CN105473164A

CN105473164A - 一种核酸和药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN105473164A
Application number: CN201480046773.1A
Authority: CN
Inventors: 张戈; 吕爱平; 郭保生; 张鸿雁
Original assignee: Suzhou Ribo Life Science Co Ltd
Current assignee: Suzhou Ribo Life Science Co Ltd
Priority date: 2013-08-26
Filing date: 2014-08-26
Publication date: 2016-04-06
Also published as: WO2015027895A1; US20160272967A1

Abstract

提供了一种针对骨形成抑制基因CKIP-1的小干扰核酸、其药物组合物及其在制备用于治疗和/或预防与CKIP-1基因表达异常相关的疾病的药物组合物中的应用。所述小干扰核酸能够跨物种抑制CKIP-1基因的表达，同时抑制人、恒河猴、大鼠和小鼠CKIP-1的表达，有效促进成骨细胞分化和骨基质矿化。

Description

一种核酸和药物组合物及其应用技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种核酸、该核酸的应用和一种药物组合物。背景技术

骨质疏松症（osteoporosis) 是一种系统性骨病，其特征是骨量下降和骨的微细结构破坏，表现为骨的脆性增加，因而极易发生骨折。成年人在骨发育成熟以后，通过骨吸收与骨形成两个相互关联的过程来维持骨的新陈代谢。随着人体衰老，骨形成能力下降，不能弥补骨吸收，造成骨丢失，出现骨质疏松及骨折并发症。伴随着人口老龄化的日益严重，骨质疏松症的发病率处于连年上升的趋势，严重威胁着患者的健康。

除了钙剂、维生素 D预防和治疗骨质疏松症的基础药物外，还有骨转换抑制剂、骨形成促进剂和解偶联剂等治疗性药物。这些治疗多是通过抑制骨吸收来维持骨量，少数药物能促进新骨生成，但在长期使用后可能会增加骨吸收的风险，或者具有其他副作用。因此，本领域需要开发新的治疗药物，能够促进新骨生成而不剌激骨吸收，以达到治疗甚至逆转骨质疏松进程的效果，同时减少用药引起的副作用。

RNA干扰（RNAi) 是一种天然的由小双链 RNA介导的在转录后水平特异性抑制基因表达的过程。理论上，任何与基因相关的疾病均可以用 RNAi进行靶向治疗，骨质疏松症也不例外。研究发现，酪蛋白激酶 2相互作用蛋白 1 (casein kinase-2 interaction protein 1， CKIP-1 ) 是一种骨形成抑制基因，重要的是 CKIP-1能特异地调节骨形成而非骨吸收，且在类风湿关节炎后期骨破坏病人及骨质疏松症患者较正常人的骨标本中表达量高。由此推测，靶向 CKIP-1的小核酸药物将是治疗骨质疏松症的一个良好品种。

根据食品和药物管理局（FDA) 的药物注册指导方针（USA)，用于抗骨质疏松的药物应当在临床试验开始前进行两个不同动物模型的预临床测试， SP，至少包括啮齿动物（大鼠或小鼠）和非人灵长类动物（恒河猴）。但是，靶向某一物种的特异性 CKIP-1 siRNA在其它物种体内都表现出较低的 mRNA抑制效率，这显然特别不利于该药物的筛选及研究，因此，需要寻找在不同物种间均能够表现出较高 mRNA抑制效率的靶向 CKIP-1的 siRNA。发明内容

本发明的目的是克服现有的核酸难以在不同物种间均表现出较高抑制效率的缺陷，提供一种能够靶向于 CKIP-1基因的跨物种同源的小干扰核酸，并达到治疗和 /或预防骨质疏松症的效果。为了实现上述目的，本发明提供了一种核酸，该核酸含有正义链序列为与 SEQ ID NO: 1具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 2具有 90% 以上的序列同一性的序列的 siRNA-l、正义链序列为与 SEQ ID NO: 3具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 4具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-2、正义链序列为与 SEQ ID NO: 5具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 6具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-3、正义链序列为与 SEQ ID NO: 7具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 8具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-4、正义链序列为与 SEQ ID NO: 9具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 10具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-5、正义链序列为与 SEQ ID NO: 11具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO : 12 具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-6, 正义链序列为与 SEQ ID NO: 13具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 14具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-7和正义链序列为与 SEQ ID NO: 15具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 16具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-8中的至少一种。优选地，具有 90%以上的序列同一性的序列是指完全一致的序列和仅有 1个碱基不一致的序列，更优选地，在正义链中，不一致的 1个碱基位于正义链的第 19位，在反义链中，不一致的 1个碱基位于反义链的第 1位。上述小干扰核酸中所有核苷酸基团可以是未经化学修饰的，也可以含有至少一个修饰的核苷酸基团。

本发明还提供了另外一种核酸，该核酸为插入有编码短发夹核糖核酸的核酸片段的质粒，所述质粒表达所述短发夹核糖核酸，所述编码短发夹核糖核酸的核酸片段由两个短反向重复片段和位于所述两个短反向重复片段之间的环片段组成；所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 17具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 18具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 19具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 20具有 90% 以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 21 具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 22具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 23具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 24具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 25具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 26具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 27具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 28 具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 29具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID N0: 30具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 31具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 32具有 90%以上的序列同一性的序列。优选地，具有 90%以上的序列同一性的序列是指完全一致的序列和仅有 1个碱基不一致的序列，更优选地，在正义链中，不一致的 1个碱基位于正义链的第 19位，在反义链中，不一致的 1个碱基位于反义链的第 1位。

本发明还提供了一种分离的 CKIP-1基因小干扰核酸分子的靶序列，其中，所述靶序列的序列为与 SEQ ID NO: 33-40中任意一条具有 90%以上的序列同一性的序列。优选地，具有 90%以上的序列同一性的序列是指完全一致的序列和仅有 1个碱基不一致的序列，更优选地，不一致的 1个碱基位于靶序列的第 19位。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的核酸和药学上可接受的载体。

本发明还提供了上述核酸在制备用于治疗和 /或预防与 CKIP-1 基因表达异常相关的疾病的药物组合物中的应用。

本发明还提供了一种治疗和 /或预防与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病的方法，该方法包括用上述核酸和 /或药物组合物对患者进行给药。

此外，本发明还提供了一种抑制细胞中 CKIP-1基因表达的方法，该方法包括将上述核酸和 /或药物组合物导入细胞。

通过上述技术方案，本发明提供的核酸和药物组合物在人、恒河猴、大鼠和小鼠中均表现出较高的 CKIP-1抑制效率，能够有效地促进成骨细胞分化和骨基质矿化，对与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病具有良好的治疗和 /或预防作用。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语 siRNA是指小干扰核糖核酸， shRNA是指短发夹核糖核酸。

本发明提供的核酸含有正义链序列为与 SEQ ID NO: 1具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO : 2 具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-K 正义链序列为与 SEQ ID NO: 3具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 4具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-2、正义链序列为与 SEQ ID NO: 5具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 6 具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-3、正义链序列为与 SEQ ID NO: 7具有 90% 以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 8具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-4、正义链序列为与 SEQ ID NO: 9具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 10具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-5、正义链序列为与 SEQ ID NO: 11具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 12具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-6、正义链序列为与 SEQ ID NO: 13具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 14具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-7和正义链序列为与 SEQ ID NO: 15具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 16具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-8中的至少一种。

优选地，具有 90%以上的序列同一性是指序列之间存在 1个碱基不一致，在正义链中，不一致的 1个碱基位于正义链的第 19位，在反义链中，不一致的 1个碱基位于反义链的第 1位。

更优选地，本发明的核酸含有正义链序列为 SEQ ID NO: 1且反义链序列为 SEQ ID NO: 2的 siRNA-l、正义链序列为 SEQ ID NO: 3且反义链序列为 SEQ ID NO: 4的 siRNA-2、正义链序列为 SEQ ID NO: 5且反义链序列为 SEQ ID NO: 6的 siRNA-3、正义链序列为 SEQ ID NO: 7且反义链序列为 SEQ ID NO: 8的 siRNA-4、正义链序列为 SEQ ID NO: 9且反义链序列为 SEQ ID NO: 10的 siRNA-5、正义链序列为 SEQ ID NO: 11且反义链序列为 SEQ ID NO: 12的 siRNA-6、正义链序列为 SEQ ID NO: 13且反义链序列为 SEQ ID NO: 14的 siRNA-7、正义链序列为 SEQ ID NO: 15且反义链序列为 SEQ ID NO: 16的 siRNA-8、正义链序列为 SEQ ID NO: 83且反义链序列为 SEQ ID NO: 84的 siRNA-lA、正义链序列为 SEQ ID NO: 85且反义链序列为 SEQ ID NO: 86的 siRNA-lG、正义链序列为 SEQ ID NO: 87且反义链序列为 SEQ ID NO: 88的 siRNA-lC、正义链序列为 SEQ ID NO: 89且反义链序列为 SEQ ID NO: 90的 siRNA-3A、正义链序列为 SEQ ID NO: 91且反义链序列为 SEQ ID NO: 92的 siRNA-3U、正义链序列为 SEQ ID NO: 93且反义链序列为 SEQ ID NO: 94的 siRNA-3C、正义链序列为 SEQ ID NO: 95且反义链序列为 SEQ ID NO: 96的 siRNA-5A、正义链序列为 SEQ ID NO: 97且反义链序列为 SEQ ID NO: 98的 siRNA-5U和正义链序列为 SEQ ID NO: 99且反义链序列为 SEQ ID NO: 100的 siRNA-5C 中的至少一种。其中， siRNA-lA、 siRNA-lG和 siRNA-lC的正义链和反义链分别与 siRNA-1的正义链和反义链具有 90%的序列同一性； siRNA-3A、 siRNA-3U和 siRNA-3C的正义链和反义链分别与 siRNA-3的正义链和反义链具有 90%的序列同一性； siRNA-5A、 siRNA-5U和 siRNA-5C的正义链和反义链分别与 siRNA-5的正义链和反义链具有 90%的序列同一性。

根据本发明所述的核酸，其中，所述核酸含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，优选情况下，所述核酸含有至少一个修饰的核苷酸基团。所述修饰的核苷酸基团不会导致所述核酸抑制 CKIP-1表达的功能的丧失。

根据本发明所述的核酸，其中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团和 /或核糖基团被修饰的核苷酸基团。

例如，磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰

(Phosphorthioate)和硼垸化磷酸盐修饰（Boranophosphate)。如下式所示分别用硫和硼垸置换磷酸基团中的氧。两种修饰都能稳定核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

硼垸化磷酸盐修饰核糖基团的修饰是指对核糖基团中 2'-羟基（2'-OH) 的修饰。在核糖基团的 2'-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加了核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中 2'-羟基的修饰包括 2'-氟修饰（2'-fluro modification )、 2'-甲氧基修饰（2'-ΟΜΕ)、 2'-甲氧乙基修饰（2'-ΜΟΕ)、 2'-2,4-二硝基苯酚修饰（2'-D P modification )、锁核酸修饰（LNA modification)、 2'-氨基修饰（2'-Amino modification)、 2'-脱氧修饰（2'-Deoxy modification) 等。

2'-甲氧乙基修饰 2'-2,4-二硝基苯酚修饰

锁核酸修饰 2'-氨基修饰 2'-脱氧修饰根据本发明所述的核酸，其中，优选情况下，核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的 2'-ΟΗ被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。

根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述核酸的正义链中含有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸基团为所述核糖基团被修饰的核苷酸基团，即，所述核酸的正义链中含有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸基团中的核糖基团的 2'-ΟΗ被甲氧基或氟取代。更优选地，所述核酸的正义链和反义链的 3 '端均连接有 dTdT。具有以上修饰的核酸表现出更为优异的体内抑制效果，且上述修饰能够进一步降低本发明的核酸在体内的免疫原性，具体修饰可参见表 2。

根据本发明所述的核酸，其中，包括所述 siRNA-l、所述 siRNA-2、所述 siRNA-3、所述 siRNA-4、所述 siRNA-5、所述 siRNA-6、所述 siRNA-7和所述 siRNA-8的 siRNA 可以通过本领域常规的方法获得，例如通过固相合成和液相合成得到，所述固相合成已经有商业的订制服务，因此可以通过商购获得（如苏州瑞博生物技术有限公司）。所述修饰的核苷酸基团可以通过具有相应修饰的核苷酸单体引入。

基于如上合成的 siRNA, 本发明进一步提供了与上述 siRNA具有相同或相似功能的 shRNA表达质粒，具体如下：

本发明还提供了一种核酸，该核酸为插入有编码短发夹核糖核酸的核酸片段的质粒，所述质粒表达所述短发夹核糖核酸，所述编码短发夹核糖核酸的核酸片段由两个短反向重复片段和位于所述两个短反向重复片段之间的环片段组成；所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 17具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 18具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 19具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO : 20具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 21 具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 22具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 23具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 24具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO : 25具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 26具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 27具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 28 具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 29具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ IDNO: 30具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 31具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQIDNO: 32具有 90%以上的序列同一性的序列。

更优选地，所述核酸为插入有编码短发夹核糖核酸的核酸片段的质粒，所述质粒表达所述短发夹核糖核酸，所述编码短发夹核糖核酸的核酸片段由两个短反向重复片段和位于所述两个短反向重复片段之间的环（loop) 片段组成；所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQIDNO: 19和 SEQ ID NO: 20，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQIDNO: 21和 SEQ ID NO: 22，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 23和 SEQIDNO: 24，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 27和 SEQ ID NO: 28，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQIDNO: 29和 SEQ ID NO: 30，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 31和 SEQ ID NO: 32, 或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 101和 SEQ ID NO: 102，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 103和 SEQ ID NO: 104，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ IDNO: 105和 SEQ ID NO: 106，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 107和 SEQ ID NO: 108，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 109和 SEQ ID NO: 110，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 111和 SEQ ID NO: 112，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ IDNO: 113和 SEQ ID NO: 114，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ IDNO: 115和 SEQ IDNO: 116，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ IDNO: 117和 SEQIDNO: 118。其中， SEQIDNO: 101、 SEQIDNO: 103和 SEQ ID NO: 105分别为与 SEQIDNO: 17具有 90%的序列同一性的序列； SEQIDNO: 102、 SEQ IDNO: 104和 SEQ IDNO: 106分别为与 SEQ IDNO: 18具有 90%的序列同一性的序列； SEQIDNO: 107、 SEQIDNO: 109和 SEQ ID NO: 111分别为与 SEQ ID NO: 21具有 90%的序列同一性的序列； SEQIDNO: 108、 SEQIDNO: 110和 SEQ ID NO: 112分别为与 SEQIDNO: 22具有 90%的序列同一性的序列； SEQIDNO: 113、 SEQ ID NO: 115和 SEQ IDNO: 117分别为与 SEQ IDNO: 25具有 90%的序列同一性的序列； SEQIDNO: 114、 SEQIDNO: 116和 SEQIDNO: 118分别为与 SEQ ID NO: 26具有 90%的序列同一性的序列。

其中，对于同一个 shRNA中的所述两个短反向重复片段，其中一个为对应于 siRNA 正义链的正义短反向重复片段，其中另一个为对应于 siRNA反义链的反义短反向重复片段。

其中，所述质粒的序列可以包括用于表达 shRNA的空载体序列和所述 shRNA的序列，还可以进一步包括其它辅助序列。在明确所需表达的 shRNA的序列的情况下，本领域技术人员可以通过常规的方法选择、设计、合成和 /或使用所述质粒，以表达所述 shRNA。例如，用于表达 shRNA的空载体可以为购自武汉晶赛公司的 pGenesil系列的空载体（编号为 1-8的载体均可使用）产品。

其中，所述环片段用于和所述两个短反向重复片段一起形成 shRNA的短发夹结构，但不破坏 shRNA的功能，所述环片段可以为构建 shRNA中常规的选择，例如文献 (Wang L, Mu F Y. A Web based design center for vector based siRNA and siRNA cassette. Bioinformatics, 2004, 20(11): 1818 - 1820 )中提及的环片段，又例如，可以为 SEQ ID NO: 81 (即， 5'-TCAAGAGA-3 ' )。

其中，所述质粒的序列还可以包括 shRNA序列上游的转录启动子序列（例如 RNA 聚合酶 III启动子序列，如 HI启动子或 U6启动子）和 shRNA序列下游的转录终止子序列（例如 5-6个连续的 T)。所述质粒的序列还可以进一步包括限制性酶切位点，以方便进行针对所述质粒的分子生物学操作，如酶切克隆和 /或酶切鉴定等。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的核酸和药学上可接受的载体。可以通过常规的方法由所述核酸和所述药学上可接受的载体制备得到所述药物组合物。例如，所述药物组合物可以为注射液。所述注射液可以用于皮下、肌肉或静脉的注射。

根据本发明所述的药物组合物，其中，对核酸和药学上可接受的载体的量没有特别的要求，一般地，相对于 1 重量份的所述核酸，所述药学上可接受的载体的含量为 1-100000重量份。

根据本发明所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体可以为本领域常规采用的各种载体，例如，可以包括 ρΗ值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述 ρΗ值缓冲液可以为 ρΗ值为 7.5-8.5 的三羟甲基胺基甲垸盐酸盐缓冲液和 /或 ρΗ为 5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为 ρΗ为 5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇和蔗糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为 0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和 /或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为 200-700 毫渗摩尔 /千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以确定所述渗透压调节剂的含量。

根据本发明一种优选的实施方式，所述药学上可接受的载体为脂质体与骨靶向分子共价连接的载体（可以参照 CN102824647A中记载的方法获得基于本发明的核酸成骨治疗的骨靶向递送系统（即本发明的药物组合物） )。

其中，骨靶向分子部分与脂质体部分的摩尔比优选为（2-10 ) : 100。

根据本发明优选实施方式中的药物组合物，其中，核酸与脂质体部分的摩尔比优选为（5-10 ) : 1，其中，核酸的摩尔量以 Ρ元素计，脂质体部分的摩尔量以 Ν元素计。更优选地，所述脂质体含有 1,2-二油烯氧基 -3-三甲胺基丙垸（DOTAP)、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)、胆固醇（Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇 2000 (N- (羰基-聚乙二醇 2000)-1,2-二硬酯酰 -SN-甘油 -3-磷酰乙醇胺， DSPE-mPEG2000 ) 和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-马来酰亚胺（N- (羰基-聚乙二醇 2000)-1,2-二硬酯酰 -SN-甘油 -3-磷酰乙醇胺-马来酰亚胺， DSPE-PEG2000-MAL ) _o上述各个物质的摩尔比优选为 ( 20-25 ) ： ( 6-8 ) ： ( 15-20 ) ： ( 1-2 ) : 1。

更优选地，所述骨靶向分子为氨基酸序列如 SEQ ID NO: 82所示的多肽。

在上述优选的药学上可接受的载体中，骨靶向分子末端的巯基可以与脂质体中 DSPE-PEG2000-MAL 的马来酰亚胺基团直接反应，从而完成骨靶向分子与脂质体的共价连接，使得骨靶向分子直接连接于所述脂质体的表面。

本发明所述药物组合物的使用剂量可以为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其根据受试者的年龄、体重和性别来确定。例如，对于雌性， 3-4月龄，体重 25-30g的 C57BL/6J小鼠，以所述药物组合物中的所述核酸的量计，所述药物组合物的用量可以为 0.01-100mg/kg体重，优选为 l-10mg/kg体重。

本发明还提供了如上所述的核酸在制备用于治疗和 /或预防与 CKIP-1 基因表达异常相关的疾病的药物组合物中的应用。在所述用于治疗和 /或预防与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病的药物组合物中，如上所述的核酸主要通过 RNA干扰的机制发挥作用。优选地，与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病包括骨质疏松、骨质疏松性骨折、骨折愈合迟缓、骨坏死、退行性关节炎和类风湿关节炎后期骨破坏中的至少一种。

本发明还提供了一种治疗和 /或预防与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病的方法，该方法包括上述核酸和 /或药物组合物对患者进行给药。所述与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病优选包括骨质疏松、骨质疏松性骨折、骨折愈合迟缓、骨坏死、退行性关节炎和类风湿关节炎后期骨破坏中的至少一种。

此外，本发明还提供了一种抑制细胞中 CKIP-1基因表达的方法，该方法包括将上述核酸和 /或药物组合物导入细胞。所述细胞优选为成骨样细胞。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品、本发明所用的核酸电泳等操作均按常规方案进行。以下实施例中，所有动物试验均在香港浸会大学骨与关节疾病转化医学研究所动物中心及威尔士亲王医院的实验动物服务中心完成，且获得了香港浸会大学伦理委员会（No. HASC/12-13/0032 ) 及香港中文大学动物实验伦理委员会（No. 09/074/MIS ) 的许可。

人成骨样细胞（hFOB 1.19)、恒河猴成骨样细胞（分离自网状髂骨）、大鼠成骨样细胞（UMR106)、小鼠成骨样细胞（MC3T3-E1 ) 均购自香港 HOUBIO科技有限公司，用含有 10%的牛胎儿血清（FBS， Gibco)和抗生素（PSN， Gibco)的 DMEM培养基（Gibco) 培养各成骨样细胞，于 37°C含 5% C0₂/95%空气的培养箱中培养。细胞汇合率达 70-80% 后，在含有 ΙΟιηΜ β-甘油磷酸盐（Sigma) 以及 5(^g/ml抗坏血酸（Sigma) 的矿化培养基中培养细胞。用合成的制备实施例中的核酸或非特异性 siRNA (由苏州瑞博生物技术有限公司合成）转染细胞时，使用 Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen), 具体操作参照制造商提供的说明书。

所有数据均用软件 SPSS 13.0版进行统计：首先采用单因素方差分析组间差异，然后进行两两比较的统计分析，结果采用 "平均值"表示。制备实施例 1

通过现有的固相合成的方法得到表 1中所列的 siRNA。

表 1

制备实施例 2

通过现有的固相合成法得到表 2中所列的修饰的 siRNA, 即正义链中所有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸基团的 2'羟基均被甲氧基修饰，且正义链与反义链的 3'端均连接 dTdT。修饰的 siRNA记为 m-siRNA，分别为 m-siRNA-l、 m-siRNA-2、 m-siRNA-3、 m-siRNA-4、 m-siRNA-5、 m-siRNA-6、 m-siRNA-7、 m-siRNA-8和修饰的非特异性 siRNA (m-siRNA-NC 其中，（OM)代表它左边的核苷酸基团的 2'羟基被甲氧基修饰。

具体的化学修饰方案如表 2所示：

表 2

5 ' -GU(OM)GC(OM)U(OM)GAGAGC(OM)U(OM)U(OM)U(OM

正义链 SEQ ID NO: 11 m-siRNA-6 )C(OM)GGGU(OM)dTdT-3 '

反义链 5'- ACCCGAAAGCUCUCAGCACdTdT-3 ' SEQ ID NO: 12

5 ' -GGU(OM)C(OM)GGC(OM)U(OM)GGGU(OM)C(OM)C(OM

正义链 SEQ ID NO: 13 m-siRNA-7 )GGAAAdTdT-3'

反义链 5'- UUUCCGGACCCAGCCGACCdTdT-3 ' SEQ ID NO: 14

5 ' -AC(OM)C(OM)GC(OM)U(OM)AU(OM)GU(OM)GGU(OM)

正义链 SEQ ID NO: 15 m-siRNA-8 GC(OM)U(OM)GAAdTdT-3 '

反义链 5'- UUCAGCACCACAUAGCGGUdTdT-3 ' SEQ ID NO: 16

5'-U(OM)U(OM)C(OM)U(OM)C(OM)C(OM)GAAC(OM)GU(0

正义链 SEQ ID NO: 41 m-siRNA-NC M)GU(OM)C(OM)AC(OM)GU(OM)dTdT-3'

反义链 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 ' SEQ ID NO: 42 上述修饰的 siRNA是等摩尔的正义链和反义链退火后形成的。制备实施例 3

通过在购自武汉晶赛公司的编号为 pGenesil-Ι的空载体（该空载体的序列如其说明书所示）中插入由一个对应于 siRNA正义链的正义短反向重复片段、一个环片段（SEQ ID NO: 49，即 5'-TCAAGAGA-3' )和一个对应于 siRNA反义链的反义短反向重复片段串联而成的编码 shRNA 的核酸片段来制备表 3 中所列的表达 shRNA 的质粒。表达 shRNA 的质粒记为 shRNA(p) , 分别为 shRNA(p)-l、 shRNA(p)-2、 shRNA(p)-3、 shRNA(p)-4、 shRNA(p)-5、 shRNA(p)-6、 shRNA(p)-7、 shRNA(p)-8和表达非特异性 siRNA 序列的 shRNA(p)-NC。表 3

正义链 5 ' -GGATGAGGTCACCGTTGAG-3 ' SEQ ID NO: 25 shRNA(p)-5

反义链 5 ' -CTCAACGGTGACCTCATCC-3 ' SEQ ID NO: 26 正义链 5 ' -GGATGAGGTCACCGTTGAA-3 ' SEQ ID NO: 113 shRNA(p)-5A

反义链 5 ' -TTCAACGGTGACCTCATCC-3 ' SEQ ID NO: 114 正义链 5 ' -GGATGAGGTCACCGTTGAT-3 ' SEQ ID NO: 115 shRNA(p)-5T

反义链 5 ' -ATCAACGGTGACCTCATCC-3 ' SEQ ID NO: 116 正义链 5 ' -GGATGAGGTCACCGTTGAC-3 ' SEQ ID NO: 117 shRNA(p)-5C

反义链 5 ' -GTCAACGGTGACCTCATCC-3 ' SEQ ID NO: 118 正义链 5 ' -GTGCTGAGAGCTTTCGGGT-3 ' SEQ ID NO: 27 shRNA(p)-6

反义链 5 ' - ACCCGA AAGCTCTC AGC AC-3 ' SEQ ID NO: 28 正义链 5 ' -GGTCGGCTGGGTCCGGAAA-3 ' SEQ ID NO: 29 shRNA(p)-7

反义链 5 ' -TTTCCGGACCCAGCCGACC-3 ' SEQ ID NO: 30 正义链 5 ' - ACCGCT ATGTGGTGCTGAA-3 ' SEQ ID NO: 31 shRNA(p)-8

反义链 5 ' -TTCAGCACC AC ATAGCGGT-3 ' SEQ ID NO: 32 正义链 5 ' -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ' SEQ ID NO: 43 shRNA(p)-NC

反义链 5 ' - ACGTGAC ACGTTCGGAGAA-3 ' SEQ ID NO: 44 制备实施例 4

按照 CN102824647A实施例三的方法制备本发明的药物组合物，不同的是，将其中的小核酸药物分别替换为制备实施例 1-3得到的核酸（siRNA、m-siRNA和 shRNA(p))，将按照 CN102824647A 实施例三的方法获得的不含核酸的载体称为骨靶向空白脂质体

测试实施例 1

本测试实施例用来测试制备实施例 1-3得到的核酸在体外对 CKIP-1基因 mRNA及蛋白表达量的抑制效率。

在体外，用制备实施例 1-3得到的针对 CKIP-1的核酸转染四种生物（人、恒河猴、大鼠和小鼠）的成骨样细胞作为处理组（RNAi组)，用非特异性核酸转染上述细胞作为对照组（NC组），单独用转染试剂 Lipofectamine™2000 (购自 Invitrogen) 处理上述细胞作为空白组（VC组）。每组 4个平行，至少重复 4次实验。转染人、恒河猴、小鼠成骨样细胞时，核酸终浓度为 40nM_; 转染大鼠成骨样细胞时，核酸终浓度为 80nM。转染 72小时后，收获上述各个物种的成骨样细胞，进行 CKIP-l mRNA及蛋白表达量检测。

( 1 ) 成骨样细胞中 CKIP-1 mRNA的检测

采用实时荧光定量 PCR (real-time PCR)测定以上收获的各个物种的成骨样细胞中 CKIP-1 mRNA表达水平，具体地：使用 RNeasy Mini KitCQIAGEN公司，货号 Cat.74106) 试剂盒，按其说明书进行总 RNA的提取，并将提取的总 RNA逆转录为 cDNA，接着用荧光定量 PCR法检测核酸对成骨样细胞的 CKIP-1 mRNA表达的抑制效率。

荧光定量 PCR法中，以 GAPDH基因作为内参基因，并且使用针对 CKIP-1的引物进行检测，引物的序列如表 4所示：表 4

荧光定量 PCR法中，核酸抑制活性按如下等式计算：

核酸抑制活性 = [ 1 - (处理组 CKIP- 1基因的拷贝数 /处理组 GAPDH的拷贝数） / (对照组 CKIP-1基因的拷贝数 /对照组 GAPDH的拷贝数） ]>< 100%。

结果如表 5所示。

表 5 对成骨样细胞 CKIP-1 mRNA抑制率（％)

siRNA-7 80.18 73.70 83.10 83.10

72.84 78.28 80.26 81.16 siRNA-8

NC组 m-siRNA-NC (0.00) (0.00) (0.00) (0.00)

VC组 Lipo2000 (0.49) (-2.68) (4.94) (5.39) m-siRNA-1 81.29 73.88 73.71 73.80 m-siRNA-1 A 80.03 74.32 74.30 72.89 m-siRNA-1 G 78.22 72.08 72.40 73.22 m-siRNA-1 C 77.98 73.80 73.01 74.00

76.78 74.16 78.11 45.75 m-siRNA-2

m-siRNA-3 88.24 88.18 90.28 88.43 m-siRNA-3A 86.80 86.72 88.45 86.68 m-siRNA-3U 88.59 87.72 88.04 86.02

RNAi组 m-siRNA-3 C 86.27 87.21 82.94 83.28

(3.04) (6.82) (-6.40) (2.6) m-siRNA-4

m-siRNA-5 75.65 80.81 75.21 74.60 m-siRNA-5A 72.48 75.89 74.28 73.80 m-siRNA-5U 76.08 78.96 77.28 75.38 m-siRNA-5 C 70.37 69.38 68.72 72.02

67.16 72.13 70.46 54.21 m-siRNA-6

m-siRNA-7 77.36 71.31 64.96 70.50

72.84 76.30 65.75 66.76 m-siRNA-8

(0.00) (0.00) (0.00) (0.00)

NC组 shRNA(p)-NC

VC组 Lipo2000 (0.38) (1.67) (5.34) (4.85)

80.56 70.89 72.54 73.02 shRNA(p)-l

74.58 78.56 79.68 46.32 shRNA(p)-2

83.21 84.25 82.78 81.14 shRNA(p)-3

(6.88) (9.02) (5.56) (2.27) shRNA(p)-4

RNAi组

shRNA(p)-5 72.02 78.25 74.33 72.22 shRNA(p)-6 63.64 72.54 64.21 55.27 shRNA(p)-7 82.03 72.14 80.12 81.22 shRNA(p)-8 73.56 77.54 76.38 78.68 备注： VC、 siRNA-1至 siR A-8、 m-siRNA-1至 m-siRNA-8和 shR A(p)-l至 shR A(p)-8分别与同组的 siR A-NC、 m-siRNA-NC和 shR A(p)-NC相比。（ ) >0.05与 NC组相比，没有统计学显著性差异。

(2) 成骨样细胞中 CKIP-1蛋白水平的免疫印迹检测按照文献（分子克隆实验指南，科学出版社， 2005年出版）中的方法，对成骨样细胞中 CKIP-1蛋白的含量进行免疫印迹检测。免疫印迹检测所用的 CKIP-1抗体购自美国圣克鲁兹生物技术公司，货号为 SC-99218 , 内参抗体采用 β-actin抗体，购自美国圣克鲁兹生物技术公司，货号为 sc-47778。

免疫印迹法中，核酸抑制活性按如下等式计算：

核酸抑制活性 = [1- (处理组 CKIP-1 蛋白免疫印迹条带的光强度值 /处理组 β-actin 蛋白免疫印迹条带的光强度值） I (对照组 CKIP-1蛋白免疫印迹条带的光强度值 /对照组 β-actin蛋白免疫印迹条带的光强度值） ]χ 100%。

结果如表 6所示。表 6 对成骨样细胞 CKIP-1蛋白抑制率（％)

shRNA(p)-5 60.29 56.47 62.29 60.20 shRNA(p)-6 52.50 51.15 49.83 48.57 shRNA(p)-7 48.23 50.17 42.69 36.92 shRNA(p)-8 50.34 39.88 38.74 32.84 备注： VC、 siR A-1至 siR A-8、 m-siR A-1至 m-siR A-8和 shR A(p)-l至 shR A(p)-8分别与同组的 siR A-NC、 m-siR A-NC和 shR A(p)-NC相比。（ ) >0.05与 NC组相比，没有统计学显著性差异。测试实施例 2

本测试实施例为制备实施例 1-3得到的核酸在体外的骨基质矿化沉积率分析。在体外，用制备实施例 1-3得到的针对 CKIP-1的核酸转染四种生物（人、恒河猴、大鼠和小鼠）的成骨样细胞作为处理组（RNAi组)，用非特异性核酸转染上述细胞作为对照组（NC组），单独用转染试剂 Lipofectamine™2000 (购自 Invitrogen) 处理上述细胞作为空白组（VC组）。转染人、恒河猴、小鼠成骨样细胞时，核酸终浓度为 40nM_; 转染大鼠成骨样细胞时，核酸终浓度为 80nM。间隙性转染的频率为一周一次，每组 4 个平行。首次转染 7、 14和 21天后，通过钙染色测定人和恒河猴成骨样细胞中的钙沉积量，首次转染 48、 72和 120小时后，通过钙染色测定大鼠成骨样细胞中的钙沉积量，首次转染 7、 10和 14天后，通过钙染色测定小鼠成骨样细胞中的钙沉积量（使用 Sigma Diagnostic Kit#587-A, 具体操作参见其说明书），结果显示，人、恒河猴成骨样细胞首次转染 21天后，大鼠成骨样细胞首次转染 120小时后，小鼠成骨样细胞首次转染 14天后， RNAi组的钙沉积量显著高于 VC组和 NC组，具体如表 7所示。表 7 成骨样细胞中的钙沉积量（ng/ g蛋白）

siRNA-5U 44.2 50.8 100.8 78.2 siRNA-5C 42.1 48.2 98.5 74.6 siRNA-6 32.3 46.9 98.0 84.9 siRNA-7 32.9 44.3 73.9 69.3 siRNA-8 38.7 44.2 69.2 69.9

NC组 m-siRNA-NC (27.8) (47.5) (67.5) (66.5)

VC组 Lipo2000 (29.0) (44.8) (63.3) (50.8) m-siRNA-1 46.5 60.8 120.6 102.5 m-siRNA-lA 44.3 58.2 118.6 99.2 m-siRNA-1 G 40.8 53.2 117.3 96.5 m-siRNA-lC 41.2 52.9 115.4 94.2 m-siRNA-2 38.5 50.4 98.5 79.3 m-siRNA-3 42.3 63.5 122.8 97.3 m-siRNA-3A 40.8 60.2 118.7 96.5 m-siRNA-3U 44.1 62.9 124.0 98.6

RNAi组 m-siRNA-3C 38.8 59.2 116.4 92.4 m-siRNA-4 (28.3) (48.3) (65.7) (68.5) m-siRNA-5 49.5 54.3 128.4 91.9 m-siRNA-5A 46.2 55.2 122.6 90.0 m-siRNA-5U 47.2 52.7 126.8 89.6 m-siRNA-5C 45.7 50.2 120.6 84.2 m-siRNA-6 36.4 50.3 110.5 89.5 m-siRNA-7 34.5 52.3 78.8 72.3 m-siRNA-8 41.5 49.9 70.3 70.5

NC组 shRNA(p)-NC (25.5) (45.2) (67.5) (66.0)

VC组 Lipo2000 (28.2) (42.5) (65.1) (60.2) shRNA(p)-l 39.6 58.1 116.5 91.6 shRNA(p)-2 30.2 50.9 88.2 80.5 shRNA(p)-3 39.5 60.9 108.3 90.5 shRNA(p)-4 (22.5) (45.2) (65.4) (66.1)

RNAi组

shRNA(p)-5 42.1 52.0 109.5 87.6 shRNA(p)-6 32.4 50.6 106.4 80.3 shRNA(p)-7 (29.4) 50.9 74.3 74.9 shRNA(p)-8 36.1 (45.5) 70.2 72.1 备注： VC、 siR A-1至 siR A-8、 m-siRNA-1至 m-siRNA-8和 shR A(p)-l至 shR A(p)-8分别与同组的 siR A-NC、 m-siRNA-NC和 shR A(p)-NC相比。（ ) >0.05与 NC组相比，没有统计学显著性差异。钙沉积量是体外成骨细胞形成过程中成熟成骨细胞的关键功能性矿化标记。 RNAi 组的钙沉积量明显高于 VC组和 NC组，这在功能水平上验证了本发明的核酸能够促进四个物种的前成骨细胞分化为成熟成骨细胞。测试实施例 3

本测试实施例用来测试制备实施例 4得到的含有核酸的药物组合物在体内对靶基因 CKIP-1、成骨细胞表型基因和生化标记物的表达的影响。

将 960只 6月龄的雌性 Sprague-Dawley大鼠或 960只 4月龄的雌性 C57/BL小鼠分成核酸处理组（RNAi组， n=840)、非特异性核酸对照组（NC组， n=60) 和空白组 (VC组， _n=60)。大鼠或小鼠每组 20只。将制备实施例 4得到的药物组合物分别注射到 RNAi组和 NC组的大鼠或小鼠体内， VC组的动物仅接受 BTDS注射。大鼠核酸注射量为 4mg/kg，小鼠核酸注射量为 7.5mg/kg。所有注射的核酸均用 FAM-荧光进行标记，注射部位为尾部经脉。在注射 0、 1、 3、 5和 7天后，分别处死各组大鼠和小鼠各 4只，收集两侧股骨的骨髓。

( 1 ) 对靶基因 CKIP-1 mRNA的表达分析

取处死的大鼠或小鼠的骨髓，按照测试实施例 1中 "成骨样细胞中 CKIP-1 mRNA 的检测"方法，检测两侧股骨骨髓中 CKIP-1 mRNA的表达水平，发现 RNAi组的体内 CKIP-1 mRNA的表达量较 NC组或 VC组的显著降低，并能持续存在 7天。注射后 7 天，处死大鼠或小鼠，取两侧股骨骨髓，检测体内 CKIP-1 mRNA的抑制效率，结果如表 8所示。表 8

siRNA-5C 55.2 46.2

50.1 47.9 siRNA-6

siRNA-7 56.3 43.2

42.4 40.3 siRNA-8

NC组 m-siRNA-NC (0.0) (0.0)

VC组 BTDS (3.2) (6.4)

m-siRNA-1 71.4 60.2 m-siRNA-1 A 70.2 58.5 m-siRNA-lG 68.5 52.3 m-siRNA-lC 66.2 54.3

60.1 50.2 m-siRNA-2

m-siRNA-3 72.4 63.1 m-siRNA-3A 70.2 58.9 m-siRNA-3U 72.4 62.2

RNAi

m-siRNA-3C 68.9 54.2 组

(7.3) (1.9) m-siRNA-4

m-siRNA-5 66.2 56.9 m-siRNA-5A 64.2 55.2 m-siRNA-5U 66.4 57.0 m-siRNA-5C 60.2 50.2

53.2 52.7 m-siRNA-6

m-siRNA-7 60.2 48.9

50.3 52.4 m-siRNA-8

NC组 shRNA(p)-NC (0.0) (0.0)

VC组 BTDS (2.6) (5.8)

70.1 58.1 shRNA(p)-l

52.3 38.9 shRNA(p)-2

68.3 62.6 shRNA(p)-3

(-1.6) (7.3)

RNAi shRNA(p)-4

组 shRNA(p)-5 56.3 53.9

shRNA(p)-6 48.2 50.1 shRNA(p)-7 56.2 49.3 shRNA(p)-8 46.2 48.7 备注： VC、 siRNA-1至 siR A-8、 m-siRNA-1至 m-siRNA-8和 shR A(p)-l至 shR A(p)-8分别与同组的 siR A-NC、 m-siRNA-NC和 shR A(p)-NC相比。（ ) >0.05与 NC组相比，没有统计学显著性差异。

(2) 对成骨细胞分化的影响的分析

取处死的大鼠或小鼠的骨髓，按照测试实施例 1中 "成骨样细胞中 CKIP-l mRNA 的检测"方法，检测两侧股骨骨髓中成骨细胞表型基因碱性磷酸酶（ALP)、 I型胶原蛋白（C0L1 )、骨调素（OPN)、骨唾液蛋白（BSP) 和骨钙蛋白（OC) mRNA随时间变化的表达水平，使用的引物如表 9所示。结果发现，注射后 3天， RNAi组的 ALP、 COL1 和 OPN的表达量较 NC组或 VC组的显著升高；注射后 5天， RNAi组的 BSP和 OC的表达量较 NC组和 VC组的显著升高。测定结果如表 10-14所示，其中，（） Ρ>0.05与 NC组相比，没有统计学显著性差异。表 9

π ¾

0.TS80/M0ZN3/X3d S68.Z0/ST0Z OAV

Zl ¾

0.TS80/M0ZN3/X3d S68.Z0/ST0Z OAV

εΐ ¾

0.TS80/M0ZN3/X3d S68.Z0/ST0Z OAV (10.2) (7.4) shRNA(p)-4

shRNA(p)-5 76.3 49.5

shRNA(p)-6 70.3 43.5

shRNA(p)-7 39.8 42.6

shRNA(p)-8 43.6 35.1 表 14

对大鼠骨髓 OC mRNA促进率（％) 对小鼠骨髓 OC mRNA促进率（％)

NC组 siRNA-NC (0.0) (0.0)

VC组 BTDS (-3.2) (-2.0)

siRNA-1 53.2 45.2

51.1 42.9

siRNA-2

siRNA-3 56.2 45.3

(3.6) (7.2)

RNAi siRNA-4

组 siRNA-5 50.2 41.2

42.6 38.3

siRNA-6

siRNA-7 40.6 35.9

37.8 36.2

siRNA-8

NC组 m-siRNA-NC (0.0) (0.0)

VC组 BTDS (-3.7) (-2.1)

m-siRNA-1 55.3 47.2

43.5 40.7

m-siRNA-2

m-siRNA-3 58.1 49.0

(-2.8) (4.3)

RNAi m-siRNA-4

组 m-siRNA-5 50.2 41.8

48.2 38.8

m-siRNA-6

m-siRNA-7 40.3 42.1

38.4 36.2

m-siRNA-8

NC组 shRNA(p)-NC (0.0) (0.0)

VC组 BTDS (-2.5) (-1.8)

50.2 43.6

shRNA(p)-l

48.2 42.7

shRNA(p)-2

51.8 48.5

shRNA(p)-3

(-4.6) (3.8)

RNAi shRNA(p)-4

组 shRNA(p)-5 48.2 39.2

shRNA(p)-6 36.9 32.4

shRNA(p)-7 32.8 32.6

shRNA(p)-8 40.1 35.9

备注：表 10-14中， VC、 siRNA-1至 siR A-8、 m-siRNA-1至 m-siRNA-8和 shR A(p)-l至 shR A(p)-8 分别与同组的 siR A-NC、 m-siRNA-NC和 shR A(p)-NC相比。（）与 NC组相比，没有统计学显著性差异。本领域技术人员公知的是， ALP、 COL1A1和 OPN在成骨细胞分化早期开始表达， BSP和 OC在成骨细胞达成熟功能期才开始表达。从上表 10-14可以看出，注射后，本发明的核酸能够促进大鼠和小鼠成骨细胞表型基因的表达，这在分子水平上表明了本发明的核酸能够在体内促进成骨细胞分化。

(3 ) 对生化标记物的表达分析

在注射 0、 1、 3、 5和 7天后，处死大鼠和小鼠之前，分别取其心脏血液和尿液，采用 ELISA 试剂盒确定血清骨形成标记 PINP (大鼠 /小鼠 PINP EIA试剂盒，购自 Immunodiagnostic Systems公司，货号 AC33F1 ) 和尿骨吸收标记 DPD (DPD EIA试剂盒，购自 CUSABIO公司，货号 CSB-E08400r (大鼠）、 CSB-E08401m (小鼠）) 的含量，其中 DPD以相对肌酐（Creatinine, Cr) 的相对含量表示，具体操作参见试剂盒说明书。结果显示，注射 5天后， RNAi组的血清 PINP含量较 NC组和 VC组显著升高，但尿 DPD含量未见明显变化，测定结果如表 15所示。表 15

3.2* 32.7 12.4 m-siRNA-6

m-siRNA-7 2.8* 29.8 0.21* 12.9

2.7* 32.8 0.23* 11.8 m-siRNA-8

NC组 shRNA(p)-NC 2.2 30.8 0.11 11.0

VC组 BTDS 2.5 32.6 0.12 11.2

3.3* 31.9 0.22* 12.4 shRNA(p)-l

2.7* 31.8 0.19* 13.2 shRNA(p)-2

3.5* 30.3 0.23* 11.7 shRNA(p)-3

1.9 29.8 0.13 11.6

RNAi shRNA(p)-4

组 shRNA(p)-5 3.5* 31.4 12.8

shRNA(p)-6 2.6* 30.6 0.15* 12.2 shRNA(p)-7 2.5* 29.5 13.2 shRNA(p)-8 2.7* 30.3 0.15* 12.5

* P<0.05 与 VC组或 NC组相比，有统计学显著性差异。从表 15可以看出，骨形成生化标记血清 PINP在用本发明的核酸处理 5天后才显著增加。该变化模式与核酸处理后 BSP和 0C的 mRNA表 o达水平随时间变化的趋势一 o o

致。另一方面，骨吸收生化标记尿 DPD没有因为本发明核酸的 *处理而发生变化。因此，本发明的核酸能够在体内促进大鼠和小鼠的骨形成，而不会剌激骨吸收。测试实施例 4

本测试实施例用来在体内评价制备实施例 4得到的药物组合物对健康啮齿类动物的合成代谢作用。

将 30只 6月龄的雌性 Sprague-Dawley大鼠或 40只 4月龄的雌性 C57/BL小鼠分成核酸处理组（m-siRNA-1组、 m-siRNA-3组、 m-siRNA-5组）、非特异性核酸对照组 (NC组，即注射 m-siRNA-NC的组）和空白组（VC组），大鼠每组 6只，小鼠每组 8 只。将制备实施例 4得到的药物组合物分别注射到 RNAi组和 NC组的大鼠或小鼠体内， VC 组的动物仅接受 BTDS 注射。大鼠核酸注射量为 4mg/kg，小鼠核酸注射量为 7.5mg/kg。各组动物都执行每周给药，共完成 6轮静脉注射。首次注射 6周后，对动物施以安乐死。进行给药前，对另外的 6只大鼠和 8只小鼠施以安乐死作为基准组（BS 组）。所有动物施以安乐死前 10天和 2天时，分别接受腹腔内注射钙黄绿素（10mg/kg) 和二甲酚橙（30mg/kg)。处死后，对健康大鼠右侧股骨远端进行显微 CT (viva CT40, SCANC0 医药，瑞士）分析，对右侧股骨远端及股骨干中段进行组织形态分析；对健康小鼠右侧股骨远端和第 5节腰椎进行显微 CT分析，对右侧股骨远端进行组织形态分析。结果如表 16 (健康大鼠）和表 17 (健康小鼠）所示。表 16

* P<0.05 与 VC组或 NC组相比，有统计学显著性差异。表 17

骨小梁间隙（μηι) 185.57 172.87 164.8 122.16* 125.82* 骨小梁数量（1/mm) 5.27 6.04 5.76 7.35* 7.19* 骨小梁连接度 ( 1/mm³) 206.98 216.58 221.97 298.37* 289.42* 290.12* 骨结构模型指数 0.74 0.76 0.69 0.55* 0.52* 0.61* 股骨远端骨形态计量分析参数

骨矿化沉积率（μηι/d) 0.58 0.72 0.68 0.90* 0.95* 0.94* 骨形成率（μΓη³/μηι²/(1) 0.24 0.29 0.23 0.39* 0.42* 0.40* 骨矿化表而 /骨表而（％) 27.17 26.07 29.1 37.86* 38.25* 37.98* 成骨细胞表而 /骨表而（％) 4.80 5.53 5.42 7.64* 7.79* 7.70* 破骨细胞表而 /骨表而（％) 3.93 4.03 3.88 4.20 4.27 4.22 备注： * ><0.05 与 VC组或 NC组相 t , 有统 i卜学显著 Ε左汁。测试实施例 5

本测试实施例用来在体内评价制备实施例 4得到的药物组合物对卵巢切除术诱导的骨质疏松小鼠模型的合成代谢作用。

00

将 48只 4月龄的雌性 C57BL/6J小鼠进行卵巢切除（OVX， n=36)和假手术（ SHAM, n=12 )， 4周内不进行任何处理。给药前，将 6只 OVX( OVX-BS )和 6只 SHAM( SHAM-BS) 小鼠施以安乐死，以确定骨质疏松模型小鼠的成功建立，这些小鼠作为基准组。剩余的 OVX 小鼠分别接受制备实施例 4 获得的药物组合物注射（ OVX-m-siRNA-1 组、 OVX-m-siRNA-3组、 OVX-m-siRNA-5组和 OVX-NC组（即注射 m-siRNA-NC的 OVX 对照组）），以及单独的 BTDS注射（OVX-VC组）；剩余的 SHAM小鼠只接受 BTDS注射（SHAM-VC组）。小鼠核酸注射量为 7.5mg/kg，各组 6只动物都执行每周给药，共完成 6轮静脉注射。首次注射 6周后，对动物施以安乐死。所有动物施以安乐死前 10 天和 2天时，分别接受腹腔内注射钙黄绿素（10mg/kg) 和二甲酚橙（30mg/kg)。处死后，采集小鼠右股骨，利用显微 CT和组织形态分析检测股骨远端的骨显微结构参数。结果如表 18所示。

表 18

* P<0.05 与 OVX-VC或 OVX-NC相比，有统计学显著性差异。

从测试实施例 4和测试实施例 5的显微 CT和组织形态的结果分析可得：注射后，本发明的核酸能显著增加健康啮齿类动物（包括大鼠和小鼠）和骨质疏松模型小鼠的骨密度、骨体积分数和骨显微结构参数（骨小梁厚度骨小梁数量，骨小梁连接度等），同时，成骨细胞表面 /骨表面、骨矿化表面 /骨表面、骨形成率和骨矿化沉积率也显著增加，这进一步表明，本发明的药物组合物能够促进成骨髓基质干细胞向成骨细胞分化和 /或成骨细胞在骨形成表面的募集，还能提高成骨细胞的活性，从而促进骨形成。测试实施例 6

取测试实施例 5 中获得的小鼠血清进行免疫剌激性分析，具体地，采集小鼠的血清，使用 ELISA试剂盒（BD OptEIA™ Mouse TNF ELISA Kit, 货号： 560478; BD OptEIA™ Mouse IFN-γ ELISA Kit II，货号： 558258; BD OptEIA™ Mouse IL-6 ELISA Kit, 货号： 550950; 以上试剂购自 BD生物科学公司； Mouse IFN-α Platinum ELISA, 货号： BMS6027, 购自 eBioscience公司）检测炎性细胞因子（包括 IFN-a、 IFN-y、 T F-α和 IL-6) 的含量，具体操作参见试剂盒说明书，结果如表 19所示。表 19

从上表可以看出，本发明的药物组合物不会在体内引起免疫剌激反应。从以上测试实施例的结果可以看出，本发明提供的核酸在人、恒河猴、大鼠和小鼠中对 CKIP-1均表现出较高抑制效率。

并且， siRNA-l、 siRNA-3、 siRNA-5具有比 siRNA-2、 siRNA-4、 siRNA-6、 siRNA-7 和 siRNA-8更高的抑制效率； m-siRNA-l、 m-siRNA-3、 m-siRNA-5具有比 m-siRNA-2、 m-siRNA-4、 m-siRNA-6、 m-siRNA-7 禾卩 m-siRNA-8 更高的抑制效率； shRNA(p)-l、 shRNA(p)-3、 shRNA(p)-5具有比 shRNA(p)-2、 shRNA(p)-4、 shRNA(p)-6、 shRNA(p)-7 和 shRNA(p)-8更高的抑制效率。

此外，修饰的 siRNA (特别是 m-siRNA-l、 m-siRNA-3、 m-siRNA-5 ) 具有比未经修饰的 siRNA ( siRNA-K siRNA-3、 siRNA-5 )和 shRNA(p) ( shRNA(p)-l、 shRNA(p)-3、 shRNA(p)-5 )更高的抑制效率，说明本发明优选实施方式中的经特定修饰的核酸能够表现出更为优异的抑制效果。

对于具有 90%以上的序列同一性的序列，当在正义链中，不一致的 1个碱基位于正义链的第 19位，在反义链中，不一致的 1个碱基位于反义链的第 1位时，如 siRNA-lA、 siRNA-lG、 siRNA-lC、 siRNA-3A、 siRNA-3U、 siRNA-3C、 siRNA-5A、 siRNA-5U、 siRNA-5C及修饰后的 siRNA (m-siRNA-lA、 m-siRNA-lG、 m-siRNA-lC、 m-siRNA-3A、 m-siRNA-3U、 m-siRNA-3C、 m-siRNA-5A、 m-siRNA-5U、 m-siRNA-5C) 与具有 100% 的序列同一性的 siRNA及修饰后的 siRNA ( siRNA-l、 siRNA-3、 siRNA-5、 m-siRNA-l、 m-siRNA-3、 m-siRNA-5) 相比，活性相当。 shRNA亦然。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

权利要求

1、一种核酸，该核酸含有正义链序列为与 SEQ ID NO: 1具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 2 具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-K 正义链序列为与 SEQ ID NO: 3具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 4具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-2、正义链序列为与 SEQ ID NO: 5具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 6 具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-3、正义链序列为与 SEQ ID NO: 7具有 90% 以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID N0: 8具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-4、正义链序列为与 SEQ ID NO: 9具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 10具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-5、正义链序列为与 SEQ ID NO: 11具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 12具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-6、正义链序列为与 SEQ ID NO: 13具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 14具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-7和正义链序列为与 SEQ ID N0: 15具有 90%以上的序列同一性的序列且反义链序列为与 SEQ ID NO: 16具有 90%以上的序列同一性的序列的 siRNA-8中的至少一种。
2、根据权利要求 1所述的核酸，其中，具有 90%以上的序列同一性是指序列之间存在 1个碱基不一致，在正义链中，不一致的 1个碱基位于正义链的第 19位，在反义链中，不一致的 1个碱基位于反义链的第 1位。
3、根据权利要求 1所述的核酸，其中，所述核酸含有正义链序列为 SEQ ID NO:

1且反义链序列为 SEQ ID NO: 2的 siRNA-l、正义链序列为 SEQ ID NO: 3且反义链序列为 SEQ ID NO: 4的 siRNA-2、正义链序列为 SEQ ID NO: 5且反义链序列为 SEQ ID NO: 6的 siRNA-3、正义链序列为 SEQ ID NO: 7且反义链序列为 SEQ ID NO: 8的 siRNA-4、正义链序列为 SEQ ID NO: 9且反义链序列为 SEQ ID NO: 10的 siRNA-5、正义链序列为 SEQ ID NO: 11且反义链序列为 SEQ ID NO: 12的 siRNA-6、正义链序列为 SEQ ID NO: 13且反义链序列为 SEQ ID NO: 14的 siRNA-7、正义链序列为 SEQ ID NO: 15且反义链序列为 SEQ ID NO: 16的 siRNA-8、正义链序列为 SEQ ID NO: 83 且反义链序列为 SEQ ID NO: 84的 siRNA-lA、正义链序列为 SEQ ID NO: 85且反义链序列为 SEQ ID NO: 86的 siRNA-lG、正义链序列为 SEQ ID NO: 87且反义链序列为 SEQ ID NO: 88的 siRNA-lC、正义链序列为 SEQ ID NO: 89且反义链序列为 SEQ ID NO: 90的 siRNA-3A、正义链序列为 SEQ ID NO: 91且反义链序列为 SEQ ID NO: 92 的 siRNA-3U、正义链序列为 SEQ ID NO: 93 且反义链序列为 SEQ ID NO: 94 的 siRNA-3C、正义链序列为 SEQ ID NO: 95且反义链序列为 SEQ ID NO: 96的 siRNA-5A、正义链序列为 SEQ ID NO: 97且反义链序列为 SEQ ID NO: 98的 siRNA-5U和正义链序列为 SEQ ID NO: 99且反义链序列为 SEQ ID NO: 100的 siRNA-5C中的至少一种。
4、根据权利要求 1-3中任意一项所述的核酸，其中，所述核酸含有至少一个修饰的核苷酸基团，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团和 /或核糖基团被修饰的核苷酸基团。
5、根据权利要求 4所述的核酸，其中，所述核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的 2'-OH被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。 6、根据权利要求 5所述的核酸，其中，所述核酸的正义链中含有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸基团为所述核糖基团被修饰的核苷酸基团，且所述核酸的正义链和反义链的 3'端均连接有 dTdT。
7、一种核酸，该核酸为插入有编码短发夹核糖核酸的核酸片段的质粒，所述质粒表达所述短发夹核糖核酸，所述编码短发夹核糖核酸的核酸片段由两个短反向重复片段和位于所述两个短反向重复片段之间的环片段组成；

所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 17具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 18具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 19具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 20具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 21具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 22具有 90% 以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 23 具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 24具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 25具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 26具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 27具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 28具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 29具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 30 具有 90%以上的序列同一性的序列，或所述两个短反向重复片段的序列分别为与 SEQ ID NO: 31具有 90%以上的序列同一性的序列和与 SEQ ID NO: 32具有 90%以上的序列同一性的序列。

8、根据权利要求 7所述的核酸，其中，具有 90%以上的序列同一性是指序列之间存在 1个碱基不一致，在正义链中，不一致的 1个碱基位于正义链的第 19位，在反义链中，不一致的 1个碱基位于反义链的第 1位。 9、根据权利要求 7所述的核酸，其中，所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 17禾 P SEQ ID NO: 18，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO: 20，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 21和 SEQ ID NO: 22, 或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 23和 SEQ ID NO: 24，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 25和 SEQ ID NO: 26，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 27和 SEQ ID NO: 28，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 29禾 P SEQ ID NO: 30，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 31和 SEQ ID NO: 32，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 101和 SEQ ID NO: 102，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 103和 SEQ ID NO: 104，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 105和 SEQ ID NO: 106，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 107和 SEQ ID NO: 108，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 109和 SEQ ID NO: 110，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 111和 SEQ ID NO: 112，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 113和 SEQ ID NO: 114，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 115和 SEQ ID NO: 116，或所述两个短反向重复片段的序列分别为 SEQ ID NO: 117和 SEQ ID NO: 118。
10、一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求 1-9中任意一项所述的核酸和药学上可接受的载体。
11、根据权利要求 10所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体为脂质体与骨靶向分子共价连接的载体，骨靶向分子部分与脂质体部分的摩尔比为 (2-10) : 100。 12、根据权利要求 11 所述的药物组合物，其中，核酸与脂质体部分的摩尔比为

( 5-10)： 1，其中，核酸的摩尔量以 P元素计，脂质体部分的摩尔量以 N元素计。

13、根据权利要求 11所述的药物组合物，其中，所述脂质体含有 1,2-二油烯氧基 -3-三甲胺基丙垸、二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇 2000和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-马来酰亚胺，上述各个物质的摩尔比为 (20-25 ) ： ( 6-8 ) ： ( 15-20) ： ( 1-2) : 1。
14、根据权利要求 10-13中任意一项所述的药物组合物，其中，所述骨靶向分子为氨基酸序列如 SEQ ID NO: 82所示的多肽。
15、权利要求 1-9中任意一项所述的核酸在制备用于治疗和 /或预防与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病的药物组合物中的应用。
16、根据权利要求 15所述的应用，其中，与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病包括骨质疏松、骨质疏松性骨折、骨折愈合迟缓、骨坏死、退行性关节炎和类风湿关节炎后期骨破坏中的至少一种。
17、一种治疗和 /或预防与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病的方法，该方法包括用权利要求 1-9中任意一项所述的核酸和 /或权利要求 10-14中任意一项所述的药物组合物对患者进行给药。
18、根据权利要求 17所述的方法，其中，与 CKIP-1基因表达异常相关的疾病包括骨质疏松、骨质疏松性骨折、骨折愈合迟缓、骨坏死、退行性关节炎和类风湿关节炎后期骨破坏中的至少一种。 19、一种抑制细胞中 CKIP-1基因表达的方法，该方法包括将权利要求 1-9中任意一项所述的核酸和 /或权利要求 10-14中任意一项所述的药物组合物导入细胞。
20、根据权利要求 19所述的方法，其中，所述细胞为成骨样细胞。