CN105555146A - 包含外源性蛋白酶的基于藻类的动物饲料组合物、动物饲料添加剂、及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物饲料组合物，其包括总计为所述组合物48-70％w/w的量的一种或多种谷物；总计为所述组合物15-30％w/w的量的非藻类蛋白源；总计为所述组合物3-15％w/w的量的藻类；总计为所述组合物0.01-0.1％w/w的外源性蛋白酶；和总计为所述组合物0.5-15％w/w的量的对所述藻类异源的油。本发明还涉及动物饲料添加剂、饲养动物的方法、改善动物饲养效率的方法和对动物饲料的改进。

Description

包含外源性蛋白酶的基于藻类的动物饲料组合物、动物饲料添加剂、及其用途

本申请要求2013年7月11日提交的美国临时专利申请61/845,243的优先权，其全部内容在此通过引用并入。

发明领域

本发明涉及基于藻类的动物饲料组合物、动物饲料添加剂、及其用途

背景技术

玉米和大豆的种植面积分别占国家耕地的29％和26％(Cromwell，“SoybeanMeal-The“GoldStandard，”TheFarmer’sPride，KPPANews，Vol.11，No.20，11月10日，1999)。在美国生产的约60％的玉米和47％的大豆被用于饲料业，主要用来饲养鸡和猪(Olson，“BelowCostFeedCrops：AnIndirectSubsidyforIndustrialAnimalFactories，”Issues202：222(2011))。尽管它们代表了两大产肉品种，但其对玉米和大豆的大量消耗直接与人类的食物供应产生竞争。因此，需要替代的饲料成分来维持畜牧业和人类食物保障。已经在用于鸡(Grauetal.，“Sewage-GrownAlgaeasaFeedstuffforChicks，”Poult.Sci.36：1046-1051(1957)；Mokadyetal.，“AlgaeGrownonWastewaterasaSourceofProteinforYoungChickensandRats，”Nutr.Rep.Int.9：383-390(1979)；Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013))和猪(Hintzetal.，“Sewage-GrownAlgaeasaProteinSupplementforSwine，”Anim.Prod.9：135-140(1967)；Yapetal.，“FeasibilityofFeedingSpirulina-Maxima，Arthrospira-PlatensisorChlorellaSptoPigsWeanedtoaDryDietat4to8DaysofAge，”Nutr.Rep.Int.25：543-552(1982)；Isaacsetal.，“APartialReplacementofSoybeanMealbywholeorDefattedAlgalMealinDietforWeanlingPigsDoesnotAffecttheirPlasmaBiochemicalIndicators，”J.ofAnimalSci.89：723-723(2011))的饮食中测试了各种海洋微藻。伴随着最近在使用微藻作为原料用于第三代生物燃料生产方面的兴趣(Chisti，“BiodieselfromMicroalgae，”Biotechnol.Adv.25：294-306(2007))，已经确定了将脱脂硅藻微藻十字脆杆藻亚属(Staurospirasp.)加入到肉仔鸡(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013))和断奶仔猪(Isaacsetal.，“APartialReplacementofSoybeanMealbywholeorDefattedAlgalMealinDietforWeanlingPigsDoesnotAffecttheirPlasmaBiochemicalIndicators，”J.ofAnimalSci.89：723-723(2011))的饮食中的功效。

在连续三个鸡的实验中，证明了在肉仔鸡饮食中加入7.5％的脱脂硅藻微藻来取代玉米和豆粕并不破坏其在整个生产周期(从第1天到第42天)中的生长表现或生化状态(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013))。然而，加入10％的脱脂硅藻微藻来取代玉米和豆粕或者加入7.5％的脱脂硅藻微藻来单独取代豆粕导致了对鸡生长表现的负面影响。由于脱脂硅藻微藻含有比豆粕更低水平的粗蛋白(19.1对48.5％)，所以实际的问题是肉仔鸡能否耐受加入更多的其他类型的具有更优的蛋白质、氨基酸和其他组分谱的脱脂微藻生物质。虽然在饮食中补充高达10％的脱脂硅藻微藻对鸡的一些血浆生化指标几乎没有效应，但是对禽类氮代谢的血浆尿酸、终产物和敏感生物标记物的效应(Donsboughetal.，“UricAcid，Urea，andAmmoniaConcentrationsinSerumandUricAcidConcentrationinExcretaasIndicatorsofAminoAcidUtilizationinDietsforBroilers，”Poult.Sci.89：287-294(2010)；Hernandezetal.，“EffectofLow-ProteinDietsandSingleSexonProductionPerformance，PlasmaMetabolites，Digestibility，andNitrogenExcretionin1-to48-Day-OldBroilers，”Poult.Sci.91：683-692(2012))仍然不确定(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013)；Lengetal.，“EffectofDietaryDefattedDiatomBiomassonEggProductionandQualityofLayingHens，”J.Anim.Sci.Biotechnol.5：3(2014))。还没有确定补充性的脱脂硅藻微藻对血浆氨基酸谱的效应。此外，虽然通常在肉仔鸡的饮食中掺入非淀粉多糖(NSP)降解酶来改善营养价值，但是以往的研究仅测试了在含7.5％脱脂硅藻微藻饲料中的补充性的可商购蛋白酶的效应(Lumetal.，“EffectsofVariousReplacementsofCornandSoybyDefattedMicroalgalMealonGrowthPerformanceandBiochemicalStatusofWeanlingPigs，”J.Anim.Sci.90：701-701(2012)；Simbayaetal.，“TheEffectsofProteaseandCarbohydraseSupplementationontheNutritiveValueofCanolaMealforPoultry：InVitroandInVivoStudies，”Anim.FeedSci.Technol.61：219-234(1996)；Ghazietal.，“ThePotentialfortheImprovementoftheNutritiveValueofSoya-BeanMealbyDifferentProteasesinBroilerChicksandBroilerCockerels，”Br.Poult.Sci.43：70-77(2002)；O′Sheaetal.，“TheEffectofProteaseandXylanaseEnzymesonGrowthPerformance，NutrientDigestibility，andManureOdourinGrower-FinisherPigs，”Anim.FeedSci.Technol.189：88-97(2014))。补充NSP酶可能在含微藻的饮食中特别有用，这归因于其生物质中存在复杂的碳水化合物(Brownetal.，”NutritionalPropertiesofMicroalgaeforMariculture，”Aquaculture151：315-331(1997)；Chenetal.，“Microalgae-BasedCarbohydratesforBiofuelProduction，”Biochem.Eng.J.78：1-10(2013))，并且其他微藻生物质可以呈现出与脱脂硅藻微藻不同的对外源性蛋白酶的易感性(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013))。

尽管将微藻作为新的或者替代的蛋白补充剂进行了探讨，以前的研究(Venkataramanetal.，“ReplacementValueofBlue-GreenAlga(Spirulinaplatensis)forFishmealandaVitamin-MineralPremixforBroilerChicks，”Br.Poult.Sci.35：373-381(1994)；Becker，“Micro-AlgaeasaSourceofProtein，”Biotechnol.Adv.25：207-210(2007))并没有考查饲喂藻类对机体新陈代谢的影响或者潜在的调节机制。具体地，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路是细胞生长的关键调节物，其整合来自营养物、能量状态和生长因子的信号来调节新陈代谢(Sarbassovetal.，“GrowingRolesforthemTORPathway，”Curr.Opin.CellBiol.17：596-603(2005))。饲喂方式(Boussaid-Ometal.，“RegulatorsofProteinMetabolismareAffectedbyCyclicalNutritionalTreatmentswithDietsVaryinginProteinandEnergyContent，”J.Nutr.Biochem.23：1467-1473(2012))、氨基酸丰度和可用度(Kimballetal.，“ControlofProteinSynthesisbyAminoAcidAvailability，”Curr.OpinionClin.Nutr.Metab.Care5：63-67(2002)；Kimballetal.，“SignalingPathwaysandMolecularMechanismsThroughwhichBranched-ChainAminoAcidsMediateTranslationalControlofProteinSynthesis，”J.Nutr.136：227S-231S(2006))、蛋白质丰度(Boussaid-Ometal.，“RegulatorsofProteinMetabolismareAffectedbyCyclicalNutritionalTreatmentswithDietsVaryinginProteinandEnergyContent，”J.Nutr.Biochem.23：1467-1473(2012))和蛋白质来源(Luoetal.，“EffectsofDifferentDietaryProteinSourcesonExpressionofGenesRelatedtoProteinMetabolisminGrowingRats，”Br.J.Nutr.104：1421(2010))能够影响此通路。mTOR的下游靶点包括介导翻译起始步骤的真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)以及被认为调节蛋白质翻译的核糖体蛋白S(S6)和核糖体蛋白S6激酶(S6K1)(Wangetal.，“ThemTORPathwayintheControlofProteinSynthesis，”Physiol.21：362-369(2006))。由于肉仔鸡在生长期间经历高强度的蛋白质合成，所以确定在其饮食中加入微藻生物质对涉及mTOR通路的信号蛋白的功能性表达的效应不仅有新意，而且相关。

正如肉仔鸡一样，断奶仔猪以较快的速度生长并伴有高强度的蛋白质代谢(Robison，“GrowthPatternsinSwine，”J.Anim.Sci.42：1024-1035(1976))。同样，以前的研究(Lumetal.，“EffectsofVariousReplacementsofCornandSoybyDefattedMicroalgalMealonGrowthPerformanceandBiochemicalStatusofWeanlingPigs，”J.Anim.Sci.90：701-701(2012))显示，断奶仔猪在以含7.5％脱脂硅藻微藻的饮食取代玉米和豆粕情况下生长良好，但在用15％的脱脂硅藻微藻替代玉米和豆粕的条件下没有此效果。随后，出现了同样的问题：断奶仔猪能否耐受加入的更高水平的含有更高蛋白的脱脂绿色微藻生物质。然而，对于猪和鸡的研究有不同的考虑。首先，在猪的研究中，加入的微藻生物质对营养状况的血浆生化量度，包括抗酒石酸酸性磷酸酶(“TRAP”)、碱性磷酸酶(“AKP”)和丙氨酸转氨酶(“ALT”)(Isaacsetal.，“APartialReplacementofSoybeanMealbywholeorDefattedAlgalMealinDietforWeanlingPigsDoesnotAffecttheirPlasmaBiochemicalIndicators，”J.ofAnimalSci.89：723-723(2011))的效应没有肉仔鸡研究中的效应那么确定。通常使用血浆尿素氮(“PUN”)和氨基酸谱来估计饲料蛋白质对于猪的营养价值(Kohnetal.，“UsingBloodUreaNitrogentoPredictNitrogenExcretionandEfficiencyofNitrogenUtilizationinCattle，Sheep，Goats，Horses，Pigs，andRats，”J.Anim.Sci.83：879-889(2005))。虽然对于猪能方便地将氧化铬作为指示剂加入饮食中来估计总氨基酸全肠道表观消化率而对于鸡这是不可能的(Steinetal.，“ComparativeProteinandAminoAcidDigestibilitiesinGrowingPigsandSows，”J.Anim.Sci.77：1169-1179(1999))，但是，从前者进行组织取样来研究饮食治疗的代谢性调节比从后者中取样更困难并且更昂贵(Suryawanetal.，“DevelopmentalRegulationoftheActivationofSignalingComponentsLeadingtoTranslationInitiationinSkeletalMuscleofNeonatalPigs，”Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.291：E849-59(2006)；Escobaretal.，“AminoAcidAvailabilityandAgeAffecttheLeucineStimulationofProteinSynthesisandeIF4FFormationinMuscle，”Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.293：E1615-21(2007))。此外，在断奶仔猪的饲料中经常只补充外源性蛋白酶，而不补充NSP酶(Guggenbuhletal.，“EffectsofDietarySupplementationwithaProteaseontheApparentIlealDigestibilityoftheWeanedPiglet，”J.Anim.Sci.90(Suppl4)：152-154(2012))。

在早前的为期8周的研究中(Lengetal.，“DefattedAlgaeBiomassmayReplaceOne-ThirdofSoybeanMealinDietsforLayingHens，”J.Anim.Sci.90(Suppl.3)：701(2012))，发现蛋鸡耐受7.5％而非15％的脱脂硅藻(十字脆杆藻亚属Staurosirasp)微藻。已发现：同更低的加入率以及对照组相比，在15％的加入率时鸟中主要的氮排泄产物血浆尿酸更低。此外，15％的藻类加入率恢复了在7.5％藻类加入率时降低的白蛋白重量。

蛋白质的质量和组成会影响一些转运系统，包括阳离子氨基酸转运体(“CAT”)家族、寡肽转运体1(“PEPT”)和NA²⁺非依赖性支链和氨基酸转运体(“LAT”)以及肠酶例如氨肽酶(“APN”)(Gilbertetal.，“DevelopmentalRegulationofNutrientTransporterandEnzymemRNAAbundanceintheSmallIntestineofBroilers，”Poult.Sci.86：1739-1753(2007)；Gilbertetal.，“DietaryProteinQualityandFeedRestrictionInfluenceAbundanceNutrientTransportermRNAintheSmallIntestineofBroilerChicks，”J.Nutr.138：262-271(2008)；Gilbertetal.，“DietaryProteinCompositionInfluencesAbundanceofPeptideandAminoAcidTransporterMessengerRibonucleicAcidintheSmallIntestineof2LinesofBroilerChicks，”Poult.Sci.89：1663-1676(2010)；Speieretal.，“GeneExpressionofNutrientTransportersandDigestiveEnzymesintheYolkSacMembraneandSmallIntestineoftheDevelopingEmbryonicChick，”Poult.Sci.91：1941-1949(2012))。S6核糖体蛋白(S6)及其上游调节物(包括P70S6激酶1(P70)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR))，连同真核起始因子4E(elF4E)的磷酸化，在引发蛋白质合成中发挥重要作用并且响应饮食蛋白的变化。

从本研究和其他类似的实验中出现了许多问题(Blumetal.，“FoodValueofSpirulineAlgaeforGrowthoftheBroiler-TypeChicken，”AnnalesdelaNutritionetdel’Alimentation29：651-674(1975)；Lipsteinetal.，“TheNutritionalValueofAlgaeforPoultry.DriedChlorellainLayerDiets，”Br.PoultrySci.21：23-27(1980)；Ginzbergetal.，“ChickensFedwithBiomassoftheRedMicroa1gaPorphyridiumsp.HaveReducedBloodCholesterolLevelandModifiedFattyAcidCompositioninEggYolk，”J.Appl.Phycol.12：325-330(2000)；Al-Harthietal.，“TheEffectsofPreparingMethodsandEnzymeSupplementationontheUtilizationofBrownMarineAlgae(Sarassumdentifebium)MealintheDietofLayingHens，”ItalianJ.Anim.Sci.10：195-203(2011)；Halleetal.，“EffectofMicroalgaeChlorellaVulgarisonLayingHenPerformance，”ArchivaZootechnica12：5-13(2009)；El-Deeketal.，“TheUseofBrownAlgaeMealinFinisherBroilerDiets，”Egypt.Poult.Sci.31：767-781(2011))。

本发明的目的是克服本领域中基于藻类的动物饲料的相关缺陷。

发明概述

本发明一方面涉及动物饲料组合物，其包括总计为所述组合物48-70％w/w的量的一种或多种谷物；总计为所述组合物15-30％w/w的量的非藻类蛋白源；总计为所述组合物3-15％w/w的量的藻类；总计为所述组合物0.01-0.1％w/w的量的外源性蛋白酶；和总计为所述组合物0.5-15％w/w的对所述藻类异源的油。

本发明另一方面涉及动物饲料添加剂，其包括藻类、外源性蛋白酶、和对所述藻类异源的油。

本发明还涉及饲养动物的方法。此方法包括向动物施用本发明的动物饲料组合物。

本发明另一方面涉及饲养动物的方法。此方法包括将动物饲料与本发明的动物饲料添加剂组合施用给动物。

本方面还涉及改善动物饲养效率的方法。此方法包括在能有效引起动物中血浆氮浓度相对于接受不含所述动物饲料添加剂的动物饲料喂养的此类动物降低的条件下，将动物饲料和本发明所述的动物饲料添加剂组合施用给动物，从而改善在动物中的饲养效率。

本发明另一方面涉及改善动物饲养效率的方法。此方法包括在能有效引起动物中血浆氮浓度相对于接受除所述动物饲料组合物以外的动物饲料喂养的此类动物降低的条件下，向动物施用本发明的动物饲料组合物，从而改善在动物中的饲养效率。

在另一方面，本发明涉及动物饲料的改进，其包括藻类和外源性蛋白酶，其中所述藻类和外源性蛋白酶的量能有效导致用所述动物饲料喂养的动物中血浆氮浓度降低。

作为本发明的一部分，进行了两个平行的猪和肉仔鸡的实验，以确定来自生物燃料研究的含有31.2％的粗蛋白的新的脱脂绿色微藻(栅藻Desmodesmussp，Cellana，Kailua-Kona，HI)生物质的营养和代谢价值。所述猪实验(I)的目的是确定添加10％的脱脂绿色微藻生物质(“DGM”)和(或)0.06％的蛋白酶对生长表现、TRAP、AKP、ALT、尿素氮、尿酸和氨基酸的血浆水平，以及总氨基酸的全肠道表观消化率的影响。所述鸡实验(II)的目的是确定添加15％的DGM和(或)0.06％的蛋白酶或NSP酶对生长表现、尿酸和氨基酸的血浆水平、以及肝脏和肌肉中与mTOR通路相关的信号蛋白的产生的影响。

此外，在本发明中，获得了两个微藻生物质来源：脱脂绿色硅藻和全脂硅藻，并且进行了为期14周的蛋鸡试验。目的是确定这两种微藻如何影响蛋的产量和质量、生理状态、以及蛋白质的消化和代谢，包括与氨基酸的消化、吸收和合成相关的分子的肠基因表达和肝蛋白生成(Gilbertetal.，“DietaryProteinQualityandFeedRestrictionInfluenceAbundanceNutrientTransportermRNAintheSmallIntestineofBroilerChicks，”J.Nutr.138：262-271(2008)；Gilbertetal.，“DietaryProteinCompositionInfluencesAbundanceofPeptideandAminoAcidTransporterMessengerRibonucleicAcidintheSmallIntestineof2LinesofBroilerChicks，”Poult.Sci.89：1663-1676(2010)；其在此通过引用全部并入本发明)。由于外源性水解酶可能会对消化微藻有帮助(Al-Harthietal.，“TheEffectsofPreparingMethodsandEnzymeSupplementationontheUtilizationofBrownMarineAlgae(Sarassumdentifebium)MealintheDietofLayingHens，”ItalianJ.Anim.Sci.10：195-203(2011)，其在此通过引用全部并入本发明)，所以也比较了在所述两种用于母鸡的藻类饲料中加入市售蛋白酶的效应。

附图简述

图1显示了脱脂绿色微藻生物质(DGM)和水解酶对肉仔鸡肝脏中蛋白生物合成调节物的蛋白和磷酸化水平的效应。数据表示成平均值±SEM(n＝3)。数值表示成对β-肌动蛋白的比率，并且随后相对于对照组进行基准化。印迹代表三个独立的重复胶。*DGM相对于对照组具有显著效应(P＜0.05)，**DGM相对于对照组具有趋势性效应(P＜0.10)，蛋白酶相对于处理组自身对照具有显著效应(P＜0.05)，蛋白酶相对于处理组自身对照具有趋势性效应(P＜0.10)，NSPase相对于处理组自身对照具有显著效应(P＜0.05)，NSPase相对于处理组自身对照具有趋势性效应(P＜0.10)。eIF4E，真核起始因子4E；p70，p70S6激酶；S6，S6核糖体蛋白；pS6，磷酸化S6核糖体蛋白；以及mTOR，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。

图2显示了脱脂绿色微藻生物质(DGM)和水解酶对肉仔鸡肌肉中蛋白生物合成调节物的蛋白和磷酸化水平的效应。数据表示成平均值±SEM(n＝3)。数值表示成对β-肌动蛋白的比率，并且随后相对于对照组进行基准化。印迹代表三个独立的重复胶。*DGM相对于对照组具有显著效应(P＜0.05)，**DGM相对于对照组具有趋势性效应(P＜0.10)，蛋白酶相对于处理组自身对照具有显著效应(P＜0.05)，蛋白酶相对于处理组自身对照具有趋势性效应(P＜0.10)，NSPase相对于处理组自身对照具有显著效应(P＜0.05)，NSPase相对于处理组自身对照具有趋势性效应(P＜0.10)。eIF4E，真核起始因子4E；p70，p70S6激酶；S6，S6核糖体蛋白；pS6，磷酸化S6核糖体蛋白；以及mTOR，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。

图3显示了在第14周时，在补充或不补充蛋白酶的条件下，在饮食中加入藻类对蛋白合成相关的关键调节物的肝脏蛋白水平的效应。位于每组条带下方的数值表示成平均值±SE。eIF4E，真核起始因子4E；mTOR，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；P70，P70S6激酶；S6，S6核糖体蛋白；以及PS6，磷酸化S6核糖体蛋白。

发明详述

本发明一般涉及动物饲料组合物和动物饲料添加剂，其含有，除其他外，微藻和外源性蛋白酶等。虽然在动物饲料中加入藻类是已知的，本发明涉及改进的基于藻类的动物饲料组合物和动物饲料添加剂，其提供了能改善现有动物饲料的成分组合。

本方面一方面涉及动物饲料组合物，其包括总计为所述组合物48-70％w/w的量的一种或多种谷物；总计为所述组合物15-30％w/w的量的非藻类蛋白源；总计为所述组合物3-15％w/w的量的藻类；总计为所述组合物0.01-0.1％w/w的外源性蛋白酶；和总计为所述组合物0.5-15％w/w的量的对所述藻类异源的油。

在一个实施方式中，所述动物饲料组合物包括所述组合物的51-69％、52-68％、53-67％、54-66％、55-65％、56-64％、57-63％、58-62％、59-61％、或者约60％w/w的量的一种或多种谷物。或者，所述动物饲料组合物包括所述组合物约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、或者70％w/w的量的一种或多种谷物。

在一个实施方式中，所述动物饲料组合物包括总计为所述组合物16-29％、17-28％、18-27％、19-26％、20-25％、21-24％、或者22-23％w/w的量的非藻类蛋白源。或者，所述动物饲料组合物包括所述组合物的约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、或者30％w/w的量的一种或多种谷物。

在一个实施方式中，所述动物饲料组合物包括总计为所述组合物的4-14％、5-13％、6-12％、7-11％、8-10％、或者约9％w/w的量的藻类。或者，所述动物饲料组合物包括所述组合物的约3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或者15％w/w的量的藻类。

在一个实施方式中，所述动物饲料组合物包括总计为所述组合物0.02-0.09％、0.03-0.08、0.04-0.07、0.05-0.06、或者约0.05w/w的外源性蛋白酶。或者，所述动物饲料组合物包括所述组合物的约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、或者0.1％w/w的量的藻类。

在一个实施方式中，所述动物饲料组合物包括总计为所述组合物0.6-14％、0.7-13％、0.8-12％、0.9-11％、1-10％、2-9％、3-8％、4-7％、或者5-6％w/w的量的对所述藻类异源的油。或者，所述动物饲料组合物包括所述组合物的约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％、或者15％w/w的量的对所述藻类异源的油。

在一个实施方式中，所述动物饲料组合物还包括总计为高达所述组合物的1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、或者0.01％w/w的量的无机磷源。

在一个实施方式中，所述动物饲料组合物还包括总计为高达所述组合物的0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、或者0.01％w/w的量的钠源。

在一个实施方式中，所述动物饲料组合物还包括选自由赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、和蛋氨酸组成的组的、总计为高达所述组合物的0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、或者0.01％w/w的量的一种或多种氨基酸。

本方面另一方面涉及动物饲料添加剂，其包括藻类、外源性蛋白酶和对所述藻类异源的油。

本文使用的“w/w”是指重量的比值，并且表示组合物中一种物质的重量对所述组合物总重量的比率，或者所述组合物中一种物质的重量对所述组合物中另一物质的重量的比率。例如，当提到组合物包括总计为所述组合物的15％w/w的藻类时，表示所述组合物重量的15％由藻类(例如，具有100mg重量的组合物会含有15mg的藻类)组成并且所述组合物的重量的其余部分(例如，本例中的85mg)由其他成分组成。

本文互换使用术语“微藻”和“藻类”，并且是指含有叶绿体的真核微生物，并且其也许有能力或者没有能力执行光合作用。微藻包括不能代谢作为能量的固定碳源的专性光合自养生物，以及能够仅以固定碳源为生的异养生物，包括不能执行光合作用的专性异养生物。微藻包括在细胞分裂后不久从姐妹细胞中分离出来的单细胞生物(例如衣藻)，以及微生物如，例如，团藻，其是具有两种不同细胞类型的简单多细胞光合微生物。

在一个实施方式中，所述藻类或微藻是绿色海洋藻类栅藻(Desmodesmussp)。其他微藻可包括例如小球藻、对小球藻(Parachlorella)和杜氏盐藻在内的细胞。小球藻是单细胞绿藻属，属于绿藻门。小球藻细胞形状通常是球形的，直径约为2到10μm，并且缺乏鞭毛。小球藻的某些种类是天然异养的。适用于本发明的动物饲料和动物饲料添加剂的小球藻种类的非限制性例子包括原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、微小小球藻(Chlorellaminutissima)、若夫小球藻(Chlorellazofinienesi)、黄绿异小球藻(Chlorellaluteoviridis)、凯氏类小球藻(Chlorellakessleri)、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)、淡褐小球藻空泡变种(Chlorellafuscavar.vacuolataChlorellasp.)、Chlorellacf.minutissima和浮水小球藻(Chlorellaemersonii)。已知原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)具有高脂质成份。

其他适用于本发明的动物饲料和动物饲料添加剂组合物的小球藻种包括，但不限于，无硝小球藻(anitrata)、南极小球藻(antarctica)、黄绿小球藻(aureoviridis)、卡氏小球藻(candida)、囊状小球藻(capsulate)、干燥小球藻(desiccate)、椭圆小球藻(ellipsoidea)(包括CCAP211/42株)、谷氏小球藻(glucotropha)、水溪小球藻(infusionum)(包括栖海岸变种(var.actophila)和增大变种(var.auxenophila))、凯氏小球藻(kessleri)(包括UTEX株397、2229、398中的任一种)、匍扇小球藻(lobophora)(包括SAG37.88株)、luteoviridis(包括SAG2203株以及黄绿(aureoviridis)和黄色(lutescens)变种)，朱红小球藻(miniata)、突变小球藻(mutabilis)、夜间小球藻(nocturna)、卵形小球藻(ovalis)、巴夫小球藻(parva)、嗜光小球藻(photophila)、普氏小球藻(pringsheimii)、原壳小球藻(protothecoides)(包括UTEX株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25中的任一种，或者CCAP211/8D、或者CCAP211/17和酸居变种(var.acidicola))、规则小球藻(regularis)(包括极小(minima)和伞状(umbricata)变种)、瑞氏小球藻(reisiglii)(包括CCP11/8株)、嗜糖小球藻(saccharophila)(包括CCAP211/31、CCAP211/32和椭圆变种(var.ellipsoidea))、盐生小球藻(salina)、简单小球藻(simplex)、耐热小球藻(sorokiniana)(包括SAG211.40B株)、球形小球藻(sphaerica)、斯蒂格小球藻(stigmatophora)、他伯氏小球藻(trebouxioides)、万尼氏小球藻(vanniellii)、普通小球藻(vulgaris)(包括CCAP211/11K、CCAP211/80株和粗皮变型(f.tertia)以及自养(autotrophica)变种、绿色(viridis)变种、普通(vulgaris)变种、粗皮(tertia)变种、绿色(viridis)变种)、黄色小球藻(xanthella)和左氏小球藻(zofingiensis)。

其他属的微藻也可用于本发明的动物饲料组合物中，并且可以包括，例如，凯氏类小球藻(Parachlorellakessleri)、类小球藻(Parachlorellabeijerinckii)、富油新绿藻(Neochlorisoleabundans)、片球藻(Bracteacoccus)(包括大片球藻(B.grandis)、B.cinnabarinas和B.aerius)、Bracteococcussp.和Scenedesmusrebescens。微藻种的其他非限制性例子包括东方曲壳藻(Achnanthesorientalis)；阿格藻属(Agmenellum)；透明苗形藻(Amphiprorahyaline)；双眉藻属(Amphora)，包括咖啡形双眉藻(A.coffeiformis)(包括咖啡形双眉藻线状变种(A.c.linea)、咖啡形双眉藻斑点变种(A.c.punctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(A.c.taylori)、咖啡形双眉藻细薄变种(A.c.tenuis)、咖啡形双眉藻优美变种(A.c.delicatissima)、咖啡形双眉藻优美头状变种(A.c.delicatissimacapitata))；鱼腥藻属(Anabaena)；纤维藻属(Ankistrodesmus)，包括镰形纤维藻(A.falcatus)；黄金色藻(Boekeloviahooglandii)；包特氏菌属(Borodinella)；布朗尼葡萄藻(Botryococcusbraunii)，包括B.sudeticus；片球藻属(Bracteoccocus)，包括B.aerius、大片球藻(B.grandis)、B.cinnabarinas、小形片球藻(B.minor)和B.medionucleatus；四鞭藻属(Carteria)；角毛藻属(Chaetoceros)，包括纤细角毛藻(C.gracilis)、牟勒氏角毛藻(C.muelleri)和牟勒氏角毛藻亚盐变种(C.muellerisubsalsum)；绿球藻属(Chlorococcum)，包括水溪绿球藻(C.infusionum)；绿梭藻属(Chlorogonium)；蓝隐藻属(Chroomonas)；金球藻(Chrysosphaera)；球钙板藻属(Cricosphaera)；隐甲藻属(Crypthecodiniumcohnii)；隐藻属(Cryptomonas)；小环藻属(Cyclotella)，包括隐秘小环藻(C.cryptica)和梅尼小环藻(C.meneghiniana)；链带藻属(Desmodesmus)；杜氏藻属(Dunaliella)，包括巴氏杜氏藻(D.bardawil)、双眼杜氏藻(D.bioculata)、颗粒杜氏藻(D.granulate)、海洋杜氏藻(D.maritime)、微小杜氏藻(D.minuta)、巴夫杜氏藻(D.parva)、比雷杜氏藻(D.peircei)、普林莫杜氏藻(D.primolecta)、盐生杜氏藻(D.salina)、土生杜氏藻(D.terricola)、特氏杜氏藻(D.tertiolecta)和绿色杜氏藻(D.viridis)；独球藻属(Eremosphaera)，包括绿色独球藻(E.viridis)；椭圆藻属(Ellipsoidon)；裸藻属(Euglena)；伏氏藻属(Franceia)；脆杆藻属(Fragilaria)，包括克罗脆杆藻(F.crotonensis)；粘球藻属(Gleocapsa)；丝藻属(Gloeothamnion)；膜胞藻属(Hymenomonas)；等鞭金藻属(Isochrysis)，包括等鞭金藻球亲近种(I.affgalbana)和球等鞭金藻(I.galbana)；鳞孔藻属(Lepocinclis)；微芒藻属(Micractinium)(包括UTEXLB2614)；单针藻属(Monoraphidium)，包括细小单针藻(M.minutum)；单针藻属(Monoraphidium)；微绿球藻属(Nannochloris)；微拟球藻属(Nannochloropsis)，包括盐生微拟球藻(N.salina)；舟形藻(N.avicula)，包括适意舟形藻(N.acceptata)、毕氏舟形藻(N.biskanterae)、伪舟形藻(N.pseudotenelloides)、薄膜舟形藻(N.pelliculosa)和嗜腐舟形藻(N.saprophila)；新绿藻(Neochlorisoleabundans)；肾鞭藻属(Nephrochloris)；肾藻属(Nephroselmis)；普通菱形藻(Nitschiacommunis)；菱形藻属(Nitzschia)，包括亚历山大菱形藻(N.alexandrina)、普通菱形藻(N.communis)、分散菱形藻(N.dissipata)、碎片菱形藻(N.frustulum)、汉氏菱形藻(N.hantzschiana)、平庸菱形藻(N.inconspicua)、中型菱形藻(N.intermedia)、小头菱形藻(N.microcephala)、微小菱形藻(N.pusilla)、椭圆微小菱形藻(N.pusillaelliptica)、微小菱形藻莫纳变种(N.pusillamonoensis)和四角菱形藻(N.quadrangular)；掠鞭藻属(Ochromonas)；卵囊藻属(Oocystis)，包括小形卵囊藻(O.parva)和极小卵囊藻(O.pusilla)；颤藻属(Oscillatoria)，包括沼泽颤藻(O.limnetica)和亚短颤藻(O.subbrevis)；拟小球藻属(Parachlorella)，包括P.beijerinckii(包括SAG2046株)和凯氏拟小球藻(P.kessleri)(包括SAG株11.80、14.82、21.11H9中的任一种)；帕氏藻属(Pascheria)，包括嗜酸帕氏藻(P.acidophila)；巴夫藻属(Pavlova)；嗷菌体属(Phagus)；席藻属(Phormidium)；扁藻属(Platymonas)；颗石藻属(Pleurochrysis)，包括卡氏颗石藻(P.carterae)和齿状颗石藻(P.dentate)；原壁藻属(Prototheca)，包括P.stagnora(包括UTEX327)、波多黎各原壁藻(P.portoricensis)和桑堪形原藻(P.moriformis)(包括UTEX株1441、1435、1436、1437、1439)；水生拟绿球藻(Pseudochlorellaaquatica)；塔胞藻属(Pyramimonas)；桑葚藻属(Pyrobotrys)；不透明红球菌(Rhodococcusopacus)；囊状金藻(Sarcinoidchrysophyte)；栅藻属(Scenedesmus)，包括被甲栅藻(S.armatus)和微红栅藻(S.rubescens)；裂殖壶菌属(Schizochytrium)；水绵藻属(Spirogyra)；钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)；丝藻属(Stichococcus)；聚球藻属(Synechococcus)；四角藻属(Tetraedron)；四爿藻属(Tetraselmis)，包括瑞典四爿藻(T.suecica)；威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)和弗雷德鲜绿球藻(Viridiellafridericiana)。

所述藻类或微藻还可以是硅藻，例如，硅藻微藻十字脆杆藻亚属(Staurosirasp)或者微壳藻属(Nannofrustulum)。硅藻是主要的浮游植物，特征为其细胞壁外膜中的二氧化硅。硅藻构建无定形二氧化硅的装饰壳，所述壳在其藻壳结构中含有复杂物质。对硅藻的研究显示，在一些物种中，发现在细胞壁中的总氨基酸比发现于细胞内容物中的总氨基酸多1.2倍。此外，相较于细胞内容物，某些氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸，似乎一致地富含于细胞壁中。

用于本发明的动物饲料组合物和动物饲料添加剂的合适的微藻来源是藻类生物质。藻类生物质是由微藻细胞的生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以含有细胞和/或胞内内容物以及胞外物质。胞外物质包括，但不限于，细胞分泌的化合物。

通常，在液体培养基中培养微藻以繁殖生物质。例如，在无光条件下，微藻物种可以在含有固定碳和/或固定氮源的培养基中生长。这种生长被称为异养型生长。对于一些微藻物种，在氮有限的情况下延长异养生长的时间(例如10到15或更多天)使得在所述微藻细胞中积累高脂质的内容物。

一个特别适用于本发明的微藻源是为生产生物燃料而培养的微藻。为生产生物燃料而培养的微藻包括在从所述藻类中收获油之前的藻类(全脂藻类)和已经经历了油萃取的藻类(脱脂藻类)。因此，本文使用的脱脂藻类已经经历了油萃取的过程并且因此相对于油提炼之前的藻类含有较少的油。脱脂藻类的细胞大部分已经裂解。脱脂藻类包括已经被溶剂(己烷)萃取的藻类生物质。

从藻类收获的油包括任何由藻类产生的三酰甘油酯(或者甘油三酯油)。以干重或体积计算，脱脂藻类含有的油比微藻在萃取前所含有的油更少。在一个实施方式中，脱脂藻类包括这样的藻类：其已被萃取了50-90％的油，使得所述脱脂藻类含有萃取前生物质的例如约10-50％的油含量。然而，所述生物质在蛋白质和其他成分的含量方面仍具有较高的营养价值，这使得其适合用于动物饲料。

可以通过本领域普通技术人员已知的标准方法进行制备用于本方面所述动物饲料组合物和添加剂的脱脂(或去脂)藻类的过程。例如，可以裂解藻类细胞，这可以通过任意方便的方式来实现，包括热诱导的裂解、加入碱、加入酸、使用酶(例如蛋白酶和多糖降解酶(例如淀粉酶))、使用超声波、基于机械压力的裂解、以及使用渗透冲击进行的裂解。这些用于裂解微生物的方法中的每一种都可以作为单一的方法使用，或者同时或连续地组合使用。可以通过显微分析来观察细胞破坏的程度。通过使用上述一种或多种方法，一般会观察到超过70％的细胞破碎。

可以通过萃取回收所述微藻产生的脂质和油。在一些情况下，可以使用有机溶剂或油进行萃取，或者可以使用无溶剂萃取程序进行萃取。

对于用有机溶剂萃取微藻油，优选的有机溶剂是己烷。一般地，将所述有机溶剂直接加入至所述裂解物中，并不预先分离裂解物组分。在一个实施方式中，将通过上述一种或多种方法产生的裂解物与有机溶剂接触足够长的一段时间，以使得所述脂质组分与所述有机溶剂形成溶液。在某些情况下，可以随后进一步改进所述溶液来回收特定想要的脂质成分。随后可以过滤所述混合物并且通过，例如，旋转蒸发，去除己烷。己烷的萃取方法在本领域是公知的(参见，例如，Frenzetal.，“HydrocarbonRecoverybyExtractionwithaBiocompatibleSolventfromFreeandImmobilizedCulturesofBotryococcus-braunii，”EnzymeMicrob.Technol.11：717-724(1989)，其全部内容在此通过引用并入)。

Miao和Wu(“BiodieselProductionfromHeterotrophicMicroalgalOil，”BiosourceTechnology97：841-846(2006)，其全部内容在此通过引用并入)描述了从原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)培养物中回收微藻脂质的方法，其中通过离心收获所述细胞，用蒸馏水洗涤，并通过冷冻干燥法对其进行干燥。将得到的细胞粉末在研钵中研磨，然后用正己烷进行萃取。

在一些情况下，可以使用液化(参见，例如，Sawayamaetal.，“PossibilityofRenewableEnergyProductionandCO₂MitigationbyThermochemicalLiquefactionofMicroalgae，”BiomassandBioenergy17：33-39(1999)，其全部内容在此通过引用并入)；油液化(参见，例如，Minowaetal.，“OilProductionfromAlgalCellsofDunaliellatertiolectabyDirectThermochemicalLiquefaction，”Fuel74(12)：1735-1738(1995)，其全部内容在此通过引用并入)；或者超临界CO₂萃取法(参见，例如，Mendesetal.，“SupercriticalCarbonDioxideExtractionofCompoundswithPharmaceuticalImportancefromMicroalgae，”InorganicaChimicaActa356：328-334(2003)，其全部内容在此通过引用并入)萃取微藻油。萃取过程的作用在于，通过超临界CO₂萃取法提取的藻油含有所有来自藻类生物质的固醇和类胡萝卜素并且在天然状态下不含有磷脂。来自这些过程的残留物基本上包括不含油的脱脂(或者去脂)藻类生物质，但是仍然保留了萃取前藻类生物质的蛋白质和碳水化合物。因此，残留的脱脂藻类生物质是蛋白质浓缩物/分离物和饮食纤维的合适来源。

油萃取还包括在没有预先分离裂解物组分的情况下将油直接加入裂解物。在加入了油之后，裂解物自行分离或者由离心等引起分离，形成不同的层。以密度递减为序，所述层可以包括：重固体沉淀、水相、乳相和油相。乳相是脂质和水相的乳液。根据加入的油相对于裂解物的百分比(w/w或者v/v)，离心力(如果有的话)、水性介质体积、以及其他因素，乳相和油相之一或两者均可存在。用油孵育或处理细胞裂解物或者乳相足够长的时间，以允许微生物生成的脂质在油中溶解以形成非均相混合物。

还可以通过冷却裂解物，经由基本上或者一点都不使用有机溶剂或者油的无溶剂萃取步骤，从裂解物中提取脂质。另外，特别是当温度在室温和65℃之间时，可以使用超声处理。这种裂解物一经离心或沉降会分离成层，其中之一是水：脂质层。其他层可以包括固相沉淀、液相层和脂质层。可以通过冻融或者其他冷却乳液的方式从乳液中提取脂质。在这种方法中，无需添加任何有机溶剂或油。如果要添加任何溶剂或油，其可以低于裂解物的5％v/v或者w/w。

用于本发明的组合物和饲料添加剂的藻类通常是干燥的和/或被研磨成藻粉的。干燥的微藻生物质，无论是大部分完整的或者是匀浆形式的，均有利于促进在本发明的组合物和饲料添加剂中进一步处理或者使用所述生物质。干燥是指从大部分完整的生物质中除去游离的或者表面的水分/水或者从匀浆(例如，通过微粉化)的生物质浆液中除去表面的水。在一些情况下，干燥生物质能促进更高效的微藻油萃取过程。

在一个实施方式中，将浓缩的微藻生物质转筒干燥成薄片形式以产生藻类薄片。在另一实施方式中，将浓缩的微藻生物质进行喷雾或闪蒸干燥(即，进行气动干燥过程)以形成主要含有用于产生藻粉末的完整细胞的粉末。在另一实施方式中，将浓缩的微藻生物质微粉化(匀浆化)以形成以裂解细胞为主的匀浆，然后将其喷雾或闪蒸干燥以生产藻粉。

在某些实施方式中，本发明的组合物和/或饲料添加剂的藻类成分是粉、薄片、或粉末的形式并且在干燥后含有占重量15％或更低、10％或更低、5％或更低、2-6％、或者3-5％的湿度。

本发明的动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂的藻类可以仅包括全脂藻类、仅包括脱脂(或去脂)藻类、或者包括其组合。当在所述动物饲料组合物中使用全脂藻类时，特别是当存在比脱脂藻类更多的全脂藻类时，可能需要减少对所述藻类异源的油的量。因此，例如，在一个实施方式中，动物饲料组合物包括比脱脂藻类更多的全脂藻类并且对所述藻类异源的油以总计为组合物0.5-5％w/w的量存在于组合物中。在另一实施方式中，动物饲料组合物包括比全脂藻类更多的脱脂藻类并且对所述藻类异源的油以总计为组合物3-15％w/w的量存在于组合物中。

可在动物饲料组合物和动物饲料添加剂中用具有与藻类相似营养品质的另一种蛋白源替换本发明的动物饲料组合物和动物饲料添加剂的海藻成分。

本文使用的外源性蛋白酶是指这样的蛋白酶：其不是本发明的动物饲料组合物或添加剂中任意其他成分(例如，谷物、蛋白质或者藻类)的组分，或者是除了可能是本发明的动物饲料组合物或添加剂的一个或多个组分的一部分的任意蛋白酶之外的蛋白酶。外源性蛋白酶已被用于动物饲料中。然而，在本发明中，显示本发明组合物中的外源性蛋白酶在与本发明的组合物中的藻类(和其他组成成分)组合使用时，具有意想不到的好处。具体合适的蛋白酶包括，但不限于，ProAct、TfpA、胰蛋白酶、胃蛋白酶、角蛋白酶、蛋白酶K、肽酶等。

在动物饲料组合物和动物饲料添加剂的一个实施方式中，对所述藻类异源的油包括玉米油，然而也可以使用其他类型的油，包括，但不限于，来源于植物的植物油或种子油，包括但不限于，来源于大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、橄榄、葵花籽、棉籽、萼距花、花生、荠蓝、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏花、大麻、咖啡、亚麻仁、榛子、大戟、南瓜子、香菜、山茶花、芝麻、红花、稻米、桐油树、可可、椰干、罂粟、蓖麻籽、山核桃、荷荷巴、麻风树、澳洲坚果、巴西坚果、鳄梨、或其组合的油。在一个实施方式中，本发明的动物饲料组合物和/或添加剂中的油是纯浓缩油。

在本发明的动物饲料组合物中，一种或多种谷物以总计为组合物的48-70％w/w的量存在。合适的谷物包括通常饲喂给动物的谷物，包括，但不限于，玉米、小麦、水稻、高粱、燕麦、土豆、红薯、木薯、DDGS、及其组合。

本发明的动物饲料组合物还包括总计为组合物15-30％w/w的量的非藻类蛋白源。非藻类蛋白源包括通常饲喂给动物的非藻类蛋白源，包括，但不限于，肉、鱼蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白、小麦蛋白、豆蛋白、稻蛋白、豌豆蛋白、乳蛋白等。在一个实施方式中，所述非藻类蛋白源是大豆、鱼粉、棉籽粕、菜籽粕、肉粉、血浆蛋白、血粉、或其组合。

在本发明的动物饲料组合物中，无机磷源可以以总计为高达所述组合物的1.5％w/w的量存在。优质无机磷酸盐提供一致的高磷总含量和优良的可消化性的组合，并且因此被广泛用作补充性磷。用于此目的的大多数无机磷酸盐来源于天然的岩石磷酸盐，主要发现于非洲、北欧、亚洲、中东和美国。然而，由于其含有的磷不能被动物代谢，因此其在天然形式下不适于在动物饲料中直接使用。因此，必须对岩石磷酸盐进行化学处理，使得其含有的磷变成可消化的正磷酸盐形式(PO4³-)。在此过程中，必须密切控制生产参数以避免正磷酸盐分子劣化成其他不可用形式的磷(例如焦磷酸盐和偏磷酸盐)，并确保适于动物营养的钙磷比例。此外，岩石磷酸盐还含有杂质，例如氟、镉和砷，如果在生产过程中不将这些杂质去除的话，其将不适用于动物营养。在一个实施方式中，本发明所述动物饲料组合物中的磷源包括磷酸二钙。

本发明的动物饲料组合物还可以包括以下任意一种或多种：总计为组合物0.5-3.0％w/w的量的血浆蛋白；总计为组合物0.1-10％w/w的量的无机钙源；总计为组合物0.1-1％w/w的量的维生素/矿物质混合物，其中所述维生素/矿物质混合物包括一种或多种微量矿物质(例如，选自Cu、Se、Zn、I、Mn、Fe、Co、及其组合)；总计为组合物0.01-0.1％w/w的量的无机镁源；总计为组合物0.01-0.1％w/w的量的抗生素。

类似地，本发明的动物饲料添加剂还可以包括以下一种或多种：血浆蛋白；无机钙源；维生素/矿物质混合物；无机镁源；以及抗生素。

通过从动物(优选猪或牛)采集血液获得血浆蛋白。例如，在屠宰厂采集血液。在采集时，将血液置于带有抗凝血剂(例如柠檬酸钠或磷酸钠)的环形不锈钢容器中以避免凝固。随后通过，例如离心，将全血分离成两部分，细胞物质(红血球、白血球和血小板)和血浆。血浆由约60％的白蛋白和约40％的球蛋白组成。分离后，在绝缘的容器中冷却血浆直到要干燥为止。

随后通过膜滤法将血浆成分进一步浓缩2到3倍。在这个阶段，可以加入主要含淀粉酶的微生物发酵提取物。因此，在一个实施方式中，可将动物血浆蛋白与具有显著淀粉酶活性水平的微生物发酵产物组合(参见Yoder的美国专利号5,372,811，其全部内容在此通过引用并入)。将所述混合物混合10分钟并且最后进行共干燥以形成米色粉状物质。喷雾干燥应该在这样的温度下进行：其低至足以维持高度易消化的蛋白质但高至足以纯化干粉以消除细菌和病毒的污染。

鉴于其优质的蛋白质和免疫球蛋白的含量，经喷雾干燥的动物血浆蛋白历来被用作优质蛋白来替代乳蛋白。在饲料工业中，由于其对自由采食量和有效收益的影响等于或优于乳蛋白，此血浆也被用作饲料添加成分，用于小牛和牛犊的代乳品、水产养殖和宠物食物。在一个实施方式中，用于本发明的动物饲料和饲料添加剂组合物的动物血浆蛋白由高水平的氨基酸组成。

用于本发明的组合物和动物饲料添加剂的无机钙源是公知的。在一个实施方式中，无机钙源是石灰石(碳酸钙)。在其他实施方式中，无机钙源来自三种无机钙补充源(方解石粉、文石和albacar)中的一种或多种(参见，Wohltetal.，“CalciumSourcesforMilkProductioninHolsteinCowsviaChangesinDryMatterIntake，MineralUtilization，andMineralSourceBufferingPotential，”J.DairySci.70：2812(1987)，其全部内容在此通过引用并入)。这些无机钙源的每一种在粒径和反应速率方面不同。

适用于本发明的动物饲料组合物和/或添加剂的维生素/矿物质混合物可以包括，例如，维生素A、维生素D₃、维生素E、维生素K、生物素、胆碱、氯化胆碱、叶酸(folacin)、叶酸(folicacid)、烟酸、泛酸、d-泛酸钙、盐酸吡哆醇、烟酸、氰钴胺素、核黄素、硫胺素、盐酸硫胺素、甲萘醌亚硫酸氢钠、乙氧喹、维生素B₆、维生素B₁₂、Cu、I、Mn、Zn、Se、Mg、Co、或者Fe、及其组合。

氧化镁(MgO)是广泛使用的无机镁源，以许多不同的形式用于不同的用途。通常，优选用于动物饲料并且存在一些商业供应商的MgO。

适用于本发明的动物饲料组合物和添加剂的抗生素可以包括，例如，四环素、杆菌肽、阿维拉霉素、尼卡巴嗪、泰乐菌素(如磷酸泰乐菌素)、泰妙菌素、林可霉素、维吉霉素、喹诺酮类抗菌药物、卡巴氧、盐酸金霉素、及其组合。

除了赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸和蛋氨酸中的一种或多种氨基酸，本发明的动物饲料组合物和动物饲料添加剂还可以包括其他氨基酸。

本发明进一步涉及饲养动物的方法。此方法涉及向动物施用本发明的动物饲料组合物。本发明的另一方面还涉及将动物饲料和本发明的动物饲料添加剂组合施用给动物。

本发明的另一方面还涉及改善动物的饲养效率的方法。此方法涉及在能有效引起动物中血浆氮浓度相对于接受不含所述动物饲料添加剂的动物饲料喂养的此类动物降低的条件下，将动物饲料和本发明的动物饲料添加剂组合施用给动物，从而改善在动物中的饲养效率。

本发明的另一方面涉及改善动物的饲养效率的方法。此方法涉及在能有效引起动物中血浆氮浓度相对于接受除所述动物饲料组合物以外的动物饲料喂养的此类动物降低的条件下，将本发明的动物饲料组合物施用给动物，从而改善在动物中的饲养效率。

本发明的又一个方面涉及动物饲料的改进，包括藻类和外源性蛋白酶，其中所述藻类和外源性蛋白酶的量能有效引起用所述动物饲料喂养的动物中血浆氮浓度的降低。

按照本发明的方法，动物中血浆氮浓度的降低可以包括，例如，在按照本发明的方法向动物施用了所述动物饲料组合物和/或添加剂后的约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多天，降低了至少约高达5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，或者50％。

藻类，无论是全脂的或是脱脂的，都含有优质蛋白质、碳水化合物、纤维、灰分、和其他适用于动物饲料的营养成分。可用本发明的动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂喂养的动物包括，但不限于，反刍动物、家禽、猪、水产养殖物、宠物、狗、猫、马、动物园动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述动物是蛋鸡、肉仔鸡、或者断奶仔猪。

实施例

实施例1-断奶仔猪和肉仔鸡饮食中脱脂绿色海洋微藻(栅藻Desmodesmussp)生物质的营养和代谢影响

材料和方法

所有的动物实验程序已得到康奈尔大学动物护理和使用委员会机构的批准。DGM的营养成分列于表1中。蛋白酶ProAct和NSPase的混合物(50％G2、40％A和10％w)获自DSMNutritionalProducts公司(Parsippany，NJ)。苯二甲醛全溶液试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。用于确定尿酸、尿素氮和丙氨酸转氨酶(ALT)的试剂盒获自ThermoScientific公司(Waltham，MA)。兔抗-β-肌动蛋白(4967)、兔抗-mTOR(7C10)、兔抗-磷酸化-mTOR(S2448)、兔抗-S6(5G10)、兔抗-磷酸化-S6(S235/236)、兔抗-S6K1(49D7)、兔抗-磷酸化-S6K1(T389)、兔抗磷酸化-4E-BP1(S65)和兔抗-eIF4E(C46H6)单克隆抗体购自CellSignalingTechnology公司(Danvers，MA)。

表1.DMG(栅藻Desmodesmussp)生物质的营养组成

¹样品由DairyOne公司(Ithaca，NY)分析。

²样品由密苏里大学的实验站化学实验室(Columbia，MO)分析。

猪实验

实验设计、生长情况和血液样品的采集

以2(DGM：在‘原样’基础上0或10％)x2(ProAct：0或0.06％)的因子排列法，将断奶的约克夏x汉普郡x兰德瑞斯猪(n＝32)分入四个处理组之一(对于每种处理，n＝8头猪)。实验组的饮食组合物列于表2。ProAct的包含率以先前的实验为基础(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCominDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013)，其全部内容在此通过引用并入)。配制所有的饮食以满足断奶仔猪的营养需求(NationalResearchCouncil，NutrientRequirementsofSwine，第十一修订版，TheNationalAcademiesPress，Washington，D.C.，2012，其全部内容在此通过引用并入)。将猪单独安置在带有喂食器和滴头饮水器的围栏里。每个早晨称重适当的饲料以减少溢出的量。第二天早晨在加入新鲜饲料前收集任何溢出物并称重。两周一次记录单只猪的重量用于确定体重增量和饲料转化效率。两周一次从前腔静脉采集血样到肝素化管中，并置于冰上直至当天完成分析。

表2.猪实验饮食的营养组成

¹DGM，含有31.2％粗蛋白的脱脂绿色微藻(栅藻Desmodesmussp)生物质(Cellana，Kailua-Kona，HI)。

²维生素和矿物质预混合物供应以下量(按每千克饮食计算)：维生素A，2,200IU；维生素D₃，220IU；维生素E，16IU；维生素K，0.5mg；生物素，0.05mg；胆碱，0.5g；叶酸，0.3mg；烟酸，15mg；泛酸，10mg；核黄素，3.5mg；硫胺素，1mg；维生素B₆，1.5mg；维生素B₁₂，17.5μg；Cu，6mg；I，0.14mg；Mn，4mg；Zn100mg；Se，0.3mg；Mg，0.4mg；和Fe，80mg。

³ ProAct(DSMNutritionalProductsInc.，Parsippany，NJ)。以PROT单位测定蛋白酶活性，其中1单位定义为在pH9.0和37℃条件下，每分钟从1mM底物(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺)释放1μmol对硝基苯胺的酶的量。

⁴抗生素添加剂(Tylan10)含有22g/kg的泰乐菌素(例如泰乐菌素磷酸盐)。

血浆生化分析

将血样在1500xg离心20分钟，收集血浆。按照Bowers和McComb的方法(Wangetal.，“ThemTORPathwayintheControlofProteinSynthesis，”Physiol.21：362-369(2006)，其全部内容在此通过引用并入)确定血浆AKP活性。按照Lau等的方法(CharacterizationandAssayofTartrate-ResistantAcidPhosphataseActivityinSerum：PotentialUsetoAssessBoneResorption，”Clin.Chem.33：458-462(1987)，其全部内容在此通过引用并入)，在将pH变更为5.8的条件下，确定血浆TRAP的活性。使用改进的邻苯二甲醛(OPA)衍生测定法确定总血浆氨基酸浓度。简单地说，将等体积的苯二甲醛全试剂加入血浆等份中，涡旋震荡，并于2分钟内在96孔板读取器(BiotekInstruments公司，Winooski，VT)上在340nm处读数。使用上述的商用试剂盒测定血浆尿酸、尿素氮和ALT。

氨基酸的全肠道表观消化率

将加有不可消化的标记物(0.3％的氧化铬)的实验饲料喂食所有的猪，共2天的适应期。在第三天，收集饲料和排泄物，通过使用商购的邻苯二甲醛(“OPA”)试剂溶液并且接着在340nm处进行分光光度读数(由Sigma提供的OPA方法)来确定氨基酸的浓度。按照(1-[(AAe/AAf)x(Mf/Me)]x100％计算总氨基酸的全肠道表观消化率，其中AAe是排泄物的氨基酸浓度，AAf是饲料的氨基酸浓度，Mf是饲料的标记物浓度，以及Me是排泄物的标记物浓度(Maynardetal.，AnimalNutrition，SixthEdition，McGraw-HillBookCompany，NewYork，1969，其全部内容在此通过引用并入)。

肉仔鸡实验

实验设计、生长情况和样品的采集

得到1日龄的Ross308肉仔鸡并用随机完全区组设计法将其分配到6个处理组之一。每个区组采用2(DGM：在‘原样’基础上0或15％)x3(酶：无、ProAct和NSPase)的因子排列法。每种处理包括5个层架式鸡笼(5只鸡/笼)并且认定每个笼子为重复组。对照饮食和含DGM饮食的组成示于表3中。基于先前的实验(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013)，其全部内容在此通过引用并入)和生产商的建议，均以0.06％掺入蛋白酶和NSPase。将鸡安置在Petersime层架式鸡笼中并允许自由采食饲料和水。第1-21天用起始饮食喂养鸡并且第22-42天用生长饮食喂养。配制所有的饮食以满足每个生长期的营养需求(NationalResearchCouncil，NutrientRequirementsofPoultry，第九修订版，TheNationalAcademiesPress，Washington，D.C.，1994，其全部内容在此通过引用并入)。每周按鸡笼记录体重和采食量。每天收集并称重溢出的饲料。在第21天和第42天经由右翅脉采集血液样品(～1-3ml，不超过血液体积的10％)到肝素针中。在第42天，每笼取一只鸡，通过CO₂窒息施以安乐死，并且切除肝和右胸肌并立即冷冻用于蛋白质定量和Western印迹分析。

表3.家禽实验饮食的营养组成

¹含有31.2％粗蛋白的脱脂绿色微藻(栅藻Desmodesmussp)生物质(Cellana，Kailua-Kona，HI)。

²提供(以mg/kg饮食计算)：CuSO₄·5H₂O，31.42；KI，0.046；FeSO₄·7H₂O，224.0；MnSO₄·H₂O，61.54；Na₂SeO₃，0.13；ZnO，43.56；Na₂MoO₄·2H₂O，1.26。

³提供(以IU/kg饮食计算)：维生素A，6500；维生素D₃，3500；维生素E，25和(以mg/kg饮食计算)：核黄素，25；d-泛酸钙，25；烟酸，150；氰钴胺，0.011；氯化胆碱，1250；生物素，1.0；叶酸，2.5；盐酸硫胺素，7.0；盐酸吡哆醇，25.0；甲萘醌亚硫酸氢钠，5.0；和乙氧喹，66。

⁴四种实验饮食每种含有淀粉(对照)或者蛋白酶(ProAct，DSMNutritionalProducts公司，Parsippany，NJ)或者NSPase(50％G2、40％和10％WX(DSMNutritionalProducts公司，Parsippany，NJ)的混合物)。以PROT单位测定蛋白酶活性，其中1单位定义为在pH9.0和37℃条件下，每分钟从1μM底物(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺)释放1μmol对硝基苯胺的酶的量。以FXU单位测定WX的活性，其中内切-1，4-β木聚糖酶的最小活性是1,000FXU/g，其中FXU单位是在pH6.0和50℃条件下，每分钟从偶氮小麦阿拉伯木聚糖释放7.8μmol还原糖(木糖的等同物)的酶的量。G2含有至少8,000U/g的内切-1，3-β葡聚糖酶；18,000U/g的内切-1，3(4)-β葡聚糖酶；和26,000U/g的内切-1，4-β木聚糖酶。其中对于每种酶来说，1U是在pH5.0和40℃条件下，每分钟从羧甲基纤维素、大麦β-葡聚糖、或者燕麦木聚糖释放0.1微摩尔葡萄糖的酶的量。A(CT)由200kilo-Novoα淀粉酶单位和350真菌β葡聚糖酶单位/克酶浓缩物组成。

血浆生化分析和Western印迹分析

将血液样品在1500xg离心20min以收集血浆。使用上述猪实验中相同的方法测定总血浆氨基酸含量和尿酸。在液氮中研磨冷冻的肝脏和肌肉样品。然后在冰上用冰冷的缓冲液(80μl)匀浆粉状组织(10mg)，所述缓冲液含有20mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、100mM的KCl、50mMNaF、1mM的二硫苏糖醇，0.5mM的原钒酸钠、0.2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)和1mM的苯甲脒。将匀浆物在1,000xg4℃离心30min并将上清液在10,000xg4℃离心10min。将最终的上清液等分并在-80℃储存。用适当的抗体(表4)将组织裂解物(50μg蛋白质)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及Western印迹。

表4.抗体信息¹

¹所有抗体购自CellSignalingTechnology(Beverly，MA)。

²eIF4E，真核起始因子4E；mTOR，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；p70，p70S6激酶；S6，S6核糖体蛋白；和pS6，磷酸化S6核糖体蛋白。

统计分析

用PC-SAS8.1(SAS研究所，Cary，NC)的GLM程序分析数据。使用双向ANOVA(猪实验为2×2因子，鸡实验为2×3因子)确定DGM和酶的整体主效应及其相互作用。将生长参数作为时间重复测量值(time-repeatedmeasures)进行分析。使用邓肯多重范围检验进行处理均值比较。如果DGM和酶之间存在相互作用，仅考虑条件性(在其它变量的相同水平内)处理均值比较。鉴于Western印迹分析的半定量性质和有限的样本量(n＝3)，仅使用t检验将选定的处理效应与相应的对照直接进行对比。数据表示成平均值±合并的SEM，并且将P＜0.05认作具有统计学显著性。

结果

猪实验

在为期28天实验中的任何时间点，10％的DGM和0.06％的蛋白酶的添加都不单独影响体重、日均增重、日均采食量或者饲养效率(表5)。然而，DGM和酶在第28天时的体重(P＝0.03)和整个28天实验的总平均增重(P＝0.02)上具有相互作用，显示蛋白酶在存在DGM的条件下对两个测量值都有有益的趋势，但在对照饮食组中具有不利的效应。DGM的添加在第14天时降低了(P＝0.05)血浆TRAP的活性，在第28天时提升了(P＜0.05)血浆AKP的活性，在第14天时降低了(P＝0.07)血浆尿酸的浓度，并且在第14和24天时将血浆尿素氮分别降低了(P＜0.05)19％和28％(表6)。蛋白酶的添加在第14天时降低了(P＝0.05)血浆AKP的活性，在第14天时提升了(P＜0.05)血浆ALT的活性，并且在第14天时将血浆尿酸浓度分别降低了(P＜0.05)24％或32％。尽管血浆氨基酸浓度不受所述两种饮食添加剂的影响，但是将4％和7％的蛋白酶加入对照和DGM饮食中分别提升了(P＜0.05)氨基酸全肠道表观消化率。

表5.DGM和蛋白酶的补充对猪的生长情况的效应¹

¹数据表示成平均值(n＝7-8)。

表6.DGM和蛋白酶的补充对猪的血浆生化指标和氨基酸全肠道表观消化率的效应¹

¹数据表示成平均值(n＝7-8)。同一行中没有相同上标字母的平均值有差异，P＜0.05。

²抗酒石酸酸性磷酸酶。

³碱性磷酸酶。

⁴丙氨酸转氨酶。

⁵血浆尿素氮。

⁶通过使用氧化铬作为指示剂来确定。

肉仔鸡实验

通过在对照饮食中加入蛋白酶，明显改善(P＜0.05)了生长期(第22-42天)和(或)整个期间(第0-42天)的体重增量，但是在DGM饮食中加入NSPase降低了(P＜0.05)体重增量(表7)。在起始期(第0-21天)，用DGM饮食喂养的鸡具有比用对照饮食喂养的鸡更低的采食量(P＜0.05)，但是这一差异在生长期得到了逆转，导致在整个42天期间没有差异。在起始期间或者整个期间，用DGM喂养的鸡的饲养效率比用不含酶添加剂的对照饮食喂养的鸡的饲养效率更高(P＜0.05)。然而，在起始期向DGM饮食中添加酶或者在生长期和整个期间将NSPase添加入DGM饮食中以及在NSPase存在的条件下添加DGM都降低了(P＜0.05)饲养效率。通过将蛋白酶加入到对照饮食中，血浆氨基酸浓度在第21和42天分别升高(P＜0.05)和降低(P＜0.05)(表8)。在第21天，蛋白酶似乎减少了血浆尿酸浓度，但是仅在两种补充了酶的DGM饮食之间发现了唯一的显著性差异(P＜0.05)。

表7.DGM和水解酶对肉仔鸡生长情况的效应¹

¹数据表示成平均值(n＝5)。同一行中没有相同上标字母的平均值有差异，P＜0.05。

表8.DGM和水解酶对肉仔鸡的血浆生化指标的效应¹

¹数据表示成平均值(n＝5)。同一行中没有相同上标字母的平均值有差异，P＜0.05。

相较于没有补充酶的对照饮食，DGM的添加一致地降低了(P＜0.05到0.1)肝脏中所有四种蛋白(eIF4E、mTOR、S6和pS6)以及pS6/S6的比率(图1)。然而，相同的添加对于胸肌中的这四种蛋白、pS6/S6的比率和p70呈现出多变的效应(图2)。在对照饮食中补充NSPase分别降低了肝脏mTOR(P＜0.05)、S6(P＜0.05)和pS6(P＜0.1)以及肌肉eIF4E(P＜0.1)、p70(P＜0.05)和pS6(P＜0.05)。在含DGM的饮食中补充NSPase降低了(P＜0.05)肝脏和肌肉mTOR的水平。在对照饮食中补充蛋白酶降低了(P＜0.05)肝脏pS6的水平并且升高了(P＜0.05)肌肉eIF4E的水平，而在含DGM的饮食中补充相同的酶降低了(P＜0.05)肝脏eIF4E和S6的水平并且增强了肌肉pS6(P＜0.1)和pS6/S6的比率(P＜0.05)。

讨论

猪实验显示，除了在第28天体重降低了7％以及总的日体重增量降低了13％之外，添加10％的DGM对猪的生长情况不产生明显的不利影响。在含DGM的饮食中补充蛋白酶恢复了这些降低。这些数据与关于猪耐受低水平的多种微藻物种的加入的以往报道一致(Hintzetal.，“Sewage-GrownAlgaeasaProteinSupplementforSwine，”Anim.Prod.9：135-140(1967)；Isaacsetal.，“APartialReplacementofSoybeanMealbywholeorDefattedAlgalMealinDietforWeanlingPigsDoesnotAffecttheirPlasmaBiochemicalIndicators，”J.ofAnimalSci.89：723-723(2011)；Fevrieretal.，“IncorporationofaSpiruline(Spirulinamaxima)inSwineFood，”Ann.Nutr.Aliment.29：625-650(1975)，其全部内容在此通过引用并入)。如先前的肉仔鸡(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013)，其全部内容在此通过引用并入)、母鸡(Lengetal.，“DefattedAlgaeBiomassmayReplaceOne-ThirdofSoybeanMealinDietsforLayingHens，”J.Anim.Sci.90：701-701(2012)，其全部内容在此通过引用并入)和猪(Lumetal.，“EffectsofVariousReplacementsofCornandSoybyDefattedMicroalgalMealonGrowthPerformanceandBiochemicalStatusofWeanlingPigs，”J.Anim.Sci.90：701-701(2012)，其全部内容在此通过引用并入)实验所显示的，用本研究中的10％DGM饮食饲养断奶仔猪不改变其血浆ALT的活性。虽然用DGM饮食喂养的猪在第28天显示出升高的血浆AKP活性，以及在第14天显示出降低的血浆TRAP活性，这些变化既不一致，也不足以表明改变的磷营养状况(Kochetal.，“BiologicalCharacteristicsforAssessingLowPhosphorusIntakeinFinishingSwine，”J.Anim.Sci.62：163-172(1986)，其全部内容在此通过引用并入)。先前的研究(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013)，其全部内容在此通过引用并入)也支持这一观点。

用血浆尿酸、尿素氮和氨基酸浓度以及氨基酸全肠道表观消化率的应答评估了补充性DFM和蛋白酶对猪饮食蛋白质的消化和利用的效应。虽然DGM饮食没有改变血浆氨基酸浓度或者氨基酸全肠道表观消化率，但其降低了血浆尿酸和尿素氮的浓度。这些有利的降低似乎表明，猪从含DGM的饮食比从对照饮食中能更有效地利用其摄取的氮。由于血浆尿素氮与尿氮的排泄率高度相关(Kohnetal.，“UsingBloodUreaNitrogentoPredictNitrogenExcretionandEfficiencyofNitrogenUtilizationinCattle，Sheep，Goats，Horses，Pigs，andRats，”J.Anim.Sci.83：879-889(2005)，其全部内容在此通过引用并入)，其降低可能代表养猪生产(swineproduction)向环境排泄更少的氮。在含DGM的饮食中加入了1.2％的血浆蛋白以匹配对照饮食中的蛋白质和氨基酸浓度。较多的血浆蛋白是否有助于克服含DGM的饮食的任何可能的缺陷是未知的。同时，在对照的和含DGM的饮食中补充0.06％的蛋白酶也提高了血浆尿酸浓度和氨基酸全肠道表观消化率。这些改进，连同上述对猪生长情况的积极的效应，表明含DGM饮食中外来蛋白酶介导的增强的蛋白水解作用。

肉仔鸡实验结果显示，加入15％的DGM具有改善鸡生长情况的潜力。在起始期和整个42天期间，用含DGM的饮食喂养的鸡比用对照饮食喂养的鸡具有更高的饲养效率值。相较于用对照饮食喂养的鸡，用DGM喂养的鸡在起始期降低的采食量以及之后在生长期升高的采食量，反映了动物对微藻生物质的适应。值得注意的是，仅在起始期将合成的赖氨酸和蛋氨酸加入了含DGM的饮食中。将含DGM的生长期饮食配制成仅匹配对照饮食中的蛋白质而不匹配两种限制性氨基酸，其设计的目的是为了确定DGM作为蛋白质来源的最大潜能。值得注意的是，用这种生长期饮食喂养的鸡与用对照饮食喂养的鸡显示出相似的生长情况。相较于仅用10％DGM喂养的断奶仔猪中减弱的体重和体重增量，肉仔鸡对加入的15％不含外源性赖氨酸或蛋氨酸的DGM的耐受表明，其利用DGM的能力优于断奶仔猪。

在肉仔鸡饮食中补充蛋白酶和NSPase对其生长情况产生了混合的或者相反的效应。在对照饮食中补充蛋白酶导致体重增量的增加。然而，在含DGM的饮食中进行同样的补充显示出很少的或者不一致的效应，和先前的研究中补充7.5％脱脂硅藻微藻的情况一样(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013)，其全部内容在此通过引用并入)。据推测，DGM在细胞壁结构中含有较高水平的NSP(Domozychetal.，“TheCellWallsofGreenAlgae：AJourneythroughEvolutionandDiversity，”Front.Plant.Sci.3：82(2012)，其全部内容在此通过引用并入)。由于NSP就算以较低的水平(＜50g/kg)存在于肉仔鸡的饮食中，其仍具有抗营养活性(Annisonetal.，“Anti-NutritiveActivitiesofCerealNon-StarchPolysaccharidesinBroilerDietsandStrategiesMinimizingtheirEffects，”WorldPoult.Sci.J.47：232-242(1991)，其全部内容在此通过引用并入)，所以饲喂DGM可能会改变肠道转运时间、肠道黏膜和激素调节(Vahouny，“DietaryFiber，LipidMetabolism，andAtherosclerosis，”Fed.Proc.41：2801-2806(1982)，其全部内容在此通过引用并入)。有趣的是，在含DGM的饮食中补充NSPase一致地降低了生长情况。造成这一与直觉相反的应答的机制目前仍不清楚。类似于在猪实验的第14天发现的结果，补充性蛋白酶降低了鸡的血浆尿酸浓度，显示了改善的饮食氮利用(Donsboughetal.，“UricAcid，Urea，andAmmoniaConcentrationsinSerumandUricAcidConcentrationinExcretaasIndicatorsofAminoAcidUtilizationinDietsforBroilers，”Poult.Sci.89：287-294(2010)；Hernandezetal.，“EffectofLow-ProteinDietsandSingleSexonProductionPerformance，PlasmaMetabolites，Digestibility，andNitrogenExcretionin1-to48-Day-OldBroilers，”Poult.Sci.91：683-692(2012)，其全部内容在此通过引用并入)。然而，与脱脂硅藻微藻的情况(Austicetal.，“PotentialandLimitationofaNewDefattedDiatomMicroalgalBiomassinReplacingSoybeanMealandCorninDietsforBroilerChickens，”J.Agric.FoodChem.61(30)：7341-7348(2013)，其全部内容在此通过引用并入)不同的是，本研究中DGM的加入并没有降低鸡的血浆尿酸浓度。DGM和蛋白酶的加入在第21天时比在第42天时对血浆氨基酸浓度产生更强的效应。这个时间差异可能再次反映鸡对微藻蛋白质随时间的适应和(或)在生长的后期在水解饮食性蛋白质方面对外源性酶较少的依赖(Adeolaetal.，“Board-InvitedReview：OpportunitiesandChallengesinUsingExogenousEnzymestoImproveNonruminantAnimalProduction，”J.Anim.Sci.89：3189-3218(2011)，其全部内容在此通过引用并入)。

新颖的是，揭示了DGM的加入强烈影响鸡肝脏和肌肉中mTOR通路的五个关键信号分子的蛋白产生。同样地，补充性蛋白酶或者NSPase也不同程度地影响了这些分子在两种组织中的蛋白水平。由于这些蛋白是细胞生长、蛋白质合成和能量代谢的关键性调节物(Annisonetal.，“Anti-NutritiveActivitiesofCerealNon-StarchPolysaccharidesinBroilerDietsandStrategiesMinimizingtheirEffects，”WorldPoult.Sci.J.47：232-242(1991)，其全部内容在此参考并入)，因此除非在试验的时间点上存在反馈机制，否则DGM或者酶的加入对其的下调，特别是在肝脏中的下调，与对生长情况或者血浆测量的饮食治疗效应并不是很相关。

总之，在饮食中分别加入10％和15％的DGM的断奶仔猪和肉仔鸡表现良好。饲喂此生物质降低了猪的血浆尿酸和尿素氮的浓度，并且改善了鸡的饲料使用效率。补充性蛋白酶对猪和(或)鸡的生长情况、氨基酸全肠道表观消化率和某些生化指标表现出适度的益处。补充性NSPase将有助于降解各种藻类生物质产品中的复杂的碳水化合物。DGM和酶可用于改善蛋白质的合成和代谢。

实施例2-持续饲喂两类微藻生物质影响蛋鸡中的蛋白质代谢

材料和方法

动物、饮食和护理

将总共150只(26周龄)ShaverWhite商用蛋鸡随机分成5个饮食处理组。每个处理组有5个重复组并且每个重复组由6只单独笼养的母鸡构成。笼子(29cm×47cm×44.5cm)配备有滴头饮水器和单独的槽式喂食器。对禽类提供了16：8小时的L：D周期。在为期14周的整个实验期间提供饲料和水用于自由采食摄取。动物实验已得到康奈尔大学动物护理和使用委员会机构(IACUC)的批准。

脱脂绿色(栅藻Desmodesmussp.)微藻(DGM)和全脂硅藻(十字脆杆藻亚属Staurosirasp；“FD”)微藻的生物质产生于生物燃料生产研究机构(Cellana，Kailua-Kona，Hawaii)。完成了对微藻生物质产品的初步分析，以确定其营养组成并建立饲料配方值(DairyOne，CornellUniversity，Ithaca，NY；AgriculturalExperimentStationChemicalLaboratories，UniversityofMissouri，Columbia，MO；表9)。所述五个饮食处理组为对照组(饮食组1)、以及包含25％DGM(饮食组2和3)或者11.7％FD(饮食组4和5)的饮食组，分别不含(-)或者含有(+)蛋白酶酶补充剂(表10)。基于已有的信息将所有饮食配制成等热量和等氮，以满足NRC(1994)关于蛋鸡的建议。然而，为了避免高基线水平饮食蛋白质和氨基酸对藻类添加潜在的负面效应产生可能的屏蔽作用，特地用14％的粗蛋白(“CP”)配制实验饮食以确保母鸡所需要的所有可用的饮食蛋白。蛋白酶添加的速率是生产商建议水平的3倍(饮食组3和5，15,000PROT/kg)。以PROT单位测定酶活性，其中1个单位定义成在pH9.0和37℃条件下每分钟从1μM底物(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺)释放1μmol对硝基苯胺的酶的量。每种饮食饲喂给5个重复组，每个重复组由6只单独笼养的鸡构成。

表9.实验中使用的两种藻类产品的近似分析和氨基酸谱*

*以原样为基础。

表10.实验饮食的组成和营养价值

¹预混合物提供以下水平(以每千克饮食计算)的维生素和矿物质：维生素A，6,500IU；维生素D，3,500IU；维生素E，25IU，亚硫酸氢钠甲萘醌，5mg；核黄素，25mg；d-钙泛酸，25mg；烟酸，150mg；维生素B₁₂(以0.1％溶于甘露醇中)，11mg；生物素，1mg；叶酸，2.5mg；硫胺素-HCl，7mg；吡哆醇-HCl，25mg；CuSO₄.5H₂O，31.4mg；KI，46μg；MnSO₄·H₂O，61.5mg；Na₂SeO₃，0.13mg；ZnO，43.5mg；Na₂MoO₄·H₂O，1.3mg。

² ProActL(DSM，Bagavaerd，丹麦)；75,000PROT/g。以3倍于200mg/kg饲料的建议加入量加入。

蛋鸡的体重每两周记录一次。每天收集鸡蛋并且在母鸡日产蛋量的基础上计算蛋产量。按重复组(byreplicates)每两周记录一次采食量。对在第2、第4、第6、第8、第10、第12和第14周的最后3天收集的鸡蛋进行单独称重。随后将同样的这些鸡蛋打破，分离并称重蛋黄和蛋清，并将蛋壳在蒸馏水中漂洗、在空气中干燥、并且称重。在第8和第14周的结束，在每个重复组(n＝5/处理组)中随机选择一只鸡来通过右翼静脉进行血液取样并且通过CO₂窒息施以安乐死来分别收集末梢8厘米的十二指肠、空肠和回肠，分别位于十二指肠、空肠和回肠内的消化物，以及肝脏。还在第14周时收集了排泄物。

总氨基酸消化率

在第14周进行安乐死的前五天，用加有0.3％氧化铬(不可消化的标记物)的相同的实验饮食饲喂前述相同的母鸡，用于确定回肠和排泄物的总氨基酸消化率(Ravindranetal.，“AComparisonofIlealDigestaandExcretaAnalysisfortheDeterminationofAminoAcidDigestibilityinFoodIngredientsforPoultry，”BritishPoulttyScience40(2)：266-274(1999)；Kimetal.，“InteractiveEffectsofAge，Sex，andStrainonApparentIlealAminoAcidDigestibilityofSoybeanMealandanAnimalBy-ProductBlendinBroilers，”Poult.Sci.4：908-917(2012)，其全部内容在此通过引用并入)。按照PhthaldialdehydeReagentCompleteSolution(Sigma-AldrichCo.LLC，St.Louis，MO)描述的方法分别确定排泄物、回肠消化物和饲料中的总氨基酸。

血浆生化

除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma-AldrichCo.，LLC(St.Louis，MO)。血液样品以1,000xg离心15min。分离血浆部分并冻于-20℃。使用高效液相色谱法测定胰岛素(Sarmentoetal.，“DevelopmentandValidationofaRapidReversed-PhaseHPLCMethodfortheDeterminationofInsulinfromNanoparticulateSystems，”Biomed.Chromatogr.20：898-903(2006)，其全部内容在此通过引用并入)、3-甲基组氨酸(3-MH)(Henriksonetal.，“AminoAcidAnalysisbyReversePhaseHighPerformanceLiquidChromatography：PrecolumnDerivatizationwithPhenylthiocyanate，”Anal.Biochem.136：65-74(1984)，其全部内容在此通过引用并入)、皮质酮(Fowleretal.，“TheDeterminationofPlasmaCorticosteroneofChickensbyHighPressureLiquidChromatography，”Poult.Sci.62：1075-1079(1983)，其全部内容在此通过引用并入)和谷氨酰胺(Georgietal.，“High-PerformanceLiquidChromatographicDeterminationofAminoAcidsinProteinHydrosylatesandinPlasmaUsingAutomatedPre-ColumnDerivatizationwithO-Phthaldialdehyde/2-Mercaptoethanol，”J.Chromatogr.613：35-42(1993)，其全部内容在此通过引用并入)的血浆浓度。使用尿酸液体稳定试剂盒(InfinityTM，FisherDiagnostics，Middletown，NY)确定血浆尿酸的浓度(Milesetal.“UricAcidExcretionbytheChickasanIndicatorofDietaryProteinQuality，”Poult.Sci.55：98-102(1976)；Vitetal.，“HepaticPurineEnzymesandUricAcidExcretionasIndicatorsofProteinQualityinChicksFedGradedL-LysineDiets，”J.Sci.FoodAgric.62：369-374(1993)，其全部内容在此通过引用并入)。根据Bowers等的方法(“MeasurementofTotalAlkalinePhosphataseActivityinHumanSerum，”Gun.Chem.21：1988(1975)，其全部内容在此通过引用并入)测定碱性磷酸酶(AKP)的血浆活性。根据Lau等的方法(CharacterizationandAssayofTartrate-ResistantAcidPhosphataseActivityinSerum：PotentialUsetoAssessBoneResorption，”Clin.Chem.33：458-462(1987)，其全部内容在此通过引用并入)，并且将pH变更为5.8，来确定抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的血浆活性。

肠道消化物和刷状缘的蛋白酶活性以及氨基酸消化率

在十二指肠、空肠和回肠处分别用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲掉小肠内容物，并且将所述内容物置于无菌小瓶中，快速在液氮中冷冻，并储存在-80℃。在要分析时，于冰上解冻肠道消化物，匀浆60秒，并在4℃18,000xg离心20分钟。倒出上清液用于蛋白酶活性的测定。从所述三个小肠部分收集粘膜片段，并储存在-80℃。在要分析时，将所述粘膜样品匀浆60秒并以3,000xg离心15分钟。将得到的上清液以27,000xg离心30分钟，并且重悬剩余的沉淀物用于确定蛋白酶活性。使用偶氮酪蛋白测定法确定总蛋白酶活性(Tomarellietal.，“TheUseofAzoalbuminasaSubstrateintheColorimetricDeterminationofPepticandTrypticActivity，”J.Lab.Clin.Med.34：428-433(1949)，其全部内容在此通过引用并入)。

Q-PCR分析和Western印迹

为了揭示微藻生物质作为饲料蛋白质新来源的营养和代谢效应的分子机制，确定了十二指肠和肝脏中几个因子的mRNA和蛋白应答。选择和理由如下：几个最重要的氨基酸/肽转运子包括阳离子氨基酸转运体(CAT)家族、寡肽转运蛋白1(PEPT1)、以及NA2+非依赖性支链和氨基酸转运体(LAT)(Gilbertetal.，“DevelopmentalRegulationofNutrientTransporterandEnzymemRNAAbundanceintheSmallIntestineofBroilers，”Poult.Sci.86：1739-1753(2007)；Gilbertetal.，“DietaryProteinQualityandFeedRestrictionInfluenceAbundanceNutrientTransportermRNAintheSmallIntestineofBroilerChicks，”J.Nutr.138：262-271(2008)；Speieretal.，“GeneExpressionofNutrientTransportersandDigestiveEnzymesintheYolkSacMembraneandSmallIntestineoftheDevelopingEmbryonicChick，”Poult.Sci.91：1941-1949(2012)；其全部内容在此通过引用并入)。此外，氨肽酶(APN)可以针对肠道蛋白质组合物的变化做出应答(Gilbertetal.，“DietaryProteinCompositionInfluencesAbundanceofPeptideandAminoAcidTransporterMessengerRibonucleicAcidintheSmallIntestineof2LinesofBroilerChicks，”Poult.Sci.89：1663-1676(2010)，其全部内容在此通过引用并入)。由于饮食性蛋白质的最重要功能之一是提供氨基酸用于蛋白质的合成，因此藻类蛋白质如何影响组织蛋白的合成仍有待确定。虽然有很复杂的系统控制和执行该合成，S6核糖体蛋白(S6)及其上游的调节物包括P70S6激酶1(P70)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化，连同真核起始因子4E(elF4E)在起始蛋白质合成中发挥重要作用并且对饮食蛋白质的改变有应答(Gilbertetal.，“DevelopmentalRegulationofNutrientTransporterandEnzymemRNAAbundanceintheSmallIntestineofBroilers，”Poult.Sci.86：1739-1753(2007)；Gilbertetal.，“DietaryProteinQualityandFeedRestrictionInfluenceAbundanceNutrientTransportermRNAintheSmallIntestineofBroilerChicks，”J.Nutr.138：262-27l(2008)；Speieretal.，“GeneExpressionofNutrientTransportersandDigestiveEnzymesintheYolkSacMembraneandSmallIntestineoftheDevelopingEmbryonicChick，”Poult.Sci.91：1941-1949(2012)；其全部内容在此通过引用并入)。

匀浆十二指肠的组织样品并且使用TRIzol试剂分离和纯化总RNA(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。在Bio-tek分光光度计上于260nm光密度处以及在AgilentBioanalyzer2100(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)上确定RNA的浓度和质量。按照制造商的说明(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)，使用Superscript和随机引物/寡T混合物生成cDNA文库。为了研究饲喂藻类和蛋白酶对肠道蛋白质代谢可能产生的影响，通过RT-qPCR使用SYBRGreen在ABI7700上(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)确定以下关键因子的相对基因表达：PepT1(NM_204365.1，其全部内容在此通过引用并入)、LAT-1(NM_001030579.1，其全部内容在此通过引用并入)、CAT-1(NM_001145490.1，其全部内容在此通过引用并入)和APN(NM_204861.1，其全部内容在此通过引用并入)。用于每个单独基因的引物列于表11中。用对照基因β-肌动蛋白(NM_205518.1，其全部内容在此通过引用并入)的表达，使用△△Ct方程(Livaketal.，“AnalysisofRelativeGeneExpressionDataUsingReal-TimeQuantitativePCRandthe2[-deltadeltaC(T)]Method，”Methods25：402-408(2001)，其全部内容在此通过引用并入)校对每个样品的相对基因表达并且相对于对照的母鸡进行标准化。

表11.鸡mRNA的引物序列

Apn，氨肽酶N；Cat1，阳离子氨基酸转运体-1；Lat1，L型氨基酸转运体1；Pept1，肽转运体-l；和βAact，β-肌动蛋白。

本研究中使用的一抗的信息列于表12中。山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶结合物来自Bio-RadLaboratories公司(Hercules，CA)。信号的检测使用了来自ThermoFisherScientific公司(Rockford，IL)的化学发光底物。使用经液氮冷却的研钵和杵通过冷冻粉碎法提取母鸡肝脏样品(6-10mg)。将提取物溶解在蛋白裂解缓冲液(150mM氯化钠；10mM三氨基甲烷；1mMEDTA；1mM乙二醇-双-N，N，N′，N′-四乙酸；1％氚核；0.5％NP-40；100mM氟化钠；10；mM磷酸钠；和2mM正钒酸钠)中。将匀浆物置于冰上45分钟，然后在4℃以1,000g离心30分钟。将上清液以10,000g再次离心45分钟并以150,000g最后离心45分钟。用二辛可宁酸(BCA)测定法(ThermoFisherScientific，Rockford，IL)确定所得上清液中的蛋白质含量。

表12.Western分析用两种类型微藻喂养的蛋鸡肝脏中蛋白合成相关因子所用的一抗的名称、类型和稀释度*

*所有的抗体均购自CellSignalingTechnology(Beverly，MA)。

**eIF4E，真核起始因子4E；mTOR，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；p70，p70S6激酶；S6，S6核糖体蛋白；和PS6，磷酸化-S6-核糖体蛋白。

将肝匀浆物(25μg蛋白)溶解在SDS还原性样品缓冲液中并在加载至12％(对于检测具有大分子量的mTOR采用7.5％)的SDS-PAGE还原微型凝胶(Bio-RadLaboratories公司，Hercules，CA)之前煮沸5分钟。在稳定的30mA跑胶。使用BioRad微型反式印迹盒在100伏将凝胶中的蛋白质向硝酸纤维素膜转移60min(mTOR转移75分钟)。在滚动的平台上，在含5％牛奶的Tris缓冲盐溶液(TBST)(含0.1％吐温20)中室温(RT)封闭膜1小时。在用TBST洗涤三次(每次5分钟)后，在恒速温和搅拌下将膜与兔的一抗(CellSignalingTechnology公司，Danvers，MA)4℃过夜培育。对于p70S6激酶、S6、磷酸化S6和eIF4E，在3％BSA20(TBST)中以1∶1000稀释抗体，对于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，在3％牛奶TBST中以1∶1000稀释抗体。在RT下与山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶结合物(Bio-RadLaboratories公司，Hercules，CA)(所述结合物以1∶3000稀释于3％牛奶TBST中)培育1小时之前，在TBST中将膜洗涤三次。在TBST中洗涤三次并且在蒸馏水中漂洗五次之后，在暴露于KodakBioMaxXAR胶卷(Carestream，Rochester，NY)之前，在RT下将膜在SuperSignalWestPico化学发光底物(Pierce，Rockford，IL)中培育5分钟。如先前所述确定目标蛋白条带的相对定量值(Yanetal.，“DietarySeleniumDeficiencyPartiallyRescuesType2Diabetes-LikePhenotypesofGlutathionePeroxidase-1-OverexpressingMaleMice，”J.Nutr.142：1975-1982(2012)，其全部内容在此通过引用并入)。

统计分析

使用随机完全区组设计法，每个处理组有5个重复并且每个重复有6只鸡。使用JMP8.0(SASInstitute，Cary，NC)执行了五个正交对比来确定基于藻类的饮食组和对照饮食组之间、藻类饮食组之间、以及酶处理组之间的差异。

1.对照组对比DGM^-+FD^-(1对比2+4)

2.DGM^-对比FD^-(2对比4)

3.DGM⁺对比DG^-(2对比3)

4.FD⁺对比FD^-(4对比5)

5.DGM⁺+FD⁺对比DGM^-+FD^-(2+4对比3+5)

将显著性定义成P＜0.05。

结果

蛋的产量和质量

饮食处理不影响体重(BW)、日均采食量(ADFI)、母鸡日产蛋量和壳的重量(表13)。在最初的2周中饲喂所述两种类型的藻类生物质降低了(P＜0.05)采食量。相较于硅藻，饲喂绿色微藻降低了(P＜0.05)蛋和蛋清的平均重量。在含有蛋白酶，特别是绿藻的饮食组中，平均蛋黄重量也更高(表13)。

表13.在补充和不补充蛋白酶的条件下加入饮食藻类对蛋鸡的蛋产量和质量的效应¹

¹数值表示成整个时期内两周一次数据的平均值(每个处理组n＝5)。

血浆生化指标

在第8或第14周时，胰岛素、谷氨酰胺、尿酸和AKP的血浆浓度在5个治疗组间无显著差异(表14)。在统计学上，在第14周时，用对照饮食喂养的母鸡相较于用藻类饮食喂养的母鸡具有更高的血浆3-MH浓度。发现在第14周时，相较于用不含蛋白酶的硅藻喂养的母鸡，用含蛋白酶的硅藻饮食喂养的母鸡中皮质酮的浓度更低。在第8周时的绿藻喂养组的血浆TRAP活性和在第14周时的所有藻类喂养组的血浆TRAP活性均低于(P＜0.05)对照组的活性。

表14.在第8和第14周时，在补充或不补充蛋白酶的条件下加入饮食藻类对蛋鸡血浆生化的效应^1，2

¹数值表示成平均值(每个处理组n＝5)。

²3-MH，3-甲基组氨酸；TRAP，抗酒石酸抗性酸性磷酸酶；和AKP，碱性磷酸酶。

消化物和刷状缘的蛋白酶活性以及氨基酸消化率

确定了蛋鸡的十二指肠、空肠或者回肠消化物中的蛋白酶活性没有统计学显著性差异(表15)。在第14周时，用绿藻和硅藻喂养的母鸡的空肠刷状缘的蛋白酶活性比对照组更高(P＜0.05)(表15)。在第14周时，蛋白酶的加入提升了十二指肠处的刷状缘蛋白酶活性。未确定刷状缘活性有其他的变化。

表15.在第8和第14周时，在补充或不补充蛋白酶的条件下加入饮食藻类对不同小肠段消化物及刷状缘膜的蛋白酶活性以及回肠和排泄物的表观氨基酸消化率的效应¹

¹数值表示成平均值(每个处理组n＝5)。

²在第14周时使用Cr₂O₃作为不可消化的标记物测得。

蛋白质代谢相关基因和蛋白的表达

观察到对LAT1具有显著的主效应。和对照组相比，在第14周时，用含有蛋白酶的绿藻和硅藻喂养的母鸡在十二指肠分别具有较低(P＜0.05)的LAT1mRNA水平(表16)。正交对比还揭示，含藻类的饮食比对照饮食具有更低水平的LAT1。未确定对CAT1、PepT1、或者APN有其他的主效应。然而，APN的正交对比结果表明含藻类的饮食组具有较低的APN水平(P＝0.056)。

表16.在第14周时，在补充或不补充蛋白酶的条件下加入饮食藻类对十二指肠中氨基酸和肽转运体的相对mRNA水平的效应¹

¹数据表示成相对于对照的相对变化平均值(n＝3-4)。

²Apn，氨肽酶N；Cat1，阳离子氨基酸转运体1；Lat1，L型氨基酸转运体1；和Pept1，肽转运蛋白1。没有相同上标字母的数值有差异，P＜0.05。

与对照组相比，用藻类喂养的4组中肝磷-S6(PS6)的量和PS6/S6的比率上升了4-9倍(P＜0.05)(图3)，而肝S6蛋白的量不受饮食处理的影响。与对照组相比，用绿藻加蛋白酶喂养的母鸡具有更高(P＜0.05)水平的肝elF4E和P70。用硅藻喂养的两组母鸡具有比对照组更低(P＜0.05)的肝mTOR水平和更高的肝P70水平。

讨论

本研究显示，用25％的脱脂绿色微藻或者11.7％的全脂硅藻微藻饲喂母鸡14周不会降低总产蛋量、采食量或者体重。同时，在两个测试的时间点上，用这些藻类产品喂养的母鸡的胰岛素、谷氨酰胺、尿酸血浆浓度和AKP活性与对照组类似。用藻类喂养的母鸡中血浆TRAP活性低于对照组中的活性，提示更优的骨和(或)磷的状态(Igarashietal.，“AcidPhosphatasesasMarkerofBoneMetabolism，”J.Chromatogr.BAnalyt.Technol.Biomed.LifeSci.781：345-358(2002)；Ekmayetal.，“TheEffectsofPulletBodyWeight，DietaryNonpyhtatePhosphorusIntake，andBreederFeedingRegimenonProductionPerformance，ChickQuality，andBoneRemodelinginBroilerBreeders，”Poult.Sci.91：948-64(2012)；其全部内容在此通过引用并入)。因此，和玉米-豆籽粕-小麦对照饮食相比，当两种微藻生物质来源在等热量和等氮的基础上以指定的比率掺入时，该两种微藻生物质来源支持产蛋和生理维持。

在早先的研究中(Lengetal.，“DefattedAlgaeBiomassmayReplaceOne-ThirdofSoybeanMealinDietsforLayingHens，”J.Anim.Sci.90(Suppl.3)：701(2012)，其全部内容在此通过引用并入)，发现与对照组相比，用15％脱脂硅藻喂养8周的Shaver蛋鸡降低了采食量和产蛋量，而用7.5％脱脂硅藻喂养的则没有。同样的，用所述两种藻源喂养的母鸡在本研究最初的2-3周中具有较低的采食量和产蛋量。最初对性能的抑制可能归因于难消化的细胞壁成分(多糖、algaenans)或者矿物(灰分)含量。然而，之后这些差异消失了，这表明所述母鸡能够适应藻类的饲喂。

长期的研究，例如Lipstein等(TheNutritionalValueofAlgaeforPoultry.DriedChlorellainLayerDiets，”Br.PoultrySci.21：23-27(1980)，其全部内容在此通过引用并入)和El-Deek等(TheUseofBrownAlgaeMealinFinisherBroilerDiets，”Egypt.Poult.Sci.31：767-781(2011)，其全部内容在此通过引用并入)的研究，成功掺入了10％以上水平的藻类，而短期的研究，例如Ginzberg等(ChickensFedwithBiomassoftheRedMicroalgaPorphyridiumsp.HaveReducedBloodCholesterolLevelandModifiedFattyAcidCompositioninEggYolk，”J.Appl.Phycol.12：325-330(2000)，其全部内容在此通过引用并入)和Lipstein等(TheNutritiveValueofSewage-Grown，Alum-FlocculatedMicractiniumAlgaeinBroilerandLayingDiets，”Poult.Sci.60：2628-2638(1981)，其全部内容在此通过引用并入)的研究，显示了对蛋鸡和肉仔鸡表现的抑制。因此，本研究中延长的饲喂时间使得更加能够表现出用这些藻类产品饲喂母鸡的潜能。此外，本研究将先前对硅藻微藻的研究扩展到了绿藻这一新来源。在存在3l％粗蛋白的条件下，可以以高于硅藻很多的水平(25％)掺入绿藻，并且对蛋和蛋清的重量只有适度的不利效应。普遍认为在饮食中只能加入高达10％的藻类(Becker，“MicroalgaeinHumanandAnimalNutrition，”RichmondA.，ed.，HandbookofMicroalgaeCulture，BiotechnologyandAppliedPhycology，Oxford：BlackwellScience，p.312-351(2004)，其全部内容在此通过引用并入)。然而，本研究的结果表明，如果有足够的适应时间，掺入更高的水平是有可能的。

在本研究中，用藻类饮食喂养的母鸡具有比用对照饮食喂养的母鸡更低的血浆3-MH浓度。作为蛋白质降解的生物标志物(Youngetal.，“Ntau-Methylhistidine(3-Methylhistidine)andMuscleProteinTurnover：AnOverview，”Fed.Proc.37：2291-300(1978)，其全部内容在此通过引用并入)，更低水平的血浆3-MH表明更少的用以满足母鸡对蛋白质需求的肌肉组织动员。用含藻类饮食喂养的母鸡的回肠总氨基酸消化率比用对照饮食喂养的母鸡更高。与用硅藻喂养的母鸡相比，用绿藻喂养的母鸡的回肠消化率也更高。此外，用藻类喂养的母鸡的空肠刷状缘活性中的总蛋白酶活性以及用绿藻+蛋白酶喂养的母鸡的十二指肠刷状缘膜中的总蛋白酶活性比对照母鸡更高。

看起来，含藻类的饮食具有比对照饮食更好的蛋白质效价或者更高的氨基酸生物利用度。这一结果和当前关于藻类蛋白质相较于酪蛋白、鸡蛋和大豆的消化率或者生物学效价的观点相反(Tejadadeetal.，“NutritiveValueoftheSpirulinaAlgae(Spirulinamaxima)，”Arch.Latinoam.Nutr.28：196-207(1978)；Becker，“Micro-AlgaeasaSourceofProtein，”Biotechnol.Adv.25：207-210(2007)；Misurcovaetal.，“NitrogenContent，DietaryFiber，andDigestibilityinAlgalFoodProducts，”CzechJ.FoodSci.28：27-35(2010)；Skredeetal.，“EvaluationofMicroalgaeasSourcesofDigestibleNutrientsforMonogastricAnimals，”J.Anim.FeedSci.20：131-142(2011)；其全部内容在此通过引用并入)。然而，目前还没有很好地建立起藻类和大豆之间的生物学效价的直接比较。已经显示，肠肽酶活性能适应饮食蛋白质的摄入和质量的变化(Corring，“TheAdaptationofDigestiveEnzymetotheDiet：ItsPhysiologicalSignificance，”Reprod.Nutr.Develop.20：1217-1235(1980)，其全部内容在此通过引用并入)。由于本研究中将所有的饮食都配制成等氮形式，因此在用藻类喂养的母鸡中升高的肠刷状缘膜蛋白水解活性很可能与蛋白质的质量差异有关(Gilbertetal.，“DietaryProteinQualityandFeedRestrictionInfluenceAbundanceNutrientTransportermRNAintheSmallIntestineofBroilerChicks，”J.Nutr.138：262-27l(2008)；Gilbertetal.，“DietaryProteinCompositionInfluencesAbundanceofPeptideandAminoAcidTransporterMessengerRibonucleicAcidintheSmallIntestineof2LinesofBroilerChicks，”Poult.Sci.89：1663-1676(2010)；其全部内容在此通过引用并入)，包括蛋白质类型和氨基酸谱或者氨基酸平衡(Smithetal.，“TheCombinedAminoAcidsinSeveralSpeciesofMarineAlgae，”J.Bio.Chem.217：845-854(1955)；Lewisetal.，“AminoAcidContentsofSomeMarineAlgaefromBombay，”NewPhytologist59：109-115(1960)；Punnettetal.，“TheAminoAcidCompositionofAlgalCellWalls，”J.Gen.Micrbiol.44：105-114(1966)；Boyd，“AminoAcidCompositionofFreshwaterAlgae，”Arch.Hydrobiol.72：1-9(1973)；Campanellaetal.，“FreeandTotalAminoAcidCompositioninBlue-GreenAlgae，”Ann.Chim.92：343-52(2002)；其全部内容在此通过引用并入)。

升高的饮食纤维的水平也被认为能解释所观察到的肠蛋白酶活性的变化。高饮食纤维的饮食上调了断奶仔猪小肠中肠蛋白的水解活性(Hedemannetal.，“IntestinalMorphologyandEnzymaticActivityinNewlyWeanedPigsFedContrastingFiberConcentrationsandFiberProperties，”J.Anim.Sci.84：1375-1386(2006)；其全部内容在此通过引用并入)。另外，Farness等(EffectsofDietaryCellulose，PectinandOatBranontheSmallIntestineintheRat，”J.Nut.112：1315-1319(1982)，其全部内容在此通过引用并入)报道，在用高水平果胶或纤维素喂养的大鼠的小肠中具有升高的肽酶活性。然而，只有硅藻中的高纤维水平(ADF＝15.4％)，而非绿藻中的纤维水平(ADF＝2％)，才有可能有助于部分解释所观察到的肠蛋白酶活性的升高。等(“Non-StarchPolysaccharidesofSugar-BeetPulpImprovetheAdaptationtotheStarterDiet，GrowthandDigestiveProcessoftheWeanedPig，”BrufauJ.(ed.)，FeedManufacturingintheMediterraneanRegion.Improvingsafety：FromFeedtoFood，Zaragoza：CIHEAM，p.185-189(2001)，其全部内容在此通过引用并入)发现，将来自甜菜渣的非淀粉多糖加入断奶仔猪的饮食中升高了其肠中的肽酶活性，并伴随有生长情况和躯体组成的改善。目前还不清楚是否藻类产品，特别是细胞壁中的某些类型的多糖或化合物增强了母鸡中的肠蛋白水解活性和氨基酸回肠消化率。细胞壁的组成也可以解释缺乏被观察到的对蛋白酶加入的效应。

基于生化指标和肠道蛋白酶的活性，加入饮食藻类显示能增强蛋白质的代谢，然而在第14周时加入藻类和蛋白酶对母鸡十二指肠中的三种氨基酸和肽转运蛋白以及氨肽酶N(APN)的基因表达产生混合的影响。虽然Gilbert等(DevelopmentalRegulationofNutrientTransporterandEnzymemRNAAbundanceintheSmallIntestineofBroilers，”Poult.Sci.86：1739-1753(2007)，其全部内容在此通过引用并入)发现了由于较高质量的蛋白质而导致升高的PepT1的表达，本研究并没有表明出任何这样的变化。所述两种类型的藻类似乎降低了LAT1和APN的基因表达，虽然Gilbert等(DietaryProteinCompositionInfluencesAbundanceofPeptideandAminoAcidTransporterMessengerRibonucleicAcidintheSmallIntestineof2LinesofBroilerChicks，”Poult.Sci.89：1663-1676(2010)，其全部内容在此通过引用并入)没有表明因蛋白质组成导致的这种变化。尽管APN的表达较低，但缺乏十二指肠的消化物和刷状缘膜蛋白酶活性的变化表明取得了更高的功效。

在用补充有赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的基于小麦的饮食喂养的生长猪中，空肠中CAT1的表达有所降低(García-Villalobosetal.，“EffectsofDietaryProteinandAminoAcidLevelsontheExpressionofSelectedCationicAminoAcidTransportersandSerumAminoAcidConcentrationinGrowingPigs，”Arch.Anim.Nutr.66：257-270(2012)，其全部内容在此通过引用并入)。然而，在处理组间没有发现CAT1表达的变化。此外，Gilbert等(DietaryProteinCompositionInfluencesAbundanceofPeptideandAminoAcidTransporterMessengerRibonucleicAcidintheSmallIntestineof2LinesofBroilerChicks，”Poult.Sci.89：1663-1676(2010)，其全部内容在此通过引用并入)没有观察到针对蛋白质组成变化的此种应答。

相较于用对照饮食喂养的母鸡，本研究在用喂藻类饮食喂养的母鸡的肝脏中发现了S6(核糖体蛋白)磷酸化的上调和磷酸化S6/S6比率升高。升高的S6的磷酸化促进mRNA的翻译(Everaertetal.，“TheEffectoftheProteinLevelinaPre-StarterDietonthePost-HatchPerformanceandActivationofRibosomalProteinS6KinaseinMuscleofNeonatalBroilers，”Br.J.Nutr.103：206-11(2010)，其全部内容在此通过引用并入)，并且两种藻类在刺激肝脏蛋白质的合成方面表现出了独特的潜力。虽然先前没有报道过藻类的这种潜能，但推测被刺激的蛋白质合成与相较于对照母鸡而言用藻类喂养的母鸡中降低的血浆3-MH和尿酸浓度以及更高的氨基酸回肠消化率是一致的。然而，S6磷酸化的上游调节物(包括P70和mTOR)的肝蛋白水平对于藻类和蛋白酶的饲喂表现出混合的响应。这意味着藻类上调的S6磷酸化的替代机制。等(“Tissue-SpecificRegulationofS6K1byInsulininChickensDivergentlySelectedforGrowth，”Gen.Comp.Endocrinol.156：190-198(2008)，其全部内容在此通过引用并入)报道，在鸡肝脏中S6的磷酸化不通过S6K1级联发生，但最有可能通过替代通路发生。此外，只有绿色海藻+蛋白酶升高了起始因子eIF-4E的肝含量。

总之，这些结果表明，如果给予母鸡足够的适应期的话，可以加入比以前认为的高得多的水平的微藻生物质。对于适应期的需求可能会减弱藻类在肉仔鸡中的潜能，但能证明其对于蛋鸡和肉种鸡是有益的。

虽然本文中已经详细地描绘和描述了优选的实施方式，但是对于相关领域的技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明精神的条件下作出各种修改、增加、替换等，并且因此认为这些修改、增加、替换等是在权利要求中所限定的本发明范围之内的。

Claims (40)

1.一种动物饲料组合物，其包括：

总计为所述组合物48-70％w/w的量的一种或多种谷物；

总计为所述组合物15-30％w/w的量的非藻类蛋白源；

总计为所述组合物3-15％w/w的量的藻类；

总计为所述组合物0.01-0.1％w/w的外源性蛋白酶；和

总计为所述组合物0.5-15％w/w的量的对所述藻类异源的油。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种谷物包括玉米、小麦、大米、高粱、燕麦、土豆、红薯、木薯、DDGS、及其组合。

3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述非藻类蛋白源包括大豆、鱼粉、棉籽粕、菜籽粕、肉粉、血浆蛋白、血粉、及其组合。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述藻类包括全脂藻类。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述对所述藻类异源的油以总计为所述组合物0.5-5％w/w的量存在于所述组合物中。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述藻类包括脱脂藻类。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述对所述藻类异源的油以总计为所述组合物3-15％w/w的量存在于所述组合物中。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述对所述藻类异源的油包括玉米油。

9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述藻类包括绿色海洋藻类栅藻(Desmodesmussp)。

10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包括以下一种或多种：

总计为高达所述组合物1.5％w/w的量的无机磷源；

总计为高达所述组合物0.5％w/w的量的钠源；和

选自下组的总计为高达所述组合物0.5％w/w的量的一种或多种氨基酸：赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸和蛋氨酸。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述磷源包括磷酸氢二钙。

12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包括以下一种或多种：

总计为所述组合物0.5-3.0％w/w的量的血浆蛋白；

总计为所述组合物0.1-10％w/w的量的无机钙源；

总计为所述组合物0.1-1％w/w的量的维生素/矿物质混合物，其中所述维生素/矿物质混合物包括一种或多种微量矿物质；

总计为所述组合物0.01-0.1％w/w的量的无机镁源；和

总计为所述组合物0.01-0.1％w/w的量的抗生素。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述一种或多种微量矿物质选自Cu、Se、Zn、I、Mn、Fe和Co。

14.一种动物饲料添加剂，其包括：

藻类；

外源性蛋白酶；和

对所述藻类异源的油。

15.根据权利要求14所述的动物饲料添加剂，其中所述藻类包括全脂藻类。

16.根据权利要求14或者权利要求15所述的动物饲料添加剂，其中所述藻类包括脱脂藻类。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的动物饲料添加剂，其中所述对所述藻类异源的油包括玉米油。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的动物饲料添加剂，其中所述藻类包括绿色海洋藻类栅藻(Desmodesmussp)。

19.根据权利要求14-18中任一项所述的动物饲料添加剂，其还包括以下任意一种或多种：

无机磷源；

钠源；和

选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸和蛋氨酸。

20.根据权利要求19所述的动物饲料添加剂，其中所述无机磷源包括磷酸氢二钙。

21.根据权利要求14-20中任一项所述的动物饲料添加剂，其还包括以下一种或多种：

血浆蛋白；

无机钙源；

维生素/矿物质混合物；

无机镁源；和

抗生素。

22.根据权利要求21所述的动物饲料添加剂，其中所述一种或多种微量矿物质选自Cu、Se、Zn、I、Mn、Fe和Co。

23.一种饲养动物的方法，所述方法包括：

向动物施用权利要求1-13中任一项所述的动物饲料组合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述动物选自下组：反刍动物、家禽、猪、水产养殖物、宠物、狗、猫、马、动物园动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述动物是断奶仔猪。

26.一种饲养动物的方法，所述方法包括：

将动物饲料和权利要求14-22中任一项所述的动物饲料添加剂组合施用给动物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述动物选自下组：反刍动物、家禽、猪、水产养殖物、宠物、狗、猫、马、动物园动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述动物是断奶仔猪。

29.一种改善动物饲养效率的方法，所述方法包括：

在能有效引起动物中血浆氮相对于接受不含所述动物饲料添加剂的动物饲料喂养的该动物浓度降低的条件下，将所述动物饲料和权利要求14-22中任一项所述的动物饲料添加剂组合施用给所述动物，从而改善在所述动物中的饲养效率。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述动物选自下组：反刍动物、家禽、猪、水产养殖物、宠物、狗、猫、马、动物园动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述动物是断奶仔猪。

32.一种改善动物饲养效率的方法，所述方法包括：

在能有效引起动物中相对于接受除所述动物饲料组合物以外的动物饲料喂养的该动物浓度降低的条件下，向所述动物施用权利要求1-13中任一项所述的动物饲料组合物，从而改善在所述动物中的饲养效率。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述动物选自下组：反刍动物、家禽、猪、水产养殖物、宠物、狗、猫、马、动物园动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述动物是断奶仔猪。

35.在动物饲料中，所述改进包括：

藻类和

外源性蛋白酶，其中所述藻类和外源性蛋白酶的量能有效引起用所述动物饲料喂养的动物中血浆氮浓度降低。

36.根据权利要求35所述的动物饲料，其中所述动物选自下组：反刍动物、家禽、猪、水产养殖物、宠物、狗、猫、马、动物园动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。

37.根据权利要求36所述的动物饲料，其中所述动物是断奶仔猪。

38.根据权利要求35-37中任一项所述的动物饲料，其中所述藻类包括全脂藻类。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的动物饲料，其中所述藻类包括脱脂藻类。

40.根据权利要求35-39中任一项所述的动物饲料，其中所述藻类包括绿色海洋藻类栅藻(Desmodesmussp)。