CN105534991A - 五环三萜类化合物在制备usp7抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用。设计优化具有高活性高选择性的USP7小分子抑制剂，有利于新型抗肿瘤药物的开发以及更为全面的理解与USP7相关的多种肿瘤的发生机理。本发明公开的五环三萜类化合物是一类全新的USP7小分子抑制剂，其中熊果酸等天然五环三萜类小分子更是已经广泛地用作医药原料以及抗肿瘤研究当中，这一研究对于开拓熊果酸等天然五环三萜类小分子应用范围，进一步了解此类小分子化合物抑制肿瘤的作用机制有重要创新意义，同时也为开发具有自主知识产权的以USP7为靶标的创新药物奠定先导化合物基础。

Description

五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，更具体地讲，涉及五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用。

背景技术

泛素化作为一种动态、可逆的蛋白质翻译后修饰，在细胞凋亡、细胞周期调控、DNA损伤修复及膜转运等细胞过程中扮演着重要角色。泛素化(ubiquitylation)是介导蛋白质降解的重要方式之一，它通过将泛素(ubiquitin，Ub)结合到靶蛋白上，形成多聚泛素链，被蛋白酶体识别，引起蛋白质降解。其逆过程，即去泛素化是由去泛素化蛋白酶(Deubiquitinatingenzyme，DUBs)所介导的。其中，泛素特异性蛋白酶(ubiquitinspecificproteases，USPs)家族在DUBs中数量最多，研究也最为深入。研究显示，USPs参与了细胞周期调控、信号传导、免疫应答、DNA修复等多种细胞生命活动。近年来，在肿瘤研究方面，已发现多种USPs与肿瘤的发生和发展密切相关。其中，USP7(也被称为HAUSP，herpesvirus-associatedubiquitin-specificprotease)已经成为新兴的肿瘤治疗靶标。

已有的研究结果表明，USP7对多种重要的肿瘤相关蛋白如p53、PTEN、FOXO4等，都具有调控作用。其中，p53是肿瘤抑制因子中的研究热点。USP7可以将p53的负调控蛋白如MDM2、MDM4等去泛素化，使p53负调控蛋白的细胞内水平增加，进而导致p53的细胞内水平下降，活性降低，从而促进肿瘤细胞的存活。因此，抑制USP7的活性，可以升高p53的细胞内水平，进而促使癌细胞凋亡。目前研究发现，USP7在前列腺癌、多发性骨髓瘤等癌细胞中存在过度表达的情况，且这种过度表达与肿瘤的发生直接相关。

由于USP7在导致肿瘤发生和发展进程中的关键作用，发展USP7选择性抑制剂日益受到人们的重视。目前已经报道的USP7抑制剂均属于有机小分子抑制剂，按照抑制剂的分子结构可以分为四类：氰基茚并吡嗪类、吡咯酮类、9-氯四氢吖啶酰胺类及噻吩类，其代表性化合物及其对USP7的抑制效果如图1所示。前三类小分子抑制剂由法国Hybrigenics医药公司研发，其代表化合物分别为化合物1(HBX41108)、化合物2、化合物3(HBX28258)。其中HBX41108是首个报道的USP7抑制剂，其对USP7的EC₅₀达到了0.4μmol/L。然而，HBX41108的选择性较差，它对USP家族的其他成员(如USP8等)也有强的抑制作用。第四类以噻吩结构为母核的小分子抑制剂是由专门致力于泛素通路研究的美国Progenra公司研发的，这种此类小分子抑制剂对USP7具有最优的选择性，其代表化合物为化合物4(P5091)。研究表明，P5091只对USP7(EC₅₀＝4.2μmol/L)和与其结构最接近的USP47(EC₅₀＝4.3μmol/L)具有抑制活性，而对USP2、USP8等其他的DUBs基本没有影响。Progenra公司的研究人员还对P5091进行了结构改造和构效关系分析，其衍生物可以进一步提高对USP7的抑制效果。但是此类小分子抑制剂也存在一定的缺陷：首先，噻吩类小分子抑制剂与USP7蛋白的具体结合模式及相互作用机制并不清楚；其次，此类小分子抑制剂依然无法区分USP7与USP47，其选择性有待进一步提高；最后，此类小分子抑制剂在生物体内的稳定性较差，在一定程度上影响了其在细胞水平的抑制效果。综上所诉，USP7选择性抑制剂的发现已成为当前抗肿瘤药物开发中的一个热点，国际上多家医药公司和学术机构纷纷开始投入大量人力物力开展这方面的研究。然而国内尚未有USP7选择性抑制剂报道。

五环三萜类化合物及其衍生物广泛存在于自然界的植物当中，并具有广泛的抗炎、抗肿瘤、抗病毒等生物活性。近年来，五环三萜类化合物在抗肿瘤药物的筛选中获得了不少有活性的化合物，而且这些化合物抗肿瘤作用呈现多部位、多环节、多靶点的特点，既能使药物长时间持续发挥效力，又能使患者带瘤生存时间延长，使其有望成为新一代的抗肿瘤药物。五环三萜类化合物的抗肿瘤作用机制研究目前已经被广泛研究，受到越来越多的科研工作者重视。

本发明通过对大量天然五环三萜类化合物对USP7抑制效果的筛选发现熊果酸等天然五环三萜类化合物对USP7具有明显的抑制活性。此类新型的USP7抑制剂具有新颖的分子骨架结构。细胞水平的研究显示熊果酸可以在癌细胞内有效抑制USP7的活性，进而上调p53，最终诱导癌细胞凋亡。

发明内容

本发明的目的在于提供五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用。

作为一个优选方案，所述五环三萜类化合物包括熊果酸、齐墩果酸、桦木酸、科罗索酸、常春藤皂甙元和扁塑藤素中的一种或几种。

本发明的优点在于：USP7可以调控重要的肿瘤抑制因子，在肿瘤的发生与发展过程中发挥了关键的作用。设计优化具有高活性高选择性的USP7小分子抑制剂，有利于新型抗肿瘤药物的开发以及更为全面的理解与USP7相关的多种肿瘤的发生机理。当前国际范围内，已有多种USP7小分子抑制剂被报道，但是其中还有诸多不足亟待解决，如选择性不高、缺乏抑制剂与靶标蛋白结合模式的研究、抑制效果有待提高等等。本发明公开的五环三萜类化合物是一类全新的USP7小分子抑制剂，其中熊果酸等天然五环三萜类小分子更是已经广泛地用作医药原料以及抗肿瘤研究当中，这一研究对于开拓熊果酸等天然五环三萜类小分子应用范围，进一步了解此类小分子化合物抑制肿瘤的作用机制有重要创新意义，同时也为开发具有自主知识产权的以USP7为靶标的创新药物奠定先导化合物基础。

附图说明

图1USP7抑制剂的分子结构及其对USP7的抑制效果。

图2天然五环三萜类化合物的分子结构及其对USP7的抑制效果。

图3计算机模拟熊果酸与USP7晶体结构(PDBID:4M5W)的对接结果。

图4(A)使用CETSA(cellularthermalshiftassay)的方法验证熊果酸在细胞内是否可以直接与USP7相结合：实验结果表明，熊果酸可以提高USP7在高温下的稳定性，证明熊果酸在细胞内直接作用于USP7；(B)熊果酸对HO8910细胞的增值抑制效果；(C)(D)卵巢癌细胞HO8910经CDDO-Me处理后，westernblot检测所示蛋白水平。

图5熊果酸对USP7及USP47的抑制效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.用Ub-AMC酶活测试体系进行体外检测天然五环三萜类小分子化合物对USPs(包括USP7、USP47)的抑制活性

以USP7为例：

测试于96孔板中进行。测试使用Buffer：EDTA，0.5mM；DTT，2mM；Tris-HCl(PH7.6)50mM，全长USP7终浓度为20nM，Ub-AMC终浓度为400nM。

(1)USP7与被测化合物于37℃孵育20分钟。

(2)加入Ub-AMC，测试体系于37℃孵育50分钟。

(3)应用酶标仪测试样品的激发光强度，激发光波长为380nm，发射光波长为460nm。将测试结果进行EC₅₀计算，得化合物对USP7的体外抑制活性。

测试结果如图2所示，多个化合物显示出对USP7明显的抑制活性：其中乌苏烷型化合物：熊果酸(IC₅₀＝7.0±1.5μmol/L)、科罗索酸(IC₅₀＝22.7±2.1μmol/L)表现出对USP7的抑制活性；齐墩果烷型化合物：齐墩果酸(IC₅₀＝12.5±1.0μmol/L)、常春藤皂苷元(IC₅₀＝33.5±1.0μmol/L)、扁塑藤素(IC₅₀＝21.1±3.2μmol/L)表现出对USP7的抑制活性；羽扇烷型化合物：桦木酸(IC₅₀＝33.3±2.6μmol/L)表现出对USP7的抑制活性。

接下来，我们以抑制活性最高的熊果酸为研究对象，测试了熊果酸对USP47的抑制活性。测试结果显示(图5)，熊果酸可以在一定程度上区分USP7与USP47，熊果酸对USP7抑制效果是对USP47抑制效果的3.6倍(熊果酸对USP47的IC₅₀为25.7±2.6μmol/L)，这一结果优于已报道的USP7抑制剂。

实施例2.熊果酸与细胞内USP7的结合效果(CETSA实验)

以72℃为例：使用大于10⁷个的HO8910细胞，用PBS洗三次，用细胞刮刮下，收集到1.5ml离心管，2500rpm离心5min，弃净上清，加入500μlPBS(1:100加入cocktail)，将细胞充分重悬，放液氮快速冷冻30s，室温放置约15min，直至完全溶解，如此重复3次，20000g，20min，4℃离心，将上清吸入新的1.5mlEP管，等分为两份，每份240μl,一份加入熊果酸(终浓度15μM)，另一份加入相同体积的DMSO，室温孵育30min。将上述裂解液等分至PCR管，每管30μl，稍离心，放PCR仪，按照设置好的温度孵育3min，室温孵育3min。然后20000g，20min，4℃离心。将20μl上清转到0.6ml的EP管中，加入5μl的5xloadingbuffer，72℃煮5min。将样品用8％的SDS-PAGE胶进行westernblot分析。

如图4A所示，熊果酸可以提USP7在高温下的稳定性，这说明熊果酸在细胞内可以直接作用于USP7蛋白。

实施例3.熊果酸对卵巢癌细胞HO8910的增值抑制试验

将HO8910细胞种至96孔板中，24小时后，细胞完全贴后，用不同浓度的熊果酸加入细胞中，用DMSO做溶剂对照。处理细胞48小时后，每孔加入10μl的CCK-8试剂。细胞培养箱再培养2小时后，在450nm检测吸光值。本实验说明，熊果酸能够抑制卵巢癌细胞HO8910的活性。

实施例4.Westernblotting检测熊果酸在卵巢癌细胞HO8910内对USP7的抑制情况

使用不同浓度的熊果酸处理HO8910细胞。收取细胞后裂解蛋白，并进行蛋白浓度测定。将样品进行westernblotting，用8％的SDS-PAGE胶。胶上的蛋白转染至NC膜上，用丽春红进行膜染色，查看上样量是不是一样。将膜用PBS漂洗3次后，用5％的脱脂牛奶室温封闭1小时，先后上一抗和二抗，用化学发光的方法进行显影。如图4C，D所示，熊果酸可以在细胞内有效抑制USP7活性，下调Mdm2，上调p53；同时检测与细胞凋亡相关的蛋白水平也说明，随着USP7被抑制，p53上调，细胞被诱导凋亡。本实验说明熊果酸在细胞内能够有效抑制USP7的活性，诱导癌细胞凋亡。

实施例5.熊果酸与USP7的计算机模拟对接实验

我们尝试使用计算机模拟的方法将熊果酸的分子结构与已报道的USP7的晶体结构进行对接实验，对接结果显示，熊果酸可能结合于USP7的泛素结合口袋(theubiquitinbindingpocket)，并与多个结合区域的氨基酸残产生相互作用(图3)。分子对接试验所使用的计算机软件为AutoDock4.2。USP7的催化域晶体结构来源于ProteinDataBank(http://www.rcsb.org/pdb)(PDBID:4M5W)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用，其特征在于，所述五环三萜类化合物包括熊果酸、齐墩果酸、桦木酸、科罗索酸、常春藤皂甙元和扁塑藤素中的一种或几种。