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CN105602901B - 生物反应器及其搅拌桨和使用其培养til细胞的方法 - Google Patents

生物反应器及其搅拌桨和使用其培养til细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养TIL细胞的方法。所述搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料，所述生物反应器含有其外包裹减小剪切力材料的搅拌桨，使用该生物反应器培养TIL细胞。本发明使用生物反应器培养TIL细胞，在搅拌桨外包裹可以减小剪切力的材料，可以降低细胞受到的剪切力伤害，有利于细胞大量扩增。本发明培养过程中不停的搅拌，为动态系统，有利于细胞进行气体交换和为细胞提供均一的培养环境，有利于细胞大量扩增。本发明方法不仅可以大量扩增TIL细胞，而且所得TIL细胞表面抗原表达量较高，对肿瘤细胞的杀伤活性较强。

Description

生物反应器及其搅拌桨和使用其培养TIL细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养TIL细胞的方法。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL细胞)是一群存在于肿瘤间质中的异质性淋巴细胞，TIL细胞对癌性胸、腹腔积液患者疗效显著。一般从肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中分离出的淋巴细胞经IL-2培养得到，其肿瘤杀伤活性为MHC限制性，即为自体肿瘤特异性杀伤细胞，具有CD3+CD8+或CD3+CD4+表面标志。
经测试TIL细胞的抗肿瘤效果是LAK的50～100倍，TIL细胞回输到体内血液及肿瘤中可以存留达两个月之久，因此它有着巨大的潜在临床治疗价值。目前，TIL细胞治疗被广泛应用于临床治疗，并取得良好效果。很多实验室开展的TIL细胞培养大多数为小规模培养，把从癌性胸腹水离心得到的细胞用密度梯度离心法分离得到TIL细胞，用含10％FBS的RPMI 1640培养基和IL-2接种到培养瓶中，通过添加IL-2促进TIL细胞在体外大量扩增，中分装到培养瓶中或者培养袋中扩增培养。
现有TIL细胞的培养规模小，操作复杂，步骤繁琐，扩增倍数低，所扩增得到的数量不够用于临床治疗，而且培养密度不能过高，浪费培养基，不利于节约成本和培养空间。此外表面抗原表达量低，杀伤效果差。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养TIL细胞的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种使用生物反应器培养TIL细胞的方法，搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料。
优选地，所述使用生物反应器培养TIL细胞的方法，包括以下步骤：
用X-VIVO 15培养基将PBMC按照1×106cells/ml的密度接种于培养瓶中，添加1％培养基体积的TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液，在37℃、5％CO2条件下培养，每2～3天补充适量的培养基和IL-2，当培养体系达到一定体积后，转入生物反应器中继续培养至两周；
所述TNF-α溶液的浓度为50～500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100～1000U/ml，OKT-3溶液的浓度为500～2000U/ml。
优选地，所述TNF-α溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，OKT-3溶液的浓度为500U/ml。
优选地，当培养体系大于500ml时，转入2L生物反应器中继续培养。
优选地，在生物反应器中培养TIL细胞的条件为：溶氧量为50％，pH7.2，搅拌速度为45rpm。
优选地，所述PBMC通过以下方法获得：
外周血和生理盐水按体积比1:1进行稀释得到血液稀释液，将其加至二分之一倍体积的淋巴细胞分离液上方，升降速调为0，800g离心30min，取单个核细胞层，用RPMI1640培养基清洗两次，用X-VIVO-15培养基重悬细胞即得PBMC。
一种生物反应器搅拌桨，所述搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。
一种生物反应器，所述生物反应器的搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。
优选地，所述减小剪切力的材料为医用硅胶管或食用橡胶管。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明使用生物反应器培养TIL细胞，在搅拌桨外包裹可以减小剪切力的材料，可以降低细胞受到的剪切力伤害，有利于细胞大量扩增。
2、本发明使用生物反应器培养TIL细胞，在培养过程中不停的搅拌，为动态系统，有利于细胞进行气体交换和为细胞提供均一的培养环境，有利于细胞大量扩增。
3、本发明使用生物反应器培养TIL细胞，在保证细胞质量的前提下，能够显著提高细胞培养密度，有利于节约培养基和培养空间。
4、本发明使用生物反应器培养TIL细胞，更接近人体内三维生长环境，与使用培养瓶、培养袋等细胞贴壁生长的培养方式相比，更利于细胞大量扩增，可以大规模培养TIL细胞，而且所得TIL细胞表面抗原表达量较高，对肿瘤细胞的杀伤活性较强。
附图说明
图1为各实施例和对比例培养的TIL细胞对HepG2细胞的杀伤活性结果。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
TIL细胞是PBMC在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。PBMC可以使用现有任何方法获得。本发明中PBMC通过以下方法制备：
把60ml外周血转移至离心管中，用生理盐水按体积比1:1进行稀释，得到血液稀释液；在一新离心管中加入淋巴细胞分离液，把血液稀释液缓慢添加至淋巴细胞液层上方，形成明显的分界线，其中，淋巴细胞分离液与血液稀释液的体积比为1：2；升降速调为0，800g离心30min，离心结束后，用巴氏吸管小心抽取单个核细胞层至另一新离心管中，往该离心管中添加RPMI1640培养基清洗细胞，300g离心5min，弃上清，再次添加RPMI1640培养基清洗细胞，300g离心5min，弃上清；用X-VIVO-15培养基重悬细胞得到PBMC悬液。取20μl PBMC悬液用台盼蓝染色法(台盼蓝与PBMC悬液体积比为1:1)进行计数。
实施例1
自2L生物反应器(购自北京元唐盛兴科技有限公司，美国BELLCO)中取出搅拌桨，在搅拌桨外套上医用硅胶管，紫外照射灭菌后，重新将搅拌桨装回生物反应器内。使用该生物反应器培养TIL的方法如下：
取2×107个PBMC，按照1×106cells/ml的密度用X-VIVO 15培养基接种于T75培养瓶中，添加TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液培养，TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液的添加量为培养基体积的1％。根据细胞的扩增情况，进行分瓶培养，当培养体系总量大于500ml时，将其转入2L生物反应器中，按照温度37℃，CO2通气量为5％，溶氧量为50％，pH为7.2，搅拌速度为45rpm的条件继续培养至两周，培养基为含1～10U/mlIL-2、0.5～5ng/mlTNF-α和5～20U/mlOKT-3的X-VIVO 15培养基。
所述TNF-α溶液的浓度为50～500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100～1000U/ml，OKT-3溶液的浓度为500～2000U/ml。本实施例中所述TNF-α溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，OKT-3溶液的浓度为500U/ml。
整个培养过程中观察并记录细胞生长情况，每2～3天进行细胞计数并补充适量的培养基、TNF-α、IL-2和OKT-3，使细胞密度为1×106cells/ml，培养体系中IL-2的浓度为1～10U/ml，TNF-α的浓度为0.5～5ng/ml，OKT-3的浓度为5～20U/ml。
对比例1
取2×107个PBMC，按照1×106cells/ml的密度用X-VIVO 15培养基接种于T75培养瓶中，添加TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液培养，TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液的添加量为培养基体积的1％。根据细胞的扩增情况，进行分瓶培养，当培养体系总量大于500ml时，将其转入2L培养中继续培养至两周，培养条件与实施例1相同。
所述TNF-α溶液的浓度为50～500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100～1000U/ml，OKT-3溶液的浓度为500～2000U/ml。本实施例中所述TNF-α溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，OKT-3溶液的浓度为500U/ml。
整个培养过程中观察并记录细胞生长情况，每2～3天进行细胞计数并补充适量的培养基、TNF-α、IL-2和OKT-3，使细胞密度为1×106cells/ml，培养体系中IL-2的浓度为1～10U/ml，TNF-α的浓度为0.5～5ng/ml，OKT-3的浓度为5～20U/ml。
对比例3
取2×107个PBMC，按照1×106cells/ml的密度用X-VIVO 15培养基接种于T75培养瓶中，添加TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液培养，TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液的添加量为培养基体积的1％。根据细胞的扩增情况，进行分瓶培养，当培养体系总量大于200ml时，则进行分瓶培养，每瓶培养体积不超过200ml，培养至两周。
所述TNF-α溶液的浓度为50～500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100～1000U/ml，OKT-3溶液的浓度为500～2000U/ml。本实施例中所述TNF-α溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，OKT-3溶液的浓度为500U/ml。
整个培养过程中观察并记录细胞生长情况，每2～3天进行细胞计数并补充适量的培养基、TNF-α、IL-2和OKT-3，使细胞密度为1×106cells/ml，培养体系中IL-2的浓度为1～10U/ml，TNF-α的浓度为0.5～5ng/ml，OKT-3的浓度为5～20U/ml。
效果实施例1
在各实施例、对比例培养结束后收集TIL细胞，采用台盼蓝染色法进行细胞计数，计算细胞的扩增倍数，结果如表1所示。
表1、TIL细胞扩增倍数表
组别 实施例1 对比例1 对比例2
增值倍数 344 187 101
细胞活力 96.7％ 96.2％ 95.3％
培养体积 1L 1L 1L
细胞密度 6.88×10<sup>7</sup>cells/ml 3.74×10<sup>6</sup>cells/ml 2.02×10<sup>6</sup>cells/ml
由表1可知，使用实施例1方法培养TIL细胞，扩增倍数高达344倍，对比例1扩增倍数为187倍，对比例2扩增倍数为101倍。所以，使用本发明方法培养TIL细胞可以大大提高TIL细胞的扩增倍数，细胞密度大，而且保持较高的细胞活力。
效果实施例2
在各实施例、对比例培养结束后收集TIL细胞，采用常规方法进行流式检测，考察TIL细胞的表面抗原CD3、CD4的表达情况，结果如表2所示。
表2、CD3+CD4+表达率表
组别 实施例1 对比例1 对比例2
CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>表达量 42.3％ 31.8％ 24.6％
由表2可知，使用实施例1方法培养得到的TIL细胞，其CD3+CD56+表达率为42.3％，而使用对比例1方法培养得到的TIL细胞的CD3+CD56+表达率为31.8％，用对比例2方法培养得到的TIL细胞的CD3+CD56+表达率为24.6％.所以，本发明方法培养得到的TIL细胞的表面抗原表达量较高。
效果实施例3
在各实施例、对比例培养结束后收集TIL细胞，采用乳酸脱氢酶释放法进行其对HepG2细胞的杀伤活性检测，结果如表3和图1所示。
表3、TIL细胞杀伤活性表
Figure BDA0000939868320000061
由表3和图1可知，本发明方法培养得到的TIL细胞对HepG2细胞的杀伤活性较高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种使用生物反应器培养TIL细胞的方法，其特征在于，搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料；包括以下步骤：
用X-VIVO 15培养基将PBMC按照1×106cells/ml的密度接种于培养瓶中，添加1%培养基体积的TNF-α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液，在37℃、5%CO2条件下培养，每2~3天补充适量的培养基和IL-2，当培养体系达到一定体积后，转入生物反应器中继续培养至两周；
所述TNF-α溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，OKT-3溶液的浓度为500U/ml；
所述减小剪切力的材料为医用硅胶管或食用橡胶管；
当培养体系大于500ml时，转入2L生物反应器中继续培养，
所述使用生物反应器培养TIL细胞的方法，在生物反应器中培养TIL细胞的条件为：溶氧量为50%，pH7.2，搅拌速度为45rpm。
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