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CN105543144A - 一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用 - Google Patents

一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用 Download PDF

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CN105543144A
CN105543144A CN201610072298.6A CN201610072298A CN105543144A CN 105543144 A CN105543144 A CN 105543144A CN 201610072298 A CN201610072298 A CN 201610072298A CN 105543144 A CN105543144 A CN 105543144A
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CN
China
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crybb2
antigen protein
fermentation
expressing
bacillus coli
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Pending
Application number
CN201610072298.6A
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Inventor
赵骞
张福诚
吴知才
李子龙
李倩倩
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Wuhan Aibo Taike Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Wuhan Aibo Taike Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Wuhan Aibo Taike Biotechnology Co Ltd filed Critical Wuhan Aibo Taike Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610072298.6A priority Critical patent/CN105543144A/zh
Publication of CN105543144A publication Critical patent/CN105543144A/zh
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Abstract

本发明公开了一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用，所述的发酵培养基的配方包括胰蛋白胨10~25g/L，玉米浆1~20g/L，KH2PO4？1～5g/L，K2HPO4？1～5g/L，酵母浸膏10~25g/L，(NH4)2SO4？0.1~1.5？g/L,MgSO4·7H2O？0.1～1.0g/L，NaCl？1～15g/L，甘油1～15ml/L，余量是水，pH值为6.0~8.0。本发明提供的培养基为全合成培养基，不仅营养成分含量准确，可重复性强，能够降低大规模发酵及后处理的操作难度，而且大大减少了大规模生产的成本，无论菌体量还是蛋白表达量都能得到显著提高。

Description

一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用。
背景技术
先天性白内障又称婴幼儿白内障,是儿童致盲的主要原因之一，具有遗传异质性。先天性白内障的发病机制还不十分明确。随着分子遗传学的发展，越来越多的与白内障相关的基因被发现，至今为止已克隆了至少39个致病基因，主要分为4类：晶状体蛋白基因、缝隙链接蛋白基因、膜蛋白基因及晶状体发育过程中的各种调节蛋白因子。目前研究者认为，晶状体蛋白基因突变是引起遗传性白内障的主要原因。晶状体蛋白，作为哺乳动物晶状体中最主要的结构蛋白，最大的特征在于其高度的稳定性和可溶性。晶状体蛋白可分为为α、β和γ晶状体蛋白家族，是白内障重要的候选致病基因。crybb2基因编码βB2-晶状体蛋白，属于β/γ晶状体蛋白超家族成员，是晶状体蛋白家族中表达最多的蛋白，具有较强的抗氧化及抗脱酰胺能力，其功能受到细胞生理和遗传特性的调节。
一般情况下，蛋白的表达量与大肠杆菌发酵密度密切相关，大肠杆菌的收率直接关系到目的蛋白的得率。
crybb2基因编码βB2-晶状体蛋白作为该供试菌株表达的异源蛋白未能分泌至胞外，而是以分泌物的形式存在于菌体胞内，因此，为提高重组蛋白得率、降低培养体积、提升下游操作效率以及减少设备投入，本发明通过应用高密度发酵技术，对供试的重组大肠杆菌菌株BL21DE(3)/pET28a-crybb2进行大规模培养，着重研究其发酵过程中菌体生长、基质消耗、次级代谢产物乙酸的生成、动态平衡及其内在规律等，确定控制发酵代谢的抑制性因素和限制性因素，实现对其发酵代谢过程的调节和控制，优化发酵培养基成分、发酵培养条件和发酵工艺，并进行中试放大及产业化放大研究，实现该供试菌株的高密度高表达发酵培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基。该培养基为全合成培养基，不仅营养成分含量准确，可重复性强，能够降低大规模发酵及后处理的操作难度，而且大大减少了大规模生产的成本。最关键的是本发明的培养基配方是适合于生产crybb2抗原蛋白的专用培养基，无论菌体量还是蛋白表达量都能得到显著提高。
本发明还提供了一种一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的发酵方法，方法简单，易行。
本发明最后一个目的在于提供了一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基的应用，包括利用本发明提供的培养基进行重组大肠杆菌的工业发酵。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基，包括：胰蛋白胨10～25g/L，玉米浆1～20g/L，KH2PO41～5g/L，K2HPO41～5g/L，酵母浸膏10～25g/L，(NH4)2SO40.1～1.5g/L,MgSO4·7H2O0.1～1.0g/L，NaCl1～15g/L，甘油1～15ml/L，余量是水，pH值为6.0～8.0。
以上所述的培养基配方，优选的：胰蛋白胨10～20g/L，玉米浆5～10g/L，KH2PO41～3g/L，K2HPO42～5g/L，酵母浸膏15～25g/L，(NH4)2SO40.5～1.5g/L,MgSO4·7H2O0.1～0.8g/L，NaCl5～15g/L，甘油5～12ml/L，余量是水，pH值为6.0～7.5。
以上所述的培养基配方，优选的：胰蛋白胨13g/L，玉米浆6g/L，KH2PO41.6g/L，K2HPO42.2g/L，酵母浸膏18g/L，(NH4)2SO41.0g/L,MgSO4·7H2O0.3g/L，NaCl7g/L，甘油10ml/L，余量是水，pH值为7.0。
一种表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的发酵方法，包括：
(1)批培养阶段：30L发酵罐的中发酵培养基的装液量为5～25L，将培养至对数生长期的重组大肠杆菌种子液按1％～3％(体积比)接种量接种至30L发酵罐中，控制温度为35-38℃，通过流加25％的氨水调控pH值至6.0-7.5，不断调节搅拌速度与通气量，控制溶氧在10％，当培养基中的甘油消耗完全时，溶氧出现陡升，开始进入补料培养阶段；
所述的发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10～25g/L，玉米浆1～20g/L，KH2PO41～5g/L，K2HPO41～5g/L，酵母浸膏10～25g/L，(NH4)2SO40.1～1.5g/L,MgSO4·7H2O0.1～1.0g/L，NaCl1～15g/L，甘油1～15ml/L，余量是水，pH值为6.0～8.0。
(2)补料培养阶段：通过溶氧实时反馈，流加无菌的75％葡萄糖溶液，控制菌体比生长速率为0.10-0.15，补料期间控制溶氧为10％。
(3)诱导表达阶段：当发酵液中菌体OD600为60～70时添加IPTG，至IPTG终浓度为0.8～1.2mM，诱导期间控制温度为15-20℃，pH值为6.0～8.0，控制溶氧为10％，诱导12～18h结束。
所述的重组大肠杆菌为表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌。
以上所述方案中，优选的，表达crybb2抗原蛋白的重组大肠杆菌的制备方法包括：
(1)crybb2基因的合成
人工合成的crybb2基因连接到pGEX-4T载体上得到重组质粒pGEX-4T-crybb2。
(2)pET-28a-crybb2质粒的构建
利用EcoRI+XholI同时酶切pGEX-4T-crybb2和pET-28a(+)，将酶切后crybb2基因片段与酶切后pET-28a(+)连接，构建出pET-28a-crybb2质粒。
(3)转化
将pET-28a-crybb2质粒加入感受态细胞BL-21(DE3)中，涂布平板，筛选阳性株，即得到表达crybb2抗原蛋白的重组大肠杆菌。
(4)目的基因在大肠杆菌中的表达鉴定
将重组菌株培养并进行诱导表达后收集菌体，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和westernblot，对蛋白进行鉴定。
以上所述方案中，优选的，鉴定正确的重组大肠杆菌的种子液的制备过程包括：
将重组大肠杆菌在TSA平皿上活化后，挑取单克隆用20mlTSB种子培养基进行一次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为1.0，得到一级种子液；再吸取6ml一级种子液用200mlTSB种子培养基进行二次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为0.6，得到二级种子液；然后按3％接种量接种至发酵罐中。
以上所述方案中，优选的，发酵过程中每10个小时取样镜检、并测定发酵液菌体密度、湿重和干重。发酵结束后通过SDS-PAGE检测发酵液的目的蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.相较于其他的半合成培养基或天然培养基，本发明的提供的培养基在考虑操作可行性的前提下，需按其不同成分的化学性质进行配制、灭菌、添加，以达到稳定有效的发酵利用。
2.本发明是针对产胞内crybb2抗原蛋白的重组大肠杆菌所设计的高密度高表达发酵培养基配方，本发明提供的培养基配方既能保证供试菌株在一定的比生长速率情况下菌体生长代谢正常，得到较高的菌体量，又能使crybb2蛋白的表达量得到显著提高，完全可以满足大规模生产的要求。
3.利用本发明提供的培养基和发酵方法，本发明的培养基在发酵终点菌体量可达210g/L，每升发酵液的蛋白表达量可达17.6g，比常用商业培养基TSB培养基蛋白表达量提高了约3倍，而发酵生产成本降低了近60％。
附图说明
图1crybb2基因PCR扩增图。
泳道1和2均为crybb2基因扩增图。
图2为本发明中pET-28a-crybb2质粒图谱示意图。
图3为本发明中重组抗原SDS-PAGE电泳。
泳道：1为marker；2为空质粒PGEX-4T；3为重组菌(BL21DE(3)/pET28a-crybb2)未诱导；4为重组菌(BL21DE(3)/pET28a-crybb2)诱导1h；5为重组菌(BL21DE(3)/pET28a-crybb2)诱导2h蛋白；6为为重组菌(BL21DE(3)/pET28a-crybb2)诱导3h蛋白；
图4为实施例5中产crybb2蛋白的重组大肠杆菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2在30L发酵罐中的菌体生长曲线示意图。
具体实施方式
本发明实施例所用技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
表达crybb2抗原蛋白的重组大肠杆菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2的构建：
(1)crybb2基因的合成
将crybb2基因(Genebank：CR456426.1)于上海生工生物工程有限公司合成，共615bp(SEQIDNO.1所示)(图1)，并连接到pGEX-4T载体上得到重组质粒pGEX-4T-crybb2。
(2)pET-28a-crybb2质粒的构建
利用EcoRI+XholI(购自宝生物(大连)有限公司产品)同时酶切pGEX-4T-crybb2的crybb2基因片段和pET-28a(+)，将酶切后crybb2基因片段与酶切后pET-28a(+)连接(图2)，构建出pET-28a-crybb2质粒。
(3)转化
取感受态细胞BL-21(DE3)100μl加入到1.5mlEP管中，将pET-28a-crybb2质粒0.5μl加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90秒，冰浴3min-5min。将其涂布于含有25μg/mlKna的LB琼脂平板。37℃正置1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14h～16h至菌落出现。得到的菌落为表达crybb2抗原蛋白的重组大肠杆菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2。
(4)目的基因在大肠杆菌中的表达鉴定
将重组大肠杆菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2接种于含有25μg/mlKna的3mLLB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μL接种于10mL含有25μg/mlKna的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD600达到0.6时，加IPTG至终浓度为1.2mmol/L，18℃继续培养，3h后收集菌体。并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(图3)及westernblot对蛋白进行鉴定，鉴定结果表明，本实施例制备的重组大肠杆菌可正确表达crybb2蛋白，作为以下大型发酵培养的供试菌株。
实施例2：
一种表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的发酵方法，包括：
A.发酵培养基的配制：胰蛋白胨500g，玉米浆400g,KH2PO4100g，K2HPO4100g，酵母浸膏500g，(NH4)2SO430g,MgSO4·7H2O20g，NaCl300g，甘油300ml，溶于20L蒸馏水，调整pH值为7.5，转移至30L发酵罐中，在121℃高压蒸汽下灭菌30min，冷却后即为发酵培养基。
B.补料培养阶段葡萄糖的制备：称取葡萄糖150g，并用蒸馏水溶解并定容至200ml，在115℃高压蒸汽下灭菌25min冷却后作为75％葡萄糖备用。当灭菌温度超过115℃时葡萄糖容易碳化，产生糠醛，对菌体的生长不利。
发酵种子液的制备：将重组大肠杆菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2在TSA平皿上活化后，挑取单克隆用20mlTSB种子培养基进行一次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为1.0，得到一级种子液；再吸取6ml一级种子液用200mlTSB种子培养基进行二次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为0.6，即得发酵种子液；
C.发酵过程控制：
(1)批培养阶段：发酵种子液的接种量为3％，发酵温度控制37℃，通过流加25％的氨水调控pH值在7.5，不断调节搅拌速度与通气量，控制溶氧在10％。当发酵培养基中的甘油消耗完全时，溶氧会出现陡升，此时发酵开始进入补料培养阶段。
(2)补料培养阶段：通过溶氧实时反馈，控制菌体比生长速率为0.10的情况下进行指数流加无菌的75％葡萄糖溶液，补料期间溶氧控制在10％。
(3)诱导表达阶段：当发酵液OD600为62时开始进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，至IPTG的终浓度为1.2mM，诱导期间将温度控制在18℃，pH值为7.5，溶氧仍控制在10％，诱导15h后结束。
按上述操作对供试菌株进行发酵，结果是：发酵前期菌体生长旺盛，在发酵30h时OD600达到62，诱导15h结束发酵，发酵终点菌体量为180g/L，crybb2蛋白的表达量达到14.6g/L。
实施例3：
一种表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的发酵方法，包括：
A.发酵培养基的配制：胰蛋白胨200g，玉米浆200g，KH2PO420g，K2HPO440g，酵母浸膏300g，(NH4)2SO410g，MgSO4·7H2O2g，NaCl100g，甘油100ml，溶于20L蒸馏水，调整pH值为6.5，转移至30L发酵罐中，在121℃高压蒸汽下灭菌30min，冷却后既为发酵培养基。
B.补料培养阶段葡萄糖的制备：称取葡萄糖150g，并用蒸馏水溶解并定容至200ml，在115℃高压蒸汽下灭菌25min冷却后作为75％葡萄糖备用。当灭菌温度超过115℃时葡萄糖容易碳化，产生糠醛，对菌体的生长不利。
发酵种子液的制备：将重组大肠杆菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2在TSA平皿上活化后，挑取单克隆用20mlTSB种子培养基进行一次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为1.0，得到一级种子液；再吸取6ml一级种子液用200mlTSB种子培养基进行二次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为0.6，即得发酵种子液；
C.发酵过程控制：
(1)批培养阶段：发酵种子液的接种量为3％，发酵温度控制37℃，通过流加25％的氨水调控pH值在6.0，不断调节搅拌速度与通气量，控制溶氧在10％。当发酵培养基中的甘油消耗完全时，溶氧会出现陡升，此时发酵开始进入补料培养阶段。
(2)补料培养阶段：通过溶氧实时反馈，控制菌体比生长速率为0.10的情况下进行指数流加无菌的75％葡萄糖溶液，补料期间溶氧控制在10％。
(3)诱导表达阶段：当发酵液OD600为60时开始进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，至IPTG的终浓度为1.2mM，诱导期间将温度控制在18℃，pH值为7.0，溶氧仍控制在10％，诱导15h后结束。
按上述操作对供试菌株进行发酵，结果是：发酵前期菌体生长旺盛，在发酵30h时OD600达到60，诱导15h结束发酵，发酵终点菌体量为172g/L，crybb2蛋白的诱导表达量达到13.8g/L。
实施例4：
一种表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的发酵方法，包括：
A.发酵培养基的配制：胰蛋白胨260g，玉米浆120g，KH2PO432g，K2HPO444g，酵母浸膏360g，(NH4)2SO420g,MgSO4·7H2O6g，NaCl140g，甘油200ml，溶于20L蒸馏水，调整pH值为7.0，转移至30L发酵罐中，在121℃高压蒸汽下灭菌30min，冷却后既为发酵培养基。
B.补料培养阶段葡萄糖的制备：称取葡萄糖150g，并用蒸馏水溶解并定容至200ml，在115℃高压蒸汽下灭菌25min冷却后作为75％葡萄糖备用。当灭菌温度超过115℃时葡萄糖容易碳化，产生糠醛，对菌体的生长不利。
发酵种子液的制备：将重组大肠杆菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2在TSA平皿上活化后，挑取单克隆用20mlTSB种子培养基进行一次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为1.0，得到一级种子液；再吸取6ml一级种子液用200mlTSB种子培养基进行二次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为0.6，即得发酵种子液；
C.发酵过程控制：
(1)批培养阶段：发酵种子液的接种量为3％，发酵温度控制37℃，通过流加25％的氨水调控pH值在7.0，通过调节搅拌速度与通气量，控制溶氧在10％。当发酵培养基中的甘油消耗完全时，溶氧会出现陡升，此时发酵开始进入补料培养阶段。
(2)补料培养阶段：通过溶氧实时反馈，控制菌体比生长速率为0.10的情况下进行指数流加无菌的75％葡萄糖溶液，补料期间溶氧控制在10％。
(3)诱导表达阶段：当发酵液OD600为70时开始进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，至IPTG的终浓度为1.2mM，诱导期间将温度控制在18℃，pH值为6.0，溶氧仍控制在10％，诱导15h后结束发酵。
按上述操作对供试菌株进行发酵，结果是：发酵前期菌体生长旺盛，在发酵30h时OD600达到70，诱导15h结束发酵，发酵终点菌体量可达210g/L，crybb2蛋白的诱导表达量达到17.6g/L。发酵曲线见图4所示。
实施例5：TSB培养基发酵实验
A.TSB发酵培养基的配制：称取600gTSB粉末，用单蒸水定容至20L，转移至30L发酵罐中，在121℃高压蒸汽下灭菌30min，冷却后既为发酵培养基。
B.补料培养阶段葡萄糖的制备：称取葡萄糖150g，并用蒸馏水溶解并定容至200ml，在115℃高压蒸汽下灭菌25min冷却后作为75％葡萄糖备用。当灭菌温度超过115℃时葡萄糖容易碳化，产生糠醛，对菌体的生长不利。
发酵种子液的制备：将重组大肠杆菌BL21DE(3)/pET28a-crybb2在TSA平皿上活化后，挑取单克隆用20mlTSB种子培养基进行一次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为1.0，得到一级种子液；再吸取6ml一级种子液用200mlTSB种子培养基进行二次扩增，培养条件为37℃，200r/min，培养至OD600为0.6，即得发酵种子液；
C.发酵过程控制：
(1)批培养阶段：发酵种子液的接种量为3％，发酵温度控制37℃，通过流加25％的氨水调控pH值在7.0，不断调节搅拌速度与通气量，控制溶氧在10％。当发酵培养基中的甘油消耗完全时，溶氧会出现陡升，此时发酵开始进入补料培养阶段。
(2)补料培养阶段：通过溶氧实时反馈，控制菌体比生长速率为0.10的情况下进行指数流加无菌的75％葡萄糖溶液，补料期间溶氧控制在10％。
(3)诱导表达阶段：当发酵液OD600为3.8时，开始进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，IPTG的终浓度为1.2mM，诱导期间将温度控制在18℃，pH值为6.0，溶氧仍控制在10％，诱导15h后结束发酵。
通过TSB对重组大肠杆菌进行表达，在发酵6h时OD600达到3.8，即开始诱导，诱导期间将温度控制在18℃，诱导15h结束发酵，诱导结束后的蛋白表达量为5.8g/L。
SEQUENCELISTING
<110>武汉爱博泰克生物科技有限公司
<120>一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用
<130>一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用
<160>1
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Claims (6)

1.一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基，包括：胰蛋白胨10~25g/L，玉米浆1~20g/L，KH2PO41～5g/L，K2HPO41～5g/L，酵母浸膏10~25g/L，(NH4)2SO40.1~1.5g/L,MgSO4·7H2O0.1～1.0g/L，NaCl1～15g/L，甘油1～15ml/L，余量是水，pH值为6.0~8.0。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：胰蛋白胨10~20g/L，玉米浆5~10g/L，KH2PO41～3g/L，K2HPO42～5g/L，酵母浸膏15~25g/L，(NH4)2SO40.5~1.5g/L,MgSO4·7H2O0.1～0.8g/L，NaCl5～15g/L，甘油5～12ml/L，余量是水，pH值为6.0~7.5。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：胰蛋白胨13g/L，玉米浆6g/L，KH2PO41.6g/L，K2HPO42.2g/L，酵母浸膏18g/L，(NH4)2SO41.0g/L,MgSO4·7H2O0.3g/L，NaCl7g/L，甘油10ml/L，余量是水，pH值为7.0。
4.一种表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的发酵方法，包括：
（1）批培养阶段：30L发酵罐的中发酵培养基的装液量为5~25L，将培养至对数生长期的重组大肠杆菌种子液按1%~3%接种量接种至30L发酵罐中，控制温度为35-38℃，通过流加25%的氨水调控pH值至6.0-7.5，不断调节搅拌速度与通气量，控制溶氧在10%；
所述的发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10~25g/L，玉米浆1~20g/L，KH2PO41～5g/L，K2HPO41～5g/L，酵母浸膏10~25g/L，(NH4)2SO40.1~1.5g/L,MgSO4·7H2O0.1～1.0g/L，NaCl1～15g/L，甘油1～15ml/L，余量是水，pH值为6.0~8.0；
（2）补料培养阶段：通过溶氧实时反馈，流加无菌的75%葡萄糖溶液，控制菌体比生长速率为0.10-0.15，补料期间控制溶氧为10%；
（3）诱导表达阶段：当发酵液中菌体OD600为60~70时添加IPTG，至IPTG终浓度为0.8~1.2mM，诱导期间控制温度为15-20℃，pH值为6.0~8.0，控制溶氧为10%，诱导12~18h结束；
所述的重组大肠杆菌为表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的方法，所述的表达crybb2抗原蛋白的重组大肠杆菌的制备方法包括：
（1）crybb2基因的合成
人工合成的crybb2基因连接到pGEX-4T载体上得到重组质粒pGEX-4T-crybb2；
（2）pET-28a-crybb2质粒的构建
利用EcoRI＋XholI同时酶切pGEX-4T-crybb2和pET-28a(+)，将酶切后crybb2基因片段与酶切后pET-28a(+)连接，构建出pET-28a-crybb2质粒；
（3）转化
将pET-28a-crybb2质粒加入感受态细胞BL-21（DE3）中，涂布平板，筛选阳性株，即得到表达crybb2抗原蛋白的重组大肠杆菌。
6.权利要求1所述的培养基在重组大肠杆菌工业发酵中的应用；所述的重组大肠杆菌为表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌。
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