CN105622674A - 一类含有生物活性基团的四价铂配合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一类含有生物活性基团的四价铂配合物及其制备方法，所述的四价铂配合物即铂(IV)配合物，其结构如式II所示：式II中，Y为OH或Cl；Bio代表生物活性基团。所述的铂(IV)配合物，按照式III所示的反应式进行，式III中，Y为OH或Cl；Bio-OH代表具有生物活性的化合物，TBTU代表偶联试剂O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸，TEA代表催化剂三乙胺，DMF代表溶剂N，N-二甲基甲酰胺，DMSO代表溶剂二甲亚砜；采用顺铂为八面体底面，在一个轴向位置引入小分子靶向或药物活性基团，另一个轴向位置引入羟基或氯原子，提供具有克服顺铂耐药的抗肿瘤四价铂配合物，以期获得高效低毒的铂(IV)药物。

Description

一类含有生物活性基团的四价铂配合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗肿瘤四价铂配合物，具体涉及以顺铂骨架为四价铂配合物八面体结构的底面，在一轴向位置引入单个具有生物活性的基团，在另一轴向位置引入羟基或氯原子，得到一类具有抗肿瘤活性的铂(IV)配合物；本发明还涉及该类铂配合物的制备方法及应用。

背景技术

顺铂、卡铂和奥沙利铂等抗肿瘤二价铂药物已被广泛应用于临床，用于治疗相关的癌症。作为第一个在临床上使用的金属抗肿瘤药物，顺铂主要作用于DNA的鸟嘌呤N7位靶点，通过与DNA交联形成加合物，使肿瘤细胞发生凋亡，导致细胞停滞和细胞死亡。大量研究表明，顺铂触发癌细胞死亡主要包括四个阶段：(1)跨膜转运：通过主动扩散和被动吸收的方式产生细胞摄取；(2)水合离解：由于细胞内外氯离子的浓度差，容易形成铂(II)水合阳离子；(3)靶向迁移：铂(II)离子与DNA形成Pt-DNA加合物；(4)DNA损伤致死：通过作用于DNA，导致癌细胞的死亡。

根据上述机制，顺铂类药物在静脉注射后，到达肿瘤细胞之前，会与血液中的亲核物质如谷胱甘肽作用中毒失活。因此，现有顺铂类药物存在一些严重缺陷：一是表现出相应的毒性，主要是肾脏毒性和骨髓毒性；二是用药后产生的耐药性。这些不足在一定程度上限制了这些铂(II)药物的应用。

近年来的研究发现，铂(IV)配合物具有较好的稳定性，能够减少与体内亲核物质的反应，引入一定的轴向基团可以调节铂(IV)配合物亲水性和亲脂性，促进药物的吸收。铂(IV)离子在体内经还原生成铂(II)离子后，可与癌细胞DNA作用，如果在铂(IV)配合物的轴向引入生物活性基团，则可能与铂(II)离子产生协同抗肿瘤活性。因此，铂(IV)配合物作为抗肿瘤前药引起了人们广泛的关注。

铂(IV)配合物的构效关系见图1，主要包括以下几个方面：X离去基团配体主要影响化合物的反应动力学、毒性、溶解性；Am载体配体主要影响Pt-DNA加合方式和抗肿瘤活性；Y轴向配体主要决定药物的靶向性、生物活性和进入肿瘤细胞的能力，影响化合物的氧化还原性质，即在低氧的肿瘤组织中被还原的能力。因此，通过引入功能型轴向配体可以增加药物的靶向性和脂溶性，克服毒副作用，增加化合物的抗肿瘤活性。

尽管人们在铂(IV)药物研究方面开展了一些工作，设计和制备了多个类型的配合物，希望利用铂(IV)配合物的空间结构，获得高效低毒、与顺铂类药物无交叉耐药或具有选择性治疗作用的药物。但是迄今为止，目前还没有能够实现靶向或克服顺铂耐药的铂(IV)配合物作为药物上市。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于利用铂(IV)配合物的空间结构，采用顺铂为八面体底面，在一个轴向位置引入小分子靶向或药物活性基团，另一个轴向位置引入羟基或氯原子，提供具有克服顺铂耐药的抗肿瘤四价铂配合物，以期获得高效低毒的铂(IV)药物；本发明还提供了这些铂(IV)配合物的制备方法，以及它们在制备抗肿瘤药物上的应用。

技术方案：本发明是一类含有生物活性基团的四价铂配合物，所述的四价铂配合物即铂(IV)配合物，其结构如式II所示：

式II中，Y为OH或Cl；Bio代表生物活性基团。

本发明的一类含有生物活性基团的四价铂配合物的制备方法，所述的铂(IV)配合物，按照式III所示的反应式进行，

式III中，Y为OH或Cl；Bio-OH代表具有生物活性的化合物，TBTU代表偶联试剂O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸，TEA代表催化剂三乙胺，DMF代表溶剂N，N-二甲基甲酰胺，DMSO代表溶剂二甲亚砜；

具体采用如下方法：将等摩尔的反应物Bio-OH和偶联试剂TBTU于无水DMF或DMSO混合，在室温搅拌下，加入等摩尔的TEA，然后加入等摩尔的Pt(IV)反应物A或B，反应液于氮气保护下在30-60℃度下搅拌12-48小时，然后减压除去溶剂，浓缩液经硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷与甲醇混合溶剂，得到黄色固体产物；

Pt(IV)反应物A和B的结构如式IV表示，

其中A代表顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]，通过顺铂和双氧水在水中反应制备获得；B代表顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)Cl]，通过顺铂和氯代丁二酰亚胺在水中反应制备获得。

所述的Bio-OH代表具有生物活性的化合物结构由式I(a-f)所示，

其中，(a)为已知进入临床试验的靶向抗肿瘤药物silmitasertib，是一种蛋白激酶CK2抑制剂，简称为CX-OH；(b)为已知上市药物苯丁酸氮芥，是一种靶点为DNA的抗肿瘤药物，简称为CHL-OH；(c)为生物素，即维生素H，简称为BT-OH；(d)为具有抗氧化抗癌作用的天然产物香豆素的羧酸衍生物，简称为CUA-OH；(e)为具有抗氧化抗癌作用的天然产物香豆素的三氮唑羧酸衍生物，简称为CUT-OH；(f)为已知抗肿瘤药物SAHA的羧酸衍生物，是一种PARP抑制剂，简称为SAA-OH。

所述的CUT-OH的制备按式V所示的反应式进行，

制备CUT-OH采用如下制备方法：

l)将等摩尔的2，4-二羟基苯甲醛和乙酰甘氨酸及三倍量的乙酸钠加入乙酸酐中，搅拌回流4h，将反应液冷却至室温，倒入冰水中，得到黄色沉淀物，过滤，用冰水洗涤两次，干燥固体得中间体M1；

2)将M1加入浓盐酸∶乙醇为2∶1的混合溶液中，回流1h，将反应液冷却至室温，倒入冰水中，然后在冰浴条件下，缓慢加入二倍量的亚硝酸钠，加完搅拌15min后，再缓慢加入三倍量的叠氮化钠，继续搅拌15min，过滤出褐色沉淀，水洗，柱层析分离得中间体M2，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯为5∶1混合溶剂；

3)将M2悬浮于甲醇，加入等摩尔的丁-3-炔-1-醇和少量抗坏血酸钠，氮气保护下室温搅拌10min，再将溶于水的二倍量的五水硫酸铜加入到反应液中，室温避光搅拌4h，然后旋蒸除去反应液中的甲醇，加水析出黄色固体，过滤，所得固体用纯水洗涤两次，干燥得中间体M3；

4)将M3溶于DMF，加入二倍量的丁二酸酐和催化量的DMAP，50℃反应过夜，冷却至室温，浓缩反应液，柱层析分离得浅黄色产物，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇为10∶10∶1混合溶剂。

有益效果：

(一)、体外抗肿瘤活性

对所制备的化合物用人肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-116、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7与MDA-MB-231、卵巢癌细胞A2780、胰腺癌细胞PANC-1、胃癌细胞SGC-7901与顺铂耐药胃癌细胞SGC-7901/CCCP、脑胶质瘤细胞U87或神经胶质细胞瘤细胞U251进行了体外抗肿瘤活性评价，顺铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况。

含有靶向蛋白激酶CK2抑制剂基团CX的化合物1和2的实验数据见表2。化合物1对CK2高表达的癌细胞MCF-7、HepG2、HCT-116和A2780的活性优于顺铂2.5-4.5倍，对CK2中度表达的癌细胞SGC-7901或低表达的癌细胞PANC-1的抑制率与顺铂相近，值得注意的是该化合物对顺铂耐药癌细胞SGC-7901/CCCP有显著抑制作用，耐药因子为0.60。化合物2对CK2高、中表达的癌细胞的活性稍低于顺铂，但其对顺铂耐药癌细胞SGC-7901/CCCP也表示出显著的抑制作用，耐药因子达到0.24。表2数据表明靶向基团的引入使铂(IV)配合物较顺铂的抗肿瘤活性有明显提高，轴向含有羟基基团的化合物1比轴向含有氯原子的化合物2的活性较好。

含有靶点为DNA的CHL基团的化合物3的实验数据见表3。该化合物对所测癌细胞的活性与顺铂相当，它对顺铂耐药癌细胞SGC-7901/CCCP有一定的抑制作用，耐药因子为2.65。

含有生物素BT基团的化合物4和5的实验数据见表4。化合物4对所测的两个癌细胞的活性都低于顺铂，但化合物5对肝癌细胞HepG2和胃癌细胞SGC701比较敏感，细胞毒活性优于顺铂，特别是对顺铂耐药癌细胞SGC-7901/CCCP尤为敏感，其活性是顺铂的21倍，耐药因子为0.42。结果表明轴向含有羟基基团的化合物4比轴向含有氯原子的化合物5的活性较弱。

含有香豆素羧酸衍生物CUA基团的化合物6的实验数据也见表4。化合物6对所有测试的癌细胞的活性都高于顺铂，如针对结肠癌细胞HCT116的细胞毒活性是顺铂的30倍，对胃癌细胞SGC-7901的细胞毒活性是顺铂的23倍，对顺铂耐药胃癌细胞SGC-7901/CCCP的细胞毒活性是顺铂的19倍，但是其耐药因子为5.31。

含有香豆素的三氮唑羧酸衍生物CUT基团的化合物7的实验数据见表5。化合物7对人脑胶质瘤细胞U87和神经胶质细胞瘤细胞U251的活性都优于顺铂，细胞毒活性是顺铂的2-3倍。

含有PARP抑制剂SAA基团的化合物8的实验数据见表6。化合物8对所测试的癌细胞的活性与顺铂相当，有的稍强，有的稍弱，但其对顺铂耐药胃癌细胞SGC-7901/CCCP的细胞毒活性是顺铂的11倍，耐药因子为0.66。

以上结果表明，引入生物活性基团至顺铂为母体的铂(IV)配合物表现出有效的抗肿瘤活性。

(二)、体内抗肿瘤活性

用所制备的化合物1对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植肿瘤生长及作用进行了体内抗肿瘤活性评价，顺铂和CX-OH及其联合用药作为对照。

实验结果见表7(受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用)，图2为受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植瘤生长体积变化的影响，图3为受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用，图4为受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植瘤裸鼠体重的影响。由表7数据可知，化合物1的抑瘤率远高于等剂量的顺铂和CX-OH。与顺铂和CX-OH联合用药相比，化合物1的抑瘤率高于顺铂结合低频次给药的CX-OH联合用药，与顺铂结合高频次给药的CX-OH联合用药相当。如图2和图3所示，无论是移植瘤的体积还是重量数据，化合物1与顺铂结合高频次给药的CX-OH联合用药能够显著抑制裸鼠异种移植瘤生长，高于其它测试组。值得注意的是图4，化合物1对受试动物体重几乎没有影响，而顺铂及其与CX-OH联合用药对动物体重影响较大，说明化合物1的毒性较小，具有高效低毒的特点。

附图说明

图1.铂(IV)配合物的构效关系。

图2.受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植瘤生长体积变化的影响。

图3.受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用。

图4.受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植瘤裸鼠体重的影响。

具体实施方式

本发明所涉及的靶向或药物活性基团为已知具有生物活性的化合物或其衍生物，它们的结构由式I(a-f)所示，

其中，(a)为已知进入临床试验的靶向抗肿瘤药物(silmitasertib)，是一种蛋白激酶CK2抑制剂，简称为CX-OH；(b)为已知上市药物苯丁酸氮芥，是一种靶点为DNA的抗肿瘤药物，简称为CHL-OH；(c)为生物素，即维生素H(在许多肿瘤细胞中生物素受体过表达)，简称为BT-OH；(d)为具有抗氧化抗癌作用的天然产物香豆素的羧酸衍生物，简称为CUA-OH；(e)为具有抗氧化抗癌作用的天然产物香豆素的三氮唑羧酸衍生物，简称为CUT-OH；(f)为已知抗肿瘤药物SAHA的羧酸衍生物，是一种PARP抑制剂，简称为SAA-OH。

本发明所述的铂(IV)配合物，其结构如式II所示：

式II中，Y为OH或Cl；Bio代表生物活性基团，为式I(a-f)所示化合物结构的母体CX、BT、CHL、CUA、CUT或SAA；具体代表性化合物的结构如表1所示：

表1.代表性化合物1.8的结构

制备式II所示的铂(IV)配合物，根据式III所示的反应式进行，

式III中，Y为OH或Cl；Bio-OH代表式I(a-f)所示的化合物，如CX-OH、BT-OH、CHL-OH、CUA-OH、CUT-OH或SAA-OH；TBTU代表偶联试剂O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸，TEA代表催化剂三乙胺，DMF代表溶剂N，N-二甲基甲酰胺，DMSO代表溶剂二甲亚砜。

制备式II所述的铂(IV)配合物，采用如下制备方法：将等摩尔的反应物Bio-OH和偶联试剂TBTU于一定体积的无水DMF或DMSO混合，在室温搅拌下，加入等摩尔的TEA，然后加入等摩尔的Pt(IV)反应物A或B，反应液于氮气保护下在30-60℃度下搅拌12-48小时，然后减压除去溶剂，浓缩液经硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷与甲醇混合溶剂，得到黄色固体产物。

Pt(IV)反应物A和B的结构如式IV表示，

其中A代表顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]，按文献方法(Can.J.Chem.1982，60，529)通过顺铂和双氧水在水中反应制备获得；B代表顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)Cl]，按文献方法(Inorg.Chem.2014，53，9326)通过顺铂和氯代丁二酰亚胺在水中反应制备获得。

反应物Bio-OH中，CX-OH(J.Med.Chem.，2011，54，635)、CHL-OH(Anti-cancerDrugs，2006，17，511)、CUA-OH(ColloidPolym.Sci.2014，292，85)和SAA-OH(J.Med.Chem.，2010，53，1937)参照相应文献报道的方法制备；BT-OH为商品。

CUT-OH的制备按式V所示的反应式进行，

制备CUT-OH采用如下制备方法：

1.将等摩尔的2，4-二羟基苯甲醛和乙酰甘氨酸及三倍量的乙酸钠加入一定体积的乙酸酐中，搅拌回流4h，将反应液冷却至室温，倒入冰水中，得到黄色沉淀物，过滤，用冰水洗涤两次，干燥固体得中间体M1；

2.将M1加入浓盐酸和乙醇(2∶1)的混合溶液中，回流1h，将反应液冷却至室温，倒入冰水中，然后在冰浴条件下，缓慢加入二倍量的亚硝酸钠，加完搅拌15min后，再缓慢加入三倍量的叠氮化钠，继续搅拌15min，过滤出褐色沉淀，水洗，柱层析分离得中间体M2，洗脱液为石油醚和乙酸乙酯(5∶1)混合溶剂；

3.将一定量的M2悬浮于甲醇，加入等摩尔的丁-3-炔-1-醇和少量抗坏血酸钠，氮气保护下室温搅拌10min，再将溶于少量水的二倍量的五水硫酸铜加入到反应液中，室温避光搅拌4h，然后旋蒸除去反应液中的甲醇，加水析出黄色固体，过滤，所得固体用纯水洗涤两次，干燥得中间体M3；

4.将一定量的M3溶于DMF，加入二倍量的丁二酸酐和催化量的DMAP，50℃反应过夜，冷却至室温，浓缩反应液，柱层析分离得浅黄色产物，洗脱液为石油醚、乙酸乙酯和甲醇(10∶10∶1)混合溶剂。

按本发明方法制备的铂(IV)配合物经核磁氢谱和质谱确定了化合物的分子结构，有的化合物还经核磁碳谱进行了表征。化合物质谱中，准分子离子峰均出现铂元素的多个同位素峰。

表1所示代表性铂(IV)配合物对一些人肿瘤细胞具有显著的抑制作用，有的超过顺铂，特别是有的化合物对顺铂耐药癌细胞表现敏感，具有克服顺铂耐药的能力。这些癌细胞包括肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、脑胶质瘤和神经胶质细胞瘤细胞。化合物1的体内试验表明，含有靶向药物基团的四价铂配合物表现出高效低毒的抗肿瘤活性，可应用于制备抗癌药物。

本发明由下述实施例进一步的说明，但这些说明并不限制本发明。除特别指出外，一些反应物包括顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]和顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)Cl]都采用文献方法制备。

(一)、化合物的制备

实施例1.化合物1的制备

将157.4mg(0.45mmol)CX-OH和144.5mg(0.45mmol)TBTU溶于15mL无水DMF，室温搅拌10min，然后加入45.5mg(0.45mmol)TEA，继续搅拌5min后，再加入150.0mg(0.45mmol)顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]，氮气保护下50℃反应48h。浓缩反应液，浓缩液经硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇混合溶剂(10∶1)，得黄色产物79.9mg，产率40％。

¹HNMR(DMSO-d6，ppm)：δ4.23(s，6H)，7.13(d，J＝7.9，1H)，7.44(t，J＝8.0，1H)，7.97(d，J＝8.4，1H)，8.07(d，J＝8.6，1H)，8.27(m，2H)，8.46(t，J＝2.0，1H)，8.61(d，J＝5.9，1H)，8.82(d，J＝8.5，1H)，9.14(d，J＝5.9，1H)，9.7(s，1H)，10.2(s，1H).¹³CNMR(DMSO-d6，ppm)：δ116.73，119.53，120.53，122.58，122.75，122.92，124.37，124.54，127.26，128.69，130.46，132.10，142.27，143.66，147.92，148.10，150.46，167.57.ESI-MS：[M-H]⁺＝665.1.

实施例2.化合物2的制备

用反应物顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)Cl]替代顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]参照实施例1所述方法制备，得黄色产物，产率38％。

¹HNMR(DMSO-d6，ppm)：δ6.38(s，6H)，7.16(d，J＝8.1，1H)，7.49(t，J＝8.2，1H)，7.99(d，J＝8.4，1H)，8.08(d，J＝8.4，1H)，8.3(m，2H)，8.61(d，J＝5.6，1H)，8.85(d，J＝8.5，1H)，9.01(d，J＝5.6，1H)，9.7(s，1H)，10.2(s，1H).¹³CNMR(DMSO-d6，ppm)：δ116.87，119.53，120.52，121.85，122.29，122.60，124.28，125.38，127.58，128.77，130.62，133.28，135.44，142.40，143.48，147.77，148.22，150.41，173.19.ESI-MS：[M-H]⁺＝681.9

实施例3.配合物3的制备

将100.0mg(0.33mmol)CHL-OH溶于5mL无水DMF，加入105.6mg(0.33mmol)TBTU，室温搅拌5min，然后加入33.3mg(0.33mmol)TEA，继续再搅拌10min后，加入115.8mg(0.33mmol)顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)Cl]，氮气保护下室温反应24h。浓缩反应液，浓缩液经硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇混合溶剂(5∶1)，得到黄色固体95.7mg，产率为46％。

¹H-NMR(DMSO-d6，ppm)：δ1.67-1.72(2H，m)，2.19-2.24(2H，m)，2.45(2H，m)，3.69(8H，s)，6.02-6.35(6H，m)，6.64-6.67(2H，d)，7.02-7.05(2H，d).ESI-MS：[M+H]⁺＝637.9(100％)。

实施例4.配合物4的制备

将122.1mg(0.50mmol)BT-OH和160.5mg(0.50mmol)TBTU溶于10mL无水DMSO，室温搅拌15min，然后加入50.6mg(0.50mmol)TEA，继续搅拌15min后，再加入160.7mg(0.50mmol)顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]，氮气保护下60℃反应36h。浓缩反应液，浓缩液经硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇混合溶剂(5∶1)，得到黄色固体50.0mg，产率18％。

¹HNMR(DMSO-d6，ppm)：δδ1.34-1.48(m，6H)，2.18(t，2H)，2.60(s，1H)，2.80(m，1H)，3.10(s，1H)，4.14(s，1H)，4.31(s，1H)，5.94(m，6H)，6.32(d，2H).ESI-MS：[M-H]-＝559.1，[M+Cl]^-＝595.0.

实施例5.配合物5的制备

将134.0mg(0.55mmol)BT-OH和176.6mg(0.55mmol)TBTU溶于10mL无水DMSO，室温搅拌15min，然后加入55.7mg(0.55mmol)TEA，继续搅拌15min后，再加入193.9mg(0.55mmol)顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)Cl]，在氮气保护下40℃反应24h。浓缩反应液，浓缩液经硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇混合溶剂(5∶1)，得到黄色固体100.1mg，

产率：31％。

¹HNMR(DMSO-d6，ppm)：δ1.62-1.35(m，6H)，2.23(s，2H)，2.57(m，3H)，2.81，3.11，4.15(s，1H)，4.31(s，1H)，6.18-6.36(m，8H).¹³CNMR(DMSO-d6，ppm)：825.01，25.98，28.66，33.97，36.62，55.93，59.66，61.48，163.22，181.05.ESI-MS：[M-H]^-＝577.0.

实施例6.配合物6的制备

将110.0mg(0.50mmol)CUA-OH和160.5mg(0.50mmol)TBTU溶于20mL无水DMSO，室温搅拌15min，然后加入50.6mg(0.50mmol)TEA，继续搅拌15min后，再加入160.7mg(0.50mmol)顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]，在氮气保护下60℃反应48h。浓缩反应液，浓缩液经硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇混合溶剂(5∶1)，得到黄色固体50.0mg，产率：19％。

¹HNMR(DMSO-d6，ppm)：δ1.24(s，1H)，4.65(s，2H)，5.95(m，6H)，6.28(d，1H)，6.94(m，2H)，7.60(d，1H)，7.99(d，1H).ESI-MS：[M-H]^-＝535.0.

实施例7.配合物7的制备

将201.6mg(0.54mmol)CUT-OH和173.4mg(0.54mmol)TBTU溶于30mL无水DMF，室温搅拌10min，然后加入54.5mg(0.54mmol)TEA，继续搅拌10min后，再加入180.4mg(0.54mmol)顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]，氮气保护下50℃反应36h。反应液旋蒸除去溶剂后，浓缩液经柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇混合溶剂(5∶1)，得到黄色固体90.1mg，产率：24％。

¹HNMR(DMSO-d6，ppm)：δ2.45(4H，s)，3.02-3.05(2H，m)，4.28-4.31(2H，m)，5.82-5.93(6H，m)，6.30(1H，s)，6.46-6.48(1H，d)，7.39-7.41(1H，d)，8.25(1H，s)，8.29(1H，s).ESI-MS：[M-H]^-＝688.1.

实施例8.配合物8的制备

将77.8mg(0.31mmol)SAA-OH和100.2mg(0.31mmol)TBTU溶于15mL无水DMF，室温搅拌5min，然后加入31.6mg(0.31mmol)TEA，继续搅拌5min后，再加入110.2mg(0.31mmol)顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)Cl]，氮气保护下50℃反应12h。反应液旋蒸除去溶剂后，浓缩液经柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇混合溶剂(15∶1)，得到黄色固体57.9mg，产率：32％。

¹HNMR(DMSO-d6，ppm)：δ1.31(s，4H)，1.53(d，J＝28.7Hz，5H)，2.35-2.18(m，4H)，6.18(s，7H)，7.01(t，J＝6.9Hz，1H)，7.28(t，J＝7.6Hz，2H)，7.58(d，J＝7.8Hz，2H).¹³CNMR(DMSO-d6，ppm)：825.53，28.95，36.78，39.62，39.76，39.90，40.04，40.18，40.31，40.45，119.52，123.36，129.08，171.73.ESI-MS：[M-H]^-＝582.0.

实施例9.CUT-OH的制备

(1)M1和M2的制备

将2.76g(20mmol)2，4-二羟基苯甲醛、2.34g(20mmol)乙酰甘氨酸和4.92g(60mmol)乙酸钠加至100mL乙酸酐中，搅拌回流4h。冷却至室温，将反应液倒入冰水(约500mL)中，得到黄色沉淀物，过滤，用冰水洗涤2次，得到M1粗品。

将上述黄色固体置于反应瓶中，加入30mL浓盐酸和乙醇(2∶1)的混合溶液，回流1h。冷却至室温，将反应液倒入装有40mL冰水中。Z冰浴条件下，缓慢加入2.76g(40mmol)亚硝酸钠，加完搅拌15min，再缓慢加入3.90g(60mmol)叠氮化钠，继续搅拌15min，过滤出褐色沉淀，水洗，柱层析分离得中间体M21.51g，洗脱液为石油醚和乙酸乙酯(5∶1)混合溶剂，产率37％。

¹H-NMR(DMSO-d6，ppm)：δ6.76(d，1H)，6.79-6.82(dd，1H)，7.47-7.50(d，，1H)，7.59(s，1H)，10.51(s，1H).

(2)M3的制备

将500.0mg(2.46mmol)M2悬浮于10mL甲醇中，172.3mg(2.46mmol)丁-3-炔-1-醇和24.4mg(0.12mmol)抗坏血酸钠，氮气保护下室温搅拌10min，再将溶于2mL水的122.9mg(0.49mmol)五水硫酸铜加入到反应液中，室温避光搅拌4h，然后旋蒸除去反应液中的甲醇，加入10mL水析出黄色固体，过滤，固体用纯水洗涤两次，干燥得中间体M3604mg，产率90％。

¹H-NMR(DMSO-d6，ppm)：δ2.87-2.89(2H，m)，3.69-3.71(2H，m)，4.72(1H，s)，6.84(1H，s)，6.89-6.91(1H，d)，7.74-7.75(1H，d)，8.33(1H，s)，8.55(1H，s)，10.83(1H，s).ESI-MS：[M-H]^-＝272.1.

(3)产物的制备

将200.0mg(0.73mmol)M3溶于10mLDMF，加入146.5mg(1.46mmol)的丁二酸酐和催化量的DMAP，50℃反应过夜，冷却至室温，浓缩反应液，柱层析分离得浅黄色产物231mg，产率85％，洗脱液为石油醚、乙酸乙酯和甲醇(10∶10∶1)混合溶剂。

¹H-NMR(DMSO-d6，ppm)：δ2.42(4H，s)，3.04-3.08(2H，m)，4.30-4.34(2H，m)，6.85(1H，s)，6.89-6.92(1H，d)，7.73-7.76(1H，d)，8.40(1H，s)，8.57(1H，s)，10.87(1H，s)，12.15(1H，s).ESI-MS：[M-H]^-＝372.1.

(二)、化合物的体外细胞毒活性测试

实验方法：采用MTT方法对本发明的代表性化合物和顺铂药物进行了细胞毒活性测试。取对数生长期的细胞计数，接种于96孔培养板内，每孔约8000-10000个细胞。过夜培养，待细胞贴壁后进行给药，分别设给药组，阳性对照组和阴性对照组。待测的化合物用5％的葡萄糖水溶液或DMSO配制成贮液，临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度，其中DMSO的终浓度不超过4‰。每个浓度设3个复孔。加药后培养72小时，加20μl浓度为5mg/ml的MTT，37℃孵育4小时，去上清，加入150μl的DMSO溶解甲瓒。用酶标仪在490波长下测定每孔的OD值，并计算抑制率，做浓度-抑制率曲线计算IC₅₀值。

试验例1

测试了化合物1-2对人乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HCT-116、卵巢癌细胞A2780、胰腺癌细胞PANC-1、胃癌细胞SGC-7901和顺铂耐药胃癌细胞SGC-7901/CCCP的体外抗肿瘤活性，顺铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC₅₀值来评价药物的细胞毒活性，结果见表2。

表2.化合物1和2的细胞毒活性

*.RF：耐药因子＝耐药癌细胞IC₅₀值/正常癌细胞IC₅₀值。

**.nd：没有测定。

试验例2

测试了化合物3对人结肠癌细胞HCT-116、胃癌细胞SGC-7901和顺铂耐药胃癌细胞SGC-7901/CCCP的体外抗肿瘤活性，顺铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC₅₀值来评价药物的细胞毒活性，结果见表3。

表3.化合物3的细胞毒活性

*.RF：耐药因子＝耐药癌细胞IC₅₀值/正常癌细胞IC₅₀值。

试验例3

测试了化合物4.6对人结肠癌细胞HCT-116、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、胃癌细胞SGC-7901和顺铂耐药胃癌细胞SGC-7901/CCCP的体外抗肿瘤活性，顺铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC₅₀值来评价药物的细胞毒活性，结果见表4。

表4.化合物4-6的细胞毒活性

*.RF：耐药因子＝耐药癌细胞IC₅₀值/正常癌细胞IC₅₀值。

**.nd：没有测定。

试验例4

测试了化合物7对人脑胶质瘤细胞U87和神经胶质细胞瘤细胞U251的体外抗肿瘤活性，顺铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC₅₀值来评价药物的细胞毒活性，结果见表5。

表5.化合物7的细胞毒活性

试验例5

测试了化合物8对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7、结肠癌细胞HCT-116、胃癌细胞SGC-7901和顺铂耐药胃癌细胞SGC-7901/CCCP的体外抗肿瘤活性，顺铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC₅₀值来评价药物的细胞毒活性，结果见表6。

表6.化合物8的细胞毒活性

*.RF：耐药因子＝耐药癌细胞IC₅₀值/正常癌细胞IC₅₀值。

(三)、化合物的体内抗肿瘤活性测试

实验方法：采用裸鼠，评价受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。

受试动物：BALB/c裸小鼠，由上海灵畅生物科技有限公司提供。实验动物生产许可证：SCXK(沪)2013-0018，合格证编号：2013001812710，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2011-0036。日龄：6w，体重：18-20g，性别：雌性，动物数：每组5只，共35只。

药物及试剂：顺铂、化合物1和CX-OH，均用5％葡萄糖注射液超声溶解。

组别及给药方案如下：

模型对照组：尾静脉注射5％葡萄糖水，0.1ml/10g，每周一次，共给药3次；

化合物1(5mg/kg)：尾静脉注射5mg/kg药物溶液，0.1ml/10g，每周一次，共给药3次；

顺铂(5mg/kg)：尾静脉注射5mg/kg的药物溶液，0.1ml/10g，每周一次，共给药3次；

CX-OH(5mg/kg)：灌胃5mg/kg的药物溶液，0.1ml/10g，每周一次，共给药3次；

CX-OH(5mg/kg)：灌胃5mg/kg的药物溶液，0.1ml/10g，隔天一次，共给药11次；

顺铂+CX-OH(均为5mg/kg)：尾静脉注射顺铂溶液，灌胃CX-OH溶液，0.1ml/10g，均为每周一次，共给药3次；

顺铂+CX-OH(均为5mg/kg)：尾静脉注射顺铂溶液，0.1ml/10g，每周一次，共给药3次，灌胃CX-OH，0.1ml/10g，隔天一次，共给药11次；

试验例6

收集培养的人胃癌SGC-7901细胞悬液，浓度为1×10⁷个/ml，以每只0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，接种11天后，肿瘤生长至100-150mm³时将动物随机分组，每组5只。同时，各组裸鼠开始给药，给药方案见组别与给药方案，使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。实验结束后，随即处死裸鼠，手术剥取瘤块称重。

肿瘤体积(tumorvolume，TV)的计算公式为：TV＝1/2ab²，其中a、b分别表示长宽。

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume，RTV)，计算公式为：

RTV＝V_t/V₀，其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标：相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：

$T/C\left(\%\right)=\frac{T_{RTV}}{C_{RTV}}\×100$

其中，T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：模型组RTV。

抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％)，计算公式如下：

均值用X±SD表示，组间分析用t检验进行统计学处理，应用SPSS(StaffsticalPackagefortheSocialScience)17.0对结果进行统计分析。

表7.受试样品对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

Claims (4)

1.一类含有生物活性基团的四价铂配合物，其特征在于，所述的四价铂配合物即铂(IV)配合物，其结构如式II所示：

式II中，Y为OH或Cl；Bio代表生物活性基团。

2.一种如权利要求1所述的一类含有生物活性基团的四价铂配合物的制备方法，其特征在于，所述的铂(IV)配合物，按照式III所示的反应式进行，

式III中，Y为OH或Cl；Bio-OH代表具有生物活性的化合物，TBTU代表偶联试剂O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸，TEA代表催化剂三乙胺，DMF代表溶剂N，N-二甲基甲酰胺，DMSO代表溶剂二甲亚砜；

具体采用如下方法：将等摩尔的反应物Bio-OH和偶联试剂TBTU于无水DMF或DMSO混合，在室温搅拌下，加入等摩尔的TEA，然后加入等摩尔的Pt(IV)反应物A或B，反应液于氮气保护下在30-60℃度下搅拌12-48小时，然后减压除去溶剂，浓缩液经硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷与甲醇混合溶剂，得到黄色固体产物；

Pt(IV)反应物A和B的结构如式IV表示，

其中A代表顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]，通过顺铂和双氧水在水中反应制备获得；B代表顺，顺，反-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)Cl]，通过顺铂和氯代丁二酰亚胺在水中反应制备获得。

3.根据权利要求2所述的一类含有生物活性基团的四价铂配合物的制备方法，其特征在于，所述的Bio-OH代表具有生物活性的化合物结构由式I(a-f)所示，

其中，(a)为已知进入临床试验的靶向抗肿瘤药物silmitasertib，是一种蛋白激酶CK2抑制剂，简称为CX-OH；(b)为已知上市药物苯丁酸氮芥，是一种靶点为DNA的抗肿瘤药物，简称为CHL-OH；(c)为生物素，即维生素H，简称为BT-OH；(d)为具有抗氧化抗癌作用的天然产物香豆素的羧酸衍生物，简称为CUA-OH；(e)为具有抗氧化抗癌作用的天然产物香豆素的三氮唑羧酸衍生物，简称为CUT-OH；(f)为已知抗肿瘤药物SAHA的羧酸衍生物，是一种PARP抑制剂，简称为SAA-OH。

4.根据权利要求2所述的一类含有生物活性基团的四价铂配合物的制备方法，其特征在于，所述的CUT-OH的制备按式V所示的反应式进行，

制备CUT-OH采用如下制备方法：

1)将等摩尔的2，4-二羟基苯甲醛和乙酰甘氨酸及三倍量的乙酸钠加入乙酸酐中，搅拌回流4h，将反应液冷却至室温，倒入冰水中，得到黄色沉淀物，过滤，用冰水洗涤两次，干燥固体得中间体M1；

2)将M1加入浓盐酸∶乙醇为2∶1的混合溶液中，回流1h，将反应液冷却至室温，倒入冰水中，然后在冰浴条件下，缓慢加入二倍量的亚硝酸钠，加完搅拌15min后，再缓慢加入三倍量的叠氮化钠，继续搅拌15min，过滤出褐色沉淀，水洗，柱层析分离得中间体M2，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯为5∶1混合溶剂；

3)将M2悬浮于甲醇，加入等摩尔的丁-3-炔-1-醇和少量抗坏血酸钠，氮气保护下室温搅拌10min，再将溶于水的二倍量的五水硫酸铜加入到反应液中，室温避光搅拌4h，然后旋蒸除去反应液中的甲醇，加水析出黄色固体，过滤，所得固体用纯水洗涤两次，干燥得中间体M3；

4)将M3溶于DMF，加入二倍量的丁二酸酐和催化量的DMAP，50℃反应过夜，冷却至室温，浓缩反应液，柱层析分离得浅黄色产物，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇为10∶10∶1混合溶剂。