基于质粒的核酸递送系统，如美国专利号6,413,942；6,214,804；5,580,859；5,589,466；5,763,270；和5,693,622中所述，其全部内容在本文通过提述并入。质粒将包含与在体内指导蛋白产物表达的控制元件可操作地连接的感兴趣的基因。这种控制元件也为本领域熟知。

腺病毒基因递送系统

在本发明的一个实施方案中，将编码IL17抑制剂的核苷酸序列如上文描述的融合蛋白插入基于腺病毒的表达载体。腺病毒基因组是约36,000个碱基对的线性双链DNA分子，其中55-kDa的末端蛋白与每条链的5’末端共价结合。腺病毒(“Ad”)DNA包含约100碱基对的相同反向末端重复(“ITR”)，其中精确的长度依赖于血清型。病毒的复制起点精确地位于基因组末端的ITR内。DNA合成在两个阶段发生。首先，复制通过链置换行进，生成子代(daughter)双链分子和亲代置换链。置换的链为单链且可形成“锅柄(panhand)”中间体，其允许子代双链分子的复制起始和生成。可替换地，复制可从基因组的两末端同时推进，避免形成锅柄结构的需要。

在增殖性感染周期过程中，病毒基因在两个阶段表达：早期，其为直至病毒DNA复制的时间段，和晚期，其与病毒DNA复制的起始一起发生。在早期过程中，仅表达由区E1、E2、E3和E4编码的早期基因产物，其实施多种功能来令细胞对于病毒结构蛋白的合成进行准备。在晚期过程中，除早期基因产物外晚期病毒基因产物也表达，且宿主细胞DNA和蛋白合成关闭。因此，细胞变成专门产生病毒DNA和病毒结构蛋白。

腺病毒的E1区是靶细胞感染后表达的第一区。该区由两个转录单元，E1A和E1B基因组成。E1A基因产物的主要功能是诱导静止细胞进入细胞周期并恢复细胞DNA合成，并在转录水平激活E1B基因和其他早期的区(E2、E3、E4)。仅具有E1A基因的初级细胞的转染可诱导无限的增殖(永生化)，但不导致完全转化。然而，E1A在大多数情况中的表达导致程序性细胞死亡(细胞凋亡)的诱导且仅偶尔永生化。需要E1B基因的共表达以预防凋亡的诱导且用于完整形态转化的发生。在建立的永生细胞系中，E1A的高水平表达可引起E1B不存在时的完整转化。

E1B-编码的蛋白辅助E1A重新定向细胞功能以允许细胞复制。E1B55kD和E433kD蛋白，其形成基本位于核中的复合物，功能在于抑制宿主蛋白的合成和促进病毒基因的表达。其主要的影响是来建立从核到细胞质的病毒mRNA的选择性运输，与之同时伴随感染的晚期发作。E1B21kD蛋白对于增殖感染周期的正确时间控制至关重要，进而在病毒生命周期完成前预防宿主细胞的提前死亡。

基于腺病毒的载体以高水平表达基因产物肽。腺病毒载体具有高感染效率，即使具有较低的病毒滴度。此外，病毒作为无细胞的病毒粒子是完全感染性的，因此生产细胞系的注射并非必须。腺病毒载体实现异源基因在体内的长期表达。腺病毒并不与严重的人病理相关，病毒可感染各种各样的细胞且具有很宽的宿主范围，病毒可以大的量相对容易地产生，且病毒可通过在病毒基因组的早期区1(“E1”)中的缺失成为复制缺陷性的。因此，源自人腺病毒的载体(其中至少E1区已缺失和由感兴趣的基因替换)已广泛用于临床前和临床期的基因疗法实验。

用于与本发明使用的腺病毒载体源自多种腺病毒血清型的任何一种，包括但不限于腺病毒超过40种血清型的任一种，如血清型2、5、12、40和41。本文使用的腺病毒载体是复制缺陷型且包含在合适启动子控制下的感兴趣的基因，如下文讨论的对应腺相关病毒的启动子的任何一种。举例来说，美国专利号6,048,551(在本文以其全文通过提述并入)描述复制缺陷型腺病毒载体，其包括用于抗炎性细胞因子IL-10的人基因以及包括用于抗炎性细胞因子IL-1ra的基因的载体，所述基因在劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子控制下，所述载体分别称为Ad.RSVIL-10和Ad.RSVIL-1ra。

其他源自任何腺病毒血清型的重组腺病毒以及不同的启动子系统可由本领域的技术人员使用。

举例来说，美国专利号6,306,652(在本文以其全文通过提述并入)描述具有E2A序列的腺病毒载体，其包含hr突变和ts125突变(称为ts400)以预防因E2A过表达的细胞死亡，以及具有E2A序列的载体，其仅包含在诱导型启动子控制下的hr突变，和具有E2A序列的载体，其包含在诱导型启动子控制下的hr突变和ts125突变(ts400)。

此外，如美国专利号6,306,652描述的“最小的”腺病毒载体发现可与本发明一起使用。这种载体保持至少部分用于将基因组包被入病毒颗粒所需的病毒基因组(包衣信号)，以及至少一个拷贝的ITR的至少功能性部分或衍生物。最小的腺病毒载体的包装可通过与辅助病毒或者如美国专利号6,306,652所述的包装缺陷型复制辅助系统共感染实现。

其他有效用于感兴趣的基因递送的基于腺病毒的载体包括“无内容(gutless)”(辅助依赖型)腺病毒，其中大量病毒基因组已移除(Wu等,Anesthes.(2001)94:1119-1132)。这种“无内容”腺病毒载体基本上不产生病毒蛋白，因此允许病毒驱动基因疗法继而在单次施用后超过一年成功地持续发生(Parks,R.J.,Clin.Genet.(2000)58:1-11；Tsai等,Curr.Opin.Mol.Ther.(2000)2:515-523)并消除免疫系统的干扰。此外，病毒基因组的移除产生插入控制序列的空间，其为全身施用药物提供表达调节(Burcin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96:355-360)，这增加了病毒驱动蛋白表达的安全性和控制。这些和其他重组腺病毒可与本发明的方法共同使用。

腺相关病毒基因递送系统

腺相关病毒(AAV)已成功地在用于基因疗法的基因递送中。AAV基因组是线性、单链DNA分子，其包含约4681个核苷酸。AAV基因组一般包含内部、非重复基因组，其在每个末端的旁侧为反向末端重复(ITR)。ITR在长度上约为145个碱基对(bp)。ITR具有多重功能，包括为病毒基因组提供DNA复制起点和包装信号。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，称为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。rep和cap基因编码病毒蛋白，其允许病毒复制并包装入病毒粒子。具体地，具有至少四种病毒(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，根据其表观分子量命名)的蛋白家族从AAVrep区表达。AAVcap区编码至少三种蛋白，VPI、VP2和VP3。

已对AAV进行工程化以通过缺失AAV基因组的内部非重复部分以递送感兴趣的基因(即rep和cap基因)并在ITR间插入异源基因(在这种情况中为编码白细胞介素受体融合蛋白的基因)。异源基因通常与能够在合适条件下于患者靶细胞中驱动基因表达的异源启动子(组成型、细胞特异型或诱导型)功能性连接。末端信号如多腺苷化位点也包括其中。

AAV是辅助依赖型病毒；也就是说，为了形成AAV病毒粒子，其需要与辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)共感染。不存在与辅助病毒共感染时，AAV建立潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体，但不产生感染性病毒粒子。随后通过辅助病毒的感染“拯救”整合的基因组，使其复制并将其基因组包装入感染性的AAV病毒粒子。尽管AAV可感染来自不同物种的细胞，辅助病毒必须与所述宿主细胞来自相同的物种。因此，举例来说，人AAV将在用犬腺病毒共感染的犬细胞中复制。

包含感兴趣的基因的重组AAV病毒粒子可使用多种本领域认可的技术产生，其在下文进行详述。可使用野生型AAV和辅助病毒以提供必需的复制功能用于产生rAAV病毒粒子(参见例如美国专利号5,139,941，其在本文通过提述以其全文并入)。可替换地，包含辅助功能基因的质粒与一种本领域已知的辅助病毒的感染组合可用作复制功能的来源(参见例如美国专利号5,622,856和美国专利号5,139,941，其在本文都以其全文通过提述并入)。相似地，可将包含配件功能基因的质粒与野生型AAV感染组合使用来提供必需的复制功能。当与rAAV载体组合使用时，这三种方式的每一种都足以产生rAAV病毒粒子。本领域的技术人员也可采用其他本领域熟知的方式来产生rAAV病毒粒子。

在本发明的一个实施方案中，使用三重转染方法(详述于美国专利号6,001,650中，其在本文通过提述以其全文并入)以产生rAAV病毒粒子，这是由于该方法不需使用感染性辅助病毒，这使得rAAV病毒粒子在无需任何可检测的辅助病毒存在下产生。其通过使用三种用于rAAV病毒粒子产生的载体实现：AAV辅助功能载体、配件功能载体和rAAV表达载体。但本领域的技术人员可以理解的是这些载体编码的核酸序列可以多种组合在两种或多种载体上提供。

如上文所释，AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即rep和cap)，其以反式发挥功能用于生产型AAV的复制和包衣。AAV辅助功能载体可支持高效的AAV载体产生而无需生成任何可检测的wtAAV病毒粒子(即包含功能性rep和cap基因的AAV病毒粒子)。这种载体的实例pHLP19描述于美国专利号6,001,650中，其在本文通过提述以其全文并入。AAV辅助功能载体的rep和cap基因可从如上文所释的任何已知AAV血清型衍生。举例来说，AAV辅助功能载体可具有源自AAV-2的rep基因和源自AAV-6的cap基因；本领域的技术人员可以认可的是其他rep和cap基因组合也是有可能的，限定的特征为支持rAAV病毒粒子产生的能力。

配件功能载体编码非AAV衍生的病毒和/或细胞功能(即“配件功能”)的核苷酸序列，AAV依赖于该功能复制。配件功能包括AAV复制必须的那些，其包括但不限于涉及激活AAV基因转录的部分、阶段特异性AAVmRNA剪接、AAVDNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳装配。基于病毒的配件功能可源自任何已知的辅助病毒如腺病毒、辅助病毒(但除单纯疱疹病毒1型)和牛痘病毒。在实施方案中，使用了配件功能质粒pLadeno5(关于pLadeno5的细节描述于美国专利号6,004,797，其在本文通过提述以其全文并入)。该质粒提供全套的腺病毒配件功能用于AAV载体产生，但缺乏形成有复制能力的腺病毒的必需组件。

为进一步理解AAV，下文提供关于重组AAV表达载体和AAV辅助和配件功能的更详细讨论。

重组AAV表达载体

重组AAV(rAAV)表达载体使用已知的技术构建以至少提供在转录方向上可操作连接的组件、包括转录起始区的控制元件、感兴趣的多核苷酸和转录终止区。选择控制元件以在感兴趣的细胞中发挥功能，如在哺乳细胞中。获得的包含可操作连接元件的构建体与功能性AAVITR序列连接(5’和3’)。

AAVITR区的核苷酸序列为已知。对于AAV-2序列，参见例如Kotin,R.M.(1994)HumangeneTherapy5:793-801；Berns,K.I.“ParvoviridaeandtheirReplication”inFundamentalVirology,2ndEdition,(B.N.Fields和D.M.Knipe,eds.)。在本发明载体中使用的AAVITR无需具有野生型核苷酸序列，也可发生改变，例如通过核苷酸的插入、缺失或取代。此外，AAVITR可源自数种AAV血清型中的任一种，其包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12等等。此外，在AAV表达载体中的所选核苷酸序列旁侧的5’和3’ITR不需一定相同或源自相同的AAV血清型或分离株，只要其如预期发挥功能，即允许感兴趣的序列从宿主细胞基因组或载体切除和拯救，且当AAVRep基因产物存在于细胞中时允许DNA分子整合入受体细胞基因组。

用于在AAV载体中使用的合适的多核苷酸分子在大小上将少于约5千碱基(kb)。所选的多核苷酸序列与在受试者体内指导其转录或表达的控制元件可操作地连接。这种控制元件可包含与所选基因正常结合的控制序列。可替换地，可采用异源控制序列。有用的异源控制序列一般包括源自编码哺乳动物或病毒基因的那些。实例包括但不限于神经元特异性烯醇化酶启动子、GFAP启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂交启动子等等。此外，源自非病毒基因的序列如鼠类金属硫蛋白基因也可在本文使用。这种启动子序列可从举例来说Stratagene(SanDiego,CA)商业获得。

包含与AAVITR结合的感兴趣的多核苷酸分子的AAV表达载体可通过直接将所选序列插入已经具有从其切除的主要AAV开放阅读框(“ORF”)的AAV基因组构建。也可将AAV基因组的其他部分缺失，只要保持ITR足以允许复制和包装功能的部分。这种构建体可使用本领域熟知的技术设计。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公开号WO92/01070(公开于1992年1月23日)和WO93/03769(公开于1993年3月4日)；Lebkowski等(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent等(1990)Vaccines90(ColdSpringHarborLaboratoryPress)；Carter(1992)CurrentOpinioninBiotechnology3:533-539；Muzyczka(1992)CurrentTopicsinMicrobiol.andImmunol.158:97-129；Kotin(1994)HumangeneTherapy5:793-801；Shelling和Smith(1994)GeneTherapy1:165-169；和Zhou等(1994)J.Exp.Med.179:1867-1875。

可选地，AAVITR可从病毒基因组或从包含它的载体剪切，并使用标准连接技术(如描述于上文Sambrook等中的那些)与存在于另一载体中的所选核酸构建体在5’和3’融合。举例来说，连接可在20mMTris-ClpH7.5,10mMMgCl2,10mMDTT,33μg/mlBSA,10mM-50mMNaCl和或者40μMATP,0.01-0.02(Weiss)单位T4DNA连接酶在0℃(用于“粘末端”连接)或者1mMATP,0.3-0.6(Weiss)单位T4DNA连接酶在14℃(用于“平末端”连接)中实现。分子间的“粘末端”连接通常以30-100μg/ml的总DNA浓度实施(5-100nM总最终浓度)。包含ITR的AAV载体已描述于例如美国专利号5,139,941中。具体地，其中描述了数种AAV载体，其可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)以登录号53222、53223、53224、53225和53226获得。

就本发明而言，用于产生来自AAV表达载体的rAAV病毒粒子的合适的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以是或已经用作异源DNA分子的接受者且能够在举例来说悬浮培养物、生物反应器等等中生长。该术语包括已转染的起始细胞的后代。因此，如本文使用的“宿主细胞”一般指已用外源DNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系293的细胞(可从例如美国典型培养物保藏中心以登录号ATCCCRL1573轻松获得)可在本发明的实践中使用。具体地，人细胞系293是人胚胎肾细胞系，其已用腺病毒5型DNA片段转化(Graham等(1977)J.Gen.Virol.36:59)，且表达腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等(1979)Virology94:460)。293细胞系可轻松转染并提供特别便利的在其中产生rAAV病毒粒子的平台。

AAV辅助功能

包含上述AAV表达载体的宿主细胞具有提供AAV辅助功能的能力，进而复制和包被旁侧为AAVITR的核苷酸序列以产生rAAV病毒粒子。AAV辅助功能一般为AAV-衍生的编码序列，其可表达以提供AAV基因产物，其继而以反式发挥功能用于生产性AAV复制。在本文使用AAV辅助功能以补充从AAV表达载体缺失的必须的AAV功能。因此，AAV辅助功能包括主要的AAVORF(即rep和cap编码区)中的一个或两者，或其功能性同源物。

“AAVrep编码区”意为本领域认可的AAV基因组中编码复制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的区。已表明这些Rep表达产物具有许多功能，包括DNA复制的AAV起点的识别、结合和切割、DNA解旋酶的活性和从AAV(或其他异源)启动子转录的调节。对于复制AAV基因组，共同需要Rep表达产物。对于AAVrep编码区的描述，参见例如Muzyczka,N.(1992)CurrentTopicsinMicrobiol.andImmunol.158:97-129；和Kotin,R.M.(1994)HumangeneTherapy5:793-801。合适的AAVrep编码区的同源物包括人疱疹病毒6(HHV-6)rep基因，已知其也介导AAV-2DNA复制(Thomson等(1994)Virology204:304-311)。

“AAVcap编码区”意为本领域认可的AAV基因组中编码包衣蛋白VP1、VP2和VP3的区，或其功能性同源物。这些Cap表达产物提供对于包装病毒基因组而言共同需要的包装功能。对于AAVcap编码区的描述，参见例如Muzyczka,N.和Kotin,R.M.(上文)。

通过用AAV辅助构建体在转染AAV表达载体之前或同时转染宿主细胞将AAV辅助功能引入宿主细胞。AAV辅助构建体因此可用于提供至少AAVrep和/或cap基因的瞬时表达以补足缺失的AAV功能，该功能对于生产型AAV感染为必需。AAV辅助构建体缺乏AAVITR且既不可复制也不能包装其自身。

这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已对多个AAV辅助构建体进行了描述，如通常使用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45，其编码Rep和Cap表达产物两者。参加例如Samulski等(1989)J.Virol.63:3822-3828；和McCarty等(1991)J.Virol.65:2936-2945。也对其他多种编码Rep和/或Cap表达产物的载体进行了描述。参见例如美国专利号5,139,941。

AAV配件功能

必需使宿主细胞(或包装细胞)也能够提供非AAV衍生功能或“配件功能”，进而产生rAAV病毒粒子。配件功能是非AAV-衍生的病毒和/或细胞功能，AAV的复制依赖于所述功能。因此，配件功能至少包括AAV复制中所需的非AAV蛋白和RNA，包括涉及AAV基因转录的激活、阶段特异性AAVmRNA剪接、AAVDNA复制、Cap表达产物合成和AAV包衣装配的那些。基于病毒的配件功能可以源自已知辅助病毒的任一种。

具体地，可使用本领域已知的方法将配件功能引入并随后表达于宿主细胞中。通常，配件功能通过具有不相关的辅助病毒的宿主细胞的感染提供。已知多种合适的辅助病毒，包括腺病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒1型和2型；和牛痘病毒。非病毒配件功能也可在本文使用，如由使用多种已知试剂中任一种进行的细胞同步化提供的那些。参见例如Buller等(1981)J.Virol.40:241-247；McPherson等(1985)Virology147:217-222；Schlehofer等(1986)Virology152:110-117。

可替换地，可使用如上文所定义的配件功能载体提供配件功能。参见例如美国专利号6,004,797和国际公开号WO01/83797，其在本文以其全文通过提述并入。提供配件功能的核酸序列可从天然来源获得，如从腺病毒颗粒的基因组或使用本领域已知的重组或合成方法构建。如上文所释，已证明腺病毒基因的完全补体对于配件辅助功能并非必需。具体地，不能进行DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体已表明可进行AAV复制。Ito等,(1970)J.Gen.Virol.9:243；Ishibashi等,(1971)Virology45:317。相似地，在E2B和E3区内的突变体已表明支持AAV复制，说明E2B和E3区可能涉及提供配件功能。Carter等,(1983)Virology126:505。然而，在E1区中缺陷或具有缺失的E4区的腺病毒不能支持AAV复制。因此，E1A和E4区对于AAV复制可能是之间或间接必需的。Laughlin等,(1982)J.Virol.41:868；Janik等,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1925；Carter等,(1983)Virology126:505。其他表征的Ad突变体包括：E1B(Laughlin等(1982)，上文；Janik等(1981),supra；Ostrove等,(1980)Virology104:502)；E2A(Handa等,(1975)J.Gen.Virol.29:239；Strauss等,(1976)J.Virol.17:140；Myers等,(1980)J.Virol.35:665；Jay等,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2927；Myers等,(1981)J.Biol.Chem.256:567)；E2B(Carter,Adeno-AssociatedVirusHelperFunctions,inICRCHandbookofParvoviruses(P.Tijssened.,1990))；E3(Carter等(1983),上文)；和E4(Carter等(1983)，上文；Carter(1995))。尽管由在E1B编码区中具有突变的腺病毒提供的配件功能的研究产生相互矛盾的结果，Samulski等,(1988)J.Virol.62:206-210报道了E1B55k对于AAV病毒粒子产生是必需的，而E1B19k并不是。此外，国际公开WO97/17458和Matshushita等,(1998)GeneTherapy5:938-945，描述编码多种Ad基因的配件功能载体。配件功能载体可包含腺病毒VARNA编码区、腺病毒E4ORF6编码区、腺病毒E2A72kD编码区、腺病毒E1A编码区和缺乏完整E1B55k编码区的腺病毒。这种载体描述于国际公开号WO01/83797。

作为用辅助病毒感染宿主细胞或用配件功能性载体转染宿主细胞的结果，附件功能得以表达，其反式激活AAV辅助构建体以产生AAVRep和/或Cap蛋白。Rep表达产物剪切来自AAV表达载体的重组DNA(包括感兴趣的DNA)。Rep蛋白也用于复制AAV基因组。表达的Cap蛋白装配入衣壳，且重组AAV基因组包装入衣壳。因此，生产型AAV复制继续发生，且DNA包装入rAAV病毒粒子。“重组AAV病毒粒子”或“rAAV病毒粒子”在本文定义为感染性、复制缺陷型病毒，其包含AAV蛋白外壳，其包被感兴趣的两侧都为AAVITR的异源核苷酸序列。

重组AAV复制后，rAAV病毒粒子可从宿主细胞使用多种常规纯化方法进行纯化，如柱层析、CsCl梯度等等。举例来说，可使用多个柱纯化步骤，如在阴离子交换柱、亲和柱和/或阳离子交换柱上的纯化。参见举例来说，国际公开号WO02/12455。此外，如果采用感染来表达配件功能，可使用已知方法将残留的辅助病毒失活。举例来说，腺病毒可通过加热至大约60℃、持续例如20分钟或更久来灭活。该处理可有效地仅灭活辅助病毒，这是由于AAV是极度热稳定的而辅助腺病毒则是热不稳定的。

获得的包含感兴趣的核苷酸序列的rAAV病毒粒子可随后使用下文所述的技术用于基因递送。

rAAV颗粒

在一些实施方案中，病毒颗粒是包含核酸的重组AAV颗粒，所述核酸包含旁侧为一个或两个ITR的转基因。所述核酸包被进AAV颗粒。AAV颗粒也包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，核酸包含在转录方向上与组件可操作连接的感兴趣的蛋白编码序列(例如治疗性转基因)、包括转录起始和终止序列的控制序列，进而形成表达盒。表达盒的5'和3'末端旁侧为至少一个功能性AAVITR序列。“功能性AAVITR序列”意为ITR序列按照预期发挥拯救、复制和包装AAV病毒粒子的功能。参见Davidson等,PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等,J.Virol.,2003,77(12):7034-40；和Pechan等,GeneTher.,2009,16:10-16，其在本文都通过提述以其全文并入。为了实践本发明的一些方面，重组载体至少包含对于包衣和用于通过rAAV感染的物理结构必要的全部AAV序列。用于在本发明的载体中使用的AAVITR无需具有野生型核苷酸序列(例如如Kotin,Hum.GeneTher.,1994,5:793-801中所述)，且可通过核苷酸的插入、缺失或取代改变，或AAVITR可源自数种AAV血清型中的任一种。目前已知多于40种的AAV血清型，且持续鉴别出新的血清型和已有血清型的变体。参见Gao等,PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao等,PNAS,2003,100(10):6081-6；和Bossis等,J.Virol.,2003,77(12):6799-810。任何AAV血清型的使用都在本发明的保护范围之内。在一些实施方案中，rAAV载体是源自AAV血清型的载体，其包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12等等。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12等的ITR。在进一步的实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12等的衣壳蛋白。在进一步的实施方案中，rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白(Gao,等J.Virol.2004,78(12):6381)。

使用不同的AAV血清型以优化特定靶细胞的转导或靶向特定靶组织(例如疾病组织)内的特定细胞类型(例如疾病组织)。rAAV颗粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。本文提供用于产生rAAV颗粒的AAV血清型的任何组合，如每种组合都明确阐述于本文般。

自身互补的AAV病毒基因组

一些方面，本发明提供包含重组自身互补基因组的病毒颗粒。具有自身互补基因组的AAV病毒颗粒和使用自身互补AAV基因组的方法描述于美国专利号6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；和WangZ.,等,(2003)GeneTher10:2105-2111，其每一篇在本文都以其全文通过提述并入。包含自身互补基因组的rAAV将凭借其部分互补的序列迅速形成双链DNA分子(例如转基因的互补编码和非编码链)。在一些实施方案中，本发明提供包含AAV基因组的AAV病毒颗粒，其中rAAV基因组包含第一异源多核苷酸序列(例如治疗性转基因编码链)和第二异源多核苷酸序列(例如治疗性转基因的非编码或反义链)，其中所述第一异源多核苷酸序列与第二多核苷酸序列沿其长度的大部分或全部可形成链内碱基对。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过促进链内碱基配对的序列连接；例如发夹DNA结构。发夹结构为本领域已知，举例来说在siRNA分子中。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过突变的ITR(例如，右侧的ITR(therightITR))连接。突变的ITR包含含有末端解析序列的D区的缺失。作为结果，在复制AAV病毒基因组时，rep蛋白将不在突变的ITR处裂解病毒基因组，且因此按5’至3’方向包含下列各项的重组病毒基因组将包装入病毒衣壳：AAVITR、包含调节序列的第一异源多核苷酸序列、突变的AAVITR、与第一异源多核苷酸反向的第二异源多核苷酸和第三AAVITR。

rAAV载体的产生

本领域已知多种用于产生rAAV载体的方法，包括转染、稳定细胞系的产生和感染性杂交病毒产生系统，其包括腺病毒AAV杂交体、疱疹病毒AAV杂交体和杆状病毒AAV杂交体。用于产生rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养都需要1)合适的宿主细胞，包括举例来说源自人的细胞系如HeLa、A549或293细胞，或在杆状病毒生产系统的情况中为源自昆虫的细胞系如SF-9；2)合适的辅助病毒功能，通过野生型或突变型腺病毒(如温度敏感型腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAVrep和cap基因和基因产物；4)旁侧为至少一个AAVITR序列的转基因(如治疗性转基因)；和5)合适的培养基和培养基组分以支持rAAV生产。本领域已知的合适的培养基可用于rAAV载体的产生。这些培养基包括但不限于HycloneLaboratories和JRH生产的培养基，其包括ModifiedEagleMedium(改良的Eagle培养基；MEM)、Dulbecco'sModifiedEagleMedium(Dulbecco氏改良的Eagle培养基；DMEM)、定制配制物如描述于美国专利号6,566,118中的那些，和描述于美国专利号6,723,551中的Sf-900IISFM培养基，其每一篇在本文都以其全文通过提述并入，特别是关于用于在产生重组AAV载体中使用的定制培养基配制物。

本发明合适的rAAV生产培养培养基可以0.5％-20％(v/v或w/v)的水平补充有血清或源自血清的重组蛋白。可替换地，如本领域已知，rAAV载体可在无血清条件中产生，该条件也可称为无动物衍生产物的培养基。本领域的技术人员能够理解的是经设计以支持rAAV载体生产的商品化或定制的培养基也可补充有一种或多种本领域已知的细胞培养成分，包括但不限于葡萄糖、维生素、氨基酸和/或生长因子，用以增加生产培养物中rAAV的滴度。

rAAV生产培养可在多种适于所利用的特定宿主细胞的条件下(在很宽的温度范围上、持续不同长度的时间等等)生长。如本领域已知，rAAV生产培养包括附着依赖型培养，其可在合适的附着依赖型容器中培养，所述容器如举例来说滚动瓶、空心纤维过滤器、微载体和填充床或流化床生物反应器中。rAAV载体生产培养还可包括悬浮适应性的宿主细胞如HeLa、293和SF-9细胞，其可以多种方式培养，包括举例来说旋转烧瓶、搅拌罐生物反应器和一次性系统如Wave袋系统。

只要细胞在本领域已知引起rAAV颗粒从完整细胞释放入培养基的条件下培养，本发明的rAAV载体颗粒可从rAAV生产培养通过裂解生产培养的宿主细胞或通过从生产培养收获用过的培养基获得，如在美国专利号6,566,118中更详细的描述。合适的细胞裂解方法也为本领域已知且包括举例来说多次冷冻/融化循环、超声、微流化和用化学物质如去污剂和/或蛋白酶处理。

rAAV载体的纯化

收获时，本发明的rAAV生产培养可包含下列一种或多种：(1)宿主细胞蛋白；(2)宿主细胞DNA；(3)质粒DNA；(4)辅助病毒；(5)辅助病毒蛋白；(6)辅助病毒DNA；和(7)培养基组分，包括举例来说血清蛋白、氨基酸、转铁蛋白和其他低分子量蛋白。此外，rAAV生产培养进一步包括具有选自下组的AAV衣壳血清型的rAAV颗粒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12等等。

因此，在一些实施方案中，澄清rAAV生产培养收获物以去除宿主细胞碎片。在一些实施方案中，通过过滤由系列深度过滤器澄清生产培养收获物，所述深度过滤器包括举例来说等级DOHCMilliporeMillistak⁺HCPod过滤器、等级A1HCMilliporeMillistak⁺HCPod过滤器和0.2μmFilterOpticapXL1OMilliporeExpressSHCHydrophilicMembrane过滤器。澄清也可通过多种其他本领域已知的标准技术实现，如离心或通过任何0.2μm或本领域已知更大孔径的醋酸纤维素过滤器过滤。

在一些实施方案中，rAAV生产培养收获物进一步用处理以消化任何存在于生产培养中的高分子量DNA。在一些实施方案中，消化在本领域已知的标准条件下实施，所述标准条件包括举例来说终浓度为1-2.5单位/ml的在室温至37℃范围的温度、持续30分钟至数小时的时间段。

可使用一种或多种下列纯化步骤分离或纯化rAAV颗粒：离心、流通式阴离子交换过滤、用于浓缩rAAV颗粒的切向流过滤(TFF)、通过磷灰石色谱法的rAAV捕获、辅助病毒的热灭活、通过疏水相互作用层析的rAAV捕获、通过尺寸排阻层析(SEC)的缓冲液交换、纳米过滤和通过阴离子交换层析的rAAV捕获。这些步骤可单独、以多种组合或以不同顺序使用。在一些实施方案中，所述方法包括如下文所述顺序的所有步骤。纯化rAAV颗粒的方法可参见举例来说美国专利号6,989,264和8,137,948，以及WO2010/148143。

组合物和递送

一旦产生，IL17抑制剂或编码IL17抑制剂的载体(或病毒粒子)，如上文所述的融合蛋白，将配制成适于直接递送至眼的组合物，用以治疗黄斑变性。如期望基因疗法，组合物将包含足够的遗传材料以产生治疗上有效量的感兴趣的IL17抑制剂，例如足以结合并介导相应的信号通路效果，或降低或改善相关疾病状态的症状的量，或足以赋予预期益处的量。除其他因素，合适的剂量也取决于待治疗的受试者的一般状况、年龄、待治疗的病况严重性、施用模式。合适的有效的量可由本领域的技术人员轻松确定。

因此，“治疗上有效的量”将落入可通过临床试验确定的相对宽的范围。举例来说，对于rAAV病毒粒子的体内注射，治疗上有效的剂量将为约10⁶至10¹⁵数量级的重组病毒，包括10⁸至10¹⁴的重组病毒。对于腺病毒递送的融合蛋白，治疗上有效的剂量可包括约1x10⁶斑形成单位(PFU)至1x10¹²PFU、约1x10⁷PFU至约1x10¹⁰PFU或在足以提供预期效果的这些范围内的任何剂量。

对于体外转导，递送至细胞的rAAV病毒粒子的有效的量可以为10⁸至10¹³数量级的重组病毒。在药物组合物中转导的细胞的量可为约10⁴至10¹⁰细胞，包括10⁵至10⁸细胞。其他有效的剂量可由本领域的普通技术人员通过建立剂量响应曲线的常规试验轻松建立。

在实施方案中，递送1μ1至1ml的组合物，如0.01至约.5ml，举例来说递送约0.05至约0.3ml，如0.08、0.09、0.1、0.2等和这些范围内的任意数字的组合物。

对于蛋白施用，剂量的量可为约10ng/kg多至100mg/kg的体重或更多每天，包括约1μg/kg/天至10mg/kg/天，取决于施用的途径。在文献中提供了递送的特定剂量和方法的指导，参见举例来说美国专利号4,657,760；5,206,344或5,225,212。

一些方面，所述组合物还可包含眼用可接受的赋形剂。所述组合物可配制为溶液、凝胶、药膏、悬浮液、有待在使用前用载剂重构的干粉，或配制为其他合适的且良好耐受的眼用递送系统。这样的赋形剂包括任何施用时没有不适当的毒性的适于直接递送至眼的药物作用剂。药物上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇、多种TWEEN化合物的任一种和液体如水、盐水、甘油和乙醇。药物上可接受的盐可包括其中，举例来说，无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；和有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。此外，辅助物质如润湿或乳化剂、pH缓冲物质等等也可存在于这种载剂中。药物上可接受的赋形剂的深入讨论可参见REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPub.Co.,N.J.1991)。

施用可在一个剂量中、持续地或贯穿治疗过程间歇性地进行。确定施用最有效方式的方法为本领域的技术人员熟知且随载体、疗法的组合物、靶细胞和待治疗的受试者而变化。单次和多次施用可随剂量水平和由治疗的医生选择的类型而实施。

如果实施多重剂量，首次施用的配制物可与随后的配制物相同或不同。因此，举例来说，首次施用可以是腺病毒载体的形式，而第二次施用可以是AAV病毒粒子、质粒DNA、AAV病毒粒子、亚单位疫苗组合物等等的形式。此外，随后的递送也可与递送的第二种模式相同或不同。

应该理解的是多于一种转基因可通过递送的重组载体表达。可替换地，不同载体，每种表达一种或多种不同转基因，也可如本文所述递送至受试者。因此，多个转基因可同时或顺序递送。此外，通过本发明的方法递送的载体还意图与其他合适的组合物和疗法组合。举例来说，可存在其他用于治疗黄斑变性的化合物。

如上文所释，为将IL17抑制剂递送至眼(无论经由基因疗法或蛋白疗法)，施用通常会是局部的。其具备限制需要施用的材料(蛋白或DNA)的量并限制全身副作用的优势。可使用多种可能的递送模式，包括但不限于：通过基因枪在角膜上局部施用；结膜下注射、前房内注射、经由滴眼剂至角膜、经由颞缘注射入前室、基质内注射、与电脉冲组合的角膜应用、角膜内注射、视网膜下注射，玻璃体内注射(例如，前部、中部或背部玻璃体内注射)和眼内注射。可替换地，细胞可离体转染或转导并通过眼内植入递送。参见Auricchio,Mol.Ther.(2002)6:490-494；Bennett,NatureMed.(1996)2:649-654,1996；Borras,ExperimentalEyeResearch(2003)76:643-652；Chaum,SurveyofOphthalmology(2002)47:449-469；Campochiaro,ExpertOpinionsinBiologicalTherapy(2002)2:537-544；Lai,GeneTherapy(2002)9:804813；Pleyer,ProgressinRetinalandEyeResearch(2003)22:277-293。

因此，眼用配制物可以任何适于眼内药物施用的形式施用，例如，适于局部施用的剂量形式、用于以滴眼剂施用的溶液或悬浮液、洗眼剂、通过注射、软膏、凝胶、脂质体分散液、胶体微粒悬浮液等等或在眼植入物(ocularinsert)中例如在任选为生物可降解的受控释放的聚合物基质中。眼内植入物在结膜、巩膜、玻璃体、眼前段或眼后段中植入。植入物提供配制物至眼表面的受控释放，通常在延长的时间段持续释放。此外，在实施方案中，配制物完全由天然存在和/或如由美国食品和药品管理局认为基本安全(GRAS(“GenerallyRegardedasSafe”))的组分组成。

可使用蛋白和核酸治疗的组合。举例来说，可将根据本发明的融合蛋白施用至患者。如果观察到最想要的响应，则可施用编码该融合蛋白的核酸分子用于长期效果。可替换地，蛋白和核酸可同时或大致同时施用。

剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。此外，可酌情对受试者施用很多次剂量。本领域的技术人员可轻易确定合适的剂量次数。

一些方面，本文描述的组合物可以本文描述的任何方法使用。

本发明的试剂盒

本发明还提供试剂盒。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含一个或多个容器，其包含纯化的白细胞介素受体、含有它的融合蛋白(例如免疫球蛋白融合蛋白)、编码它的重组载体或编码它的AAV病毒粒子/rAAV载体。在实施方案中，试剂盒包含眼用可接受的赋形剂。试剂盒还可包含适于眼内递送的递送装置。试剂盒可进一步包含关于试剂盒和其内容物用于本文所述任何方法的一套合适的说明、一般性书面说明。

试剂盒可包含在任何便利的、合适的包装中的组分。举例来说，如果提供的核酸、蛋白、载体或病毒粒子为干燥配制物(例如冻干或干粉)，通常可使用具有弹性塞的小瓶，进而所述载体可通过经由所述弹性塞注入流体来重悬。具有非弹性、可去除的封盖(例如密封玻璃)或弹性塞的安瓿也可用于液体配制物。也考虑与特定装置组合使用的包装。

说明一般包括信息，其涉及用于预期使用方法的剂量、给药方案和施用途径。容器可以是单位剂量、批量包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。在本发明的试剂盒中提供的说明通常是在标签或包装内页(例如，包括在试剂盒内的纸页)上的书面说明，但也考虑机器可读的说明(例如磁盘或光存储盘携带的说明)。

2.实验

下文是用于实施本发明的特定实施方案的实施例。提供实施例仅出于阐述目的而非意在以任何方式限制本发明的保护范围。

已作出努力来确保关于使用的数字的精确性(例如量、温度等)，但当然也应允许一些实验误差和偏差的存在。

材料和方法

人组织

人组织从NIH临床中心、JohnsHopkinsWilmerInstitute和MinnesotaEyeBank获得。

细胞和培养

在这些实施例中使用了ARPE-19和COS-7细胞(ATCC)。ARPE-19细胞在37℃用5％CO₂在补充了1％2mM的L-谷氨酰胺/100U/ml青霉素/0.1mg/ml链霉素(Sigma)的10％胎牛血清(FBS)DMEM/F12Ham’s(Invitrogen)中培养。对COS-7细胞进行相似培养，但在FBS/DMEM中。每2-3天通过传代20次将细胞胰蛋白酶化，在该时间点将细胞从冷冻保存物中重新接种。细胞在无抗生素的培养基中血清饥饿24h并用重组的IL17A或IL17F(R&DSystems)处理48h或用0.4mMH₂O₂处理45分钟。

动物

从近来发现为rd8等位基因纯合的C57BL/6N背景生成Ccl2^-/-/Cx3cr1^-/-/Crb1^rd8小鼠(Mattapallil等,InvestOphthalmolVisSci.(2012)53:2921-2927)。对共40只DKO/rd8小鼠的两次独立实验涉及AAV2.sIL17R注射入右眼如下文所述产生1.0x10⁹抗DNA酶颗粒(DRP)，和AAV2.EV注射入左眼(1.0x10⁹DRPs)以作为载体对照。六只小鼠接受了相同注射并用于蛋白免疫印迹。

可溶性载体构建和表征

包含人IL-17受体的胞外结构域的可溶性受体以符合读框的方式克隆至9-Gly接头，其后为使用鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子驱动的人IgG1的CH3区。质粒pCBA2-int-BGHsIL17R-9G-CH3描述于图4。

最终的IL-17r融合蛋白示于图2，且核苷酸和氨基酸序列示于图3A-3B(SEQIDNO:3和4)。如图2所示，IL-17r构建体编码可溶性IL-17r，包括人IL-17r的氨基酸1至317，由九个甘氨酸序列连接至CH3结构域，人IgG1C区的氨基酸225至330。制备构建体并如下文并入rAAV病毒粒子。

将可溶性IL17R/9gly/CH3克隆入质粒pCBA2(Xu等,HumGeneTher(2001)12:563-573)，其包含杂交的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(BGH多聚A)。将表达盒转至包含AAV2反向末端重复的前病毒质粒载体pAAVSP70(Ziegler等,MolTher(2004)9:231-240)。重组载体AAV2.sIL17R由用pAAVSP70.sIL17R和辅助质粒p5repΔCMVcap(Vincent等,JVirol(1997)71:1897-1905)和pHelper(Stratagene,LaJolla,CA,USA)三重转染293细胞产生。在空载体(AAV2.EV)中，来自α-1-抗胰蛋白酶的3.8kb内含子取代sIL17R。用碘克沙醇步骤梯度和在FPLC系统上的HiTrapHeparin柱(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)从细胞裂解物纯化载体(Vincent等,JVirol(1997)71:1897-1905；Zolotukhin等,Methods(2002)28:158-167。病毒载体滴度使用TaqManRT-PCR测定用特异性针对BGH多聚A的引物确定(ABIPrism7700；AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)。

对于sIL17R与IL17A的结合，用100μg/ml人IL17A或小鼠IL17A包被ELISA平板过夜，随后用1％BSA封闭。将系列两倍稀释的sIL17R一式三份添加至平板并在37℃温育1h。在ELISA平板洗涤器中从平板洗涤未结合的受体。将100μl生物素化的抗IL17RA(1μg/ml)添加至每孔并在室温温育1h且将多余的抗体洗走。每孔用链霉亲和素-HRP偶联物温育并洗涤。结合的HRP通过与TMBD底物温育20分钟随后添加酸终止溶液进行测量。在450nm测量OD。

如图5A和5B所示，受体与人和小鼠IL17A二者都结合。

定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)

将石蜡包埋的人眼切片显微切割。裂解细胞并使用ParadiseRNA分离试剂盒(AppliedBiosystems)提取RNA。对于ARPE-19细胞、COS-7细胞和DKO/rd8视网膜，使用Trizol(Qiagen)和氯仿/异戊醇提取总RNA。用SuperScriptII试剂盒(Invitrogen)制备cDNA。将SYBRGreen(Qiagen)引物用于人IL17A、人IL17RC、小鼠Il17a和小鼠Il17rc。将TaqMan基因表达测定(AppliedBiosystems)用于人IL8和小鼠Il6。通过2^-ΔΔCT计算表达倍数变化。

通过ELISA检测小鼠视网膜中的sIL17R

从麻醉小鼠取出眼并保存在-70℃直至测试。玻璃体和视网膜从冷冻的眼解剖并在ELISA试剂盒中提供的200μL裂解缓冲剂中均质化。未稀释的匀浆物通过离心澄清并使用人IL17RDuoset试剂盒(R&DSystems)对IL17R水平进行测定。

MTT测定

ARPE-19或COS-7细胞在96孔板上10％FBS中一式四份铺板(2x10⁴细胞/孔)并在37℃和5％CO₂温育24h。细胞在PBS中洗涤并血清饥饿24h，随后用1：10系列稀释的IL17A或IL17F处理48h。细胞在溶解于DMEM/F12中的0.5mg/mlMTT中温育4h。吸出后，添加DMSO并将平板置于暗处摇床上20分钟。在570nm(SynergyIIplatereader；Gen5software；BioTek)测量吸收并以未处理的细胞的吸收进行标准化。

共聚焦显微术

细胞或冷冻小鼠眼切片在4％的多聚甲醛中固定15分钟，在PBS中洗涤并在ICC缓冲液中用5％山羊或兔血清于4℃封闭30分钟。在4℃过夜进行一抗温育。二抗温育在室温持续1h并将载玻片在Vectashield荧光介质(VectorLabs)中固定，且在4℃暗处保存直至用OlympusFV1000共聚焦扫描显微镜成像。一抗包含CleavedCaspase-3(CellSignalingTechnology,1:200)、CleavedCaspase-9(SantaCruz,1:100)和NF-κBp65(CellSignalingTechnology,1:50)。二抗包含山羊抗兔IgG(1:400)、兔抗山羊IgG(1:400)和兔抗小鼠IgG(1:400)。用DAPI(1:1000)标记核。

鼠眼底镜检查和临床分级。

眼底镜检查在注射前和注射后2个月实施。将具有平行照明和观察通道的内窥镜连接至NikonD90数码相机。小鼠接受腹腔注射氯胺酮(1.4毫克/小鼠)和甲苯噻嗪(0.12毫克/小鼠)用于全身麻醉且局部接受1％托吡卡胺眼用溶液(AlconInc,FortWorth,TX)用于散瞳。

盲测观察员通过在2个月的时段比较相同眼底区如下指定病灶分级：

表1

A2E提取和定量

用氯仿/甲醇如先前所述提取A2E(Karan等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2005)102:4164-4169。简而言之，A2E([2,6-二甲基-8-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-1E,3E,5E,7E-辛四烯]-1-(2-羟乙基)-4-[4-甲基-6(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)1E,3E,5E,7E-己三烯]-吡啶)检测和定量通过液相色谱质谱使用具有Agilent1100LC系统(Agilent,Wilmington,DE)的QTRAP2000线性离子阱串联质谱仪(AppliedBiosystems/MDSSCIEX,Concord,Ontario,Canada)实施。使用80％至98％甲醇梯度在C18柱(Zorbax；Agilent)上以0.3ml/min流速分离A2E。使用外部A2E标准定量A2E。

组织病理学

对于亮视野显微术，眼在4％戊二醛中固定30分钟随后在10％福尔马林中1h。其随后包埋于甲基丙烯酸甲酯中并在垂直瞳孔-视神经面中系列切片。每只眼切片4次，用苏木精和伊红染色，并通过亮视野显微术分析。对于透射电子显微镜，小鼠眼在2.5％戊二醛和0.5％四氧化锇中固定，脱水并包埋于Spurr氏环氧树脂中。制备90nm切片并用醋酸铀和柠檬酸铅双染色，且使用JEOLJEM1010透射电子显微镜观察。

离体信号转导的蛋白免疫印迹检测。

如下在具有之前接受了AAV2.sIL17R或AAV2.EV的神经视网膜中用重组小鼠Il17a刺激之后测量了Erk1/2、p38和Akt的磷酸化。AAV2.sIL17R和AAV2.EV注射两周后，分离来自六只小鼠的神经视网膜并于37℃和5％CO₂中在1％BSA的PBS中培养2h。用50ng/ml重组小鼠Il17a(R&DSystems)处理神经视网膜0、5或15min。在RIPA和完全蛋白裂解缓冲液中分离蛋白裂解物，使用P200移液器匀质化并在冰上保持30min，伴随偶尔涡旋振荡。离心后(16,000rpm，30min，4℃)，使用BCA测定(Pierce)测量蛋白浓度。用10μg蛋白/泳道装载10％聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)并在125V运行1h。在300mA于4℃持续1小时实施至硝酸纤维素膜上的转移。在5％BSA中封闭膜1h并与一抗在4℃摇床上温育过夜。一抗包括磷酸化的和完整的-Erk1/2、磷酸化和完整的-Akt、磷酸化和完整的p38和GAPDH(CellSignalingTechnology)。膜与二抗山羊抗兔抗体(偶联至HRP(1:10,000))在室温温育45min。使用SuperSignalWestDura(Pierce)曝光膜。

统计学

使用非配对t检验评估细胞和患者qRT-PCR数据。对于小鼠qRT-PCR，临床眼底分数和A2E进行配对t检验。P<0.05确定为统计学显著性。

实施例1

由于AMD.IL17A导致的IL17A和IL17RC基因表达的眼内变化

在脉络膜扣状体和黄斑中研究了由于AMD.IL17A导致的IL17A和IL17RC基因表达的眼内变化，且仅在黄斑中使用上述方法检查了IL17RC。用GA和nAMD作用的脉络膜和黄斑都显著表达更高量的IL17A(图6A-6B)。IL17RC转录物在GA和nAMD黄斑中显著升高(图6C)。增加的基因表达通过与年龄匹配的健康供体相比在从AMD供体获得的眼部切片上针对IL17A和IL17RC蛋白两者加强的免疫反应性反映(图6D)。反之，在27例AMD和4例正常供体周边视网膜中通过qRT-PCR未检测到IL17A。在27例AMD周边视网膜的三例中检测到低IL17RC但表达显著少于黄斑区。IL17F，一种具有重叠功能的IL17A同源物(Ishigame等,Immunity(2009)30:108-119)，在患者黄斑中通过qRT-PCR未检测到。这些结果证明IL17通路的黄斑表达参与AMD的形成。

实施例2

IL17A对ARPE-19的影响

由于在AMD患者视网膜中增加的IL17A表达(图6A-6D)和其在慢性炎症中的作用，研究了IL17A对ARPE-19的影响，这是因为确信RPE细胞的死亡起始视网膜变性(Curcio等,InvestOphthalmol.Vis.Sci.(1996)37:1236-1249)。首先在ARPE-19中评估了IL17A信号转导，这是基于已报到ARPE-19经历典型的IL17相关信号传导(Chen等,MolVis(2011)17:3072-3077)，如核因子(NF)-κB核易位的诱导，但不表达IL17RA(Chen等,PLoSOne(2011)6:e18139)，一种必须的信号转导机制组分(Gaffen,S.L.,NatRevImmunol(2009)9:556-567)。在ARPE-19中，检测到了IL17RA蛋白并确认了IL17RA和IL17RC两者的组成型表达。随后，观察到NF-κB核易位(Gaffen,S.L.,NatRevImmunol(2009)9:556-567)且当IL17A刺激时测量IL8诱导。

为洞察IL17A对RPE细胞具有的影响，用IL17A处理ARPE-19细胞且持续注意到细胞发生生存力的降低。上面描述的MTT测定经由线粒体还原酶消失的活性测量降低的细胞生存力(图7)，表明IL17A损伤线粒体并激活凋亡。事实上，当一并将H₂O₂作为阳性对照评估时，IL17A诱导胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3的裂解。

为评估细胞损伤的程度，用透射电子显微镜将未处理细胞与暴露于IL17A的那些进行了比较。未处理细胞容纳有正常的线粒体、健康的胞质细胞器和完整的核膜。低剂量处理(1pg/mlIL17A)促进了胞质脂质小滴的积累。高剂量处理(10ng/mlIL17A)加剧了脂质积累、线粒体损伤、自噬体且最终导致细胞变性和凋亡。脂质积累让人联想到在AMD视网膜中观察到的脂褐素积累且是RPE变性的早期征兆，意味着RPE不能保持细胞内的稳态。通过MTT测定，用IL17F处理的ARPE-19细胞未经历细胞生存力的降低(图8)，但确实展示出胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9活性。然而，由于在AMD视网膜中仅检测到IL17A，因此确定这些影响在AMD形成中无关紧要。

实施例3

IL17A影响的细胞类型特异性

由于AMD未与任何目前识别的全身炎性疾病相关，所以假设IL17A的影响是细胞特异性的。用IL17A处理COS-7并未降低细胞生存力(图9A)。因此很有可能这些差异的发生是由于IL17A受体在COS-7中的较低表达。用qRT-PCR发现与ARPE-19相比COS-7表达较低的IL17RA和IL17RC(图9B)。这些数据证实了AMD黄斑组织中观察到的增强的受体表达很可能在赋予IL17A介导的组织损伤中是有帮助的。

实施例4

体内的IL17A和感光细胞及RPE变性

鉴于IL17A与AMD相关且在体外发现有害影响，假设Il17a信号传导在DKO/rd8小鼠中促成感光细胞和RPE变性。在野生型小鼠(C57BL/6N和C57BL/6J系)中视网膜Il17a表达随年龄线性增加，尽管DKO/rd8展示显著更大的增加(图10A)，反映了在AMD患者中测量出的模式(图6)。为将增加的Il17a表达归于Ccl2和Cx3cr1双重缺陷而非用于生成DKO/rd8的C57BL/6N系中的rd8等位基因(Mattapallil等,InvestOphthalmolVisSci.(2012)53:2921-2927)，将2月龄的DKO/rd8中的视网膜Il17a表达与年龄匹配的C57BL/6N进行了比较且在DKO/rd8中发现了高得多的表达(图11)。这些数据表明同源免疫病理机制驱动了具有AMD的人和DKO/rd8小鼠两者中的感光细胞和RPE病理。

为在DKO/rd8视网膜中抑制Il17a信号传导，对40只小鼠在2组独立试验中使用如上文制备的编码可溶性IL17受体的AAV2载体施用了玻璃体内注射(sIL17R,图5)。将编码sIL17R的载体注射入右眼并将空载体(EV)注射入左眼。注射后两个月，对眼在体内进行眼底评估并随后离体进行组织学和生物化学评估。在接受AAV2.sIL17R与接受AAV2.EV的眼的对比中，检测到显著更高的sIL17R蛋白，且在Il17a视网膜mRNA表达中未测量到变化。还观察到IL6中的非显著性降低(图12A-12C)。综上所述，这表明在接受AAV2.sIL17R的眼中存在sIL17R表达而在接受AAV2.EV的眼中不存在。

临床上，sIL17R视网膜展示相比其EV对应物的显著改进(图10B和图13)。sIL17R处理显著降低脂褐素荧光团A2E(一种来自全反式视网膜视觉周期通量的副产品和RPE应激的生物标志)(Ben-Shabat等,Bioorg.Med.Chem.Lett.(2001)11:1533-1540)的浓度(图10C)。组织病理学上，EV视网膜经历AMD样IS/OS/RPE变性病灶和rd8ONL萎缩性病灶，而sIL17R处理预防了IS/OS/RPE而非rd8相关损伤(图10D)。超微结构分析揭示了脂褐素和糖原沉积物在整个EVRPE的存在，未发现其中任一项在sIL17R眼中有显著的量(图10E)。该发现与在视网膜A2E浓度中测量到的降低平行且表明整体更加健康的RPE。RPE和线粒体的严重损伤仅在EV而非sIL17R眼中发现(图10E)。这些数据与之前的工作相一致，表明由于下调视网膜Il17a，抗炎症疗法在DKO/rd8中有效(Tuo等,JNeuroinflammation(2012)9:59。

实施例5

信号转导的改变

为鉴定反应机制，评估了信号转导中的改变。在人脂肪细胞中，IL17A诱导Akt和Erk1/2磷酸化(Zuniga等,JImmunol(2010)185:6947-6959)，而在ARPE-19中，细胞因子激活Erk1/2、p38、Akt和NF-κB(Chen等,MolVis(2011)17:3072-3077)。使用从用重组小鼠Il17a刺激的表达EV或sIL17R的DKO/rd8神经视网膜提取的裂解物离体分析MAPK和Akt磷酸化(图10F)。sIL17R对比EV视网膜在背景MAPK(Erk1/2和p38)以及在Akt磷酸化中存在降低，尽管sIL17R抑制Erk1/2和p38的激活。由于在EV神经视网膜中未诱导Akt，可以做出的结论是从Il17a并无直接输入。在EV对比sIL17R视网膜中评估了NF-κB核易位，但通过共聚焦显微术未检测到任何信号。由于这些数据并未排除NF-κB的参与，表明在焦视网膜变性中的MAPK依赖型机制。近来，在GAAMD组织中注意到增强的ERK1/2磷酸化且Erk1/2抑制在小鼠模型中拯救了RPE变性(Dridi等,ProcNatlAcadSciUSA(2012)109:13781-13786)。

有趣的是，测量到Il17rc视网膜表达的降低(图14A和14B)。该发现进一步表明Il17rc和视网膜变性间的相关性，与我们的患者数据相符。然而，用IL17A处理ARPE-19未诱导体内IL17RC表达。因此，IL17RC可为AMD或焦视网膜变性的诱因，或其可以是疾病的生物标记。

总之，发明人证明IL17A促成了视网膜病理。由于在DKO/rd8小鼠中，经由MAPK依赖性通路IL17A信号的阻断有效阻滞了感光细胞和RPE变性，判断IL17A信号传导直接介导焦视网膜变性且因此为用于治疗AMD进展的治疗靶标。

因此，本发明描述了用于治疗黄斑变性的方法，以及包含IL17r-免疫球蛋白融合蛋白的组合物。尽管在某些方面以对本发明例示性的实施方案进行了描述，可以理解的是在不脱离如本文限定的本发明的精髓和范围的前提下可以进行明显的变化。

Claims (63)

1.一种在哺乳动物受试者中治疗黄斑变性的方法，其包括将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至所述受试者的患病眼。

2.一种在哺乳动物受试者中治疗或降低视网膜变性的方法，其包括将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至受试者的患病眼。

3.权利要求2的方法，其中所述视网膜变性是焦视网膜变性(focalretinaldegeneration)。

4.权利要求2或3的方法，其中所述受试者具有黄斑变性。

5.一种在哺乳动物受试者中治疗或降低视网膜色素上皮细胞(RPE)变性、RPE应激或RPE损伤的方法，其包括将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至所述受试者的患病眼。

6.权利要求5的方法，其中所述受试者具有黄斑变性。

7.一种在哺乳动物受试者中治疗或降低感光细胞变性的方法，其包括将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至受试者的患病眼。

8.权利要求7的方法，其中所述感光细胞变性在感光细胞的内节(IS)中。

9.权利要求7或8的方法，其中所述感光细胞变性在感光细胞的外节(OS)中。

10.权利要求7-9任一项的方法，其中所述受试者具有黄斑变性。

11.一种在哺乳动物受试者患病眼中降低脂褐素或糖原沉积的方法，其包括将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至所述受试者的患病眼。

12.权利要求11的方法，其中所述受试者具有黄斑变性。

13.一种在哺乳动物受试者患病眼中降低[2,6-二甲基-8-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-1E,3E,5E,7E-辛四烯]-1-(2-羟乙基)-4-[4-甲基-6(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)1E,3E,5E,7E-己三烯]-吡啶(A2E)的方法，其包括将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至所述受试者的患病眼。

14.权利要求13的方法，其中所述受试者具有黄斑变性。

15.一种在哺乳动物受试者患病眼中治疗或降低线粒体损伤的方法，其包括将包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物施用至所述受试者的患病眼。

16.权利要求15的方法，其中所述受试者具有黄斑变性。

17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述组合物进一步包含眼用可接受的载剂。

18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述IL17抑制剂是能够结合并调节IL17活性的IL17受体。

19.权利要求1-17任一项的方法，其中所述IL17抑制剂是IL17A抑制剂。

20.权利要求19的方法，其中所述IL17A抑制剂包含能够结合并调节所述IL17A活性的IL17A受体。

21.权利要求18-20任一项的方法，其中所述IL17抑制剂是包含所述IL17受体和多聚化结构域的融合蛋白。

22.权利要求21的方法，其中所述多聚化结构域源自免疫球蛋白(Ig)重链。

23.权利要求21或22的方法，其中所述多聚化结构域源自免疫球蛋白(Ig)恒定区。

24.权利要求21-23任一项的方法，其中所述多聚化结构域源自免疫球蛋白(Ig)的Fc区。

25.权利要求21-24任一项的方法，其中所述多聚化结构域包含免疫球蛋白(Ig)的CH3。

26.权利要求21-25任一项的方法，其中所述多聚化结构域源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

27.权利要求21-26任一项的方法，其中所述多聚化结构域来自IgG1重链的恒定区。

28.权利要求21-27任一项的方法，其中当所述融合蛋白表达时，产生所述融合蛋白的多聚体。

29.权利要求1-17任一项的方法，其中所述重组载体编码融合蛋白，其包含：

(a)IL17A受体；和

(b)免疫球蛋白恒定区多聚化结构域，

其中当所述融合蛋白表达时，产生所述融合蛋白的多聚体。

30.权利要求29的方法，其中所述多聚化结构域包含IgG的CH3结构域或其活性片段。

31.权利要求29或30的方法，其中所述多聚化结构域来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

32.权利要求31的方法，其中所述多聚化结构域来自IgG1重链的恒定区。

32.权利要求28-32任一项的方法，其中所述多聚体是同型二聚体。

33.权利要求18-32任一项的方法，其中所述IL17受体是可溶性IL17受体。

34.权利要求21-32任一项的方法，其中所述融合蛋白包含图3B(SEQIDNO:4)的氨基酸序列或其活性变体，其中所述活性变体与图3B(SEQIDNO:4)所述序列具有至少90％序列同一性。

35.权利要求1-34任一项的方法，其中所述重组载体是重组病毒载体。

36.权利要求35的方法，其中所述重组病毒载体是病毒粒子。

37.权利要求36的方法，其中所述病毒粒子是重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子。

38.权利要求36的方法，其中所述病毒粒子是重组腺病毒。

39.权利要求1-38任一项的方法，其中所述黄斑变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)。

40.权利要求39的方法，其中所述黄斑变性是干性AMD。

41.权利要求1-40任一项的方法，其中所述组合物玻璃体内施用。

42.包含编码IL17抑制剂的多核苷酸的重组载体在制造用于治疗黄斑变性的药物中的用途。

43.权利要求42的用途，其中所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(a)所述IL17A受体；和

(b)免疫球蛋白恒定区多聚化结构域，

其中当所述融合蛋白表达时，产生所述融合蛋白的多聚体。

44.权利要求42或43任一项的用途，其中所述IL17受体是可溶性IL17受体。

45.权利要求44的用途，其中所述融合蛋白包含图3B(SEQIDNO:4)的氨基酸序列或其活性变体，其中所述活性变体与图3B(SEQIDNO:4)所述序列具有至少90％序列同一性。

46.一种用于治疗或降低患病眼中的黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤的组合物，其包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物。

47.一种用于治疗或降低患病眼中的黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤的组合物，其包含含有编码IL17抑制剂的核酸的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子。

48.权利要求47的组合物，其中所述rAAV病毒粒子是rAAV2病毒粒子。

49.包含编码IL17抑制剂的重组载体的组合物用于权利要求1-41任一项的方法中的用途。

50.一种包含含有编码IL17抑制剂的核酸的rAAV病毒粒子的组合物用于权利要求1-41任一项的方法中的用途。

51.权利要求50的组合物，其中所述rAAV病毒粒子是rAAV2病毒粒子。

52.一种编码IL17抑制剂的重组载体用于治疗或降低患病眼中的黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤的用途。

53.一种编码IL17抑制剂的重组载体用于权利要求1-41任一项的方法中的用途。

54.一种包含编码IL17抑制剂的核酸的rAAV病毒粒子用于治疗或降低患病眼中的黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤的用途。

55.一种包含编码IL17抑制剂的核酸的rAAV病毒粒子用于权利要求1-41任一项的方法中的用途。

56.一种包含权利要求46-51任一项的组合物的试剂盒。

57.一种包含权利要求52或53的重组载体的试剂盒。

58.一种包含权利要求54或5的rAAV病毒粒子的试剂盒。

59.权利要求56-58任一项的试剂盒，其进一步包含用于所述组合物、重组载体或rAAV病毒粒子在治疗或降低患病眼中的黄斑变性、RPE变性、RPE应激、RPE损伤、感光细胞变性、脂褐素或糖原沉积；患病眼中的A2E；或线粒体损伤中的使用说明。

60.一种包含权利要求46-51任一项的组合物的制品。

61.一种包含权利要求52或53的重组载体的制品。

62.一种包含权利要求54或55的rAAV病毒粒子的制品。