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CN105555297A - Wnt组合物及纯化方法 - Google Patents

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CN105555297A
CN105555297A CN201480051425.3A CN201480051425A CN105555297A CN 105555297 A CN105555297 A CN 105555297A CN 201480051425 A CN201480051425 A CN 201480051425A CN 105555297 A CN105555297 A CN 105555297A
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CN
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mammal
polypeptide
cell
liposome
compositions
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CN201480051425.3A
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J·赫尔姆斯
G·达姆德赫瑞
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Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
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Publication date
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Abstract

本文公开了用于产生在骨缺损位点处使用的骨移植材料的方法、工艺、组合物及试剂盒，其利用含有脂质体Wnt多肽如脂质体Wnt3a多肽、脂质体Wnt5a多肽或脂质体Wnt10b多肽的组合物。本文还公开了用于强化哺乳动物骨髓细胞的方法、工艺、组合物及试剂盒，其利用含有脂质体Wnt多肽如脂质体Wnt3a多肽、脂质体Wnt5a多肽或脂质体Wnt10b多肽的组合物。

Description

WNT组合物及纯化方法
发明背景
Wnt蛋白形成了高度保守的分泌型信号传导分子的家族，其结合由Frizzled编码的细胞表面受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)。WNT基因家族由编码分泌型信号传导蛋白的结构相关的基因组成。这些蛋白已经涉及肿瘤发生和多种发育过程，包括细胞命运的调控和胚胎发育过程中的模式形成(patterning)。一旦结合，配体启动细胞内事件的级联反应，其最终导致靶基因通过β-连环蛋白和DNA结合蛋白TCF的核活性的转录(CleversH,2004Wntsignaling:Ig-norrinthedogma.CurrBiol14:R436-R437；Nelson&Nusse2004ConvergenceofWnt,beta-catenin,andcadherinpathways.Science303:1483-1487；Gordon&Nusse2006Wntsignaling:Multiplepathways,multiplereceptors,andmultipletranscriptionfactors.JBiolChern281:22429-22433)。
Wnt蛋白还涉及与骨发生程序相关的各种各样的细胞决定。例如，Wnt蛋白调控sox9的表达水平，其影响间叶祖细胞定型(commitment)至骨骼发生命运。Wnt蛋白影响细胞分化成成骨细胞或软骨细胞。在成体动物中，有证据证明Wnt信号传导调控骨量。例如，人Wnt共受体LRP5中的突变与多种高骨量综合征相关，包括I型骨质疏松和骨内膜骨质增生或常染色体显性骨硬化，以及低骨量疾病，骨质疏松-假神经胶质瘤。Wnt抑制剂Dkkl的产生增加与多发性骨髓瘤—以增加的骨再吸收作为其区别特征之一的一种疾病—相关。对于进一步的细节，参见S.Minear等,Wntproteinspromoteboneregeneration.Sci.Transl.Med.2,29ra30(2010)；和Zhao等,ControllingtheinvivoactivityofWntliposomes,MethodsEnzyrnol465:331-47(2009)。
发明内容
在某些实施方式中，本文公开了一种组合物，其包含功能活性Wnt3a多肽和包含脂质体的水性溶液，其中功能活性Wnt3a多肽包含在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处的脂质修饰。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽被整合到脂质体膜中。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽从脂质体膜突出到脂质膜的外表面上。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽未被引入到脂质体的水性核心中。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽的浓度在约5μg/μL和约15μg/μL之间或约8μg/μL和约12μg/μL之间。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃，约15℃至约25℃，或约20℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，脂质体在约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有0的净电荷。在一些实施方式中，磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。在一些实施方式中，脂质体还包含胆固醇。在一些实施方式中，DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。在一些实施方式中，Wnt3a多肽是哺乳动物Wnt3a多肽。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在一些实施方式中，脂质修饰是棕榈酰化。在一些实施方式中，Wnt3a多肽被进一步糖基化。在一些实施方式中，组合物是稳定的组合物。在一些实施方式中，组合物稳定最多约106天而没有实质活性损失。在一些实施方式中，组合物在约1℃和约8℃之间的温度下是稳定的。在一些实施方式中，组合物在氮气下稳定。
在某些实施方式中，本文公开了一种组合物，其包含功能活性哺乳动物Wnt多肽和包含脂质体的水性溶液，其中构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在某些实施方式中，本文还公开了一种组合物，其包含功能活性哺乳动物Wnt多肽和包含脂质体的水性溶液，其中构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt多肽被整合到脂质体膜中。在一些实施方式中，Wnt多肽从脂质体膜突出到脂质膜的外表面上。在一些实施方式中，Wnt多肽未被引入到脂质体的水性核心中。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽的浓度在约5μg/μL和约15μg/μL之间或约8μg/μL和约12μg/μL之间。在一些实施方式中，脂质体在约6.5和约8.0之间的pH下具有0的净电荷。在一些实施方式中，脂质体在约6.5和约8.0之间的pH下具有净的正电荷或净的负电荷。在一些实施方式中，磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。在一些实施方式中，脂质体还包含胆固醇。在一些实施方式中，DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在一些实施方式中，脂质修饰是棕榈酰化。在一些实施方式中，Wnt多肽被进一步糖基化。在一些实施方式中，组合物是稳定的组合物。在一些实施方式中，组合物稳定最多约106天而没有实质活性损失。在一些实施方式中，组合物在约1℃和约8℃之间的温度下稳定。在一些实施方式中，组合物在氮气下稳定。
在某些实施方式中，本文公开了一种制备脂质体Wnt3a多肽的方法，其包括：(a)从包含哺乳动物细胞的条件培养基收获Wnt3a多肽；(b)将Wnt3a多肽引入固定有磺化聚芳族化合物的离子交换柱；(c)用不连续梯度从离子交换柱洗脱Wnt3a多肽；和(d)将来自步骤(c)的Wnt3a多肽与脂质体水性溶液接触。在一些实施方式中，接触在约21℃和约25℃之间的温度下发生。在一些实施方式中，接触的时间在约30分钟和约24小时之间。在一些实施方式中，不连续梯度包括第一梯度和第二梯度。在一些实施方式中，第一梯度包括包含50mM氯化钾的缓冲溶液，并且第二梯度包括包含在约150mM和约1.5M之间的氯化钾的缓冲溶液。在一些实施方式中，缓冲溶液还包含洗涤剂。在一些实施方式中，洗涤剂是CHAPS或TritonX-100。在一些实施方式中，条件培养基包含最多10％胎牛血清。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方式中，在步骤(c)后，Wnt3a多肽的收率在约60％和约90％之间。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃，约15℃至约25℃，或约20℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，脂质体在约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有0的净电荷。在一些实施方式中，磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。在一些实施方式中，脂质体还包含胆固醇。在一些实施方式中，DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt3a多肽是哺乳动物Wnt3a多肽。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在一些实施方式中，条件培养基包含血清或血清代用品。在一些实施方式中，条件培养基包含血清。在一些实施方式中，血清是胎牛血清。在一些实施方式中，条件培养基中血清的浓度在约0.1％和约15％之间。在一些实施方式中，条件培养基包含血清代用品。在一些实施方式中，血清代用品是基于脂质的代用品。在一些实施方式中，条件培养基是无血清培养基。在一些实施方式中，脂质修饰是棕榈酰化。在一些实施方式中，Wnt3a多肽被进一步糖基化。在一些实施方式中，Wnt3a产物通过离心从样品混合物分离。在一些实施方式中，离心的时间在约1℃和约8℃之间的温度下为最多1小时。在一些实施方式中，离心后Wnt3a产物被重悬在无菌1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在一些实施方式中，Wnt3a产物在氮气下稳定。在一些实施方式中，Wnt3a产物在约1℃和约8℃之间的温度下稳定。
在某些实施方式中，本文公开了一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括将包含Wnt多肽的样品与脂质体水性溶液接触，其中构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在某些实施方式中，本文还公开了一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括将包含Wnt多肽的样品与脂质体水性溶液接触，其中构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，接触在约21℃和约25℃之间的温度下发生。在一些实施方式中，接触的时间在约6小时和约24小时之间。在一些实施方式中，该方法还包括在将Wnt多肽与脂质体水性溶液接触之前的额外纯化步骤。在一些实施方式中，额外纯化步骤是离子交换纯化步骤、疏水纯化步骤或亲或纯化步骤。在一些实施方式中，额外纯化步骤是离子交换纯化步骤。在一些实施方式中，离子交换纯化步骤包括将样品与磺化聚芳族化合物固定的珠或固定有磺化聚芳族化合物的柱接触。在一些实施方式中，离子交换纯化步骤包括不连续梯度。在一些实施方式中，离子交换纯化缓冲液包含洗涤剂。在一些实施方式中，洗涤剂是CHAPS或TritonX-100。在一些实施方式中，额外纯化步骤是疏水纯化步骤。在一些实施方式中，疏水纯化步骤包括蛋白A固定的珠或蛋白A柱。在一些实施方式中，在额外纯化步骤后，Wnt多肽的收率在约60％和约99％之间。在一些实施方式中，该方法还包括从包含来自表达细胞系的细胞的条件培养基收获Wnt多肽。在一些实施方式中，表达细胞系是哺乳动物表达细胞系。在一些实施方式中，哺乳动物表达细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。在一些实施方式中，条件培养基包含血清或血清代用品。在一些实施方式中，血清是胎牛血清。在一些实施方式中，条件培养基中血清的浓度在约0.1％和约15％之间。在一些实施方式中，条件培养基包含血清代用品。在一些实施方式中，血清代用品是基于脂质的代用品。在一些实施方式中，条件培养基是无血清培养基。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，脂质体在约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有0的净电荷。在一些实施方式中，磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。在一些实施方式中，脂质体还包含胆固醇。在一些实施方式中，DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。在一些实施方式中，Wnt多肽是哺乳动物Wnt多肽。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在一些实施方式中，脂质修饰是棕榈酰化。在一些实施方式中，Wnt多肽被进一步糖基化。在一些实施方式中，Wnt产物通过离心从样品混合物分离。在一些实施方式中，离心的时间在约1℃和约8℃之间的温度下为最多1小时。在一些实施方式中，离心后Wnt产物被重悬到无菌1XPBS中。在一些实施方式中，Wnt产物在氮气下稳定。在一些实施方式中，Wnt产物在约1℃和约8℃之间的温度下稳定。
在某些实施方式中，本文公开了一种分离的强化哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是啮齿动物骨髓细胞。在一些实施方式中，啮齿动物骨髓细胞从大于10月龄的啮齿动物收获。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是人骨髓细胞。在一些实施方式中，人骨髓细胞从处于或大于35岁的受试者获得。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。在一些实施方式中，增强的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。在一些实施方式中，在用脂质体Wnt多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞中降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。在一些实施方式中，细胞凋亡水平的降低为约50％。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。在一些实施方式中，增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。在一些实施方式中，新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。在一些实施方式中，与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，用脂质体Wnt多肽处理后的人骨髓细胞表现出在小于35岁的人受试者中观察到的生物标志物表达水平。在一些实施方式中，脂质体Wnt多肽包含Wnt多肽和脂质体水性溶液。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
在某些实施方式中，本文公开了一种从处于或大于35岁的人受试者获得的哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞表达选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。在一些实施方式中，增强的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。在一些实施方式中，在用脂质体Wnt多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞中降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。在一些实施方式中，细胞凋亡水平的降低为约50％。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。在一些实施方式中，增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。在一些实施方式中，新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。在一些实施方式中，与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，用脂质体Wnt多肽处理后的人骨髓细胞表现出在小于35岁的人受试者中观察到的生物标志物表达水平。在一些实施方式中，脂质体Wnt多肽包含Wnt多肽和脂质体水性溶液。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位点处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位点处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
在某些实施方式中，本文公开了一种通过包括将分离的哺乳动物骨髓细胞与脂质体Wnt多肽体外接触的方法产生的哺乳动物骨髓组合物，其中接触的时间在约30分钟和约4小时之间。在一些实施方式中，接触的温度在约0℃和约37℃或约20℃和约25℃之间。在一些实施方式中，该方法还包括在接触后的清洗步骤以除去游离的脂质体Wnt多肽。在一些实施方式中，该方法还包括将脂质体Wnt多肽移植到骨缺损位点。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，骨髓细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。在一些实施方式中，在用脂质体Wnt多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞中降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。在一些实施方式中，细胞凋亡水平的降低为约50％。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。在一些实施方式中，增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。在一些实施方式中，新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。在一些实施方式中，与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞从股骨、胫骨和/或髂嵴收获。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，分离的哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是啮齿动物骨髓细胞。在一些实施方式中，啮齿动物骨髓细胞从大于10月龄的啮齿动物收获。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是人骨髓细胞。在一些实施方式中，人骨髓细胞从处于或大于35岁的受试者收获。在一些实施方式中，用脂质体Wnt多肽处理后的人骨髓细胞表现出在小于35岁的受试者中观察到的生物标志物表达水平。在一些实施方式中，脂质体Wnt多肽包含Wnt多肽和脂质体水性溶液。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
在某些实施方式中，本文公开了一种处理受试者中的骨缺损的方法，其包括：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体Wnt3a多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体Wnt3a多肽；和(c)将脂质体Wnt3a多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。在一些实施方式中，接触的温度在约0℃和约37℃或约20℃和约25℃之间。在一些实施方式中，接触的时间在约30分钟和约4小时之间。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，骨髓细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。在一些实施方式中，在用脂质体Wnt3a多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞中降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。在一些实施方式中，细胞凋亡水平的降低为约50％。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。在一些实施方式中，增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。在一些实施方式中，新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。在一些实施方式中，与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞从股骨、胫骨和/或髂嵴收获。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，分离的哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是啮齿动物骨髓细胞。在一些实施方式中，啮齿动物骨髓细胞从大于10月龄的啮齿动物收获。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是人骨髓细胞。在一些实施方式中，人骨髓细胞从处于或大于35岁的受试者收获。在一些实施方式中，用脂质体Wnt3a多肽处理后的人骨髓细胞表现出在小于35岁的受试者中观察到的生物标志物表达水平。在一些实施方式中，脂质体Wnt3a多肽包含Wnt3a多肽和脂质体水性溶液。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
在某些实施方式中，本文公开了一种处理受试者中的骨缺损的方法，其包括：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体Wnt多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体Wnt多肽；和(c)将脂质体Wnt多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。在一些实施方式中，接触的温度在约0℃和约37℃或约20℃和约25℃之间。在一些实施方式中，接触的时间在约30分钟和约4小时之间。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，骨髓细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。在一些实施方式中，在用脂质体Wnt多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞中降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。在一些实施方式中，细胞凋亡水平的降低为约50％。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。在一些实施方式中，增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。在一些实施方式中，新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。在一些实施方式中，与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞从股骨、胫骨和/或髂嵴收获。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，分离的哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是啮齿动物骨髓细胞。在一些实施方式中，啮齿动物骨髓细胞从大于10月龄的啮齿动物收获。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是人骨髓细胞。在一些实施方式中，人骨髓细胞从处于或大于35岁的受试者收获。在一些实施方式中，用脂质体Wnt多肽处理后的人骨髓细胞表现出在小于35岁的受试者中观察到的生物标志物表达水平。在一些实施方式中，脂质体Wnt多肽包含Wnt多肽和脂质体水性溶液。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
在某些实施方式中，本文公开了一种用于产生包含脂质体Wnt多肽的骨移植材料的试剂盒。在一些实施方式中，脂质体Wnt多肽是包含功能活性哺乳动物Wnt多肽和含有脂质体的水性溶液的组合物，其中构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，脂质体Wnt多肽是包含功能活性哺乳动物Wnt多肽和含有脂质体的水性溶液的组合物，其中构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt多肽被整合到脂质体膜中。在一些实施方式中，Wnt多肽从脂质体膜突出到脂质膜的外表面上。在一些实施方式中，Wnt多肽未被引入到脂质体的水性核心中。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽的浓度在约5μg/μL和约15μg/μL之间或约8μg/μL和约12μg/μL之间。在一些实施方式中，脂质体在约6.5和约8.0之间的pH下具有0的净电荷。在一些实施方式中，脂质体在约6.5和约8.0之间的pH处具有净的正电荷或净的负电荷。在一些实施方式中，磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。在一些实施方式中，脂质体还包含胆固醇。在一些实施方式中，DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在一些实施方式中，脂质修饰是棕榈酰化。在一些实施方式中，Wnt多肽被进一步糖基化。在一些实施方式中，组合物是稳定的组合物。在一些实施方式中，组合物稳定最多约106天而没有实质活性损失。在一些实施方式中，组合物在约1℃和约8℃之间的温度下稳定。在一些实施方式中，组合物在氮气下稳定。
在某些实施方式中，本文公开了一种用于产生包含脂质体Wnt3a多肽的骨移植材料的试剂盒。在一些实施方式中，脂质体Wnt3a多肽是包含功能活性Wnt3a多肽和含有脂质体的水性溶液的组合物，其中功能活性Wnt3a多肽包含在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处的脂质修饰。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽被整合到脂质体膜中。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽从脂质体膜突出到脂质膜的外表面上。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽未被引入到脂质体的水性核心中。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，功能活性Wnt3a多肽的浓度在约5μg/μL和约15μg/μL之间或约8μg/μL和约12μg/μL之间。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃，约15℃至约25℃，或约20℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，脂质体在约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有0的净电荷。在一些实施方式中，磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。在一些实施方式中，脂质体还包含胆固醇。在一些实施方式中，DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。在一些实施方式中，Wnt3a多肽是哺乳动物Wnt3a多肽。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在一些实施方式中，脂质修饰是棕榈酰化。在一些实施方式中，Wnt3a多肽被进一步糖基化。在一些实施方式中，组合物是稳定的组合物。在一些实施方式中，组合物稳定最多约106天而没有实质活性损失。在一些实施方式中，组合物在约1℃和约8℃之间的温度下稳定。在一些实施方式中，组合物在氮气下稳定。
在某些实施方式中，本文公开了一种用于产生包含分离的强化哺乳动物骨髓细胞组合物的骨移植材料的试剂盒。在一些实施方式中，分离的强化哺乳动物骨髓细胞组合物是从处于或大于35岁的人受试者获得的哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞表达选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。在一些实施方式中，增强的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。在一些实施方式中，在用脂质体Wnt多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞中降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些实施方式中，骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。在一些实施方式中，细胞凋亡水平的降低为约50％。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。在一些实施方式中，增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。在一些实施方式中，新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。在一些实施方式中，与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些实施方式中，同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些实施方式中，用脂质体Wnt多肽处理后的人骨髓细胞表现出在小于35岁的人受试者中观察到的生物标志物表达水平。在一些实施方式中，脂质体Wnt多肽包含Wnt多肽和脂质体水性溶液。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
进一步的方面和实施方式从本公开的其余部分来看是明显的，并且包括在本发明之内。
附图说明
图1说明了本发明的纯化方案。
图2显示了Wnt3a的SDSPAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图3示例了质谱数据。
图4显示了L-Wnt3a的TEM表征。TEM被用来使L-Wnt3a可视化，并计算了囊泡的平均直径。
图5说明了人Wnt3a和L-Wnt3a活性的定量。在双光即用照度计(Berthold)上用三重读数来定量生物发光。从由Wnt3a蛋白的连续稀释产生的标准曲线确定人Wnt3a(ng/uL；A)和L-Wnt3a(B)的活性。
图6显示了L-Wnt3a在4℃下的稳定性。检查了脂质体-Wnt3a相互作用。脂质体Wnt3a(L-Wnt3a)在4℃下孵育最多48天。然后在LSL试验中测试人L-Wnt3a多肽的活性。L-Wnt3a多肽在48天测试期间未显示出活性损失。
图7显示了L-Wnt3a在23℃下的稳定性。
图8说明了L-Wnt3a在37℃下的稳定性。测试了人Wnt3a与DMPC：胆固醇脂质体的相关性以确定它是否为Wnt3a多肽提供了稳定性。使多个时间点的数据拟合单指数衰减，其示出了在10h后，L-Wnt3a在37℃下保留了其一半的活性(蓝线，图8A)，而Wnt3a在5min内损失其活性(红线，图8A)。人Wnt3a的活性损失是由于蛋白水解。在Wnt3a+CHAPS溶液中，可以在免疫印迹法中检测到较小分子量的条带(图8B)。L-Wnt3a制剂的免疫印迹没有检测到对应于Wnt3a的较小分子量的条带(图8C)。
图9示例了从在悬浮液中生长的细胞产生的人Wnt3a多肽与从在粘附培养物中生长的细胞产生的人Wnt3a多肽。
图10说明了人Wnt3a多肽分泌的多西环素浓度依赖性的诱导。多西环素以一系列浓度(ng/uL)添加到培养基，其影响由CHO细胞产生的人Wnt3a的量。
图11示例了胎牛血清被用于CHO细胞的人Wnt3a多肽分泌。
图12说明了随培养天数变化的CHO细胞的人Wnt3a多肽分泌。
图13说明了LSL细胞报告试验的稳健性、精密度、检测限和特异性。
图14说明了使用原代细胞的L-Wnt3a剂量-反应曲线。(A)在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，有效浓度的线性范围是0.025-0.1ng/μL人Wnt3a。(B)骨髓源干细胞中的L-Wnt3a活性，并测定了0.004-0.08ng/μL的有效浓度的线性范围。
图15说明了在不同脂质制剂下的人Wnt3a活性。DMPC和胆固醇脂质替换CHAPS以维持Wnt3a活性，但是用脂质如MPPC、DPPC、DMPS、DMPG和DMGE制造的脂质体是无活性的。
图16示例了蔗糖密度梯度。
图17示例了对于脂质体膜的人Wnt3a亲和性。Wnt3a/Frizzled结合亲和力为约3.6nM。Wnt3a/LRP6结合亲和力为约9nM。基于Wnt3a、Frizzled(Fz)和Lrp6之间的拉下试验(pull-downassay)，Wnt3a与脂质体膜之间的结合亲和力为约～6nM。
图18说明了人Wnt3a与脂质体相关性的动力学。
图19说明了与中性DMPC脂质体的Wnt5a和Wnt10b多肽结合。
图20说明了骨移植材料的单个组分。骨移植材料含有干细胞群和祖细胞群体。图20A-C显示了从大鼠股骨(图20A)、髂嵴(图20B)和胫骨(图20C)收获的BGM的Gomori染色。图20D是从所指出的来源新收获的大鼠BGM中成骨基因内源性表达的定量RP-PCR分析。图20E说明了实验设计的示意图，其中自体BGM被移植到大鼠的SRC中。图20F示例了在移植后第7天的髂嵴BGM的代表性组织切片，其被染色以检测BrdU掺入。虚线标示出BGM中包括的骨小梁碎片。图20G、图20H和图20I分别是Runx2、Sox9和PPAPγ表达。图20J示出了用苯胺蓝染色以检测类骨质基质的BGM的代表性组织切片；星号标示出与老的骨碎片(黄色虚线)相反的新骨基质。肾表面在该小图和图20G中用白色虚线标示。图20K是检测富蛋白聚糖软骨(红色)的番红O/固绿组织学，且图20L是检测脂肪细胞的Gomori三色染色。缩写：BrdU，溴脱氧尿苷；PPARγ，过氧物酶体增殖物激活蛋白γ。比例尺：50μm，星号：p<0.05。
图21说明骨移植材料是Wnt响应性的。图21A显示了Axin2CreERT2、R26mTmG小鼠中的GFP+ve细胞，其通过骨外膜的免疫染色而可视化，而图21B是骨内膜。图21C是指定的显微镜视野内GFP+ve细胞/总细胞的定量。图21D表明BGM中的GFP+ve细胞通过荧光来可视化。图21E是BGM年轻(绿色条)和BGM老年(灰色条)中内源性Axin2、Lef1和GAPDH表达的绝对定量RT-PCR结果。图21F说明了BGM年轻(绿色条)和BGM老年(灰色条)中的Wnt3a、总β连环蛋白、Axin2和β肌动蛋白的蛋白质印迹法分析。比例尺＝50μm。星号：p<0.05。
图22示出了BGM的成骨分化潜力随时间下降。图22A显示了BGM年轻(绿色条)和BGM老年(灰色条)中碱性磷酸酶、Osterix和骨钙蛋白表达的定量RT-PCR分析。图22B是被移植到SRC中并在明视野下可视化的从ACTB-eGFP小鼠收获的BGM，而图22C是使用荧光检测BGM中的GFP信号。图22D-E是来自BGM年轻(N＝5)(图22D)和BGM老年(N＝5)(图22E)的用苯胺蓝(小图)染色的代表性组织切片。虚线标示出肾表面。图22F显示了在移植后第7天，被BGM占据的总区域内苯胺蓝+ve像素的组织形态学分析。图22G-H显示了来自BGM年轻(N＝5)(图G)和BGM老年(N＝5)(图H)的进行染色以检测ALP活性的代表性组织切片。图22I显示了在移植后第7天，被BGM占据的总区域内ALP+ve像素的定量。图22J-K示出了来自BGM年轻(N＝5)(图22J)和BGM老年(N＝5)(图22K)的进行GFP的免疫染色的代表性组织切片。图22L示出了在移植后第7天，被BGM占据的总区域内GFP+ve像素的定量。缩写：ALP，碱性磷酸酶；Oc，骨钙蛋白。比例尺：100μm。星号：p<0.05；双星号：p<0.01。
图23示出了需要内源性Wnt信号的BGM成骨分化。图23A-B示出了用鼠IgG2αFc片段(Ad-Fc)(图23A)或表达可溶性Wnt拮抗剂Dkk1(Ad-Dkk1)的腺病毒(图23B)处理的BGM中对ALP活性染色的代表性组织切片。图23C-D示出了用Ad-Fc(图23C)或Ad-Dkk1(图23D)处理的BGM中对PPARγ免疫染色的代表性组织切片。图23E-F说明了用Ad-Fc(图23E)或Ad-Dkk1(图23F)处理的BGM中对Dlk1免疫染色的代表性组织切片。图23G-H说明了在接受用Ad-Fc(图23G)或Ad-Dkk1(图23H)处理的BGM的缺损位点处检测骨形成的微CT重建。原始缺损用红色虚线圆圈标示。图23I示出了从微CT数据±SEM计算的新骨体积(N＝5)。图23J-K显示了来自接受用Ad-Fc(图23J)或Ad-Dkk1(图23K)处理的BGM的缺损位点处的代表性组织切片上的苯胺蓝染色。图23L显示了使用组织形态学分析的新骨体积的定量。图23I-J是用Ad-Fc(图23I)或Ad-Dkk1(图23J)处理的BM移植物中的PPAR-γ表达。单个星号p<0.05。比例尺：A-B，200μm；C-F、J-K，50μm；G-H，2mm。
图24说明了BGM老年的人Wnt3a激活，及其成骨分化潜力的恢复。图24A显示了来自老年ACTB-eGFP小鼠的BGM，其用L-PBS或L-WNT3A(0.15μg/ml)处理1h，然后在24h后通过qRT-PCR分析靶基因表达，或者立即移植到SRC中7天。图24B说明了用L-PBS(灰色条)或L-WNT3A(蓝色条)处理的BGM老年中Axin2和Lef1表达的倍数变化。图24C是用L-PBS(灰色条)或L-WNT3A(蓝色条)处理的BGM老年中总β连环蛋白、Axin2和β肌动蛋白的蛋白质印迹法分析。在移植后第4天从SRC收获BGM老年后，对来自(图24D)L-PBS(N＝5)和(图24E)L-WNT3A的代表性组织切片进行BrdU掺入的染色。图24F显示了以骨移植物的中部为中心的显微镜视野内BrdU+ve像素的定量。图24G-H说明了来自L-PBS(N＝5)(图24G)和L-WNT3A(N＝5)(图24H)处理的样品的代表性组织切片，其在移植后第7天进行BrdU掺入的染色。图24I说明了上述BrdU+ve像素的定量。图24J-K说明了来自L-PBS(N＝5)(图24J)和L-WNT3A(N＝5)(图24K)处理的样品的代表性组织切片，其在移植后第7天进行Dlk1表达的免疫染色。图24L示出了在移植后第7天，被BGM占据的总区域内Dlk1+ve像素的定量。图24M-N示出了来自L-PBS(N＝5)(图24M)和L-WNT3A(N＝5)(图24N)处理的样品的代表性组织切片，其在移植后第7天进行Oc表达的免疫染色。图24O说明了如针对Dlk1所描述的Oc+ve像素的定量。图24P-Q示出了用苯胺蓝染色以检测L-PBS(N＝5)(图24P)和L-WNT3A(N＝5)(图24Q)处理的样品中的类骨质基质的代表性组织切片。图24R显示了新骨基质的组织形态学定量。缩写在本文中的其他部分加以描述。比例尺：100μm。星号：p<0.05；双星号：p<0.01。
图25说明了BGM干细胞的L-Wnt3a刺激以及脊柱融合的改善。图25A示出了在所指出的时间点用L-PBS或L-WNT3A在37℃下处理人MSC培养物，并使用Axin2表达的qPT-PCR来测定Wnt-响应。图25B示出了用L-PBS或L-WNT3A在37℃下处理鼠SSC达12h，并用Axin2表达的qRT-PCR分析Wnt响应。图25C说明了响应于L-PBS(虚线)或L-WNT3A(0,15μg/mL；蓝线)室温下1h孵育的Axin2和Lef1表达的定量绝对RT-PCR分析。数据表示为在24h时间段内，RNA拷贝/总RNA含量的比率。图25D-E显示了大鼠棘突经由最小的切口暴露，并且来自髂嵴的标准化体积的自体BGM用L-PBS或L-WNT3A处理1hr，然后移植到L4和L5椎骨的横突之间(图25E)。图25F-G显示了在手术后第2天(POD2)，对用L-PBS(图25F)和L-WNT3A(图25G)处理的移植物(粉色)进行微CT采集。图25H-I显示了在手术后第49天(POD49)，再次进行微CT采集以评估用L-PBS(灰色)(图25H)和L-WNT3A(蓝色)(图25I)处理的移植物的骨生长。图25J显示了对每个处理组绘图的以倍数体积表示的移植物生长，比较每个移植物在POD2时与POD9时的大小(由如上所述的颜色标示)。缩写：L4，腰椎#4；L5，腰椎#5；AP，顶突(apicalprocess)；SP，棘突；TP，横突；POD，手术后天。
图26说明了BGM体积的定量。从胫骨和股骨收获的BGM分成每个约～20μL的5个等分，然后评估DNA浓度作为定量细胞、基质和骨碎片的非均质混合物中细胞密度的手段。样品#1中的DNA浓度设定为100，并测定其他4个等分的相对DNA浓度。
图27说明了BGM的植入效率。L-Wnt3a处理改善了BGM植入效率。图27A-B说明了BGM老年(图27A)和BGMACT(图27B)在SRC中4d后的GFP免疫染色。图27C示出了在移植后第4天，被BGM占据的总像素上GFP+ve像素的定量。图27D-E示出了BGM老年(图27D)和BGMACT(图27E)在SRC中4d后的TUNEL染色。图27F示出了在移植后第4天，被BGM占据的总区域内总DAPI+ve像素上的TUNEL+ve细胞的定量。图27G-H示出了BGM老年(图27G)和BGMACT(图27H)在SRC中7d后的TUNEL染色。图27I示出了在移植后第7天，被BGM占据的总区域内总DAPI+ve像素上的TUNEL+ve细胞的定量。图27J-K说明了针对酒石酸盐抗性酸性磷酸酶(TRAP)活性染色的组织切片，以检测BGM老年(图27J)和BGMACT(图27K)在SRC中7d后的破骨细胞。图27L示出了在移植后第7天，被BGM占据的总区域内TRAP+ve像素的定量。比例尺＝100μm，**表示p<0.01。
具体实施方式
本文公开了用于产生脂质体Wnt多肽的组合物、方法、工艺及试剂盒。本文还公开了用于产生骨移植材料的组合物、方法、工艺及试剂盒。在一些实施方式中，组合物包含功能活性哺乳动物Wnt多肽和含有脂质体的水性溶液，其中构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，组合物包含功能活性哺乳动物Wnt多肽和含有脂质体的水性溶液，其中构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，组合物也包含功能活性Wnt3a多肽和含有脂质体的水性溶液，其中所述功能活性Wnt3a多肽包含在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处的脂质修饰。
在一些实施方式中，本文描述了一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括将包含Wnt多肽的样品与脂质体水性溶液接触的步骤，其中构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，本文描述了一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括将包含Wnt多肽的样品与脂质体水性溶液接触的步骤，其中构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，本文还描述了一种制备脂质体Wnt3a多肽的方法，其包括以下步骤：(a)从包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的条件培养基收获Wnt3a多肽；(b)将Wnt3a多肽引入固定有磺化聚芳族化合物的离子交换柱；(c)用不连续梯度从离子交换柱洗脱Wnt3a多肽；和(d)将来自步骤(c)的Wnt3a多肽与脂质体水性溶液接触。
在一些实施方式中，本文描述了一种分离的强化哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，本文还描述了从处于或大于35岁的人受试者获得的哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞表达选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。
在一些实施方式中，本文描述了一种通过包括将分离的哺乳动物骨髓细胞与脂质体Wnt多肽体外接触的步骤的方法产生的哺乳动物骨髓组合物，其中接触的时间在约30分钟和约4小时之间。
在一些实施方式中，本文描述了一种处理受试者中的骨缺损的方法，其包括以下步骤：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体Wnt多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体Wnt多肽；和(c)将脂质体Wnt多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。本文还描述了一种处理受试者中的骨缺损的方法，其包括以下步骤：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体Wnt3a多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体Wnt3a多肽；和(c)将脂质体Wnt3a多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。
在一些实施方式中，本文描述了一种产生骨移植材料的方法，其包括以下步骤：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体Wnt多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体Wnt多肽；和(c)将脂质体Wnt多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。本文还描述了一种产生骨移植材料的方法，其包括以下步骤：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体Wnt3a多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体Wnt3a多肽；和(c)将脂质体Wnt3a多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。
在一些方面，本文描述了包含至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％的SEQIDNO:1的功能活性Wnt3a多肽的组合物，所述功能活性Wnt3a多肽在Ser209处，或者在Cys77处无脂质修饰的情况下在非人哺乳动物Wnt3a多肽的对应的保守Ser处，或者在非人哺乳动物Wnt3a多肽的对应的保守Cys处被脂质修饰。在一些实施方式中，本文描述了包含至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％的除Wnt3A以外的功能活性人Wnt多肽的组合物，其在Wnt3ACys77的对应保守Cys处无脂质修饰的情况下，在对应于Wnt3Aser209的保守Ser处被脂质修饰。
在一些方面，Wnt多肽是Wnt3a或其功能活性变体。在其他方面，Wnt多肽是人Wnt3a或其功能活性变体。在又一个方面，Wnt多肽是SEQIDNO:1的Wnt3a或其功能活性变体。在进一步方面，脂质修饰是棕榈酰化。在其他方面，Wnt多肽是除Wnt3A以外的人Wnt蛋白，如Wnt1、Wnt2、Wnt2b(或Wnt13)、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(Wnt14或Wnt14b)、Wnt9b(Wnt14b或Wnt15)、Wnt10a、Wnt10b(或Wnt12)、Wnt11、Wnt-16a、Wnt-16b多肽或其功能活性变体。在一些实施方式中，多肽是Wnt5A或Wnt10b或其功能活性变体。在一些这样的实施方式中，Wnt多肽配置成脂质体，例如包含DMPC和/或胆固醇的脂质体。
在另一个方面，本文描述了用于纯化来自包括但不限于重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的哺乳动物细胞培养物的Wnt多肽的方法，其包括在不存在可选纯化步骤如凝胶过滤纯化步骤的情况下，使含有Wnt多肽的所述细胞的培养基经历采用例如在色谱柱(例如，蓝色琼脂糖离子交换柱)上的分离步骤的纯化。在一些实施方式中，纯化也在不存在硫酸肝素柱的纯化步骤的情况下进行。在另一个实施方式中，细胞是粘附的细胞，并且培养基还包含血清，如胎牛血清(FBS)。在进一步实施方式中，柱例如蓝色琼脂糖离子交换柱上的纯化使用150mM至1.5M的盐梯度进行，其中盐可以例如是氯化钠或氯化钾。在一些情况下，纯化方案之后是进一步的纯化步骤，例如使用预制脂质体，其可包含脂质，如例如90:10mol：mol比率的DPMC和/或胆固醇。在一些情况下，预制脂质体的使用利用了Wnt多肽的疏水性，并消除了对进一步的纯化步骤如凝胶过滤和/或硫酸肝素柱纯化步骤的需要。
当细胞是悬浮细胞时，培养可以在无血清条件下进行。在一些实施方式中，Wnt多肽可以是Wnt3a，如人Wnt3a，例如SEQIDNO:1的人Wnt3a或其功能活性变体；或者Wnt多肽可以是除Wnt3A以外的人Wnt多肽，例如Wnt1、Wnt2、Wnt2b(或Wnt13)、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(Wnt14或Wnt14b)、Wnt9b(Wnt14b或Wnt15)、Wnt10a、Wnt10b(或Wnt12)、Wnt11、Wnt-16a、Wnt-16b多肽或其功能活性变体。在一些实施方式中，多肽是Wnt5A或Wnt10b或者其功能活性变体。在进一步的方面，本发明涉及通过前述方法纯化的Wnt组合物。在一个实施方式中，Wnt组合物包含Wnt多肽，其是Wnt3a或其功能活性变体。在另一个实施方式中，Wnt组合物包含Wnt多肽，其是人Wnt3a或其功能活性变体。在又一个实施方式中，Wnt组合物包含Wnt多肽，其是SEQIDNO:1的人Wnt3a或其功能活性变体。
在一些方面，本文所描述的内容还包括用于产生骨移植材料的试剂盒，其包括脂质体Wnt多肽、脂质体Wnt3a多肽或分离的强化哺乳动物骨髓细胞组合物。
A.定义
在描述本方法之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法，因此其当然可以进行变化。还应理解本文所用术语仅出于描述特定实施方式的目的而非旨在作出限制，因为本发明的范围仅将受限于所附权利要求。
在提供一个值的范围的情况下，应理解，除非上下文明确另有说明的，在该范围的上下限之间的至下限的十分之一单位每个中间值及在所陈述的范围中的其他任何所陈述的或中间的值都包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在本发明涵盖的较小范围中，但需服从所陈述的范围中的任何具体排除的限制。也在本文中使用的，范围和量可以表述为“大约”的特定值或范围。大约还包括该精确量。因此，“约5μL”意味着“约5μL”以及“5μL”。通常，术语“约”包括预期在该量的±10％内的量。
除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员所通常理解的相同含义。Singleton等，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology，第2版，J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994)为本领域技术人员提供了许多本申请中使用的术语的一般指导。
Wnt多肽形成了高度保守的分泌型信号传导分子的家族，其在胚胎发生过程中调控细胞-细胞相互作用。术语“Wnt”或“Wnt基因产物”或“Wnt多肽”在本文中使用时包含天然序列Wnt多肽、Wnt多肽片段、嵌合Wnt多肽或前述种类的功能活性变体。术语“WNT”和“Wnt”在本文中可交换地使用。类似地，术语“WNT3A”、“WNT3a”、“Wnt3A”或“Wnt3a”在本文中可交换地使用。
“天然序列”多肽是具有与天然来源的Wnt多肽相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列多肽可以从产生内源Wnt蛋白的细胞分离或者可以通过重组或合成方法产生。因此，天然序列多肽可以具有例如天然存在的人多肽、鼠多肽、或者来自任何其他哺乳动物物种或来自非哺乳动物物种(例如果蝇、秀丽隐杆线虫(C.elegans)等)的多肽的氨基酸序列。在一些情况下，“天然序列”多肽还包括N末端甲硫氨酸。在一些情况下，它不包括N末端甲硫氨酸。
术语“天然序列Wnt多肽”包括但不限于哺乳动物Wnt多肽，例如人或鼠Wnt多肽。人Wnt多肽包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b(或Wnt13)、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(Wnt14或Wnt14b)、Wnt9b(Wnt14b或Wnt15)、Wnt10a、Wnt10b(或Wnt12)、Wnt11、Wnt-16a或Wnt-16b多肽。Wnt1可以由Genbank参考号NP005421.1和AAH74799.1指代。Wnt2可以由Genbank参考号NP003382.1和AAH78170.1指代。一般而言，Wnt2可以在脑、丘脑、胎儿和成体肺中、或在胎盘中表达。Wnt2B具有两种亚型，且它们的Genbank参考号分别为NP004176.2和NP078613.1。亚型1可以在成体心脏、脑、胎盘、肺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠和/或结肠中表达。在成体脑中，它主要在尾状核、底丘脑核和丘脑中发现。在一些情况下，它还在胎儿脑、肺和肾中检测到。亚型2可以在胎儿脑、胎儿肺、胎儿肾、尾状核、睾丸和/或癌症细胞系中表达。
Wnt3和Wnt3a在发育的神经管的形态发生期间的细胞-细胞信号传导中起到不同作用。Wnt3具有Genbank参考号AB060284.1(还参见GenBankNo.BAB61052.1和AAI03924.1)。Wnt3a具有SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列和SEQIDNO:2中所示的核酸序列。天然人Wnt3a氨基酸和核酸序列还在Genbank参考号NM_033131中公开，并且蛋白质序列在Genbank参考号NP_149122中公开。Wnt3a蛋白质前体具有Genbank参考号NP_149122.1。天然Wnt3a长度为352个氨基酸残基。它含有氨基酸残基1-18的信号肽。成熟蛋白质含有氨基酸残基19-352。如本文所用的对例如Wnt3A的Cys77或Ser209的引用是相对于SEQIDNO:1中所示全长序列作出的。在一些情况下，术语“天然人Wnt3a”多肽是指有或没有其N末端甲硫氨酸(Met)且有或没有天然信号序列的SEQIDNO:1的天然人Wnt3a多肽。
Wnt4具有Genbank参考号NP110388.2和BAC23080.1。Wnt5a具有Genbank参考号NP003383.1和NP003383.2。Wnt5b具有Genbank参考号BAB62039.1和AAG38659。Wnt6具有Genbank参考号NP006513.1和BAB55603.1。Wnt7a具有Genbank参考号NP004616.2和BAA82509.1。它可以在胎盘、肾、睾丸、子宫、胎儿肺、胎儿脑或成体脑中表达。Wnt7b具有Genbank参考号NP478679.1和BAB68399.1。它可以在胎儿脑、肺和/或肾，或者在成体脑、肺和/或前列腺中表达。Wnt8A具有至少两种可选转录物，Genbank参考号NP114139.1和NP490645.1。Wnt8B可以在前脑中表达。它具有Genbank参考号NP003384.1。Wnt10A具有Genbank参考号AAG45153和NP079492.2。Wnt10B在大部分成体组织中检测到，最高水平在心脏和骨骼肌中。它具有Genbank参考号NP003385.2。Wnt11可以在胎儿肺、肾、成体心脏、肝、骨骼肌和胰腺中表达。它具有Genbank参考号NP004617.2。Wnt14具有Genbank参考号NP003386.1。Wnt15可以在胎儿肾或成体肾中表达。它还可以在脑中表达。它具有Genbank参考号NP003387.1。Wnt16具有由可变剪接产生的两种亚型，Wnt-16a和Wnt-16b。亚型Wnt-16a可以在胰腺中表达。亚型Wnt-16b可以在外周淋巴器官，如脾、阑尾和淋巴结中，或者在肾中表达。然而，它不可能在骨髓中表达。Wnt16a和Wnt16b的Genbank参考号分别为NP476509.1和NP057171.2。所列举的全部GenBank、SwissProt和其他数据库序列都通过引用明确并入本文。
“变体”多肽是指具有与天然序列多肽小于100％的序列一致性的如下文所定义的功能活性多肽。这样的变体包括更长的多肽或更短的多肽，例如其中在天然序列的N或C末端处或在天然序列内增加一个或多个氨基酸残基；删除约1至300个氨基酸残基。变体多肽包括与天然多肽序列相比具有一个或多个氨基酸置换的多肽，或者多肽序列的衍生物，其中氨基酸残基被共价地修饰以使得所得产物具有非天然存在的氨基酸。
“功能活性”Wnt多肽(例如，Wnt3a多肽)保留了由天然序列Wnt多肽直接或间接地引起或执行的效应子功能。天然序列Wnt多肽的效应子功能包括β-连环蛋白的稳定化、干细胞更新的刺激、爪蟾动物帽试验(animalcapassay)中靶基因的C57MG转化和诱导、以及人畸胎癌细胞中的靶基因表达。纯化的Wnt组合物具有在多种治疗方法中的用途，包括干细胞的维持和生长、组织再生等。
在一些情况下，功能活性Wnt变体的氨基酸序列将具有与天然序列的Wnt多肽的至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％的氨基酸序列一致性。在一个实施方式中，天然序列的Wnt多肽是哺乳动物(例如，人)Wnt多肽，如Wnt3a。
术语“氨基酸”是指同时含有氨基和羧基的分子。适合的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体二者，以及通过有机合成或其他代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。本文所用术语氨基酸包括但不限于α-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。
术语“α-氨基酸”是指同时含有结合到命名为α-碳的碳上的氨基和羧基的分子。
术语“β-氨基酸”是指以β构型同时含有氨基和羧基的分子。
术语“天然存在的氨基酸”是指通常在自然界中合成的肽中发现，并通过单字母缩写A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V而为人所知的二十种氨基酸中的任何一种。
下表显示了天然氨基酸性质的总结：
“疏水性氨基酸”包括小的疏水性氨基酸和大的疏水性氨基酸。“小的疏水性氨基酸”是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及其类似物。“大的疏水性氨基酸”是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其类似物。“极性氨基酸”是丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸及其类似物。“带电的氨基酸”是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及其类似物。
术语“氨基酸类似物”是指结构上与氨基酸相似且可以在拟肽大环(peptidomimeticmacrocycle)的形成中替换氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于β-氨基酸以及其中氨基或羧基被相似反应性的基团替换(例如，用仲胺或叔胺替换伯胺，或者用酯替换羧基)的氨基酸。
术语“非天然氨基酸”是指不是通常在自然界中合成的肽中发现并通过单字母缩写A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V而为人所知的二十种氨基酸中的一种的氨基酸。非天然氨基酸或氨基酸类似物包括但不限于根据以下的结构：
氨基酸类似物包括β-氨基酸类似物。β-氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：环状β-氨基酸类似物；β-丙氨酸；(R)-β-苯丙氨酸；(R)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(R)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-五氟苯基丁酸；(R)-3-氨基-5-己烯酸；(R)-3-氨基-5-己炔酸；(R)-3-氨基-5-苯基戊酸；(R)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；(S)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(S)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氟苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(S)-3-氨基-5-己烯酸；(S)-3-氨基-5-己炔酸；(S)-3-氨基-5-苯基戊酸；(S)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；1,2,5,6-四氢吡啶-3-羧酸；1,2,5,6-四氢吡啶-4-羧酸；3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(2-噻吩基)-丙酸；3-氨基-3-(3-溴苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-甲氧苯基)-丙酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氨基己二酸；D-β-苯丙氨酸；β-亮氨酸；L-β-高丙氨酸；L-β-高天冬氨酸γ-苄基酯；L-β-高谷氨酸δ-苄基酯；L-β-高异亮氨酸；L-β-高亮氨酸；L-β-高甲硫氨酸；L-β-高苯丙氨酸；L-β-高脯氨酸；L-β-高色氨酸；L-β-高缬氨酸；L-Nω-苄基氧羰基-β-高赖氨酸；Nω-L-β-高精氨酸；O-苄基-L-β-高羟脯氨酸；O-苄基-L-β-高丝氨酸；O-苄基-L-β-高苏氨酸；O-苄基-L-β-高酪氨酸；γ-三苯甲基-L-β-高天冬酰胺；(R)-β-苯丙氨酸；L-β-高天冬氨酸γ-叔丁酯；L-β-高谷氨酸δ-叔丁酯；L-Nω-β-高赖氨酸；Nδ-三苯甲基-L-β-高谷氨酰胺；Nω-2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基-L-β-高精氨酸；O-叔丁基-L-β-高羟脯氨酸；O-叔丁基-L-β-高丝氨酸；O-叔丁基-L-β-高苏氨酸；O-叔丁基-L-β-高酪氨酸；2-氨基环戊烷羧酸；和2-氨基环己烷羧酸。
氨基酸类似物包括丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物。丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和亮氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲氧基甘氨酸；α-烯丙基-L-丙氨酸；α-氨基异丁酸；α-甲基-亮氨酸；β-(1-萘基)-D-丙氨酸；β-(1-萘基)-L-丙氨酸；β-(2-萘基)-D-丙氨酸；β-(2-萘基)-L-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-L-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-L-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-D-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-L-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-L-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-L-丙氨酸；β-氯-L-丙氨酸；β-氰基-L-丙氨酸；β-环己基-D-丙氨酸；β-环己基-L-丙氨酸；β-环戊烯-1-基-丙氨酸；β-环戊基-丙氨酸；β-环丙基-L-丙氨酸-OH.二环己基铵盐；β-叔丁基-D-丙氨酸；β-叔丁基-L-丙氨酸；γ-氨基丁酸；L-α,β-二氨基丙酸；2,4-二硝基-苯基甘氨酸；2,5-二氢-D-苯基甘氨酸；2-氨基-4,4,4-三氟丁酸；2-氟-苯基甘氨酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氟-缬氨酸；4,4,4-三氟-缬氨酸；4,5-脱氢-L-亮氨酸-OH.二环己基铵盐；4-氟-D-苯基甘氨酸；4-氟-L-苯基甘氨酸；4-羟基-D-苯基甘氨酸；5,5,5-三氟-亮氨酸；6-氨基己酸；环戊基-D-甘氨酸-OH.二环己基铵盐；环戊基-甘氨酸-OH.二环己基铵盐；D-α,β-二氨基丙酸；D-α-氨基丁酸；D-α-叔丁基甘氨酸；D-(2-噻吩基)甘氨酸；D-(3-噻吩基)甘氨酸；D-2-氨基己酸；D-2-二氢茚基甘氨酸；D-烯丙基甘氨酸-二环己基铵盐；D-环己基甘氨酸；D-正缬氨酸；D-苯基甘氨酸；β-氨基丁酸；β-氨基异丁酸；(2-溴苯基)甘氨酸；(2-甲氧基苯基)甘氨酸；(2-甲基苯基)甘氨酸；(2-噻唑基)甘氨酸；(2-噻吩基)甘氨酸；2-氨基-3-(二甲基氨基)-丙酸；L-α,β-二氨基丙酸；L-α-氨基丁酸；L-α-叔丁基甘氨酸；L-(3-噻吩基)甘氨酸；L-2-氨基-3-(二甲基氨基)-丙酸；L-2-氨基己酸二环己基-铵盐；L-2-二氢茚基甘氨酸；L-烯丙基甘氨酸.二环己基铵盐；L-环己基甘氨酸；L-苯基甘氨酸；L-炔丙基甘氨酸；L-正缬氨酸；N-α-氨基甲基-L-丙氨酸；D-α,γ-二氨基丁酸；L-α,γ-二氨基丁酸；β-环丙基-L-丙氨酸；(N-β-(2,4-二硝基苯基))-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-D-α,β-二氨基丙酸；(N-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-4-甲基三苯甲基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-烯丙基氧羰基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-D-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-L-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-4-甲基三苯甲基)-D-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-4-甲基三苯甲基)-L-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-烯丙基氧羰基)-L-α,γ-二氨基丁酸；D-α,γ-二氨基丁酸；4,5-脱氢-L-亮氨酸；环戊基-D-甘氨酸-OH；环戊基-甘氨酸-OH；D-烯丙基甘氨酸；D-高环己基丙氨酸；L-1-芘基丙氨酸；L-2-氨基己酸；L-烯丙基甘氨酸；L-高环己基丙氨酸；和N-(2-羟基-4-甲氧基-Bzl)-甘氨酸-OH。
氨基酸类似物包括精氨酸或赖氨酸的类似物。精氨酸和赖氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：瓜氨酸；L-2-氨基-3-胍基丙酸；L-2-氨基-3-脲基丙酸；L-瓜氨酸；赖氨酸(Me)2-OH；赖氨酸(N3)-OH；Nδ-苄氧羰基-L-鸟氨酸；Nω-硝基-D-精氨酸；Nω-硝基-L-精氨酸；α-甲基-鸟氨酸；2,6-二氨基庚二酸；L-鸟氨酸；(Nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-环己-1-亚基)乙基)-D-鸟氨酸；(Nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-环己-1-亚基)乙基)-L-鸟氨酸；(Nδ-4-甲基三苯甲基)-D-鸟氨酸；(Nδ-4-甲基三苯甲基)-L-鸟氨酸；D-鸟氨酸；L-鸟氨酸；精氨酸(Me)(Pbf)-OH；精氨酸(Me)2-OH(不对称的)；精氨酸(Me)2-OH(对称的)；赖氨酸(ivDde)-OH；赖氨酸(Me)2-OH.HCl；赖氨酸(Me3)-OH氯化物；Nω-硝基-D-精氨酸；和Nω-硝基-L-精氨酸。
氨基酸类似物包括天冬氨酸和谷氨酸的类似物。天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-D-天冬氨酸；α-甲基-谷氨酸；α-甲基-L-天冬氨酸；γ-亚甲基-谷氨酸；(N-γ-乙基)-L-谷氨酰胺；[N-α-(4-氨基苯甲酰基)]-L-谷氨酸；2,6-二氨基庚二酸；L-α-氨基辛二酸；D-2-氨基己二酸；D-α-氨基辛二酸；α-氨基庚二酸；亚氨基二乙酸；L-2-氨基己二酸；苏式-β-甲基-天冬氨酸；γ-羧基-D-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；γ-羧基-L-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；谷氨酸(OAll)-OH；L-Asu(OtBu)-OH；和焦谷氨酸。
氨基酸类似物包括半胱氨酸和甲硫氨酸的类似物。半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于半胱氨酸(法呢基)-OH，半胱氨酸(法呢基)-OMe，α-甲基-甲硫氨酸，半胱氨酸(2-羟乙基)-OH，半胱氨酸(3-氨丙基)-OH，2-氨基-4-(乙硫基)丁酸，丁硫氨酸，丁硫氨酸亚砜亚胺，乙硫氨酸，甲硫氨酸甲基锍氯化物，硒甲硫氨酸，磺基丙氨酸，[2-(4-吡啶基)乙基]-DL-青霉胺，[2-(4-吡啶基)乙基]-L-半胱氨酸，4-甲氧基苄基-D-青霉胺，4-甲氧基苄基-L-青霉胺，4-甲基苄基-D-青霉胺，4-甲基苄基-L-青霉胺，苄基-D-半胱氨酸，苄基-L-半胱氨酸，苄基-DL-高半胱氨酸，氨基甲酰基-L-半胱氨酸，羧乙基-L-半胱氨酸，羧甲基-L-半胱氨酸，二苯基甲基-L-半胱氨酸，乙基-L-半胱氨酸，甲基-L-半胱氨酸，叔丁基-D-半胱氨酸，三苯甲基-L-高半胱氨酸，三苯甲基-D-青霉胺，胱硫醚，高胱氨酸，L-高胱氨酸，(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸，硒-L-胱氨酸，胱硫醚，半胱氨酸(StBu)-OH，和乙酰胺基甲基-D-青霉胺。
氨基酸类似物包括苯丙氨酸和酪氨酸的类似物。苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸类似物的实例包括β-甲基-苯丙氨酸，β-羟基苯丙氨酸，α-甲基-3-甲氧基-DL-苯丙氨酸，α-甲基-D-苯丙氨酸，α-甲基-L-苯丙氨酸，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸，2,4-二氯-苯丙氨酸，2-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸，2-(三氟甲基)-L-苯丙氨酸，2-溴-D-苯丙氨酸，2-溴-L-苯丙氨酸，2-氯-D-苯丙氨酸，2-氯-L-苯丙氨酸，2-氰基-D-苯丙氨酸，2-氰基-L-苯丙氨酸，2-氟-D-苯丙氨酸，2-氟-L-苯丙氨酸，2-甲基-D-苯丙氨酸，2-甲基-L-苯丙氨酸，2-硝基-D-苯丙氨酸，2-硝基-L-苯丙氨酸，2；4；5-三羟基-苯丙氨酸，3,4,5-三氟-D-苯丙氨酸，3,4,5-三氟-L-苯丙氨酸，3,4-二氯-D-苯丙氨酸，3,4-二氯-L-苯丙氨酸，3,4-二氟-D-苯丙氨酸，3,4-二氟-L-苯丙氨酸，3,4-二羟基-L-苯丙氨酸，3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸，3,5,3′-三碘-L-甲状腺原氨酸，3,5-二碘-D-酪氨酸，3,5-二碘-L-酪氨酸，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸，3-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸，3-(三氟甲基)-L-苯丙氨酸，3-氨基-L-酪氨酸，3-溴-D-苯丙氨酸，3-溴-L-苯丙氨酸，3-氯-D-苯丙氨酸，3-氯-L-苯丙氨酸，3-氯-L-酪氨酸，3-氰基-D-苯丙氨酸，3-氰基-L-苯丙氨酸，3-氟-D-苯丙氨酸，3-氟-L-苯丙氨酸，3-氟-酪氨酸，3-碘-D-苯丙氨酸，3-碘-L-苯丙氨酸，3-碘-L-酪氨酸，3-甲氧基-L-酪氨酸，3-甲基-D-苯丙氨酸，3-甲基-L-苯丙氨酸，3-硝基-D-苯丙氨酸，3-硝基-L-苯丙氨酸，3-硝基-L-酪氨酸，4-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸，4-(三氟甲基)-L-苯丙氨酸，4-氨基-D-苯丙氨酸，4-氨基-L-苯丙氨酸，4-苯甲酰基-D-苯丙氨酸，4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸，4-双(2-氯乙基)氨基-L-苯丙氨酸，4-溴-D-苯丙氨酸，4-溴-L-苯丙氨酸，4-氯-D-苯丙氨酸，4-氯-L-苯丙氨酸，4-氰基-D-苯丙氨酸，4-氰基-L-苯丙氨酸，4-氟-D-苯丙氨酸，4-氟-L-苯丙氨酸，4-碘-D-苯丙氨酸，4-碘-L-苯丙氨酸，高苯丙氨酸，甲状腺氨酸，3,3-二苯丙氨酸，甲状腺原氨酸，乙基-酪氨酸，和甲基-酪氨酸。
氨基酸类似物包括脯氨酸的类似物。脯氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于3,4-脱氢-脯氨酸，4-氟-脯氨酸，顺-4-羟基-脯氨酸，四氢噻唑-2-羧酸，和反-4-氟-脯氨酸。
氨基酸类似物包括丝氨酸和苏氨酸的类似物。丝氨酸和苏氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于3-氨基-2-羟基-5-甲基己酸，2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸，2-氨基-3-乙氧基丁酸，2-氨基-3-甲氧基丁酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，2-氨基-3-苄氧基丙酸，2-氨基-3-苄氧基丙酸，2-氨基-3-乙氧基丙酸，4-氨基-3-羟基丁酸，和α-甲基丝氨酸。
氨基酸类似物包括色氨酸的类似物。色氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-色氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-D-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-L-丙氨酸；1-甲基-色氨酸；4-甲基-色氨酸；5-苄氧基-色氨酸；5-溴-色氨酸；5-氯-色氨酸；5-氟-色氨酸；5-羟基-色氨酸；5-羟基-L-色氨酸；5-甲氧基-色氨酸；5-甲氧基-L-色氨酸；5-甲基-色氨酸；6-溴-色氨酸；6-氯-D-色氨酸；6-氯-色氨酸；6-氟-色氨酸；6-甲基-色氨酸；7-苄氧基-色氨酸；7-溴-色氨酸；7-甲基-色氨酸；D-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-羧酸；6-甲氧基-1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-1-羧酸；7-氮杂色氨酸；L-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-羧酸；5-甲氧基-2-甲基-色氨酸；和6-氯-L-色氨酸。
在一些实施方式中，氨基酸类似物是外消旋的。在一些实施方式中，使用氨基酸类似物的D异构体。在一些实施方式中，使用氨基酸类似物的L异构体。在其他实施方式中，氨基酸类似物包含R或S构型的手性中心。在又一些实施方式中，β-氨基酸类似物的氨基被保护基团替换，例如叔丁氧羰基(BOC基团)、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、甲苯磺酰基等。在又一些实施方式中，β-氨基酸类似物的羧酸官能团被保护，例如作为其酯衍生物。在一些实施方式中，使用氨基酸类似物的盐。
“非关键”氨基酸残基是可以从多肽的野生型序列进行改变而不消除或实质性改变其基本的生物学或生物化学活性(例如，受体结合或激活)的残基。“关键”氨基酸残基是在从多肽的野生型序列进行改变时导致消除或实质性消除多肽的基本生物学或生物化学活性的残基。
“保守的氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如K、R、H)、酸性侧链(例如D、E)、不带电荷的极性侧链(例如G、N、Q、S、T、Y、C)、非极性侧链(例如A、V、L、I、P、F、M、W)、β-支链侧链(例如T、V、I)和芳族侧链(例如Y、F、W、H)的氨基酸。因此，多肽中所预测的非关键氨基酸残基被例如来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基代替。可接受的置换的其他实例是基于电子等排的考虑(例如，正亮氨酸置换甲硫氨酸)或其他性质(例如，2-噻吩基丙氨酸置换苯丙氨酸，或者6-Cl-色氨酸置换色氨酸)的置换。
B.详细描述
Saitoh等,BiochemBiophysResCommun,2001,29；284(5):1168-75描述了Wnt3a的分子克隆和表征。天然人Wnt3a是由352个氨基酸组成(SEQIDNO:1)的脂质修饰的生长因子，其在激活干细胞或刺激它们的自我更新中有效。在一些情况下，由于其疏水性特征，活性Wnt3a多肽或其他Wnt多肽难以在可放大的水平下纯化到同质。在一个方面，本文描述了一种用于纯化Wnt多肽的方法。在一些情况下，纯化方法改善了人Wnt多肽的纯度和收率。在一些实施方式中，纯化的Wnt多肽作为治疗方案的部分使用。在一些实施方式中，纯化的Wnt多肽作为治疗性多肽使用。
如本文其他部分所描述的，Wnt多肽形成了高度保守的分泌型信号传导分子家族。Wnt多肽可以是哺乳类动物的，例如人Wnt多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b(或Wnt13)、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(Wnt14或Wnt14b)、Wnt9b(Wnt14b或Wnt15)、Wnt10a、Wnt10b(或Wnt12)、Wnt11、Wnt-16a或Wnt-16b多肽序列或其功能活性变体。在一些实施方式中，Wnt多肽选自Wnt3a多肽、Wnt5a多肽、Wnt10b多肽及其功能活性Wnt变体。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽或其功能活性变体。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽或其功能活性变体。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt10b多肽或其功能活性变体。在一些实施方式中，Wnt3a多肽是人Wnt3a多肽或其功能活性变体。在一些情况下，功能活性变体Wnt3a多肽的序列一致性是与天然Wnt3a多肽序列(如人Wnt3a多肽序列(例如SEQIDNO:1))至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％相同。在一些情况下，功能活性变体Wnt3a多肽的序列一致性是与天然Wnt3a多肽序列(如人Wnt3a多肽序列(例如SEQIDNO:1))最多约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％相同。在一些情况下，Wnt3a多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1中所示，或者Wnt3a多肽由SEQIDNO:2的核酸序列编码。
在一些情况下，本文所述的纯化方案简单且经济。在一些情况下，本文所述的纯化方案使得能够以更高纯度纯化Wnt多肽的功能活性形式。在一些实施方式中，本文所述的纯化方法使得能够纯化来自重组宿主细胞的培养基的Wnt多肽。在一些情况下，重组宿主细胞或表达细胞系是原核宿主细胞或表达细胞系、酵母宿主细胞或表达细胞系、昆虫宿主细胞或表达细胞系、或哺乳动物宿主细胞或表达细胞系。
在一些实施方式中，重组宿主细胞或表达细胞系是酵母宿主细胞或表达细胞系。示例性酵母宿主细胞包括但不限于毕赤酵母菌株，如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33，以及酿酒酵母菌株，如INVSc1。
在一些实施方式中，重组宿主细胞或表达细胞系是昆虫宿主细胞或表达细胞系。示例性昆虫细胞系包括但不限于果蝇S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、HighFiveTM细胞和细胞。
在一些实施方式中，重组宿主细胞或表达细胞系是哺乳动物宿主细胞或表达细胞系。在一些情况下，哺乳动物细胞系是稳定的细胞系，或者已将感兴趣的遗传物质引入到其自身基因组中并有能力在多个世代的细胞分裂后表达该遗传因物质的产物的细胞系。在一些实施方式中，哺乳动物细胞系是符合动态药品生产管理规范(cGMP)的细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括但不限于293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、CHODG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、Expi293FTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRGTM细胞、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系和T-RExTM-HeLa细胞系。在一些实施方式中，哺乳动物细胞系是CHO细胞系。在一些实施方式中，哺乳动物细胞系是CHO-S细胞系。本文所用的“CHO细胞”或“CHO细胞系”是涵盖不同类型的CHO细胞和CHO细胞系的通用术语。
在一些实施方式中，哺乳动物宿主细胞作为在软琼脂中、在软琼脂顶部上的液体悬浮培养物，或者作为单层生长。在一些实施方式中，CHO细胞作为在软琼脂中、在软琼脂顶部上的液体悬浮培养物，或者作为单层生长。在一些实施方式中，CHO细胞在液体悬浮培养物中培养。在一些情况下，培养基含有血清。血清的非限制性实例包括胎牛血清(FBS)、HyCloneFetalCloneII和III、铁补充的胎小牛血清(ICS)和人血小板裂解物。在一些实施方式中，血清是FBS。在一些实施方式中，培养基中存在的FBS为最多约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更少。在一些实施方式中，培养基中存在的FBS为至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更多。
在一些实施方式中，血清(例如FBS)是诱导Wnt多肽(例如Wnt3a多肽)表达和分泌到培养基中所需要的。在一些实施方式中，血清提供了用于在Wnt多肽(例如，Wnt3a中的残基如Ser209)上进行脂质修饰的一种或多种必需因子。在一些实施方式中，血清提供了用于将Wnt多肽(例如Wnt3a)从内质网(ER)转运到高尔基体和然后到细胞膜的一种或多种伴侣蛋白和亲脂性分子。
在一些实施方式中，血清被改性以除去脂质组分。在一些情况下，限定的脂质组然后被引入到改性的血清中。在一些情况下，剥离剂(如炭)被用来从血清除去非极性亲脂性物质(例如，病毒、生长因子和激素)。在一些情况下，脂质补充剂被引入到改性的血清中。脂质补充剂的非限制性实例包括脂质混合物1(Sigma-Aldrich)、脂质混合物2(Sigma-Aldrich)、(RockyMountainBiologicals)，和化学限定的脂质浓缩物(LifeTechnologies)。
在一些实施方式中，哺乳动物宿主细胞(例如CHO或CHO-S细胞)在无血清培养基中培养。无血清培养基的非限制性实例包括CDCHO培养基、CDCHOAGTTM培养基、CDOptiCHOTM培养基、CHO-S-SFMII(任选地包含次黄嘌呤和胸苷)、CD293AGTTM培养基、腺病毒表达培养基(AEM)、FreeStyleTM293表达培养基、302无血清培养基、325PFCHO无血清培养基、CDCHO-2无动物组分培养基、CDCHO-3培养基和CDHODHFR-无动物组分培养基。
在一些实施方式中，无血清培养基含有一种或多种额外补充剂。在一些实施方式中，额外补充剂是血清。在一些情况下，血清是FBS。在一些情况下，无血清培养基中存在的FBS为最多约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更少。在一些情况下，无血清培养基中存在的FBS为至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更多。
在一些实施方式中，额外补充剂是脂质补充剂。脂质补充剂的非限制性实例包括脂质混合物1(Sigma-Aldrich)、脂质混合物2(Sigma-Aldrich)、(RockyMountainBiologicals)，和化学限定的脂质浓缩物(LifeTechnologies)。在一些实施方式中，无血清培养基含有脂质补充剂。
在一些实施方式中，额外补充剂是血清代用品。在一些实施方式中，血清代用品选自EXCYTE(Millipore)、EX-CYTE+人血清白蛋白+AOFITS(胰岛素、转铁蛋白和硒，Millipore)、人血清白蛋白(Millipore)、硫酸肝素(Sigma)、脂质(例如本文其他部分所描述的，但不限于DMPC和胆固醇)、Cell-ess(EssentialPharmaceuticals)等。在一些情况下，血清代用品存在的情况下Wnt多肽分泌到条件培养基中。在一些情况下，血清代用品存在的情况下Wnt多肽不分泌到条件培养基中。在一些情况下，血清代用品存在的情况下Wnt3a多肽分泌到条件培养基中。在一些情况下，血清代用品存在的情况下Wnt3a多肽不分泌到条件培养基中。
在一些实施方式中，使用耐受无血清培养基条件的表达载体。在一些情况下，表达载体导致高拷贝数的期望转录物和感兴趣的多肽的分泌。在一些情况下，表达载体与cGMP相容性哺乳动物细胞系相容。哺乳动物表达载体的非限制性实例包括pOptivec载体、pTargeTTM载体、BacMampCMV-Dest载体、Flp-InTM核心系统、载体套装、载体、载体、pCMVTNTTM载体和pcDNATM4/TO载体。在一些实施方式中，表达载体选自pOptivec和pTargeTTM载体。pOptivec载体是改造双顺反子质粒，其允许快速克隆含有哺乳动物分泌信号的基因和CMV启动子下游的感兴趣的基因。二氢叶酸还原酶选择标记允许快速选择。在一些情况下，该载体被用于CHO-S细胞的瞬时转染。在一些情况下，pTargeTTM载体被用于CHO-S细胞的瞬时转染和用于产生表达Wnt多肽(例如Wnt3a)的稳定细胞系。
在一些实施方式中，培养条件的酸化被用于帮助Wnt分泌。在一些情况下，培养条件的酸化被用于帮助Wnt3a分泌。在一些情况下，酸化模拟囊泡的酸化。在一些情况下，酸化是细胞质的酸化。在一些情况下，酸化自然发生，例如由在条件培养基中生长的细胞分泌的酸，或者人为发生，例如添加酸如乙酸。在一些情况下，酸化帮助Wnt多肽的分泌。在一些情况下，酸化帮助Wnt3a多肽的分泌。
在一些实施方式中，Wnt多肽在酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中的表达方法遵循本领域公知的实验方案。在一些情况下，Wnt多肽在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方式中，转录诱导剂被用于诱导Wnt多肽的表达。在一些情况下，转录诱导剂包括多西环素、四环素和香豆霉素。在一些情况下，表达是组成型的，或者多肽在没有诱导剂的情况下表达。在一些实施方式中，Wnt多肽分泌到培养基中。在一些情况下，收获条件培养基，并添加另外的试剂以使Wnt多肽溶解。在一些情况下，另外的试剂是洗涤剂。在一些情况下，洗涤剂是非离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂或两性离子型洗涤剂。示例性的洗涤剂包括但不限于Brij-35、Brij-58、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-([3-胆酰胺丙基]二甲铵基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、TritonX-100、TritonX-114、吐温20和吐温80。在一些实施方式中，洗涤剂是CHAPS或TritonX-100。在一些实施方式中，洗涤剂是CHAPS。CHAPS是可用于膜蛋白增溶的两性离子型洗涤剂。在一些实施方式中，Wnt多肽还通过糖基化和棕榈酰化来进行翻译后修饰。
棕榈酰化是脂肪酸(如棕榈酸)共价连接到半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基。在一些情况下，棕榈酰化增强蛋白质的疏水性并增进其膜缔合。例如，Nusse等报告了鼠Wnt3a蛋白在保守的半胱氨酸残基(C77)处S-棕榈酰化(Willert等,Nature,2003,423:448-452)以及小鼠Wnt3a蛋白的突变体形式(其中棕榈酰化的Cys77被丙氨酸置换(C77A))表现出激活Wnt信号传导的能力降低，但正常地分泌到培养基中。此外，研究表明Cys77残基的棕榈酰化对生物活性是重要的。
在一些实施方式中，Wnt多肽在半胱氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基处被棕榈酰化。在一些实施方式中，Wnt3a多肽在半胱氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基处被棕榈酰化。在一些情况下，Wnt3a多肽在SEQIDNO:1中所示的C77、S139、S181、S209或S211处被棕榈酰化。在一些情况下，Wnt3a多肽在选自SEQIDNO:1中所示的C77、S139、S181、S209或S211的一个或多个氨基酸位置处被棕榈酰化。在一些情况下，Wnt3a多肽在SEQIDNO:1中所示的C77处被棕榈酰化。在一些情况下，Wnt3a多肽在SEQIDNO:1中所示的S209处被棕榈酰化。在一些情况下，Wnt3a多肽在SEQIDNO:1中所示的C77和S209处被棕榈酰化。在一些情况下，Wnt3a蛋白未在SEQIDNO:1中所示的C77处被棕榈酰化。在一些情况下，Wnt3a蛋白在SEQIDNO:1中所示的S209处被棕榈酰化但未在C77处被棕榈酰化。
在一些实施方式中，包含棕榈酰化残基的Wnt多肽是功能活性的变体多肽，如Wnt3a天然多肽(例如人Wnt3a)的功能活性变体。在一些实施方式中，Wnt3a功能活性变体多肽包含选自SEQIDNO:1中所示的C77、S139、S181、S209和S211的棕榈酰化残基。在一些实施方式中，Wnt3a功能活性变体多肽具有在SEQIDNO:1中所示的S139处的棕榈酰化残基。在一些实施方式中，功能活性变体Wnt3a多肽具有在SEQIDNO:1中所示的S181处的棕榈酰化残基。在一些实施方式中，功能活性变体Wnt3a多肽具有在SEQIDNO:1中所示的S209处的棕榈酰化残基。在一些实施方式中，功能活性变体Wnt3a多肽具有在SEQIDNO:1中所示的S211处的棕榈酰化残基。在一些实施方式中，功能活性变体Wnt3a多肽具有在SEQIDNO:1中所示的S209处和另一个残基处的棕榈酰化残基。在一个实施方式中，该另一个残基不包括C77。在一些实施方式中，功能活性变体Wnt3a多肽在SEQIDNO:1中所示的S209处被棕榈酰化但未在C77处被棕榈酰化。
在一些实施方式中，本文所述的纯化方案涉及选自Wnt1、Wnt2、Wnt2b(或Wnt13)、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(Wnt14或Wnt14b)、Wnt9b(Wnt14b或Wnt15)、Wnt10a、Wnt10b(或Wnt12)、Wnt11、Wnt-16a和Wnt-16b多肽的Wnt多肽。在一些情况下，本文所述的纯化方案涉及Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些情况下，本文所述的纯化方案涉及Wnt3a多肽。在一些情况下，本文所述的纯化方案涉及Wnt5a多肽。在一些情况下，本文所述的纯化方案涉及Wnt10b多肽。
在一些实施方式中，本文所述的纯化方案涉及在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸位置77处的半胱氨酸的半胱氨酸残基处，或者在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸位置209处的丝氨酸的丝氨酸残基处具有棕榈酰化的Wnt3a多肽。在一些实施方式中，本文所述的纯化方案选择在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸位置77处的半胱氨酸的半胱氨酸残基处具有棕榈酰化的Wnt3a多肽。在一些实施方式中，本文所述的纯化方案选择在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸位置209处的丝氨酸的丝氨酸残基处具有棕榈酰化的Wnt3a多肽。在一些实施方式中，本文所述的纯化方案选择在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸位置209处的丝氨酸的丝氨酸残基处具有棕榈酰化以及具有至少一个其他棕榈酰化残基的Wnt3a多肽。在一些实施方式中，该至少一个其他棕榈酰化残基不是SEQIDNO:1中所示的C77。在一些实施方式中，本文所述的纯化方案不选择在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸位置77处的半胱氨酸的半胱氨酸残基处具有棕榈酰化的Wnt3a多肽。
在一些实施方式中，本文所述的纯化方案采用分离步骤。在一些实施方式中，分离步骤是离子交换纯化步骤、疏水纯化步骤或亲和纯化步骤。在一些情况下，分离步骤是离子交换纯化步骤。在一些情况下，离子交换纯化步骤采用固定有一种或多种磺化聚芳族化合物的珠。在一些情况下，离子交换纯化步骤采用固定有一种或多种磺化聚芳族化合物的柱。磺化聚芳族化合物的非限制性实例是CibacronblueF3GA。在一些情况下，CibacronblueF3GA是三嗪染料。在一些情况下，固定有三嗪染料的珠和/或柱在离子交换纯化步骤过程中使用。固定有CibacronblueF3GA的色谱柱的非限制性实例是蓝色琼脂糖柱。
在一些实施方式中，纯化使用固定有磺化聚芳族化合物的珠以批处理模式进行。通常，Wnt多肽在含有低浓度盐的结合缓冲液中结合于磺化聚芳族化合物固定的珠。高盐使蛋白质与珠之间的非共价离子相互作用不稳定，由此允许洗脱Wnt多肽。在一些实施方式中，结合缓冲液中使用的盐浓度为最多0、0.01、5、10、15、20、25、30、40、50mM或更低。在一些实施方式中，结合缓冲液中使用的盐浓度为至少0、0.01、5、10、15、20、25、30、40、50mM或更高。在一些实施方式中，使用一种或多种洗涤缓冲液以除去未结合的杂质。在一些实施方式中，使用最多1、2、3、4、5个或更多洗涤步骤。在一些实施方式中，使用至少1、2、3、4、5个或更少洗涤步骤。在一些实施方式中，洗涤缓冲液中使用的盐浓度为至少30、40、50、60、70、80、90、100mM、更高。在一些实施方式中，洗涤缓冲液中使用的盐浓度为最多30、40、50、60、70、80、90、100mM、更低。在一些实施方式中，跟随着一个或多个洗脱步骤。在一些实施方式中，洗脱缓冲液中的盐浓度为至少80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000mM或更高。在一些实施方式中，洗脱缓冲液中的盐浓度为最多80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000mM或更低。示例性的盐包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钙、磷酸钾、磷酸镁、磷酸钠、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等。在一些实施方式中，洗涤剂也配制到结合缓冲液、洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液中。在一些实施方式中，洗涤剂是CHAPS或TritonX-100。在一些实施方式中，CHAPS或TritonX-100的百分比为至少0.01％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或更高。在一些实施方式中，CHAPS或TritonX-100的百分比为最多0.01％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或更低。在一些情况下，使用缓冲液组分，如三(羟甲基)甲胺HCl(Tris-HCl)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)等。在一些情况下，缓冲液的pH为至少4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或更高。在一些情况下，缓冲液的pH为最多4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或更低。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。
在一些实施方式中，纯化使用固定有磺化聚芳族化合物的柱进行。通常，Wnt多肽在含有低浓度盐的结合缓冲液中结合于固定有磺化聚芳族化合物的柱。高盐使多肽与柱、珠之间的非共价离子相互作用不稳定，由此允许洗脱Wnt多肽。在一些实施方式中，结合缓冲液中使用的盐浓度为最多0、0.01、5、10、15、20、25、30、40、50mM或更低。在一些实施方式中，结合缓冲液中使用的盐浓度为至少0、0.01、5、10、15、20、25、30、40、50mM或更高。在一些实施方式中，使用一种或多种洗涤缓冲液以除去未结合的杂质。在一些实施方式中，使用最多1、2、3、4、5个或更多洗涤步骤。在一些实施方式中，使用至少1、2、3、4、5个或更少洗涤步骤。在一些实施方式中，洗涤缓冲液中使用的盐浓度为至少30、40、50、60、70、80、90、100mM、更高。在一些实施方式中，洗涤缓冲液中使用的盐浓度为最多30、40、50、60、70、80、90、100mM、更低。在一些实施方式中，跟随着一个或多个洗脱步骤。在一些实施方式中，洗脱缓冲液中的盐浓度为至少80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000mM或更高。在一些实施方式中，洗脱缓冲液中的盐浓度为最多80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000mM或更低。示例性的盐包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钙、磷酸钾、磷酸镁、磷酸钠、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等。在一些实施方式中，洗涤剂也配制到结合缓冲液、洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液中。在一些实施方式中，洗涤剂是CHAPS或TritonX-100。在一些实施方式中，CHAPS或TritonX-100的百分比为至少0.01％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或更高。在一些实施方式中，CHAPS或TritonX-100的百分比为最多0.01％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或更低。在一些情况下，使用缓冲液组分，如三(羟甲基)甲胺HCl(Tris-HCl)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)等。在一些情况下，缓冲液的pH为至少4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或更高。在一些情况下，缓冲液的pH为最多4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或更低。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。
在一些实施方式中，分离步骤是疏水纯化步骤。在一些实施方式中，疏水纯化步骤采用固定有疏水性配体的珠或固定有疏水性配体的柱。配体的非限制性实例包括丁基、辛基、苯基、蛋白A等。
在一些实施方式中，分离步骤是亲和纯化步骤。在一些实施方式中，亲和纯化步骤采用固定有亲和性配体的珠或固定有亲和性配体的柱。示例性的配体包括Frizzled受体(Fzd)或其片段，以及低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)或其片段。
在一些实施方式中，洗脱的Wnt多肽的浓度和收率在经历进一步的纯化步骤之前测量。在一些实施方式中，收率为至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。在一些实施方式中，收率为最多约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更低。在一些实施方式中，纯度为至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。在一些实施方式中，纯度为最多约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更低。
在一些实施方式中，纯化的Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，从分离步骤纯化含有在对应于SEQIDNO:1中所示的丝氨酸209的氨基酸残基处的棕榈酰化的Wnt3a多肽。在一些实施方式中，从分离步骤纯化含有在对应于SEQIDNO:1中所示的半胱氨酸77的氨基酸残基处的棕榈酰化的Wnt3a多肽。在一些实施方式中，从分离步骤纯化含有在对应于SEQIDNO:1中所示的半胱氨酸77的氨基酸残基处的棕榈酰化和丝氨酸209的氨基酸残基处的棕榈酰化的Wnt3a多肽。在一些实施方式中，从分离步骤纯化含有在对应于SEQIDNO:1中所示的丝氨酸209的氨基酸残基处的棕榈酰化和至少一个其他氨基酸残基处的棕榈酰化的Wnt3a多肽。在一些实施方式中，至少一个其他氨基酸残基不是SEQIDNO:1中所示的C77。
在一些实施方式中，洗脱产物中含有丝氨酸209棕榈酰化的Wnt3a种类的浓度高于含有半胱氨酸77棕榈酰化的Wnt3a种类。在一些实施方式中，两种Wnt3a种类的浓度由值(如比率)限定。在一些实施方式中，Wnt3a丝氨酸209种类与Wnt3a半胱氨酸77种类的比率在约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约99:1或约100:0之间。在一些实施方式中，洗脱产物中含有丝氨酸209棕榈酰化的Wnt3a种类的浓度高于含有半胱氨酸77和丝氨酸209棕榈酰化的Wnt3a种类。在一些实施方式中，两种Wnt3a种类的浓度由值(如比率)限定。在一些实施方式中，Wnt3a丝氨酸209种类与Wnt3a半胱氨酸77/丝氨酸209种类的比率在约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约99:1或约100:0之间。
在一些实施方式中，进一步的纯化步骤是采用预制脂质体的步骤。在一些实施方式中，脂质体从多肽制剂消除血清(FBS)。在一些实施方式中，这后一步骤利用了Wnt多肽的疏水性，并消除了对额外或后续纯化步骤，如后续凝胶过滤和/或色谱纯化步骤(例如硫酸肝素固定的柱)的需要。
在一些实施方式中，脂质体使用本领域公知的方法制备。脂质体是人工制备的球状囊泡，其由层状相脂质双层和水性核心组成。存在多种类型的脂质体，如多层囊泡(MLV)、小的单层脂质体囊泡(SUV)、大的单层囊泡(LUV)和蜗壳状囊泡。在一些情况下，脂质体由磷脂形成。在一些实施方式中，磷脂分离成具有二酰基甘油酯结构的磷脂或源于鞘磷脂(phosphosphingolipid)的磷脂。在一些实施方式中，二酰基甘油酯结构包括磷脂酸(磷脂酸酯)(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷酸肌醇类，如磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇双磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。在一些实施方式中，鞘磷脂包括神经酰胺磷酰胆碱、神经酰胺磷酰乙醇胺和神经酰胺磷酰酯。在一些实施方式中，脂质体由磷脂酰胆碱形成。
在一些实施方式中，脂质还基于其相变温度(Tm)或液晶相与凝胶相之间的温度界面来选择。在一些实施方式中，Tm受头部基团种类、烃长度、不饱和度以及电荷控制。例如，短脂质(含有8、10或12的尾碳链长度的脂质)在低于4℃的温度下具有液晶相。然而，从这些短碳链脂质制造的脂质体对细胞是有毒的，因为它们使细胞膜溶解。从较长碳链脂质制造的脂质体对细胞是无毒的，但它们的相变温度较高。例如，尾部碳长度为16的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)的Tm为约41℃。在一些实施方式中，本文所用的脂质的Tm在约10℃和约37℃、15℃和约30℃、18℃和约27℃、或21℃和约25℃之间。在一些实施方式中，本文所用的脂质的Tm为至少22℃、23℃、24℃或更高。在一些实施方式中，本文所用的脂质的Tm为最多22℃、23℃、24℃或更低。在一些实施方式中，本文所用的脂质具有至少约12、13、14或更大的尾部碳长度。在一些实施方式中，本文所用的脂质具有最多约12、13、14或更小的尾部碳长度。
在一些实施方式中，脂质进一步基于脂质体的净电荷进行选择。在一些实施方式中，脂质体在约4.0和约10.0、约5.0和约9.0、约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有0的净电荷。在一些实施方式中，脂质体在约7.3、约7.4、或约7.5的pH下具有0的净电荷。在一些实施方式中，脂质体在约4.0和约10.0、约5.0和约9.0、约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有净的正电荷。在一些实施方式中，脂质体在约7.3、约7.4、或约7.5的pH下具有净的正电荷。在一些实施方式中，脂质体在约4.0和约10.0、约5.0和约9.0、约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有净的负电荷。在一些实施方式中，脂质体在约7.3、约7.4、或约7.5的pH下具有净的负电荷。
在一些实施方式中，脂质选自1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1-十四酰-2-十六酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DMPS)和1,2-二己酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPG)。在一些实施方式中，脂质是DMPC。
在一些实施方式中，额外的脂质被制造成脂质体。在一些实施方式中，额外的脂质是胆固醇。在一些情况下，磷脂酰胆碱如DMPC和胆固醇的浓度由值(如比率)限定。在一些实施方式中，磷脂酰胆碱如DMPC和胆固醇的浓度的比率在约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约99:1或约100:0之间。在一些实施方式中，磷脂酰胆碱如DMPC和胆固醇的浓度的比率为约90:10。在一些实施方式中，浓度单位为摩尔。在一些实施方式中，比率为摩尔：摩尔。
在一些实施方式中，Wnt多肽以至少约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5ng/μL或更高的浓度用脂质体重构(reconstitute)。在一些实施方式中，Wnt多肽以最多约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5ng/μL或更低的浓度用脂质体重构。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。
在一些实施方式中，Wnt多肽以至少约0.1:50、0.5:30、1:20、或1:14或更高的Wnt多肽-脂质体比率用脂质体重构。在一些实施方式中，Wnt多肽以最多约0.1:50、0.5:30、1:20、或1:14或更低的Wnt多肽-脂质体比率用脂质体重构。在一些情况下，比率是重量/重量比率。在一些情况下，Wnt多肽的单位是纳克单位。
在一些实施方式中，用脂质体重构Wnt多肽的温度至少在约15℃和约37℃、约18℃和约33℃、或约20℃和约28℃之间。在一些实施方式中，温度为至少约21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或更高。在一些实施方式中，温度为最多约21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或更低。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。
在一些实施方式中，Wnt多肽被整合到脂质体膜中。在一些情况下，Wnt多肽从脂质体膜突出到脂质膜的表面上。在一些情况下，Wnt多肽未被引入到脂质体的水性核心中。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽被整合到脂质体膜中。在一些情况下，Wnt3a多肽从脂质体膜突出到脂质膜的表面上。在一些情况下，Wnt3a多肽未被引入到脂质体的水性核心中。
在一些实施方式中，用脂质体重构的Wnt多肽称为脂质体Wnt多肽或L-Wnt。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，用脂质体重构的Wnt3a多肽称为脂质体Wnt3a多肽或L-Wnt3a。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽。在一些实施方式中，用脂质体重构的Wnt5a多肽称为脂质体Wnt5a多肽或L-Wnt5a。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt10b多肽。在一些实施方式中，用脂质体重构的Wnt10b多肽称为脂质体Wnt10b多肽或L-Wnt10b。
在一些实施方式中，L-Wnt经历离心步骤，且然后重悬到缓冲液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在一些情况下，L-Wnt在氮气下储存。在一些情况下，L-Wnt在氮气下稳定而没有实质活性损失。在一些情况下，L-Wnt在约1℃和约8℃之间的温度下储存。在一些情况下，L-Wnt在至少约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或更高的温度下稳定而没有实质活性损失。在一些情况下，L-Wnt在最多约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或更低的温度下稳定而没有实质活性损失。在一些实施方式中，L-Wnt稳定至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、356、400、700、1000天或更久而没有实质活性损失。在一些实施方式中，L-Wnt稳定最多约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、356、400、700、1000天或更短而没有实质活性损失。
在一些实施方式中，L-Wnt3a经历离心步骤，且然后重悬到缓冲液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在一些情况下，L-Wnt3a在氮气下储存。在一些情况下，L-Wnt3a在氮气下稳定而没有实质活性损失。在一些情况下，L-Wnt3a在约1℃和约8℃之间的温度下储存。在一些情况下，L-Wnt3a在至少约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或更高的温度下稳定而没有实质活性损失。在一些情况下，L-Wnt3a在最多约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或更低的温度下稳定而没有实质活性损失。在一些实施方式中，L-Wnt3a稳定至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、356、400、700、1000天或更久而没有实质活性损失。在一些实施方式中，L-Wnt3a稳定最多约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、356、400、700、1000天或更短而没有实质活性损失。
在一些情况下，术语“没有实质活性损失”是指脂质体Wnt多肽的功能活性接近于在没有脂质体情况下的对应天然Wnt多肽的功能活性。在一些情况下，与天然Wnt多肽的功能活性相比，脂质体Wnt多肽的功能活性为至少约100％、99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％或更高。在一些情况下，与天然Wnt多肽的功能活性相比，脂质体Wnt多肽的功能活性为最多约100％、99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％或更低。在一些情况下，Wnt多肽的功能活性使用如质谱、与本文其他部分描述的生物标志物分析相关的试验、移植手术(如肾包膜下移植手术、脊柱融合手术)、ALP、TRAP和TUNEL染色、免疫组织化学法和微CT分析及移植物生长的定量的分析方法进行检测。
在一些情况下，术语“稳定”是指Wnt多肽处于折叠状态而未展开或降解。在一些情况下，术语“稳定”也指Wnt多肽保留功能活性而没有实质活性损失。在一些情况下，用于测定稳定性的试验包括如上文所述那些的建立Wnt多肽活性的试验，还包括例如基于LSL细胞的试验，如基于小鼠LSL细胞的试验。
在一些实施方式中，本文所述的纯化方法利用Wnt多肽的疏水结构域，并且不干扰Wnt多肽构象或功能活性。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些情况下，Wnt3a多肽的疏水结构域含有在对应于SEQIDNO:1中所示的丝氨酸209的丝氨酸残基上的棕榈酰化。
在一些实施方式中，Wnt多肽对脂质体的亲和性低于Wnt多肽结合伴体。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5b多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，Wnt3a多肽对脂质体的亲和性低于Wnt3a多肽结合伴体。在一些实施方式中，Wnt3a多肽结合伴体包括Frizzled蛋白及其片段以及LPR6蛋白及其片段。在一些实施方式中，Wnt3a对脂质体的亲和性在约4nM和约50nM、约4.5nM和约20nM、及约5nM和约15nM之间。在一些实施方式中，Wnt3a对脂质体的亲和性为至少约5.5nM、6nM、6.5nM、7nM、7.5nM、8nM、8.5nM、9nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM或更高。在一些实施方式中，Wnt3a对脂质体的亲和性为最多约5.5nM、6nM、6.5nM、7nM、7.5nM、8nM、8.5nM、9nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM或更低。在一些实施方式中，Wnt3a多肽对其结合伴体的亲和性在约0.01nM至约4nM、约0.1nM至约4nM、或约1nM至约4nM之间。在一些情况下，Wnt3a多肽对其结合伴体的亲和性为至少约1.1nM、1.3nM、1.5nM、1.7nM、2nM、2.3nM、2.5nM、2.7nM、3nM、3.1nM、3.2nM、3.3nM、3.4nM、3.5nM、3.6nM、3.7nM、3.8nM、3.9nM或更高。在一些情况下，Wnt3a多肽对其结合伴体的亲和性为最多约1.1nM、1.3nM、1.5nM、1.7nM、2nM、2.3nM、2.5nM、2.7nM、3nM、3.1nM、3.2nM、3.3nM、3.4nM、3.5nM、3.6nM、3.7nM、3.8nM、3.9nM或更低。
不同纯化方案产出不同量的纯化多肽。在一些实施方式中，在对应于SEQIDNO:1中所示的半胱氨酸77的氨基酸残基处含有棕榈酰化的Wnt3a多肽是活性形式。在一些实施方式中，在对应于SEQIDNO:1中所示的丝氨酸209的氨基酸残基处含有棕榈酰化的Wnt3a多肽是活性形式。在一些实施方式中，含有对应于SEQIDNO:1中所示的半胱氨酸209的氨基酸残基处的棕榈酰化和对应于SEQIDNO:1中所示的丝氨酸77的氨基酸残基处的棕榈酰化的Wnt3a多肽是活性形式。在一些实施方式中，含有对应于SEQIDNO:1中所示的丝氨酸209的氨基酸残基处的棕榈酰化和对应于SEQIDNO:1中所示的半胱氨酸77的氨基酸残基处的棕榈酰化的Wnt3a多肽不是活性形式。在一些实施方式中，含有对应于SEQIDNO:1中所示的半胱氨酸77的氨基酸残基处的棕榈酰化的Wnt3a多肽不是活性形式。在一些实施方式中，与用于检测或测量Wnt多肽(例如，Wnt3a多肽)活性的额外试验结合的质谱被用于鉴别活性种类。在一些情况下，额外试验包括与本文其他部分描述的生物标志物分析相关的试验、移植手术(如肾包膜下移植手术、脊柱融合手术)、ALP、TRAP和TUNEL染色、免疫组织化学法、和微CT分析及移植物生长的定量。
在一些方面，洗脱产物中含有丝氨酸209棕榈酰化的脂质体Wnt3a种类的浓度高于含有半胱氨酸77棕榈酰化的Wnt3a种类。在一些实施方式中，两种Wnt3a种类的浓度由值(如比率)限定。在一些实施方式中，Wnt3a丝氨酸209种类与Wnt3a半胱氨酸77种类的比率在约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约99:1或约100:0之间。在一些实施方式中，洗脱产物中含有丝氨酸209棕榈酰化的脂质体Wnt3a种类的浓度高于含有半胱氨酸77和丝氨酸209棕榈酰化的Wnt3a种类。在一些实施方式中，两种Wnt3a种类的浓度由值(如比率)限定。在一些实施方式中，Wnt3a丝氨酸209种类与Wnt3a半胱氨酸77/丝氨酸209种类的比率在约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约99:1或约100:0之间。
在一些情况下，包括在本文所公开的文献中描述的那些的前述纯化方案产生两个种类的混合物(例如，1:5的单修饰/活性的：双重修饰/非活性的)。在一些情况下，使用本文所述的纯化方案，主要多肽种类处于单修饰(在Ser209处)的活性构型。在一些情况下，本文所述的纯化方法提供Wnt3a组合物，其主要含有在Ser209处含有脂质修饰的多肽的活性形式。在一些情况下，本文所述的纯化方法提供Wnt3a组合物，其未被其他多肽种类如Cys77Wnt3a种类污染。
在一些实施方式中，本文描述了一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括将包含Wnt多肽的样品与脂质体水性溶液接触的步骤，其中构成脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。在一些实施方式中，本文描述了一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括将包含Wnt多肽的样品与脂质体水性溶液接触的步骤，其中构成脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。
在一些实施方式中，本文公开了一种制备脂质体Wnt3a多肽的方法，其包括以下步骤：(a)从包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的条件培养基收获Wnt3a多肽；(b)将Wnt3a多肽引入固定有磺化聚芳族化合物的离子交换柱；(c)用不连续梯度从离子交换柱洗脱Wnt3a多肽；和(d)将来自步骤(c)的Wnt3a多肽与脂质体水性溶液接触。
在一些实施方式中，本文公开了一种制备脂质体Wnt5a多肽的方法，其包括以下步骤：(a)从包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的条件培养基收获Wnt5a多肽；(b)将Wnt5a多肽引入固定有磺化聚芳族化合物的离子交换柱；(c)用不连续梯度从离子交换柱洗脱Wnt5a多肽；和(d)将来自步骤(c)的Wnt5a多肽与脂质体水性溶液接触。
在一些实施方式中，本文公开了一种制备脂质体Wnt10b多肽的方法，其包括以下步骤：(a)从包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的条件培养基收获Wnt10b多肽；(b)将Wnt10b多肽引入固定有磺化聚芳族化合物的离子交换柱；(c)用不连续梯度从离子交换柱洗脱Wnt10b多肽；和(d)将来自步骤(c)的Wnt10b多肽与脂质体水性溶液接触。
测定Wnt多肽的生物活性的功能试验是本领域所公知的，并且可以包括例如β-连环蛋白的稳定化、干细胞的生长促进、非功能试验(例如免疫染色、ELISA、考马斯或银染凝胶上的定量等)中存在的Wnt多肽量的定量、以及功能活性Wnt与总Wnt的比率的分析。用于生物活性的示例性试验包括将Wnt组合物与细胞(如小鼠L细胞)接触，且然后将细胞培养足以使β-连环蛋白稳定的一段时间，如至少约1小时。然后裂解细胞并通过SDS-PAGE解析细胞裂解物。随后将来自SDSPAGE的解析的细胞裂解物组分转移到硝酸纤维素，并然后用β-连环蛋白特异性抗体对其进行探测。用于Wnt活性分析的其他试验包括用于靶基因诱导的C57MG转化和爪蟾动物帽试验。另外的示例性分析参见美国专利第7,335,643号。
C.使用方法
本文公开了用于产生在骨缺损位点使用的骨移植材料的方法、工艺、组合物及试剂盒。本文还公开了用于强化哺乳动物骨髓细胞的方法、工艺、组合物及试剂盒。在一些情况下，骨缺损是指其中需要移植材料来刺激和引导自然骨的修复性生长的骨损伤，如骨折。
在一些实施方式中，该方法是指一种产生骨移植材料的方法，其包括以下步骤：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体WNT多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体WNT多肽；和(c)将脂质体WNT多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，该方法是指一种产生骨移植材料的方法，其包括以下步骤：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体WNT3a多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体WNT3a多肽；和(c)将脂质体WNT3a多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽。在一些实施方式中，该方法是指一种产生骨移植材料的方法，其包括以下步骤：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体WNT5a多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体WNT5a多肽；和(c)将脂质体WNT5a多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt10b多肽。在一些实施方式中，该方法是指一种产生骨移植材料的方法，其包括以下步骤：(a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体WNT10b多肽体外接触；(b)清洗样品以除去游离的脂质体WNT10b多肽；和(c)将脂质体WNT10b多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。
在一些实施方式中，该方法涉及一种通过包括将分离的哺乳动物骨髓细胞与脂质体WNT多肽体外接触的步骤的方法产生的哺乳动物骨髓组合物，其中接触的时间在约30分钟和约4小时之间。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，该方法涉及一种通过包括将分离的哺乳动物骨髓细胞与脂质体WNT3a多肽体外接触的步骤的方法产生的哺乳动物骨髓组合物，其中接触的时间在约30分钟和约4小时之间。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽。在一些实施方式中，该方法涉及一种通过包括将分离的哺乳动物骨髓细胞与脂质体WNT5a多肽体外接触的步骤的方法产生的哺乳动物骨髓组合物，其中接触的时间在约30分钟和约4小时之间。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt10b多肽。在一些实施方式中，该方法涉及一种通过包括将分离的哺乳动物骨髓细胞与脂质体WNT10b多肽体外接触的步骤的方法产生的哺乳动物骨髓组合物，其中接触的时间在约30分钟和约4小时之间。
在一些实施方式中，组合物是指一种分离的强化哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体WNT多肽处理后，细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，组合物是指一种分离的强化哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体WNT3a多肽处理后，细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽。在一些实施方式中，组合物是指一种分离的强化哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体WNT5a多肽处理后，细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt10b多肽。在一些实施方式中，组合物是指一种分离的强化哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体WNT10b多肽处理后，细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
在一些实施方式中，组合物还指一种从处于或大于35岁的人受试者获得的哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体WNT多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞表达选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽、Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt3a多肽。在一些实施方式中，组合物还指一种从处于或大于35岁的人受试者获得的哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt3a多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞表达选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt5a多肽。在一些实施方式中，组合物还指一种从处于或大于35岁的人受试者获得的哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt5a多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞表达选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
在一些实施方式中，Wnt多肽是Wnt10b多肽。在一些实施方式中，组合物还指一种从处于或大于35岁的人受试者获得的哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt10b多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞表达选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。在一些实施方式中，生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
在一些实施方式中，增强的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些情况下，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平在约1％和约100％、约1％和约50％、约2％和约20％、约3％和约15％、或约4％和约10％之间。在一些情况下，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平为至少约5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或更高。在一些情况下，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，增强的表达水平为最多约5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或更低。
在一些实施方式中，在用脂质体WNT多肽处理后，哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。在一些情况下，哺乳动物骨髓细胞中降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。在一些情况下，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，降低的表达水平在约1％和约100％、约2％和约80％、约3％和约50％、约3％和约30％、或约4％和约20％之间。
在一些实施方式中，骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。在一些情况下，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，细胞凋亡水平的降低为至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高。在一些情况下，与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，细胞凋亡水平的降低为最多约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更低。
在一些实施方式中，哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。在一些实施方式中，增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。在一些情况下，与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。在一些情况下，与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平提高约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或更高。
本文所用的骨移植材料是指从供体获得的细胞组合物，其中供体可以是活体或尸体。骨移植材料通常包含复杂细胞群体，并包含干细胞，如间充质干细胞，并且在一些情况下，还包含骨细胞及其祖细胞。在一些情况下，细胞是粘附的骨髓细胞或非粘附的骨髓细胞。在一些情况下，骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些情况下，粘附的骨髓细胞是骨髓干细胞或骨髓祖细胞。在一些情况下，粘附的骨髓细胞是骨髓基质细胞。在一些实施方式中，供体是同种异体的。在一些情况下，供体相对于受体是自体的。用于骨移植物的细胞量可以随供体、受体、移植目的等而变化。骨移植物可以包含最多约103、最多约104、最多约105、最多约106、最多约107、最多约108、最多约109、最多约1010或更多细胞。
骨移植材料从供体获得，例如从髂嵴、从下颌联合(颏区域)、从股骨和/或胫骨、腓骨、肋骨、前下颌支的扩髓、灌洗和吸引；脊柱骨的部分(例如在手术期间移除的那些)、尸体骨等获得。在一些情况下，移植物材料从骨髓收获，例如从适合的骨的骨内膜表面刮下，或者从含有髓和小块骨的块状移植物收获。在一些情况下，同种异体移植骨从尸体、骨库等获得，例如从来自髋置换手术的股骨头获得。在一些情况下，骨移植材料是新鲜的，或者如本领域已知的低温保存直至需要它时。
在一些实施方式中，骨移植物的细胞在有效剂量的脂质体Wnt多肽，如L-Wnt3a、L-Wnt5a或L-Wnt10b的存在下悬浮在适合的培养基中。可以使用任何适合的培养基，例如DMEM、RPMI、PBS等。细胞通常在孵育过程期间以维持活力的浓度重悬，例如最高约104/ml、最高约105/ml、最高约106/ml、最高约107/ml。
在一些情况下，接触的温度在约0℃和约37℃，或约20℃和约25℃之间。在一些实施方式中，接触的温度较低，例如最多约32℃、最多约25℃、最多约15℃、最多约10℃、最多约8℃、最多约4℃、最多约1℃，但通常高于冻结温度，除非为冷冻保存而特别制备。在一些情况下，孵育温度为至少约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃或更高。在一些情况下，孵育温度为最多约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃或更低。
在一些情况下，骨移植材料与Wnt多肽接触至少约10分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时，和最多约36小时、最多约24小时、最多约18小时、最多约15小时、最多约12小时、最多约8小时、最多约6小时、或最多约4小时。
Wnt多肽的有效剂量可以根据来源、纯度、制备方法等而变化。在一些情况下，Wnt多肽的有效剂量为至少约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或更高。在一些情况下，Wnt多肽的有效剂量为最多约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或更低。
在一些情况下，Wnt多肽是L-Wnt3a，Wnt3a的有效剂量为至少约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或更高。在一些情况下，Wnt3a多肽的有效剂量为最多约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或更低。
在一些情况下，Wnt多肽是L-Wnt5a，Wnt5a的有效剂量为至少约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或更高。在一些情况下，Wnt5a多肽的有效剂量为最多约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或更低。
在一些情况下，Wnt多肽是L-Wnt10b，Wnt10b的有效剂量为至少约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或更高。在一些情况下，Wnt10b多肽的有效剂量为最多约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml或更低。
在一些实施方式中，骨移植材料与Wnt多肽孵育足以增强成骨能力的一段时间。增强可以以多种方式测量，如使用本文所述的生物标志物，例如通过增加的Axin2表达，通过骨移植材料中增加的有丝分裂活性(在移植后约第2天至约第6天测量)；通过增加的移植后骨形成，通过增加的Runx2或骨钙蛋白的表达，通过减少的移植后细胞凋亡；或通过移植后产生的骨体积。
孵育后，骨移植材料可以依照常规实验方案移植到受体中以用于例如脊柱骨的修复、骨折、牙科支撑物等。
在一些实施方式中，在将Wnt处理的骨移植材料移植回患者之前，进行清洗步骤以除去任何游离的脂质体Wnt多肽。在一些实施方式中，进行至少约1、2、3、4、5次或更多的洗涤。在一些实施方式中，进行最多约1、2、3、4、5次或更少的洗涤。在一些实施方式中，使用任何适合的缓冲液进行洗涤，例如磷酸盐缓冲盐水溶液。
在一些情况下，洗涤步骤后的剩余脂质体Wnt为最多约0.01pg(皮克)、0.05pg、0.1pg、0.5pg、1pg、1.5pg、2pg、2.5pg、3pg、3.5pg、4pg、4.5pg、5pg、5.5pg、6pg或更少。在一些情况下，洗涤步骤后的剩余脂质体Wnt为至少约0.01pg(皮克)、0.05pg、0.1pg、0.5pg、1pg、1.5pg、2pg、2.5pg、3pg、3.5pg、4pg、4.5pg、5pg、5.5pg、6pg或更多。
在一些情况下，本文所述的用Wnt处理骨移植材料的方法允许控制Wnt多肽暴露于细胞的时间、暴露持续时间、暴露浓度和/或毒性。在一些情况下，本文所述的用Wnt3a处理骨移植材料的方法允许控制Wnt3a多肽暴露于细胞的时间、暴露持续时间、暴露浓度和/或毒性。
在一些实施方式中，通过用Wnt多肽，如L-Wnt3a、L-Wnt5a或L-Wnt10b孵育使老化骨移植物的成骨潜力恢复。在一些情况下，脂质体Wnt3a处理减少老化骨移植物中的细胞死亡。在一些情况下，在移植后，用脂质体Wnt3a处理的骨移植物产生更多的骨(p<0.05)。在一些情况下，脂质体Wnt3a处理增强移植物中的细胞存活，并重建来自老年动物的移植物的骨形成能力。
在一些情况下，哺乳动物骨髓细胞从任何哺乳动物获得，包括但不限于人。在一些情况下，供体是啮齿动物，如小鼠或大鼠。在一些情况下，供体是兔。在一些情况下，供体是人。在一些情况下，供体是自身，并且骨髓细胞是自体的。在一些情况下，如本文其他部分所述，自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些情况下，自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些情况下，自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些情况下，自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些情况下，供体是另一个体，并且骨髓细胞是同种异体的。在一些情况下，同种异体骨髓细胞从活体供体或尸体供体获得。在一些情况下，如本文其他部分所述，同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。在一些情况下，同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。在一些情况下，同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。在一些情况下，同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。在一些情况下，供体是处于或大于35岁的个体。在一些情况下，从处于或大于35岁的个体获得的骨髓细胞被视为老骨髓细胞或老年骨髓细胞。在一些情况下，供体是小于35岁的年轻个体。在一些情况下，从小于35岁的年轻个体获得的骨髓细胞被视为年轻骨髓细胞。在一些情况下，从处于或大于35岁的个体获得的骨髓细胞是自体骨髓细胞或同种异体骨髓细胞。在一些情况下，从小于35岁的年轻个体获得的骨髓细胞是自体骨髓细胞或同种异体骨髓细胞。本文所用的术语“个体”、“受试者”、“供体”和“患者”在本文中可以交换使用，且指的是任何哺乳动物，包括但不限于人。
在一些实施方式中，本文所述的方法、组合物、工艺和试剂盒提供了用于使来自老年患者或愈合潜力降低的其他患者(如吸烟者、糖尿病患者、或患有营养缺陷的患者)的骨移植物复苏的基于临床适用的再生医学的策略。
在一些实施方式中，用于测定生物标志物如Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1、Tcf4、SOX9和PPARγ的表达水平或存在的方法是本领域所公知的。在一些情况下，例如通过流式细胞法、免疫组织化学法、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、磁珠分选法(magneticbeadselection)和表达这些生物标志物的任一种的细胞的定量来测量生物标志物的表达水平或存在。生物标志物RNA或DNA表达水平可以通过RT-PCR、Qt-PCR、微阵列、RNA印迹法或其他类似技术来测量。本文所用的术语“生物标志物”和“标志物”可以交换使用。
如本文所公开的，在多肽或核苷酸水平测定感兴趣的生物标志物的表达或存在使用本领域技术人员已知的任何检测方法实现。“检测表达”或“检测……的水平”旨在测定生物样品中生物标志物蛋白或基因的表达水平或存在。因此，“检测表达”涵盖其中生物标志物被测定为未表达、未可检测地表达、以低水平表达、以正常水平表达或过表达的情形。
在某些方面，使用例如免疫组织化学技术或基于核酸的技术(如原位杂交和RT-PCR)在蛋白质或核酸水平检测生物样品中的这些多种生物标志物和任何临床可用的预后标志物的表达或存在。在一些实施方式中，一种或多种生物标志物的表达或存在通过核酸扩增方法、核酸测序方法、采用核酸微阵列(DNA和RNA)的方法或使用特异性标记探针的原位杂交方法进行。
在其他实施方式中，测定一种或多种生物标志物的表达或存在通过凝胶电泳进行。在一个实施方式中，测定通过转移到膜上并用特异性探针进行杂交来进行。
在其他实施方式中，测定一种或多种生物标志物的表达或存在通过诊断成像技术进行。
在又一些实施方式中，测定一种或多种生物标志物的表达或存在通过可检测的固体基质进行。在一个实施方式中，可检测的固体基质是用抗体功能化的顺磁性纳米颗粒。
在一些实施方式中，使用例如针对特定生物标志物蛋白的抗体在蛋白质水平检测生物标志物的表达。这些抗体被用于各种方法中，如蛋白质印迹法、ELISA、多路复用技术(multiplexingtechnologies)、免疫沉淀或免疫组织化学技术。在一些实施方式中，生物标志物的检测通过ELISA实现。在一些实施方式中，生物标志物的检测通过电化学发光(ECL)实现。
在一些实施方式中，通过能够与生物标志物蛋白或其功能活性变体特异性相互作用的结合蛋白检测生物样品中感兴趣的生物标志物蛋白的表达水平。在一些实施方式中，使用标记抗体、其结合部分或其他结合们体。在本文中使用时，“标记(label)”是指与抗体直接或间接偶联从而生成“标记的(labeled)”抗体的可检测的化合物或组合物。在一些实施方式中，标记通过自身(例如，放射性同位素标记或荧光标记)可检测，或者在酶标记的情况下，催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
用于生物标志物蛋白检测的抗体起源是单克隆或多克隆的，或者是合成或重组产生的。复合蛋白质的量，例如与结合蛋白(例如特异性结合生物标志物蛋白的抗体)缔合的生物标志物蛋白的量使用本领域技术人员已知的标准蛋白检测方法来测定。免疫学试验设计、理论和方案的详细综述见于本领域中的众多文本(参见，例如，Ausubel等,eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology)(GreenePublishingandWiley-Interscience,NY))；Coligan等,eds.(1994)CurrentProtocolsinImmunology(JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,N.Y.)中。
用于标记抗体的标志物的选择将根据应用而变化。然而，标志物的选择可以由本领域技术人员容易地决定。这些标记抗体被用于免疫试验以及组织学应用中以检测任何感兴趣的生物标志物或蛋白质的存在。标记抗体是多克隆或单克隆的。此外，用于检测感兴趣的蛋白质的抗体被如本文其他部分所述的放射性原子、酶、发色团部分或荧光部分、或比色标签标记。标签标记的选择也将取决于期望的检测限。酶试验(ELISA)通常允许检测通过酶标记复合体与酶底物之间的相互作用形成的有色产物。充当可检测标记的放射性核素包括例如1-131、1-123、1-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212和Pd-109。充当可检测标记的酶的实例包括但不限于辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。发色团部分包括但不限于荧光素和罗丹明。抗体通过本领域已知的方法与这些标记偶联。例如，酶和发色团分子通过偶联剂如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等与抗体偶联。或者，偶联通过配体-受体对发生。适合的配体-受体对的实例是生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白及抗体-抗原。
本文所用的术语“抗体”以最宽泛的意义使用，并包括完全装配的抗体、可结合抗原的抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2、Fv、单链抗体、双体、抗体嵌合体、杂交抗体、双特异性抗体、人源化抗体等)和包含前述的重组肽。
本文所用的术语“单克隆抗体”和“mAb”是指从抗体的基本上同质群体获得的抗体，即构成该群体的个体抗体除可能少量存在的可能天然发生的突变以外是相同的。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白(heterotetramericglycoprotein)，其由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每个轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每个重链和轻链还具有规则地间隔的链内二硫键。每个重链在一端具有可变域(VH)和之后的多个恒定域。每个轻链在一端具有可变域(VL)和在其另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并且轻链可变域与重链的可变域对齐。据信特定氨基酸残基形成在轻链和重链可变域之间的界面。
术语“可变”是指可变域的某些部分的序列在抗体之间极为不同。可变区赋予抗原结合特异性。然而，可变性并非在抗体的整个可变域均匀地分布。它集中在轻链和重链可变域二者中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个段中。可变域的更高度保守的部分处于框架(FR)区中。天然重链和轻链的可变域各自包含由三个CDR连接的四个FR区(主要采用β-折叠-片层构型)，其形成连接的环和在一些情况下构成β-折叠-片结构的一部分。每个链中的CDR通过FR区密切靠近地保持在一起，并且与另一链的CDR一起导致抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat等，(1991)NIHPubL.No.91-3242,Vol.I,pages647-669)。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，如Fc受体(FcR)结合、抗体参与抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性的引发和肥大细胞脱粒。
术语“高变区”在本文中使用时是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.)和/或来自“高变环(hypervariableloop)”的那些残基(即，轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变域中的(H1)、53-55(H2)和96-101(13)；Clothia和Lesk,(1987)J.Mol.Biol.,196:901-917)。“框架”或“FR”残基是除本文认为的高变区残基以外的那些可变域残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab、F(ab’)2和Fv片段；二体；线性抗体(Zapata等，(1995)ProteinEng.10:1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生各自具有单个抗原结合位点的称为“Fab”片段两个相同的抗原结合片段，以及其名称反映出其容易结晶的能力的残余“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变区和一个轻链可变域的二聚体构成。在这种构型中，每个可变域的三个CDR相互作用以在VH-VL二聚体表面上限定抗原结合部位。总体上，六个CDR赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或者仅包含三个对抗原特异性的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然与完整的结合部位相比亲和性要低。
Fab片段还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab片段与Fab’片段的区别在于在重链CH1域的羧基末端增加多个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。其中恒定域的半胱氨酸残基携带自由巯基的Fab’在本文中命名为Fab’-SH。Fab’片段通过还原F(ab’)2片段的重链二硫键而产生。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于它们的恒定域氨基酸序列而归属于两个明显不同的类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))之一。
取决于它们的重链的恒定域氨基酸序列，免疫球蛋白可以归属于不同种类。人免疫球蛋白有五个主要种类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的一些可以进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。不同的同种型具有不同的效应子功能。例如，人IgG1和IgG3同种型具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。
在一些实施方式中，生物样品(例如，组织样品)中一种或多种生物标志物或其他感兴趣的蛋白质的表达或存在通过放射免疫测定或酶联免疫测定(ELISA)、竞争性结合酶联免疫测定、斑点印迹(参见，例如，PromegaProtocolsandApplicationsGuide,PromegaCorporation(1991))、蛋白质印迹法(参见，例如，Sambrook等，(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual,Vol.3,Chapter18(ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,N.Y.)、色谱法如高效液相色谱法(HPLC)或本领域已知的其他试验来测定。因此，检测分析包括例如但不限于免疫印迹、免疫扩散、免疫电泳或免疫沉淀的步骤。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种生物标志物的表达或存在还在核酸水平测定。用于评估表达的基于核酸的技术是本领域中公知的，并且包括例如测定生物样品中的生物标志物mRNA的水平。许多表达检测方法使用分离的RNA。不针对mRNA分离进行选择的任何RNA分离技术被用于RNA的纯化(参见，例如，Ausubel等，ed.(1987-1999)CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,NewYork)。此外，大量的组织样品容易地使用本领域技术人员公知的技术进行处理，例如美国专利第4,843,155号中公开的单步骤RNA分离方法。
因此，在一些实施方式中，生物标志物或感兴趣的其他蛋白质的检测使用核酸探针在核酸水平进行分析。术语“核酸探针”是指能够选择性结合特别针对的靶核酸分子(例如，核苷酸转录物)的任何分子。探针通过本领域技术人员合成，或来源于适当的生物制剂。探针具体地设计为用例如放射性标记、荧光标记、酶、化学发光标签、比色标签或上述所讨论的或本领域所已知的其他标记或标签进行标记。用作探针的分子的实例包括但不限于RNA和DNA。
例如，分离的mRNA被用于包括但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应分析和探针阵列的杂交或扩增试验。用于mRNA水平检测的一种方法包括将分离的mRNA与核酸分子(探针)接触，所述核酸分子与被要检测的基因编码的mRNA杂交。核酸探针由例如全长cRNA或其一部分组成，如长度为至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸且足以在严格条件下与编码生物标志物、上文所述的生物标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。mRNA与探针杂交表明生物标志物或其他感兴趣的靶蛋白被表达。
在一些实施方式中，mRNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过将分离的mRNA在琼脂糖凝胶上运行，并将mRNA从凝胶转移到膜，如硝酸纤维素。在替代性实施方式中，探针被固定在固体表面上，并且mRNA与探针(例如在基因芯片阵列中)接触。本领域技术人员容易将已知的mRNA检测方法适应用于检测编码生物标志物或其他感兴趣的蛋白质的mRNA的水平。
用于检测样品中感兴趣的mRNA的水平的替代方法包括核酸扩增方法，例如通过RT-PCR(参见，例如美国专利第4,683,202号)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189193)、自维持的序列复制(Guatelli等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177)、Q-Beta复制酶(Lizardi等，(1988)Bio/Technology6:1197)、滚环复制(美国专利第5,854,033号)或其他任何核酸扩增方法，接着是使用本领域技术人员所公知的技术检测扩增的分子。这些检测方案可特别用于核酸分子的检测，如果这些分子以非常低的数量存在。在本发明的特别方面，生物标志物表达通过定量的荧光RT-PCR(即TaqMan0系统)评估。
感兴趣的RNA的表达水平使用膜印迹(如用于杂交分析的，如RNA印迹法、斑点印迹法等)、或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或包含结合的核酸的任何固体载体)进行监测。参见美国专利第5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，其通过引用全文并入本文。表达的检测也包括使用溶液中的核酸探针。
在一些实施方式中，微阵列被用于测定一种或多种生物标志物的表达或存在。微阵列因不同实验之间的再现性而特别适合于这一目的。DNA微阵列提供了一种用于同时测量大量基因的表达水平的方法。每个阵列由附着于固体载体的捕获探针的可再现图案组成。标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，且然后通过激光扫描检测。阵列上的每个探针的杂交强度被测定和转换成代表相对基因表达水平的定量值。参见美国专利第6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316，其通过引用全文并入本文。高密度寡核苷酸阵列可特别用于测定样品中大量RNA的基因表达谱。
使用机械合成方法合成这些阵列的技术在例如美国专利第5,384,261中描述，其通过引用全文并入本文。在一些实施方式中，阵列在实际上任何形状的表面或甚至多个表面上制造。在一些实施方式中，阵列是平面阵列表面。在一些实施方式中，阵列包括在珠、凝胶、聚合物表面、纤维如光导纤维、玻璃、或其他任何适合的基底上的肽或核酸，参见美国专利第5,770,358、5,789,162、5,708,153,6,040,193和5,800,992，其各自全文并入本文。在一些实施方式中，阵列以允许广泛装置(all-inclusivedevice)的诊断或其他操作的方式包装。
D.试剂盒/制品
在某些实施方式中，本文公开了用于本文所述的一种或多种方法、工艺和组合物的试剂盒和制品。这样的试剂盒包括区室化以接纳一个或多个容器如小瓶、管等的托架、包装或器箱，每个容器包含要在本文描述的方法中使用的单独元件之一。适合的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。在一些实施方式中，容器由多种材料如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品含有包装材料。包装材料的实例包括但不限于瓶、管、袋、容器、瓶和适合于选择的制剂与预期施用和处理模式的任何包装材料。
例如，容器包含L-Wnt多肽。这样的试剂盒任选地包括涉及其在本文描述的方法中的用途的识别描述或标记或指示。
试剂盒通常包括列举内容物和/或用途指示的标签，以及具有用途指示的包装插页。一组说明也将通常包括在内。
在一个实施方式中，标签在容器上或与容器相关联。在一个实施方式中，当形成标签的字母、数字或其他字符附着、模塑或蚀刻在容器自身中时，标签是在容器上；当其存在于也保持容器的盛器(receptacle)或托架中时，标签与容器相关联，例如，作为包装插页。在一个实施方式中，标签被用来表明内容物将被用于特定治疗应用。标签还表明内容物的使用指示，例如在本文描述的方法中。
本发明的进一步细节在下列非限制性实施例中提供。
实施例1
生产和纯化人Wnt3a多肽
人WNT3A是有效激活成体干细胞并刺激它们的自我更新和存活的脂质修饰人干细胞生长因子。天然人WNT3A352个氨基酸的多肽通过糖基化和棕榈酰化进行翻译后修饰。疏水性多肽可能难以在可放大水平下纯化到同质。
如本文所述和图1中所说明的，人WNT3A从CHO细胞分泌并用离子交换(蓝色琼脂糖)柱纯化。在纯化后，将重组人WNT3A重驵成由DMPC和胆固醇组成的脂质囊泡。蔗糖密度梯度数据证实了WNT3A和脂质体之间的物理结合。而且，脂质体人Wnt3a多肽(L-WNT3A)可以在生理性、水性条件下是稳定的。在一些情况下，脂质体结构的形成不是该相互作用的前提。在一些情况下，具有随机结构特征的脂质能够与人WNT3A相互作用并使水性环境中的多肽稳定化。
在一些方面，L-WNT3A制剂被用于研究中新药(IND)I期研究以治疗处于骨愈合延迟的高风险的患者中的骨缺损。在一些情况下，收获自体骨移植材料(BGM)，用L-WNT3A体外处理，然后洗涤并形成团粒。在一些情况下，所得材料，激活的BGM(例如BGMACT)，被视为药物产品并可供立即使用。在一些情况下，L-WNT3A不直接施用于患者，但被用于体外激活自体细胞。在一些情况下，对于该程序的初始阶段，预期制剂将符合全身施用的脂质体蛋白制剂的常规美国食品药品管理局(FDA)标准(纯度、稳定性等)。
从CHO细胞产生WNT3A
将人WNT3A多肽引入中国仓鼠卵巢细胞系中并作为粘附的细胞在32-37℃范围温度下生长。测试悬浮液中生长的CHO细胞以评估悬浮液中的CHO细胞是否可以有效分泌WNT3A(图9)。
WNT3A-转化的CHO细胞在添加Glutamax、抗生素和血清的DMEM中生长。WNT3A质粒是可诱导的，并测试了一系列多西环素浓度(图10)。观察到多西环素浓度可以调节CHO细胞的Wnt3a分泌量。细胞可以生长最多10天，其后使用新的细胞等份。
胎牛血清(FBS)被用于CHO细胞的WNT3A分泌(图11)。
收集来自CHO细胞培养物的条件培养基(CM)，合并和在4℃下储存最多2个月而不损失活性(图12)。
在纯化之前，过滤CM(0.22微米过滤器)并添加1％TritonX-100。将CM(40mL)施加到在20mMTrisClpH7.5和1％CHAPS中平衡的蓝色琼脂糖柱(1.6ml)。收集流过物，并用4个柱体积的20mMTrisClpH7.5、1％CHAPS、50mMKCl洗涤柱。再用4个柱体积的20mMTrisClpH7.5、1％CHAPS、100mMKCl洗涤柱。然后用3个柱体积的20mMTrisClpH7.5、1％CHAPS、150mMKCl洗涤柱，其中从这次洗涤中洗脱人WNT3A。再用4个柱体积的20mMTrisClpH7.5、1％CHAPS、250mMKCl洗涤柱。从40mLCM，在约60％纯度下收率为12μg多肽。与其他纯化方案相比，该方法产生了具有更高纯度和更高收率的WNT3A。在一些情况下，纯度为70％。
WNT3A产生和脂质体
WNT3A表征。SDS-PAGE/蛋白质印迹法。收集WNT3A纯化部分的SDSPAGE和考马斯亮蓝染色分析并通过考马斯亮蓝和硝酸银染色的12％SDS聚丙烯酰胺凝胶分析WNT3A多肽纯度(图2)。如图2中所示，收集纯化部分并通过考马斯亮蓝和硝酸银染色的12％SDS聚丙烯酰胺凝胶分析WNT3A多肽纯度。WNT3A的估计纯度为70％。使用Pierce660蛋白质分析试剂盒和280nm处的吸光度测量总蛋白质浓度。在每个试验中，产生BSA标准曲线以估计总蛋白质浓度。使用定量蛋白质印迹法和WNT3A标准曲线测定WNT3A多肽浓度。
质谱。质谱分析验证了WNT3A多肽被脂质化(lipidated)和糖基化(图3)。观察到多肽在S209处棕榈酰化。
如图3中所示，制备WNT3A样品以进行质谱的方法如下。使用4x体积的在-80℃下预冷冻的丙酮来沉淀多肽样品。样品在-80℃下储存过夜，之后以10,000RPM在4℃下超速离心10分钟。除去上清液，将多肽重构到含有8M脲和蛋白酶max(proteasemax，Promega)的溶液中。将样品用5mMDTT还原，并在55℃下孵育30分钟。然后使样品冷却到室温，并然后用丙烯酰胺(15mM)在室温下烷基化30分钟。然后用50mM碳酸氢铵pH8.0将样品稀释到浓度为<1M脲，并添加1μg胰蛋白酶(Promega)。在37℃下进行消化过夜。通过添加50％甲酸淬灭反应，并立即在C18微型柱(NESTgroup)上清洁及浓缩多肽。
液相色谱法和质谱(LCMS)。将多肽重构到流动相A中。使用长度在80和120分钟之间的梯度利用在300nL/分钟下运行的WatersNanoAcquityLC。分析柱填充在外壳中，并使用长度约15cm的PEEKEC183uM基质用熔融石英制备(75uMID)。使用设置为数据依赖模式(DDA)的LTQOrbitrapVelos质谱仪进行强前体离子的MSMS裂解。使用CAD、HCD和ETD裂解技术。
数据库检索和分析。使用Sequest针对人Uniprot数据库检索来自质谱仪的.RAW文件。然后，产生并检索含有WNT3A序列的定制数据库，其允许一批可变修饰，不限于STY磷酸化、SThexNac、STNac、STC棕榈酰化等。将所有Sequest检索文件上载到Scaffold(ProteomeSoftware)以进行探询和半定量分析。
在阳性对照(购自StemRD的WNT3A蛋白质)的情况下，实现约43％的覆盖。以黄色突出显示序列覆盖和独特肽(图3A)。以绿色示出修饰的残基。只在C77残基上检测到棕榈酰化修饰(图3B)。在纯化的WNT3A的情况下，实现～51％的覆盖。以黄色突出显示序列覆盖和独特肽(图3C)。以绿色示出修饰的残基。在S211残基上检测到棕榈酰化修饰(图3C、D)，并在残基S139和S181上检测可能的肉豆蔻酰化(myristoleylation)修饰。
L-WNT3A制剂和表征。
通过在室温下孵育带正电荷的脂质、带负电荷的脂质或电荷中性的脂质与纯化的Wnt3a至少6h和最多约24h来生产含有净的正、负电荷或电荷中性的脂质体Wnt3a(L-Wnt3a)多肽。脂质与胆固醇比率维持在90:10。孵育后，L-Wnt3a通过在16,000-150,000xg范围的力作用下在4℃下离心最多1h与CHAPS及其他杂质分离。然后在无菌1XPBS中重悬L-Wnt3a团粒，用氮气覆盖并在4℃下储存。
脂质与WNT3A的相互作用。当与各种不同碳链长度的脂质组合时，WNT3A证实了与不带电荷的脂质的功能相关的相互作用(图15)。这些数据表明，它主要是介导WNT3A多肽与脂质体之间的结合的疏水性相互作用(图4)。
L-WNT3A的TEM表征。TEM被用于对L-WNT3A所观察到的直径范围可视化(图4)。L-WNT3A的外观和大小落入对于外来体所报告的大小范围内，例如20-100nM。还参见Dhamdhere等，(2014)PLoSONE9(1):e83650，其通过引用全文具体并入本文。
基于小鼠LSL细胞的试验。小鼠LSL细胞用Wnt-反应性萤光素酶报告质粒pSuperTOPFlash(Addgene)和组成型LacZ表达构建体pEF/Myc/His/LacZ(Invitrogen)稳定转染以将β半乳糖苷酶活性针对细胞数标准化。用上述两种质粒稳定转染人胚胎肾上皮(HEK293T)细胞。除非另有说明，用浓度为10uL/总体积150uL的补充了10％FBS(Gibco)和1％P/S(Cellgro)的DMEM中的L-WNT3A处理细胞(50000细胞/孔，96孔板)。还包括纯化WNT3A多肽的系列稀释。
细胞在37℃、5％CO2下孵育过夜，然后洗涤、用LysisBuffer(AppliedBiosystems)裂解，并用双光组合报告基因试验系统(AppliedBiosysytems)定量萤光素酶和β半乳糖苷酶表达水平。在双光即用照度计(Berthold)上用三重读数来定量生物发光。从通过WNT3A多肽的系列稀释产生的标准曲线确定WNT3A(ng/uL)和L-WNT3A的活性(图5)。在涉及时间进程的实验中，WNT3A活性表达为百分活性。如下计算百分活性：
稳定性数据总结
基于LSL报告细胞试验和PAGE-蛋白质印迹法分析，来自发酵的条件培养基在4℃下最少稳定2个月。基于LSL报告细胞试验和PAGE-蛋白质印迹法分析，L-WNT3A在4℃下稳定>106天(图6)。基于LSL报告细胞试验和PAGE-蛋白质印迹法分析，23℃下的L-WNT3A具有>48小时的半衰期(蓝线，图7)。与无修饰的WNT3A多肽相比，其在23℃下在5min内损失其活性。
基于LSL报告细胞试验和PAGE-蛋白质印迹法分析，37℃下的L-WNT3A具有10.5小时的半衰期(蓝线，图8)。注意到，即使添加洗涤剂(CHAPS)以使疏水性多肽稳定，WNT3A仍在5min内损失其活性(红线，图8)。
WNT细胞报告试验的表征
使用LSL报告细胞系评估Wnt多肽和激动剂的活性。使用以下报告试验进行L-WNT3A的以下表征。将细胞以5.0x104/试验孔置于板上，并用LSL和HEK293报告系定量WNT3A和L-WNT3A的活性。在这些条件下，WNT3A和L-WNT3A示出了激活Wnt信号传导的相似活性(图13)。
精度和检测限：试验的灵敏度为R2＝0.99。在图14A和图14B中，WNT显示为达到0.1ng/μL的最优浓度。试验的截止点为0.025ng/μL和0.2ng/μL。LSL试验未受WNT3A浓度的有意改变的影响(图14C)。一系列WNT3A浓度证实了随时间的成比例萤光素酶反应，其表明试验的可靠性。
特异性使用Wnt多肽激动剂R-spondin2证实，其与WNT多肽协同以激活WNT途径。还使用WNT5A证实试验特异性，其在Wnt共受体Ror2的存在下抑制该途径的β连环蛋白介导的激活。如图13D中所示，任一试剂在LSL报告试验中都没有显示活性。
如图13(A、B)中所示，细胞以5.0x104/试验孔置于板上，并且定量WNT3A和L-WNT3A二者的活性。在这些条件下，WNT3A和L-WNT3A都显示了激活Wnt信号传导的相似能力。试验的灵敏度为R2＝0.99。使用纯化的人WNT3A多肽作为阳性对照。(C)LSL试验未受WNT3A浓度的有意改变的影响。一系列浓度的数据证实了随时间的成比例萤光素酶反应，其提供了试验可靠性的指示。(D)通过在WNT3A存在或不存在的情况下添加Rspo2来证实特异性。
准确度：试验具有17.2％的批内和批间变异系数。
使用原代MEF的L-WNT3A剂量反应曲线
LSL和HEK293T细胞工程化以对Wnt和Wnt激动剂敏感，并因此提供关于剂量、药效和临床反应之间关系的较少意义的数据。为更密切地模拟对Wnt刺激的体内细胞反应，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)使用Wnt靶基因Axin2的表达作为途径活性的测量手段来分析。
在原代细胞中，有效浓度的线性范围为0.025-0.1ng/μLWNT3A(图14A)。还在骨髓来源的干细胞中分析L-WNT3A活性，并发现有效浓度的线性范围为0.004-0.08ng/μL(图14B)。因此，原代细胞群体表现出对Wnt刺激明显不同的敏感性。
选择的脂质可以替换CHAPS以维持WNT3A。DMPC和胆固醇脂质可以替换CHAPS以维持WNT3A活性。用其他脂质例如MPPC、DPPC、DMPS、DMPG和DMGE制造的脂质体是无活性的。
WNT3A的脂质重构
很多蛋白质在高温下变性，而避免在体温下的这种变性是延长蛋白质治疗药物持续时间的关键。脂质体包装保持了Wnt3a的生物活性，并且这种制剂可以在多种骨损伤应用中具有功效。Wnt3a对于脂质体的亲和性和这种结合的稳定性被表征。通过L-WNT3A的Wnt3a途径激活的动力学和热力学被证实。
WNT3A和脂质体之间的亲和性。蔗糖密度梯度数据证实了WNT3A多肽和脂质之间的物理结合(图16)。图16中的蔗糖密度梯度证实了WNT3A和脂质之间的物理结合。定位到高密度级分的WNT3A多肽(图16A)和该高密度级分进一步显示了WNT活性(图16B)。蛋白质印迹分析证实了大部分WNT3A多肽被定位到该高密度级分(图16C)。磷脂试验证明该高密度级分含有大部分脂质(橙色线，图16B)。因此在与单独的WNT3A(其隔离到低密度级分2-3中，图16D、E)相比较时，L-WNT3A转移至高密度级分，这证明了物理结合而非作为WNT3A与脂质体之间的聚集。
Wnt3a与脂质体之间的亲和性估计。Wnt3a/Frizzled结合亲和性为约3.6nM。Wnt3a/脂质体结合亲和性为约9nM。在L-Wnt3a与Frizzled之间的竞争试验中，Wnt3a在脂质体团粒中观察到(图17A)。在进一步孵育后，Wnt3a从脂质体团粒解离，并优先与上清液中的Frizzled结合(图17B)。因此Wnt3a对脂质体膜的亲和性低于Wnt3a对Frizzled的亲和性。
在脂质体与LRP6之间的第二竞争试验中，上清液中观察到LRP6(图17C)。当在L-Wnt3a的存在下孵育LRP6时，LRP6蛋白质从上清液(图17C)迁移至L-Wnt3a团粒(图17D)。
结论：基于这些拉下试验，Wnt3a与脂质体膜之间的结合亲和性估计为约6nM。这些试验还证实了在脂质体膜中重构的Wnt3a以其可以与其受体Frizzled和LRP6相互作用的方式定位。
WNT3A与脂质体结合的动力学
基于LSL报告细胞试验和PAGE-蛋白质印迹分析，Wnt3a与脂质体快速结合，并且该结合负责维持多肽的活性。最初，在上清液中观察到Wnt3a活性。在约30分钟的过程中，Wnt3a多肽以约3x10-3nM/sec的速率从上清液转移到团粒(图18A)。到6h时，在团粒中观察到90％的Wnt3a活性。类似地，蛋白质印迹分析显示在团粒中发现90％的多肽(图18B)。在23℃下24h后，脂质体通过离心从水性上清液分离。团粒中未观察到可见的多肽沉淀。蛋白质印迹法证实了大部分Wnt3a在脂质体团粒中(图18C)。图18D示出了实验结束时上清液和团粒中的Wnt3a活性。
图19说明了Wnt5a和Wnt10b与脂质体的相互作用(图19)。
放大实验。将来自冷冻储备的细胞接种到15cm组织培养板上。在37℃、5％CO2下孵育3-4天后，细胞以1:5扩增到2x15cm板中4天。这些细胞进一步以1:5扩增到20x15cm板中。在孵育24小时后，用多西环素诱导细胞。每24小时收集CM并在4℃下储存。测量CM活性以确认WNT3A分泌。将1％TritonX添加到1LCM并通过0.22μm过滤器过滤。然后将CM装载到150ml蓝色琼脂糖柱上。从这次试验，在KCl梯度中洗脱80μg的WNT3A，获得40％总收率。
材料及供应商
CHO细胞：Invitrogen
质粒载体：Promega
脂质：AvantiPolarLipids
蓝色琼脂糖纯化柱：
WNT3A标准品：StemR&D
LSL细胞：
超速离心：
缩写
BGM：骨移植材料
BGMACT：L-WNT3A激活的骨移植材料
CHO：中国仓鼠卵巢
CM：条件培养基
Fz：Frizzled，WNT受体
HEK：人胚胎肾
LSL：小鼠L细胞
L-WNT3A：脂质体WNT3A
MEF：小鼠胚胎成纤维细胞
实施例2
通过用携带人Wnt3a核酸的质粒转染基因工程化中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系来产生人Wnt3a多肽。使用基于脂质体转染(lipofectin)的转染方法。质粒受多西环素诱导型启动子的控制。Wnt3a-转化的CHO细胞在含有DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)+10％胎牛血清(FBS)、GlutaMaxTM(基于谷氨酰胺的二肽)、抗生素(例如多西环素)、G418、非必需氨基酸、杀稻瘟素及血清的培养基中的粘附或悬浮培养物中并在约32-37℃范围的温度下生长。从CHO细胞分泌的Wnt3a的量取决于CHO细胞是作为粘附还是悬浮的培养物生长。多西环素以一系列浓度添加到培养基，其可以调节由CHO细胞产生的人Wnt3a的量。培养基包括在整个培养期存在的胎牛血清(FBS)，在此期间CHO细胞分泌Wnt3a。细胞可以生长最多10天，其后使用新的细胞等份。
与使用连续梯度或凝胶过滤的纯化方案相比，本纯化方案使用不连续梯度(stepgradient)，其产生如表1和2中所示的更高纯度和更高收率。在使用连续梯度或凝胶过滤的纯化方案中，连续盐梯度在蓝色琼脂糖柱上从150nM到1.5MNaCl运行，接着是凝胶过滤和硫酸肝素柱。在一些情况下，如本文其他部分所述，本方案还采用疏水纯化步骤，如疏水柱(例如，蛋白A-琼脂糖柱)。
表1示出了通过本发明的纯化步骤获得的结果，而表2示出了通过使用连续梯度或凝胶过滤纯化步骤的纯化方案获得的结构。
表1
表2
实施例3
动物
所有程序都遵循由斯坦福动物研究委员会批准的方案。使用β-肌动蛋白增强的绿色荧光蛋白(ACTB-eGFP；TheJacksonLaboratory,Sacramento,California)和CD1野生型同系小鼠。<3月龄的小鼠被视为年轻的；>10月的小鼠被视为老年的。Axin2CreERT/+和R26RmTmG/+小鼠购自JacksonLabs。老年野生型Lewis大鼠(来自CharlesRivers,MA的“不能生育的大鼠(retiredbreeders)”)根据AAUC和IUPAC指南用于脊柱融合手术。
用于啮齿动物模型的骨移植材料(BGM)的收集和处理
大鼠和小鼠都用于该研究。小鼠模型的使用允许广谱的分子分析，然而因为自体移植对于这些小动物是高度侵入性的，在进行自体移植术(例如，图20和25)时使用大鼠，并在采用先进的分子技术时使用同系小鼠(图21-24)。在所有情况下，通过纵向切割骨头，用锋利的工具轻柔地刮去骨内膜表面，并将骨髓内容物冲洗到收集盘中而从股骨、胫骨和髂嵴收获骨移植材料(BGM)。该方法模仿用于人的扩髓/灌洗/吸引(reamer/irrigator/aspirator，RIA)技术。
为诱导Axin2CreERT/+、R26RmTmG/+小鼠中的重组(图21)，给动物连续5天通过腹腔注射或强饲给予160μg/g体重的他莫昔芬。在第一次处理后7天收获组织并通过GMP免疫染色或荧光进行分析。
为确保用于移植到肾包膜下(SRC)的BGM等分在细胞内容物方面等同，将来自3只小鼠(同窝仔畜)的BGM合并，然后分成20μL等分，就像在移植试验中一样。用DNeasyTissueKit(QIAGEN)提取DNA内容物，并用Quant-iTPicoGreendsDNAKit(Invitrogen)和微板荧光阅读器(BERTHOLD,BadWildbad,Germany)测量相对DNA浓度。DNA内容物的百分变化<20％(图26)。
为获得BGMACT，将新鲜收获的BGM置于含有磷酸盐缓冲盐水的脂质体制剂(L-PBS)或WNT3A的脂质体制剂(L-WNT3A，有效L-WNT3A浓度＝0.15μg/mL)的20μL培养基中并在23℃下维持1小时。
定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)
将组织样品在TRIzol溶液中匀浆化。分离RNA并进行反转录。使用Prism7900HT序列检测系统和PowerSYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)进行定量实时PCR。通过ΔΔCT法测定基因表达水平，并针对它们的GAPDH值标准化。所有反应一式三份进行，并计算平均值和标准偏差。
引物序列如下(5’至3’)：Axin2，[正向-TCATTTTCCGAGAACCCACCGC]，[反向-GCTCCAGTTTCAGTTTCTCCAGCC]；Lef1，[正向-AGGAGCCCAAAAGACCTCAT]，[反向-CGTGCACTCAGCTATGACAT]；GAPDH，[正向-ACCCAGAAGACTGTGGATGG]，[反向-GGATGCAGGGATGATGTTCT]；ALP[正向-ACCTTGACTGTGGTTACTGC]，[反向-CATATAGGATGGCCGTGAAGG]；Osterix，[正向-GGAGACCTTGCTCGTAGATTTC]，[反向-GGGATCTTAGTGACTGCCTAAC]；骨钙蛋白，[正向-TGTGACGAGCTATCAAACCAG]，[反向-GAGGATCAAGTTCTGGAGAGC]。
蛋白质印迹分析
从年轻(N＝5)和老年(N＝5)小鼠收获BGM，并然后置于含有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，在5％CO2中37℃下孵育。24小时后，除去非粘附的细胞，替换培养基，并传代粘附的细胞直到它们达到汇合。每3天更换培养基。在一些实验中，用L-PBS或L-WNT3A(有效浓度＝0.03μg/mL)处理传代3次后的细胞。在这些实验中，24h后收集细胞并用RIPA缓冲液裂解。提取总蛋白质以用于蛋白质印迹分析。泛-肌动蛋白被用作内标物和确保蛋白质的完整性。使用抗WNT3A、非磷酸化β连环蛋白和Axin2的抗体。通过ImageJ分析积分强度以定量蛋白质印迹法结果。
肾包膜下移植手术
在一些情况下，采用肾包膜下试验(SRCA)以分析其分化潜力。在同系宿主小鼠进行吸入麻醉后，在左胁腹径直作出尾部到胸廓的皮肤切口。打开腹膜腔以使肾暴露。在肾包膜中形成小的切口，并用软的塑料管将BGM仔细放置到包膜之下。然后将肾放回腹膜腔，并用缝合线封闭腹膜和皮肤。使用丁丙诺啡(0.05mg/kg)进行镇痛。
在从Axin2CreERT2、R26mTmG供体收获BGM的情况下，随后在第0天开始给宿主通过强饲提供5天的他莫昔芬(100μL的10mg/mL)。在指明的时间点收获SRC移植物。
腺病毒介导的Wnt3a信号传导的抑制
产生DKK1和阴性对照Fc腺病毒构建体。将腺病毒构建体转染到293T细胞中。2天后，收集细胞、裂解并通过离心沉淀。将纯化的腺病毒等分并在-80℃下储存。通过将BGM与Ad-DKK1和对照Ad-Fc体外孵育2小时来实现Wnt抑制，然后将BGM等分移植到颅盖缺损中。
颅盖临界尺寸缺损手术
麻醉小鼠，并作出3mm切口以使顶骨暴露。使用显微解剖环锯产生2mm直径的圆周、全厚度缺损；未干扰硬脑膜。BGM等分与Ad-Dkk1和对照Ad-Fc孵育2小时。然后将BGM等分移植到颅盖缺损中，并用缝合线封闭皮肤。在从手术恢复后，小鼠接受丁丙诺啡以进行镇痛。
如下进行微计算机断层扫描术(微CT)分析。用2％异氟烷麻醉小鼠，并使用多模式正电子发射断层扫描-计算机断层扫描数据-采集系统(InveonPET-CT)在40μm分辨率下扫描。用MicroView软件分析数据。使用三维兴趣区域工具(three-dimensionalregion-of-interesttool)对每个样品指定结构和骨体积。
使用高分辨率微CT(vivaCT40)，以70kVp、55μA、200ms积分时间和10.5μm各向同性的体素大小来评估再生骨体积分数(通过将再生的骨体积除以总骨体积计算的百分比[BV/TV，％])。感兴趣的区域长为2cm并且开始于缺损边缘近端250μm处并向远端延伸250μm超出缺损的相对边缘(1.5cm总直径)。骨使用阈值为275mg/cm3的羟基磷灰石与软组织分割。依照已出版的指南进行扫描和分析。
脊柱融合手术
使用70-100mg/kg的氯胺酮和5-10mg/kg的甲苯噻嗪(Xylazine)的混合物麻醉Lewis大鼠。对大鼠的腰区进行剃毛，然后用聚乙烯酮碘(Betadine)浸湿的纱布消毒。在皮肤切开之前，对大鼠注射镇痛的丁丙诺啡0.02mg/kgSC/IP。首先，从髂嵴收获骨移植材料(BGM)；简而言之，触诊左侧髂棘(iliacspine)并作出垂直的皮肤切口；获得到达髂棘的背侧嵴的通路，并通过钝器解剖使之暴露。提起附着的肌肉和骨外膜，并用修骨钳收获0.3gBGM并分碎(morselized)。然后用100μL的L-PBS或用100μL的[0.15μg/mL]L-Wnt3a孵育BGM，同时使横突暴露。
为使横突暴露，进行后外侧钝器解剖，并通过牵开器将翻转的椎旁肌固定在适当的位置。清除掉L4-L5横突的骨外膜，并用牙钻剥除皮质。将BGM铺展在L4-L5横突上和之间。用可吸收缝合线(4-0薇乔，Ethicon)封闭椎旁肌，并用间断的不可吸收缝合线(4-0尼龙，Ethicon)封闭皮肤。用抗生素软膏剂处理手术部位。皮下递送10mg/kg拜有利(Baytril)。手术后施用3天的丁丙诺啡(0.02mg/kg)，并在需要时提供后续剂量以控制疼痛。
样品制备、组织处理、组织学
将组织固定在4％低聚甲醛(PFA)中4℃下过夜。样品在19％EDTA中脱钙1天。在进行石蜡包埋之前，样本通过上升的乙醇系列脱水。切割8微米厚的纵切片并收集在Superfrost-plus载玻片上以进行组织学分析。进行番红O、苯胺蓝和Gomori染色。使用LeicaDM5000B数字成像系统为组织切片拍照。
ALP、TRAP和TUNEL染色
通过在氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)和NTM缓冲液(100mMNaCl、100mMTrispH9.5、5mMMgCl)中孵育来检测碱性磷酸酶(ALP)活性。依照生产商说明书，使用白细胞酸性磷酸酶染色试剂盒观察耐酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)活性。显色后，载玻片在一系列乙醇中脱水，在Citrisolv中清洁，并用中性树胶封片剂(Permountmountingmedia)盖片。为进行TUNEL染色，使用0.1％TritonX-100和0.1％柠檬酸钠将切片渗透，并用TUNEL反应混合物(原位细胞死亡检测试剂盒)进行孵育。用DAPI封片介质封闭切片，并在落射式荧光显微镜下可视化。
为进行溴脱氧尿苷(BrdU)试验，对小鼠腹膜内注射BrdU标记的试剂(Invitrogen,CA,USA)，并在注射后4小时使其安乐死。依照生产商说明书，使用BrdU染色试剂盒进行BrdU检测。
免疫组织化学
使组织切片脱蜡并在PBS中复水。通过3％过氧化氢淬灭内源性过氧化物酶活性5min，并然后在PBS中清洗。在室温下用5％山羊血清封闭载片1小时。添加适合的一抗并在4℃下孵育过夜。然后用适合的生物素化二抗及抗生物素蛋白/生物素化酶复合体孵育样品，并通过DAB底物试剂盒显色。所用抗体包括GMP和DLK1、Runx2、Sox9和PPAR-γ。
微CT分析和移植物生长的定量
依照已出版的指南进行扫描和分析。用2％异氟烷麻醉小鼠，并使用微计算机断层扫描数据-采集系统(Inveon)在52μm分辨率下扫描。为确定在各个样品中发生的移植物生长，将POD2和POD49时间点扫描数据输出到Osirix软件第5.8版中并以相同方向登记以进行分段(segmentation)。形成的新骨与移植的初始BGM体积进行比较。通过在XLStat软件版本中使用Mann-Whitney检验来确定数据组之间的差异。p值<0.05被认为是统计学显著的。
定量和统计学分析
定量GFP、BrdU、TUNEL、DLK1、骨钙蛋白和苯胺蓝染色。使用PhotoshopCS5测定损伤位点处的感兴趣区域(ROI)中的像素数。使用魔棒工具指定ROI内正像素的区域。正信号的像素与ROI的像素的比率表示为百分比。定量损伤位点上均匀间隔的至少5个切片以测定每个样品的平均值。每个组中包括5个样品(n＝5)。结果显示为平均值±SD。使用Student’st检验来定量本文所述的差异。P≤0.05被认为是显著的。
骨移植材料含有多个干细胞/祖细胞群体
在一些情况下，收获自体移植物的最佳解剖学位点取决于多种因素，包括供体位点发病率和骨储备的可获得性。使用改良的扩髓-灌洗-吸引(RIA)技术从三个解剖学位置收获BGM，并注意到股骨、髂嵴和胫骨产生具有明显不同的组织学外观的BGM。除造血细胞以外，股骨BGM含有脂肪细胞，甚至在从幼年动物收获时(图20A)。髂嵴BGM主要由紧密粘附的细胞中覆盖的骨小梁碎片组成(图20B)。来自胫骨的BGM含有相当量的纤维基质和小的无核细胞(图20C)。使用定量RP-PCR评估内源性成骨基因表达并发现在这三种来源中，髂嵴BGM表达了明显更高水平的碱性磷酸酶和骨钙蛋白(图20D)。
在一些情况下，据信自体移植物的成骨性质可归因于骨移植材料(BGM)内的干细胞/祖细胞群体和成骨细胞。通过将BGM移植到肾包膜下(SRC)试验中测试了自体移植物的这种成骨性质。SRC为移植的组织提供了血管供应，并支持细胞分化成包括骨、皮肤、肌肉、牙齿、器官和肿瘤的多种组织。从髂嵴收获BGM，随后移植到动物的肾包膜之下(图20A)，并允许其在那里发育7天。
BrdU掺入证实了自体BGM中细胞的高有丝分裂活性(图20B)。Runx2(图20C)、Sox9(图20D)和PPARγ(图20E)的免疫染色证实了BGM中的细胞亚集表达了与成骨、成软骨和成脂定型相关的基因标志物。在第7天，源自BGM的细胞亚群已经分化成骨(图20F)、软骨(图20G)和脂肪(图20H)。总的来说，这些数据证实了BGM含有能够分化成全部三种谱系的干细胞/祖细胞。
骨移植材料中的Wnt信号传导随年龄下降
使用Axin2CreERT2、R26mTmG报告小鼠来诱导导致识别骨外膜(图21A)和骨内膜(图21B)中的GFP+ve前成骨细胞的重组。骨内膜中的GFP+ve细胞的频率为～0.1％(图21C)。GFP+ve细胞还在新鲜收获的BGM中鉴别(图21D)。因此，异质BGM中的细胞亚集为Wnt反应性的。
在年轻(<3月龄)和老年(>10月龄)小鼠之间比较BGM的Wnt反应性状态。绝对定量RT-PCR证实了Wnt靶基因Axin2和Lef1的表达在从老年小鼠收获的BGM(BGM老年)中相对于从年轻小鼠收获的BGM(BGM年轻；图21F)低几乎两倍。蛋白质印迹分析确认Wnt3a、磷酸化β连环蛋白和Axin2表达在BGM老年中都明显低于BGM年轻(图21G)。因此，BGM的内源性Wnt反应性状态随年龄恶化。
成骨分化能力也随年龄下降
在人类中，骨愈合速率随年龄下降。相似的年龄相关的下降也在小鼠的BGM成骨能力中发现。新鲜收获的BGM老年示出了与新鲜收获的BGM年轻相比明显更低的成骨基因碱性磷酸酶、Osterix及骨钙蛋白表达水平(图22A)。
为测试成骨基因表达的减少是否影响BGM的成骨能力，使用了SRC试验。然而，在小鼠中进行自体移植术是过度损伤性的。为模拟自体移植，使用了同系供体和宿主。由于同系动物如此密切相关，它们的组织是免疫学相容的，并且组织移植不引起免疫应答。ACTB-eGFP小鼠充当供体，并且BGM通过其GPF荧光在SRC中可容易地识别(图22B、图22C)。
移植后7天，收获BGM并分析骨形成的证据。苯胺蓝染色的类骨质基质在BGM年轻中是明显的(图22D)，但在BGM老年中没有(图22E；在图22F中定量)。如通过ALP染色所示，BGM年轻中的类骨质基质经受矿化(图22G)，而BGM老年未示出ALP染色(图22H；在I中定量)。而且，GMP免疫染色证实了在BGM年轻(图22J)和BGM老年(图22K)中都有相似数量的存活供体细胞(在图22L中定量)。总的来说，这些数据表明BGM的成骨基因表达和成骨能力随年龄下降。
Wnt信号传导和BGM的成骨能力
BGM的内源性Wnt响应性和成骨能力随年龄减小。为测试减弱的Wnt信号传导是否造成成骨潜力的这种年龄相关的下降，阻断了BGM中的内源性Wnt信号传导。还使用Wnt抑制剂Dkk1的过表达来短暂破坏体内Wnt信号传导。将Ad-Dkk1或Ad-Fc(对照)递送到年轻小鼠的骨髓腔，然后在24h后收获BGM年轻并将等分试样移植到临界尺寸的(未愈合的)骨骼缺损中。
7天后，当对照BGM年轻的ALP活性为强阳性时(图23A)，Ad-Dkk1处理的BGM年轻示出了最小的活性(图23B)。相反，Ad-DKK1处理的BGM年轻示出了成脂蛋白PPAR-γ(图23C、图23D)和Dlk1(图23E、图23F)的广泛表达。如微CT(图23G、图23H；在图23I中定量)和BGM的组织形态学分析(图23J、图23K；在图23L中定量)所示，骨形成被Ad-Dkk1处理所抑制。因此，BGM的成骨能力依赖于内源性Wnt信号。
在BGM老年中增加内源性Wnt信号恢复其成骨能力
图23J-图23L显示内源性Wnt信号传导可以激活BGM的成骨能力。还测试了足以增强BGM效力的Wnt刺激。收获BGM老年，用L-WNT3A或脂质体PBS(L-PBS)处理，且然后在37℃下孵育(图24A)。绝对qRT-PCR分析揭示了Axin2表达的小的升高(图24B)。Lef1对L-WNT3A作出响应而适度地升高(图24B)。蛋白质印迹分析表明β连环蛋白和Axin2蛋白都对L-WNT3A作出响应而升高(图24C)。
BGM中的有丝分裂活性通过L-WNT3A处理而提高。在移植后第4天，L-WNT3A处理的BGM老年与L-PBS处理的BGM老年相比，细胞增殖增加(图24D、图24E；在图24F中定量)。对于细胞周期的作用到移植后第7天是瞬时的；BrdU掺入在L-PBS和L-WNT3A样品之间等同(图24G、图24H；在图24I中定量)。
评估了BGM老年中的细胞分化。在L-WNT3A处理的BGM老年中，成脂蛋白Dlk1的表达较低(图24J、图24K；在图24L中定量)，而成骨蛋白骨钙蛋白的表达较高(图24M、图24N；在图24O中定量)。新骨形成只在L-WNT3A处理的BGM老年中发现(图24P、图24Q；在图24R中定量)。使用L-WNT3A进行处理没有影响植入效率(图27A、B；在图27C中定量)，但程序性细胞死亡的分析证明了L-WNT3A处理的BGM老年具有比L-PBS处理的样品更少的TUNEL+ve细胞(图27D、图27E；在图27F中定量)。减少的细胞凋亡也在移植后第7天观察到(图27G、图27H；在图27I中定量)。新骨形成充当对破骨细胞介导的骨重建的刺激，并且在L-WNT3A处理的BGM老年样品中新形成的类骨质基质周围观察到TRAP活性(图27J、图27K；在图27L中定量)。
L-WNT3A激活BGM老年中的干细胞和改善脊柱融合模型中的骨产生
还鉴别了BGM中导致L-WNT3A介导的成骨能力激增的细胞群体。使用标准程序从BGM分离了两个干细胞群体并使用L-PBS(作为对照)或L-WNT3A基于它们的Wnt反应性进行评估。
时间进程分析揭示了干细胞对L-WNT3A处理的响应。在L-WNT3A暴露的15h内，观察到Axin2的4倍激活，并在36h时实现最大Axin2激活(图25A)。如通过在60h时间点处干细胞中减少的Axin2表达所示出的，该作用是瞬时的(图25A)。使用了从BGM分离的第二干细胞群体来验证干细胞对L-WNT3A的反应(图25B)。
BGM的激活状态通过qRT-PCR示出。收获BGM老年，用L-WNT3A或L-PBS处理，然后使用Axin2和Lef1表达来分析其Wnt反应性状态(图25C)。在12h内，可检测到Lef1升高。在24h内，Axin2和Lef1都升高(图25C)。这些分析确认了BGM的WNT介导的激活状态；下文中称这种材料为BGMACT。
还测试了大鼠脊柱融合模型中BGMACT的治疗潜力。剥除第四和第五腰椎(例如，L4-5)横突的皮质(图25D)，并在此过程期间收获来自髂嵴的自体BGM老年和用L-WNT3A(或L-PBS)处理1h。然后将所得材料BGMACT(或BGM老年)移植到L4-5突起上和之间(图25E)。在手术后第2天，通过微CT评估BGM体积。这些分析验证了BGM老年(图25F)和BGMACT(图25G)在开始时含有相当量的矿化组织(还参见图26)。
在手术后第49天，再评估新骨形成的体积。微CT数据的三维重建证实了在用BGM老年处理的位点中差的骨再生(灰色；图25H)。相反，用BGMACT处理的位点示出了强健骨形成和横突融合的迹象(蓝色；图25I)。定量了L4和L5横突上和之间的新骨体积。与BGM老年相比，BGMACT造成了更多的矿化基质(图25J)。因此，L-WNT3A处理改善了来自老年动物的自体移植物的成骨能力。
实施例4
从对于无血清CHO细胞特异性的载体表达Wnt3a
分泌Wnt3a的CHO悬浮(CHO-S)细胞还可以在适合的表达培养基(例如来自Invitogen的表达培养基)中无血清条件下培养。使用了cGMP相容性CHO-S细胞系和两种类型的载体克隆WNT3A。一种载体是pOptivec，其是允许快速克隆含有哺乳动物分泌信号的基因和CMV启动子下游的感兴趣基因的基因改造的双顺反子质粒。二氢叶酸还原酶选择标记允许快速选择。这种载体被用于CHO-S细胞的瞬时转染。另一种载体是pTargeT。这种载体被用于CHO-S细胞的瞬时转染，并且还产生表达WNT3A的稳定细胞系。
在诱导后的第3天和第13天之间收集来自CHO细胞培养物的条件培养基(CM)并合并。基于每天对CM中蛋白质产生的分析，确定了培养条件下最优的天数范围。在这些条件下，观察到高蛋白质产生在第3-13天之间发生，而细胞在第13天后开始死亡。
实施例5
用脂质限定的代用品替换血清
测试了血清中的脂质组分以确定它们是否可以被限定的脂质组替换。炭剥离从血清除去了非极性亲脂性物质(病毒、生长因子、激素)。与其中CHO细胞在10％FBS中生长的对照条件相比，在炭剥离的FBS中生长的CHO细胞不分泌Wnt3a。这些数据支持了Wnt3a分泌需要血清的亲脂性组分的结论。补充含有胆固醇、生育酚和非动物来源的脂肪酸(亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸)的脂质混合物1(Sigma)将改善CHO细胞生长速率并将恢复CHO细胞的Wnt3a分泌。
实施例6
血清依赖性的逐步降低
还测试了作为达到WNT3A产生的非血清依赖性方法的手段的顺序培养。CHO细胞生长速率随血清减少同时降低；因此，重要的是改变收集条件培养基的时间范围。在一些情况下，细胞适应于0.5％FBS。
虽然在前文描述中，本发明参照某些实施方式进行说明，但其并非限制于此。实际上，除那些已在本文中示出和描述的以外，本发明的各种改变从前文描述来看对本领域技术人员是明显的，并且落入所附权利要求的范围之内。

Claims (293)

1.一种组合物，其包含功能活性Wnt3a多肽和含有脂质体的水性溶液，其中所述功能活性Wnt3a多肽包含在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处的脂质修饰。
2.权利要求1所述的稳定组合物，其中所述功能活性Wnt3a多肽未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述功能活性Wnt3a多肽被整合到所述脂质体膜中。
4.权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述功能活性Wnt3a多肽从所述脂质体膜突出到所述脂质膜的外表面上。
5.权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述功能活性Wnt3a多肽未被引入到所述脂质体的水性核心中。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述功能活性Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。
7.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述功能活性Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。
8.权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述功能活性Wnt3a多肽的浓度在约5μg/μL和约15μg/μL之间或约8μg/μL和约12μg/μL之间。
9.权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中构成所述脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。
10.权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中构成所述脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃，约15℃至约25℃，或约20℃至约25℃的相变温度。
11.权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述脂质体在约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有0的净电荷。
12.权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。
13.权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述脂质体还包含胆固醇。
14.权利要求12或13所述的组合物，其中所述DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。
15.权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述Wnt3a多肽是哺乳动物Wnt3a多肽。
16.权利要求15所述的组合物，其中所述哺乳动物是人。
17.权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述脂质修饰是棕榈酰化。
18.权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述Wnt3a多肽被进一步糖基化。
19.权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物是稳定的组合物。
20.权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述组合物稳定多达约106天而没有实质活性损失。
21.权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物在约1℃和约8℃之间的温度下是稳定的。
22.权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物在氮气下稳定。
23.一种组合物，其包含功能活性哺乳动物Wnt多肽和含有脂质体的水性溶液，其中构成所述脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。
24.一种组合物，其包含功能活性哺乳动物Wnt多肽和含有脂质体的水性溶液，其中构成所述脂质体的所述磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。
25.权利要求23或24所述的组合物，其中所述Wnt多肽被整合到所述脂质体膜中。
26.权利要求23-25中任一项所述的组合物，其中所述Wnt多肽从所述脂质体膜突出到所述脂质膜的外表面上。
27.权利要求23-26中任一项所述的组合物，其中所述Wnt多肽未被引入到所述脂质体的水性核心中。
28.权利要求23-27中任一项所述的组合物，其中所述Wnt多肽是Wnt3a多肽。
29.权利要求28所述的组合物，其中所述Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。
30.权利要求28所述的组合物，其中所述Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。
31.权利要求28-30中任一项所述的组合物，其中所述Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
32.权利要求23-27中任一项所述的组合物，其中所述Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
33.权利要求23-32中任一项所述的组合物，其中所述Wnt多肽的浓度在约5μg/μL和约15μg/μL之间或约8μg/μL和约12μg/μL之间。
34.权利要求23-33中任一项所述的组合物，其中所述脂质体在约6.5和约8.0之间的pH下具有0的净电荷。
35.权利要求23-34中任一项所述的组合物，其中所述脂质体在约6.5和约8.0之间的pH下具有净的正电荷或净的负电荷。
36.权利要求23-34中任一项所述的组合物，其中所述磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。
37.权利要求23-36中任一项所述的组合物，其中所述脂质体还包含胆固醇。
38.权利要求36或37所述的组合物，其中所述DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。
39.权利要求23-38中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物是人。
40.权利要求23-39中任一项所述的组合物，其中所述脂质修饰是棕榈酰化。
41.权利要求23-40中任一项所述的组合物，其中所述Wnt多肽被进一步糖基化。
42.权利要求23-41中任一项所述的组合物，其中所述组合物是稳定的组合物。
43.权利要求23-42中任一项所述的组合物，其中所述组合物稳定多达约106天而没有实质活性损失。
44.权利要求23-43中任一项所述的组合物，其中所述组合物在约1℃和约8℃之间的温度下是稳定的。
45.权利要求23-44中任一项所述的组合物，其中所述组合物在氮气下稳定。
46.一种制备脂质体Wnt3a多肽的方法，其包括：
a)从包含哺乳动物细胞的条件培养基收获Wnt3a多肽；
b)将所述Wnt3a多肽引入固定有磺化聚芳族化合物的离子交换柱；
c)用不连续梯度从所述离子交换柱洗脱所述Wnt3a多肽；和
d)将来自步骤(c)的所述Wnt3a多肽与脂质体水性溶液接触。
47.权利要求46所述的方法，其中所述接触在约21℃和约25℃之间的温度下发生。
48.权利要求46所述的方法，其中所述接触的时间在约30分钟和约24小时之间。
49.权利要求46所述的方法，其中所述不连续梯度包括第一梯度和第二梯度。
50.权利要求49所述的方法，其中所述第一梯度包括包含50mM氯化钾的缓冲溶液，并且所述第二梯度包括包含在约150mM和约1.5M之间氯化钾的缓冲溶液。
51.权利要求50所述的方法，其中所述缓冲溶液还包含洗涤剂。
52.权利要求51所述的方法，其中所述洗涤剂是CHAPS或TritonX-100。
53.权利要求46所述的方法，其中所述条件培养基包含最多10％胎牛血清。
54.权利要求46所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
55.权利要求46所述的方法，其中在步骤(c)后，所述Wnt3a多肽的收率在约60％和约90％之间。
56.权利要求46所述的方法，其中构成所述脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。
57.权利要求46或56所述的方法，其中构成所述脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃，约15℃至约25℃，或约20℃至约25℃的相变温度。
58.权利要求46、56或57中任一项所述的方法，其中所述脂质体在约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有0的净电荷。
59.权利要求46或56-58中任一项所述的方法，其中所述磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。
60.权利要求46或56-59中任一项所述的方法，其中所述脂质体还包含胆固醇。
61.权利要求59或60所述的方法，其中所述DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。
62.权利要求46所述的方法，其中所述Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。
63.权利要求46所述的方法，其中所述Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。
64.权利要求46、62或63中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
65.权利要求46或62-64中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a多肽是哺乳动物Wnt3a多肽。
66.权利要求65所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
67.权利要求46所述的方法，其中所述条件培养基包含血清或血清代用品。
68.权利要求67所述的方法，其中所述条件培养基包含血清。
69.权利要求68所述的方法，其中所述血清是胎牛血清。
70.权利要求69所述的方法，其中所述条件培养基中所述血清的浓度在约0.1％和约15％之间。
71.权利要求67所述的方法，其中所述条件培养基包含血清代用品。
72.权利要求71所述的方法，其中所述血清代用品是基于脂质的代用品。
73.权利要求46所述的方法，其中所述条件培养基是无血清培养基。
74.权利要求46-66中任一项所述的方法，其中所述脂质修饰是棕榈酰化。
75.权利要求46-74中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a多肽被进一步糖基化。
76.权利要求46-75中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a产物通过离心从样品混合物分离。
77.权利要求76所述的方法，其中所述离心的时间在约1℃和约8℃之间的温度下为最多1小时。
78.权利要求46-77中任一项所述的方法，其中在离心后所述Wnt3a产物被重悬在无菌1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
79.权利要求46-78中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a产物在氮气下稳定。
80.权利要求46-79中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a产物在约1℃和约8℃之间的温度下是稳定的。
81.一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括将包含Wnt多肽的样品与脂质体水性溶液接触，其中构成所述脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。
82.一种制备脂质体Wnt多肽的方法，其包括将包含Wnt多肽的样品与脂质体水性溶液接触，其中构成所述脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。
83.权利要求81或82所述的方法，其中所述接触在约21℃和约25℃之间的温度下发生。
84.权利要求81或82所述的方法，其中所述接触的时间在约6小时和约24小时之间。
85.权利要求81或82所述的方法，其还包括在将所述Wnt多肽与脂质体水性溶液接触之前的额外纯化步骤。
86.权利要求85所述的方法，其中所述额外纯化步骤是离子交换纯化步骤、疏水纯化步骤或亲和纯化步骤。
87.权利要求86所述的方法，其中所述额外纯化步骤是离子交换纯化步骤。
88.权利要求87所述的方法，其中所述离子交换纯化步骤包括将所述样品与磺化聚芳族化合物固定的珠或固定有磺化聚芳族化合物的柱接触。
89.权利要求87或88所述的方法，其中所述离子交换纯化步骤包括不连续梯度。
90.权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述离子交换纯化缓冲液包含洗涤剂。
91.权利要求90所述的方法，其中所述洗涤剂是CHAPS或TritonX-100。
92.权利要求86所述的方法，其中所述额外纯化步骤是疏水纯化步骤。
93.权利要求92所述的方法，其中所述疏水纯化步骤包括蛋白A固定的珠或蛋白A柱。
94.权利要求85-93中任一项所述的方法，其中在所述额外纯化步骤后，所述Wnt多肽的收率在约60％和约99％之间。
95.权利要求81-94中任一项所述的方法，其还包括从包含来自表达细胞系的细胞的条件培养基收获Wnt多肽。
96.权利要求95所述的方法，其中所述表达细胞系是哺乳动物表达细胞系。
97.权利要求96所述的方法，其中所述哺乳动物表达细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
98.权利要求97所述的方法，其中所述条件培养基包含血清或血清代用品。
99.权利要求98所述的方法，其中所述血清是胎牛血清。
100.权利要求99所述的方法，其中所述条件培养基中所述血清的浓度在约0.1％和约15％之间。
101.权利要求98所述的方法，其中所述条件培养基包含血清代用品。
102.权利要求101所述的方法，其中所述血清代用品是基于脂质的代用品。
103.权利要求97所述的方法，其中所述条件培养基是无血清培养基。
104.权利要求81-98中任一项所述的方法，其中所述Wnt多肽是Wnt3a多肽。
105.权利要求104所述的方法，其中所述Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。
106.权利要求104所述的方法，其中所述Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。
107.权利要求104-106中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
108.权利要求81-107中任一项所述的方法，其中所述Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
109.权利要求81-108中任一项所述的方法，其中所述脂质体在约6.5和约8.0、约7.0和约7.8、或约7.2和约7.6之间的pH下具有0的净电荷。
110.权利要求81-109中任一项所述的方法，其中所述磷脂是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。
111.权利要求81-110中任一项所述的方法，其中所述脂质体还包含胆固醇。
112.权利要求110或111所述的方法，其中所述DMPC和胆固醇的浓度由在约70:30和约100:0之间的比率限定。
113.权利要求81-112中任一项所述的方法，其中所述Wnt多肽是哺乳动物Wnt多肽。
114.权利要求113所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
115.权利要求81-114中任一项所述的方法，其中所述脂质修饰是棕榈酰化。
116.权利要求81-115中任一项所述的方法，其中所述Wnt多肽被进一步糖基化。
117.权利要求81-116中任一项所述的方法，其中所述Wnt产物通过离心从样品混合物分离。
118.权利要求117所述的方法，其中所述离心的时间在约1℃和约8℃之间的温度下为最多1小时。
119.权利要求81-118中任一项所述的方法，其中在离心后所述Wnt产物被重悬到无菌1XPBS中。
120.权利要求81-119中任一项所述的方法，其中所述Wnt产物在氮气下稳定。
121.权利要求81-120中任一项所述的方法，其中所述Wnt产物在约1℃和约8℃之间的温度下是稳定的。
122.一种分离的强化哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，所述细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。
123.权利要求122所述的组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是啮齿动物骨髓细胞。
124.权利要求123所述的组合物，其中所述啮齿动物骨髓细胞从大于10月龄的啮齿动物收获。
125.权利要求122所述的组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是人骨髓细胞。
126.权利要求125所述的组合物，其中所述人骨髓细胞从处于或大于35岁的受试者获得。
127.一种从处于或大于35岁的人受试者获得的哺乳动物骨髓细胞的组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，所述哺乳动物骨髓细胞表达增强表达水平的选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物。
128.权利要求122或127所述的组合物，其中所述生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。
129.权利要求122或127所述的组合物，其中所述生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
130.权利要求122-129中任一项所述的组合物，其中所述增强的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。
131.权利要求130所述的组合物，其中与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，所述增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。
132.权利要求122-131中任一项所述的组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，所述哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。
133.权利要求132所述的组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞中所述降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。
134.权利要求122-133中任一项所述的组合物，其中所述骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。
135.权利要求134所述的组合物，其中所述细胞凋亡水平的降低为约50％。
136.权利要求122-135中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比包含增强的成骨潜力。
137.权利要求136所述的组合物，其中所述增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。
138.权利要求137所述的组合物，其中所述新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。
139.权利要求137或138所述的组合物，其中与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，所述移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。
140.权利要求122-139中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
141.权利要求140所述的组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
142.权利要求141所述的组合物，其中所述粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
143.权利要求141所述的组合物，其中所述粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
144.权利要求122-143中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。
145.权利要求144所述的组合物，其中所述自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
146.权利要求145所述的组合物，其中所述自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
147.权利要求146所述的组合物，其中所述自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
148.权利要求146所述的组合物，其中所述自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
149.权利要求122-143中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。
150.权利要求149所述的组合物，其中所述同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
151.权利要求150所述的组合物，其中所述同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
152.权利要求151所述的组合物，其中所述同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
153.权利要求151所述的组合物，其中所述同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
154.权利要求126或127所述的组合物，其中用脂质体Wnt多肽处理后的所述人骨髓细胞表现出在小于35岁的人受试者中观察到的生物标志物表达水平。
155.权利要求122-154中任一项所述的组合物，其中所述脂质体Wnt多肽包含Wnt多肽和脂质体水性溶液。
156.权利要求155所述的组合物，其中构成所述脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。
157.权利要求155或156所述的组合物，其中构成所述脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。
158.权利要求155所述的组合物，其中所述Wnt多肽是Wnt3a多肽。
159.权利要求158所述的组合物，其中所述Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。
160.权利要求158所述的组合物，其中所述Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。
161.权利要求158-160中任一项所述的组合物，其中所述Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中描述的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
162.权利要求155所述的组合物，其中所述Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
163.一种通过包括将分离的哺乳动物骨髓细胞与脂质体Wnt多肽体外接触的方法产生的哺乳动物骨髓组合物，其中所述接触的时间在约30分钟和约4小时之间。
164.权利要求163所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述接触的温度在约0℃和约37℃或约20℃和约25℃之间。
165.权利要求163或164所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述方法还包括在接触后的清洗步骤以除去游离的脂质体Wnt多肽。
166.权利要求163-165中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述方法还包括将所述脂质体Wnt多肽移植到骨缺损位点。
167.权利要求163-166中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，所述骨髓细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。
168.权利要求163-166中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。
169.权利要求163-166中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
170.权利要求167-169中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，所述增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。
171.权利要求163-170中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，所述哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。
172.权利要求171所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞中所述降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。
173.权利要求163-172中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。
174.权利要求173所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述细胞凋亡水平的降低为约50％。
175.权利要求163-174中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。
176.权利要求175所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。
177.权利要求176所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。
178.权利要求176或177所述的哺乳动物骨髓组合物，其中与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，所述移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。
179.权利要求163-178中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
180.权利要求179所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
181.权利要求180所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
182.权利要求180所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
183.权利要求163-182中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。
184.权利要求183所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述自体骨髓细胞从股骨、胫骨和/或髂嵴收获。
185.权利要求183或184所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
186.权利要求185所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
187.权利要求186所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
188.权利要求186所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
189.权利要求163-182中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述分离的哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。
190.权利要求189所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
191.权利要求190所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
192.权利要求191所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
193.权利要求191所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
194.权利要求163-193中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是啮齿动物骨髓细胞。
195.权利要求194所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述啮齿动物骨髓细胞从大于10月龄的啮齿动物收获。
196.权利要求163-193中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述哺乳动物骨髓细胞是人骨髓细胞。
197.权利要求196所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述人骨髓细胞从处于或大于35岁的受试者收获。
198.权利要求196或197所述的哺乳动物骨髓组合物，其中用脂质体Wnt多肽处理后的所述人骨髓细胞表现出在小于35岁的受试者中观察到的生物标志物表达水平。
199.权利要求163-198中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述脂质体Wnt多肽包含Wnt多肽和脂质体水性溶液。
200.权利要求199所述的哺乳动物骨髓组合物，其中构成所述脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。
201.权利要求199或200所述的哺乳动物骨髓组合物，其中构成所述脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。
202.权利要求199所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述Wnt多肽是Wnt3a多肽。
203.权利要求202所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。
204.权利要求202所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。
205.权利要求202-204中任一项所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
206.权利要求199所述的哺乳动物骨髓组合物，其中所述Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
207.一种处理受试者中的骨缺损的方法，其包括：
a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体Wnt3a多肽体外接触；
b)清洗所述样品以除去游离的脂质体Wnt3a多肽；和
c)将所述脂质体Wnt3a多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。
208.权利要求207所述的方法，其中所述接触的温度在约0℃和约37℃或约20℃和约25℃之间。
209.权利要求207所述的方法，其中所述接触的时间在约30分钟和约4小时之间。
210.权利要求207所述的方法，其中与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，所述骨髓细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。
211.权利要求207所述的方法，其中所述生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。
212.权利要求207所述的方法，其中所述生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
213.权利要求207或210-212中任一项所述的方法，其中与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，所述增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。
214.权利要求207或210-213中任一项所述的方法，其中在用脂质体Wnt3a多肽处理后，所述哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。
215.权利要求214所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞中所述降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。
216.权利要求207或210-215中任一项所述的方法，其中所述骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。
217.权利要求216所述的方法，其中所述细胞凋亡水平的降低为约50％。
218.权利要求207或210-217中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。
219.权利要求218所述的方法，其中所述增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。
220.权利要求219所述的方法，其中所述新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。
221.权利要求219或220所述的方法，其中与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，所述移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。
222.权利要求207-221中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
223.权利要求222所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
224.权利要求223所述的方法，其中所述粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
225.权利要求223所述的方法，其中所述粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
226.权利要求207-225中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。
227.权利要求226所述的方法，其中所述自体骨髓细胞从股骨、胫骨和/或髂嵴收获。
228.权利要求226或227所述的方法，其中所述自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
229.权利要求228所述的方法，其中所述自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
230.权利要求229所述的方法，其中所述自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
231.权利要求229所述的方法，其中所述自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
232.权利要求207-225中任一项所述的方法，其中所述分离的哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。
233.权利要求232所述的方法，其中所述同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
234.权利要求233所述的方法，其中所述同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
235.权利要求234所述的方法，其中所述同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
236.权利要求234所述的方法，其中所述同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
237.权利要求207-236中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞是啮齿动物骨髓细胞。
238.权利要求237所述的方法，其中所述啮齿动物骨髓细胞从大于10月龄的啮齿动物收获。
239.权利要求207-236中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞是人骨髓细胞。
240.权利要求239所述的方法，其中所述人骨髓细胞从处于或大于35岁的受试者收获。
241.权利要求239或240所述的方法，其中用脂质体Wnt3a多肽处理后所述人骨髓细胞表现出在小于35岁的受试者中观察到的生物标志物表达水平。
242.权利要求207-241中任一项所述的方法，其中所述脂质体Wnt3a多肽包含Wnt3a多肽和脂质体水性溶液。
243.权利要求242所述的方法，其中构成所述脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。
244.权利要求242或243所述的方法，其中构成所述脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。
245.权利要求242所述的方法，其中所述Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。
246.权利要求242所述的方法，其中所述Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。
247.权利要求242、245或246中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
248.一种处理受试者中的骨缺损的方法，其包括：
a)将包含哺乳动物骨髓细胞的样品与脂质体Wnt多肽体外接触；
b)清洗所述样品以除去游离的脂质体Wnt多肽；和
c)将所述脂质体Wnt多肽处理的骨移植材料移植到骨缺损位点中。
249.权利要求248所述的方法，其中所述接触的温度在约0℃和约37℃或约20℃和约25℃之间。
250.权利要求248所述的方法，其中所述接触的时间在约30分钟和约4小时之间。
251.权利要求248所述的方法，其中与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，所述骨髓细胞具有选自Runx2、Osterix、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4的一种或多种生物标志物的增强的表达水平。
252.权利要求248所述的方法，其中所述生物标志物选自骨钙蛋白、骨桥蛋白、Axin2、Lef1和Tcf4。
253.权利要求248所述的方法，其中所述生物标志物选自骨钙蛋白和骨桥蛋白。
254.权利要求248或251-253中任一项所述的方法，其中与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比，所述增强的表达水平在约2％和约20％或约4％和约10％之间。
255.权利要求248或251-254中任一项所述的方法，其中在用脂质体Wnt多肽处理后，所述哺乳动物骨髓细胞还具有选自SOX9和PPARγ的生物标志物的降低的表达水平。
256.权利要求255所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞中所述降低的表达水平是与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比。
257.权利要求248或251-256中任一项所述的方法，其中所述骨髓细胞还包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比细胞凋亡水平的降低。
258.权利要求257所述的方法，其中所述细胞凋亡水平的降低为约50％。
259.权利要求248或251-258中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞包括与未处理的哺乳动物骨髓细胞相比增强的成骨潜力。
260.权利要求259所述的方法，其中所述增强的成骨潜力包括在移植经处理的哺乳动物骨髓细胞后在骨缺损位点处的新骨生长水平。
261.权利要求260所述的方法，其中所述新骨生长水平是与移植的未处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比。
262.权利要求260或261所述的方法，其中与移植的未处理的哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平相比，所述移植的经处理哺乳动物骨髓细胞的新骨生长水平在约1％和约20％或约5％和约12％之间。
263.权利要求248-262中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
264.权利要求263所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
265.权利要求264所述的方法，其中所述粘附的骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
266.权利要求264所述的方法，其中所述粘附的骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
267.权利要求248-266中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞是自体骨髓细胞。
268.权利要求267所述的方法，其中所述自体骨髓细胞从股骨、胫骨和/或髂嵴收获。
269.权利要求267-268中任一项所述的方法，其中所述自体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
270.权利要求269所述的方法，其中所述自体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
271.权利要求270所述的方法，其中所述自体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
272.权利要求270所述的方法，其中所述自体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
273.权利要求248-266中任一项所述的方法，其中所述分离的哺乳动物骨髓细胞是同种异体骨髓细胞。
274.权利要求273所述的方法，其中所述同种异体骨髓细胞包括粘附的和非粘附的骨髓细胞。
275.权利要求274所述的方法，其中所述同种异体骨髓细胞是粘附的骨髓细胞。
276.权利要求275所述的方法，其中所述同种异体骨髓细胞包括骨髓干细胞和骨髓祖细胞。
277.权利要求275所述的方法，其中所述同种异体骨髓细胞包括骨髓基质细胞。
278.权利要求248-277中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞是啮齿动物骨髓细胞。
279.权利要求278所述的方法，其中所述啮齿动物骨髓细胞从大于10月龄的啮齿动物收获。
280.权利要求248-277中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物骨髓细胞是人骨髓细胞。
281.权利要求280所述的方法，其中所述人骨髓细胞从处于或大于35岁的受试者收获。
282.权利要求280或281所述的方法，其中用脂质体Wnt多肽处理后所述人骨髓细胞表现出在小于35岁的受试者中观察到的生物标志物表达水平。
283.权利要求248-282中任一项所述的方法，其中所述脂质体Wnt多肽包含Wnt多肽和脂质体水性溶液。
284.权利要求283所述的方法，其中构成所述脂质体的磷脂具有约10℃至约25℃的相变温度。
285.权利要求283或284所述的方法，其中构成所述脂质体的磷脂具有在约12个碳和约14个碳之间的尾部碳长度。
286.权利要求283所述的方法，其中所述Wnt多肽是Wnt3a多肽。
287.权利要求286所述的方法，其中所述Wnt3a多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的序列一致性。
288.权利要求286所述的方法，其中所述Wnt3a多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。
289.权利要求286-288中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a多肽在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基209的氨基酸位置处被脂质修饰，并且未在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸残基77的氨基酸位置处被脂质修饰。
290.权利要求283所述的方法，其中所述Wnt多肽是Wnt5a多肽或Wnt10b多肽。
291.一种用于产生包含权利要求23-45所述的脂质体Wnt多肽的骨移植材料的试剂盒。
292.一种用于产生包含权利要求1-22所述的脂质体Wnt3a多肽的骨移植材料的试剂盒。
293.一种用于产生包含权利要求127-162所述的分离的强化哺乳动物骨髓细胞组合物的骨移植材料的试剂盒。
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