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CN105483230A - 用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用 - Google Patents

用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用，特点是分子标记物为miR-3197分子标志物，其核苷酸序列为5’GGAGGCGCAGGCUCGGAAAGGCG-3’，其正向扩增引物的核苷酸序列为5’-GGA？GGC？GCA？GGC？TCG？GAA？-3’，？可应用于检测2型糖尿病视网膜病变的试剂盒中，优点是检测效率高，针对性强，可用群2型糖尿病视网膜病变的辅助诊断、检测或筛查药物中。

Description

用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用
技术领域
本发明涉及一种miRNA分子标记物，尤其是涉及一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用。
背景技术
2型糖尿病（Type2diabetesmellitus，T2DM）又名非胰岛素依赖性糖尿病，是糖尿病最主要的类型，约占90%（23499527）。是一组以慢性高血糖为特征的多因素代谢异常综合征，它是全球性主要致死、致残及耗费巨大的疾病之一。糖尿病性视网膜病变(Diabeticretinopathy,DR)作为糖尿病最严重的微血管并发症之一，已成为糖尿病患者致盲的首位原因，目前全球DR患者约9300万（22301125）。我国糖尿病患者9240万，居全球第一位，其中DR患病率为37％（20335585）。且随着糖尿病发病率的增加和人均寿命的延长，DR的患病率正不断增加，提示未来DR将是视力丧失和视功能损害的主要原因。糖尿病视网膜病变诊断的金标准是眼底荧光血管造影，但其是侵入性检测，具有创伤性，并且价格昂贵，费时。因此，寻找一些生物标记物预测或警示DR的发生，对降低其致盲率有着重要的意义。
目前，已有研究表明循环miRNAs是一类具有潜在临床诊断价值的新型生物标志物。但目前，国内外还没有公开任何关于利用miRNA分子作为检测2型糖尿病视网膜病变预测或诊断的分子标记物来检测2型糖尿病视网膜病变的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用，其中循环miR-3197表达水平与2型糖尿病性视网膜病变患病率呈正相关，检测效率高，针对性强。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物，所述的miRNA分子标记物为miR-3197分子标志物，分子标记物miR-3197基因片段的核苷酸序列为5’GGAGGCGCAGGCUCGGAAAGGCG-3’。
上述miR-3197分子标志物的正向扩增引物的核苷酸序列为5’-GGAGGCGCAGGCTCGGAA-3’，其反向扩增引物为通用引物。
一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的试剂盒，该试剂盒包括扩增上述miR-3197基因片段的正向扩增引物：5’-GGAGGCGCAGGCTCGGAA-3’以及cel-miR-39内参基因的正向扩增引物的核苷酸序列为：5’-CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3’。
一种利用上述miR-3197分子标记物检测2型糖尿病视网膜病变的检测方法，步骤如下：
a、总RNA的提取；
b、采用miScript?IIRTKit试剂盒对miRNA进行反转录；
c、PCR扩增：利用7500real-timePCRsystem仪器进行，加入cel-miR-39作为内参基因，25ul扩增体系:12.5ulSYBRGreen混合液，2.5ul通用引物，2.5ul特异性引物，2ulcDNA溶液和5.5ul无RNA酶水；扩增反应条件：初始激活在95℃，15分钟；94℃15s，55℃30s，70℃30s，共40次循环；反应完成后进行熔解曲线分析；其中引物溶液包括扩增miR-3197基因片段的正向扩增引物：5’-GGAGGCGCAGGCTCGGAA-3’以及cel-miR-39内参基因的正向扩增引物，其核苷酸序列为：5’-CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3’，反向引物为通用引物；各引物浓度均为10pmol/ul；
d、鉴定：扩增完成后，利用2-△△CT方法分析基因表达量，若miR-3197基因片段高水平表达，且表达倍数高于1.7则认为处于糖尿病视网膜病变发病早期。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物及其扩增引物和应用，其中分子标记物为miR-3197分子标志物、内参基因为cel-miR-39以及扩増miR-3197、cel-miR-39的正向引物；检测方法为总RNA的提取、cDNA合成、PCR扩增和鉴定，鉴定快速、简便、特异和有效。循环miR-3197表达水平增加会导致糖尿病视网膜病变发生，与糖尿病视网膜病变发病率呈正相关。该标记物的发掘和应用可以方便快捷地在分子水平上实现对2型糖尿病视网膜病变的检测，检测效率高，针对性强，同时，以循环miR-3197表达水平为靶点的药物有望成为2型糖尿病视网膜病变辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
附图说明
图1为循环miR-3197在DR与T2DM的表达水平差异性图；
图2是PCR扩增获得的miR-3197基因片段的ROC曲线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
1、研究对象的收集
本研究所有样本都是在单位医学研究伦理道德委员会批准和患者知情同意情况下收集，其中健康组血清样本144例、糖尿病前期组血清样本70例、T2DM血清样本117例及DR血清样本75例。收集要求：①诊断均经眼底荧光血管造影检查证实，DR经证实有微血管瘤，出血，硬性渗出，棉絮状软性渗出等症状；健康组、糖尿病前期组、T2DM组经证实双眼散瞳检查眼底正常。均排除①急、慢性感染性疾病；②严重心、脑、肝功能损害及影响糖代谢的其它内分泌疾病；③单眼或双眼屈光介质明显浑浊，影响眼底观察者。
2、运用基因芯片在5例糖尿病前期、5例健康人、5例T2DM及5例DR（根据年龄、性别、BMI及病史（>10年）严格配对）血清样本中筛选出有差异明显、可能与DR发展密切相关的循环miRNAs。
根据芯片检测技术，结果显示循环miR-3197、miR-2116-5P、miR-3939及miR-1910-3p在DR与T2DM组中表达差异显著。各分子标记物基因片段的核苷酸序列如下：分子标记物miR-3197的核苷酸序列为5’-GGAGGCGCAGGCUCGGAAAGGCG-3’；
miR-2116-5P的核苷酸序列为：5’-GGUUCUUAGCAUAGGAGGUCU-3’；
miR-3939的核苷酸序列为：5’-UACGCGCAGACCACAGGAUGUC-3’；
miR-1910-3p的核苷酸序列为：5’-GAGGCAGAAGCAGGAUGACA-3’；
3、通过根据年龄、性别、BMI及病史（>10年）进行匹配，最后配对出45例DR血清和45例T2DM血清样本，并进一步扩大样本验证。
4、应用miRNeasySerum/PlasmaKit(Qiagen)试剂盒提取样本的血清miRNA，再通过分光光度测定仪检测所得miRNA的浓度，以供循环miR-3197、miR-2116-5P、miR-3939及miR-1910-3p荧光定量PCR检测。
5、RT-PCR检测
本研究采用荧光定量PCR（RT-PCR）对循环miR-3197、miR-2116-5P、miR-3939及miR-1910-3p在DR与T2D表达水平进行检测。此技术的基本原理：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。用于实验的miR-3197PCR扩增正向引物序列如下：5’-GGAGGCGCAGGCTCGGAA-3’、miR-2116-5PPCR扩增正向引物序列：5’-GGGTTCTTAGCATAGGAGGTC-3’、miR-3939PCR扩增正向引物序列：5’-TTACGCGCAGACCACAGGAT-3’、miR-1910-3pPCR扩增正向引物序列：5’-TGGAGGCAGAAGCAGGATGA-3’。反向引物均为通用引物（核苷酸序列如SEQIDNO.9所示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG）。cel-miR-39内参基因的核苷酸序列为：5’-CCUGAGUCGAUCGAUAUAGGA-3’。扩增cel-miR-39内参基因的正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3’，反向向引物均为通用引物（核苷酸序列如SEQIDNO.9所示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG），体积为2.5ul。
上述扩增的具体步骤为：
（1）miRNeasy血清提取试剂盒(Qiagen)提取血清miRNAs，在提取好的血清miRNA中加入3.5μlmiRNA-39作为内控；
（2）采用miScript?II反转录试剂盒(Qiagen，Germany)试剂盒对miRNA进行反转录；
（3）把步骤（2）中反转录成的cDNA在定量聚合酶链反应（PCR）稀释11倍，加入cel-miR-39为归一化的外参控制，25ul扩增体系：12.5ulSYBRPCR混合液，2.5ul通用引物，2.5ul特异性引物，2ulcDNA溶液和5.5ul无RNA酶水。扩增步骤包括初始激活在95℃，15分钟；94℃15s，55℃30s，70℃30s，共进行40次循环。而在7500real-timePCRsystem(AppliedBiosystems)仪器进行操作。（注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定）各引物浓度均为10pmol/ul。
6、数据分析
本次研究采用2-△△CT方法对数据进行整理分析得到的箱图（如图1所示），结果发现：被检测的循环miR-3197在DR与T2DM中表达差异显著，P=0.0033，小于0.01，有统计学意义。
通过SPSS18.0软件分析得到的ROC曲线（受试者工作特征曲线）图（如图2所示）中，曲线下面积（AUC）为0.967，大于0.5，这说明循环miR-3197的表达水平程度用来辅助诊断2型糖尿病视网膜病变有很强的诊断价值。通过试剂盒检测循环miR-3197的表达水平程度来辅助诊断糖尿病视网膜病变有一定意义。注：参考线即机会对角线，参考线下面积（AUC)为0.5，此线之下则该诊断方法完全没有诊断价值。
鉴定：扩增完成后，利用2-△△CT方法分析基因表达量，若miR-3197基因片段高水平表达，且表达倍数高于1.7则认为处于糖尿病视网膜病变发病早期。
通过试剂盒对循环miRNAs表达水平的测量分析，我们发现：总群体中miR-3197在2型糖尿病视网膜病变患者与2型糖尿病对照组之间有差别，即在2型糖尿病视网膜病变患者的表达水平要明显高于对照组。
本发明可用于检测与2型糖尿病视网膜病变相关的循环miR-3197表达水平程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物，其特征在于：所述的分子标记物miR-3197基因片段的核苷酸序列为5’GGAGGCGCAGGCUCGGAAAGGCG-3’。
2.一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-3197分子标记物的扩增引物，其特征在于：权利要求1所述的miR-3197分子标志物的正向扩增引物的核苷酸序列为5’-GGAGGCGCAGGCTCGGAA-3’，其反向扩增引物为通用引物。
3.一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的试剂盒，其特征在于包括权利要求2所述的扩增miR-3197基因片段的正向扩增引物：5’-GGAGGCGCAGGCTCGGAA-3’以及cel-miR-39内参基因的正向扩增引物的核苷酸序列为：5’-CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3’。
4.一种利用权利要求1所述的miR-3197分子标记物检测2型糖尿病视网膜病变的检测方法，其特征在于步骤如下：
a、总RNA的提取；
b、采用miScript?II反转录试剂盒试剂盒对miRNA进行反转录；
c、PCR扩增：利用7500real-timePCRsystem仪器进行，加入cel-miR-39作为内参基因，25ul扩增体系：12.5ulSYBRPCR混合液，2.5ul通用引物，2.5ulmiR-3197特异性引物，2ulcDNA溶液和5.5ul无RNA酶水；扩增反应条件：初始激活在95℃，15分钟；94℃15s，55℃30s，70℃30s，共40次循环；反应完成后进行熔解曲线分析；其中引物溶液包括扩增miR-3197基因片段的正向扩增引物：5’-GGAGGCGCAGGCTCGGAA-3’以及cel-miR-39内参基因的正向扩增引物的核苷酸序列为：5’-CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3’，反向引物为通用引物；各引物浓度均为10pmol/ul；
d、鉴定：扩增完成后，利用2-△△CT方法分析基因表达量，若miR-3197基因片段高水平表达，且表达倍数高于1.7则认为处于糖尿病视网膜病变发病早期。
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