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CN105451759A - 预测t细胞表位的免疫原性 - Google Patents

预测t细胞表位的免疫原性 Download PDF

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CN105451759A CN201480026604.1A CN201480026604A CN105451759A CN 105451759 A CN105451759 A CN 105451759A CN 201480026604 A CN201480026604 A CN 201480026604A CN 105451759 A CN105451759 A CN 105451759A
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Abstract

本发明涉及预测T细胞表位的方法。特别地，本发明涉及预测肽或多肽如肿瘤相关新抗原中的修饰是否是免疫原性的方法。本发明的方法特别适用于提供患者肿瘤特异性的疫苗，并因此适用于个性化的癌症疫苗的情况。

Description

预测T细胞表位的免疫原性
发明的技术领域
本发明涉及预测T细胞表位的方法。特别地，本发明涉及预测肽或多肽如肿瘤相关新抗原中的修饰是否是免疫原性的的方法。本发明的方法特别适用于提供患者肿瘤特异性的疫苗，因此适用于个性化的癌症疫苗的情况。
发明背景
个性化的癌症疫苗是针对给定患者的独特目标肿瘤特异性突变而量身定制的治疗性疫苗。由于此类治疗不伤害健康细胞，并且具有提供终生缓解的潜力，因而其为癌症患者提供了极大希望。但是不是癌症表达的每个突变都可被用作疫苗的靶标。事实上，当被疫苗针对时，大部分癌症的体细胞突变不会导致免疫应答(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerResearch72,1081(2012))。由于肿瘤能够编码多达100,000种体细胞突变(M.R.Stratton,ScienceSignalling331,1553(2011))，而疫苗仅靶向少量表位，因此显然癌症免疫治疗的关键目标是鉴定哪种突变可能是免疫原性的。
从生物学的角度，为了使体细胞突变产生免疫应答，需要满足一些标准：细胞应当表达含有所述突变的等位基因，所述突变应当位于蛋白编码区并且是非同义的，翻译的蛋白应当被蛋白酶体剪切，以及含有所述突变的表位应当被MHC复合体呈递，呈递的表位应当被T细胞受体(TCR)识别，最后TCR-pMHC复合体应当启动激活T细胞的信号级联(S.Whelan,N.Goldman,Molecularbiologyandevolution18,691(2001))。到现在为止没有提出能够高确定性的预测哪种突变可能满足所有这些标准的算法。在本报告中，我们考虑了一些可能促成免疫原性的因素，将这些因素与实验数据进行比较，提出了用于鉴定免疫原性突变的简单模型。
MHC结合预测：本领域现状
20多年前，确定在MHC结合肽上有比其它位点更有助于结合能力的位点(例如(A.Setteetal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences86,3296(1989)))。对那些锚定位点的鉴定和描述使得能够找到MHC结合肽的模式，因此是发展预测方法的基础。近年来，在抗原处理机制的计算机模型(insilicomodels)领域实现了显著发展。在1990年代后期发展的两个开拓性方法BIMAS(K.C.Parker,M.A.Bednarek,J.E.Coligan,TheJournalofImmunology152,163(1994))和SYFPEITHI(H.-G.Rammensee,J.Bachmann,N.P.N.Emmerich,O.A.Bachor,S.Immunogenetics50,213(1999))基于锚定位点的知识和衍生的等位基因-特异的基序。随着可获得越来越多的实验MHC肽-结合数据，利用多种统计技术和计算技术，已经发展了更多工具(参见图1作为综述)。所谓的基于矩阵的方法利用位点特异的得分矩阵来确定肽序列是否与具体MHC等位基因的结合基序匹配。另一类MHC结合预测方法利用机器学习技术，如人工神经网络或支持向量机(参见图1)。这些算法的性能强烈依赖于可获得的每个等位基因模型的训练数据集的数量和质量(例如“HLA-A*02:01”、“H2-Db”等)，以“学习”具有结合的预测能力的潜在的模式/特征。最近，出现了基于结构的方法，由于它们仅依赖于肽-MHC晶体结构和打分函数(例如不同的能量函数)，通过例如能量最小化来预测肽-MHC相互作用(参见图1)，因而避开了具有大训练集的瓶颈。然而，那些方法的准确性仍远低于基于序列的方法。基准研究显示基于人工神经网络的工具NetMHC(C.Lundegaardetal.,NucleicAcidsResearch36,W509(2008))和基于矩阵的算法SMM(B.Peters,A.Sette,BMCbioinformatics6,132(2005))在测试评估数据方面表现最好(B.Peters,A.Sette,BMCbioinformatics6,132(2005)；H.H.Lin,S.Ray,S.Tongchusak,E.L.Reinherz,V.Brusic,BMCimmunology9,8(2008))。这两种方法都被整合进了所谓的IEDB一致性方法，可在免疫表位数据库获得(Y.Kimetal.,NucleicAcidsResearch40,W525(2012))。由于MHCII分子在其任一侧具有为开放端的结合槽，允许其结合不同长度的肽，因而肽-MHCII结合的相互作用模型远比MHCI复杂。然而与MHCI结合的肽主要限于8-12个氨基酸，该长度可与MHCII肽明显不同(9-30个氨基酸)。最近的基准研究显示，与MHCI预测相比，可获得的MHCII预测方法提供有限的准确性(H.H.Lin,S.Ray,S.Tongchusak,E.L.Reinherz,V.Brusic,BMCimmunology9,8(2008))。
Moutaftsi等人进行了寻找T细胞表位的那些算法的第一次大规模系统应用(M.Moutaftsietal.,NatureBiotechnology24,817(2006))，其将不同的工具组合来预测牛痘病毒感染的C57BL76小鼠的可能候选疫苗，提取脾脏细胞并测定CD8+T细胞针对前1％的预测的肽的应答。他们鉴定了49条肽(2256条肽中)诱导T细胞应答。从那时起，已经公开了许多利用不同的MHC结合预测工具寻找作为候选疫苗的T细胞表位的研究，主要是针对病原体，例如利什曼原虫(Leishmaniamajor)(C.Herrera-Najera,R.F.Xacur-Garcia,M.J.Ramirez-Sierra,E.Dumonteil,Proteomics9,1293(2009))。然而，单独使用MHCI结合预测工具来预测免疫原性是误导性的，因为那些工具被训练用于预测给定的肽是否具有与给定的MHC等位基因结合的潜力。利用MHC结合预测来预测免疫原性的基本原理是假定与各个MHC等位基因高亲和力地结合的肽更可能是免疫原性的(A.Setteetal.,TheJournalofImmunology153,5586(1994))。然而，有很多研究显示，低MHC结合亲和力也可导致高免疫原性(M.C.Feltkamp,M.P.Vierboom,W.M.Kast,C.J.Melief,MolecularImmunology31,1391(1994))，并且肽-MHC稳定性可能是比肽亲和力更好的免疫原性预测因素(M.Harndahletal.,EuropeanJournalofImmunology42,1405(2012))。因此，迄今为止免疫原性预测不是十分准确，这反映在预测免疫原性的低成功率上。然而，肽结合是T细胞表位识别的必要但非充分条件，并且有效预测会明显降低进行实验测试的肽的数量。
显然预测免疫原性的模型的发展还需要考虑到T细胞受体(TCR)的识别和中枢耐受，即在胸腺发育过程中T细胞的阴性选择和阳性选择。
需要能够模拟上文提到的全部方面来准确预测表位的免疫原性而不仅仅是结合的预测模型。
发明描述
发明概述
一方面，本发明涉及预测免疫原性氨基酸修饰的方法，该方法包括下述步骤：
a)确定修饰的肽与一种或多种MHC分子结合的评分，和
b)确定非修饰的肽与一种或多种MHC分子结合的评分，和/或
c)确定当存在于MHC-肽复合体中时，修饰的肽与一种或多种T细胞受体结合的评分。
在一个实施方案中，修饰的肽包含修饰的蛋白的片段，所述片段含有所述蛋白中存在的修饰。在一个实施方案中，非修饰的肽或蛋白在其与修饰的肽或蛋白中的修饰位点相对应的位点，含有种系氨基酸。
在一个实施方案中，非修饰的肽或蛋白与修饰的肽或蛋白除所述修饰外是相同的。优选地，非修饰的肽或蛋白与修饰的肽或蛋白具有相同的长度和/或序列(除所述修饰外)。
在一个实施方案中，非修饰的肽和修饰的肽的长度是8-15个氨基酸，优选8-12个氨基酸。
在一个实施方案中，一种或多种MHC分子包含不同的MHC分子类型，特别是不同的MHC等位基因。在一个实施方案中，一种或多种MHC分子是MHCI类分子和/或MHCII类分子。在一个实施方案中，一种或多种MHC分子包含一组MHC等位基因，如个体的一组MHC等位基因或其子集。
在一个实施方案中，通过包括与MHC-结合基序的数据库进行序列比较的方法来确定与一种或多种MHC分子的结合评分。
在一个实施方案中，步骤a)包括确定所述评分是否满足与一种或多种MHC分子结合的预先确定的阈值和/或步骤b)包括确定所述评分是否满足与一种或多种MHC分子结合的预先确定的阈值。在一个实施方案中，步骤a)中应用的阈值与步骤b)中应用的阈值不同。在一个实施方案中，与一种或多种MHC分子结合的预先确定的阈值反映了与一种或多种MHC分子结合的可能性。
在一个实施方案中，一种或多种T细胞受体包含一组T细胞受体，如个体的一组T细胞受体或其子集。在一个实施方案中，步骤c)包括假定所述T细胞受体组不包含与存在于MHC-肽复合体中的非修饰的肽结合的T细胞受体和/或不包含与存在于MHC-肽复合体中时的非修饰的肽高亲和力地结合的T细胞受体。
在一个实施方案中，步骤c)包括确定非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸之间的化学和物理相似性的评分。在一个实施方案中，步骤c)包括确定所述评分是否满足氨基酸之间的化学和物理相似性的预先确定的阈值。在一个实施方案中，所述氨基酸之间的化学和物理相似性的预先确定的阈值反映了氨基酸在化学上和物理上相似的可能性。在一个实施方案中，基于氨基酸在天然状态下互换的可能性确定化学和物理相似性评分。在一个实施方案中，氨基酸在天然状态下互换的频度越高，认为氨基酸的相似性越高，反之亦然。在一个实施方案中，利用基于进化的对数-几率矩阵来测定化学和物理相似性。
在一个实施方案中，如果非修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分满足指示与一种或多种MHC分子结合的阈值，并且修饰的肽的与一种或多种MHC分子的结合评分满足指示与一种或多种MHC分子结合的阈值，则将所述修饰或修饰的肽预测为是免疫原性的，条件是非修饰氨基酸和修饰的氨基酸的化学和物理相似性评分满足指示化学和物理不相似性的阈值。
在一个实施方案中，如果非修饰的肽与一种或多种MHC分子结合或有与一种或多种MHC分子结合的可能性，并且修饰的肽与一种或多种MHC分子结合或有与一种或多种MHC分子结合的可能性，则将所述修饰或修饰的肽预测为是免疫原性的，条件是非修饰的氨基酸和修饰的氨基酸在化学上和物理上不相似或者有在化学上和物理上不相似的可能性。
在一个实施方案中，修饰不位于与一种或多种MHC分子结合的锚定位点。
在一个实施方案中，如果非修饰的肽的与一种或多种MHC分子的结合评分满足指示不与一种或多种MHC分子结合的阈值，并且修饰的肽的与一种或多种MHC分子的结合评分满足指示与一种或多种MHC分子结合的阈值，则将所述修饰或修饰的肽预测为是免疫原性的。
在一个实施方案中，如果非修饰的肽不与一种或多种MHC分子结合或者具有不与一种或多种MHC分子结合的可能性，并且修饰的肽与一种或多种MHC分子结合或有与一种或多种MHC分子结合的可能性，则将所述修饰或修饰的肽预测为是免疫原性的。
在一个实施方案中，修饰位于与一种或多种MHC分子结合的锚定位点。
在一个实施方案中，本发明的方法包括对两种或更多种不同修饰的肽实施步骤a)，所述两种或更多种不同修饰的肽包含相同的修饰。在一个实施方案中，含有相同的修饰的两种或更多种不同修饰的肽包含修饰的蛋白的不同片段，所述不同片段含有所述蛋白中存在的相同的修饰。在一个实施方案中，含有相同的修饰的两种或更多种不同修饰的肽包含修饰的蛋白的所有可能的MHC结合片段，所述片段含有所述蛋白中存在的相同的修饰。在一个实施方案中，本发明的方法还包括从包含相同的修饰的两种或更多种不同修饰的肽中选择修饰的肽，所述两种或多种不同修饰的肽具有与一种或多种MHC分子结合的可能性或最大可能性。在一个实施方案中，所述含有相同的修饰的两种或更多种不同修饰的肽在修饰长度和/或位点上有所不同。
在一个实施方案中，本发明的方法包括对两种或更多种不同修饰的肽实施步骤a)，以及任选地实施步骤b)和c)中的一项或两项。在一个实施方案中，所述两种或更多种不同修饰的肽包含相同的修饰和/或包含不同修饰。在一个实施方案中，不同修饰存在于同种蛋白和/或不同的蛋白中。步骤a)和任选地步骤b)和c)中的一项或两项中使用的两种或更多种不同修饰的肽的组可以相同或不同。在一个实施方案中，步骤b)和/或步骤c)中使用的两种或更多种不同修饰的肽的组是步骤a)中使用的两种或更多种不同修饰的肽的组的子集。优选地，所述子集包括步骤a)中评分最高的肽。
在一个实施方案中，本发明的方法包括比较两种或更多种所述不同修饰的肽的评分。在一个实施方案中，本发明的方法包括将两种或更多种所述不同修饰的肽进行排名。在一个实施方案中，修饰的肽与一种或多种MHC分子结合的权重高于当存在于MHC-肽复合体中时修饰的肽与一种或多种T细胞受体结合的权重，优选地高于非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸之间的化学和物理相似性的评分，并且当存在于MHC-肽复合体中时修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合的评分，优选地非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸之间的化学和物理相似性评分，的权重高于非修饰的肽与一种或多种MHC分子结合的评分。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括鉴定一个或多个蛋白编码区域中的非同义突变。
在一个实施方案中，根据本发明，通过对一种或多种细胞如一种或多种癌细胞以及任选地一种或多种非癌细胞的基因组或转录组进行部分或完全测序，以及鉴定一个或多个蛋白编码区域中的突变，来鉴定修饰。
在一个实施方案中，所述突变是体细胞突变。在一个实施方案中，所述突变是癌症突变。
在一个实施方案中，将本发明的方法用于疫苗的制备。在一个实施方案中，疫苗来源于通过本发明的方法预测为是免疫原性的一种或多种修饰或一种或多种修饰的肽。
另一方面，本发明提供用于提供疫苗的方法，其包括下述步骤：通过本发明的方法确定预测为是免疫原性的一种或多种突变或一种或多种修饰的肽。
在一个实施方案中，方法还包括下述步骤：提供包含肽或多肽的疫苗，或者包含编码所述肽或多肽的核酸的疫苗，所述肽或多肽含有预测为是免疫原性的修饰或修饰的肽。
另一方面，本发明提供利用根据本发明的方法获得的疫苗。本文描述了此类疫苗的优选实施方案。
根据本发明提供的疫苗可包含药学可接受的载体，以及可任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。疫苗可以是治疗性或预防性疫苗的形式。
另一方面涉及在患者中诱导免疫应答的方法，包括向患者施用根据本发明提供的疫苗。
另一方面涉及治疗癌症患者的方法，其包括下述步骤：
(a)通过根据本发明的方法提供疫苗；和
(b)向患者施用所述疫苗。
另一方面涉及治疗癌症患者的方法，其包括向患者施用根据本发明的疫苗。
在其它方面，本发明提供本文所述的疫苗，其用于本文所述的治疗方法，特别是用于治疗或预防癌症。
可将本文所述的癌症的治疗与外科手术和/或放射和/或传统的化疗组合。
从下述详细描述和权利要求中，本发明的其它特征和优势是显而易见的。
发明详述
尽管下文详细描述了本发明，应当理解本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为他们可能发生变化。还应当理解本文使用的术语仅是为描述具体实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常所理解的具有相同含义。
在下文中，将描述本发明的元件。这些元件与具体实施方案一同列出，然而，应当理解它们可以以任何方式、任何数量组合以产生另外的实施方案。不应将各种描述实例和优选实施方案解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持和包含将明确描述的实施方案与任何数量的公开的和/或优选的元件组合的实施方案。此外，应将本申请中的全部所述元件的任何排列和组合认为是被本申请的描述所公开，除非上下文另外指明。
优选地，如"Amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms:(IUPACRecommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,andH.Eds.,(1995)HelveticaChimicaActa,CH-4010Basel,Switzerland中所述，对本文使用的术语进行限定。
除非另外指明，本发明的实践应用在本领域的文献中解释的生物化学、分子生物学、免疫学以及重组DNA技术中的常规方法(cf.,例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,J.Sambrooketal.eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor1989)。
除非上下文另有需要，否则贯穿本说明书和下述权利要求中，术语“包括(comprise)”以及变体如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应被理解为意指包含所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤组，但不排除任何其它成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤组，尽管在一些实施方案中，可能将此类其它成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤组排除，即主题由包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤组组成。在本发明的文本中(特别是在权利要求的文本中)使用的术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”以及类似的引用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。本文对数值范围的叙述仅意图用作落入所述范围的单独提及的每个分开的值的速记法。除非本文另外指明，将每个单独的值并入本说明书，如同本文对其进行单独叙述一样。
可以以任何合适的顺序实施本文所述的全部方法，除非本文另外指明或者与上下文明显矛盾。本文提供的任何和全部实例或示例性语言(例如“如”)的应用仅意图更好地阐明本发明，并且不对要求保护的本发明的范围造成限制。本说明书的语言不应被解释为指示本发明的实施中所必需的任何未要求的元件。
贯穿本说明书的文本引用了一些文件。在此将本文所引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、具体公开物、制造商的说明书、说明等)，不管在上文中还是在下文中，以引用的方式整体并入。本文全部都不应被解释为承认本发明无权因为是在先发明而先于此类公开。
根据本发明，术语“肽”指含有通过肽键共价相连的两个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选21个或更多个以及高至优选8、10、20、30、40或50个，特别是100个氨基酸的物质。术语“多肽”或“蛋白”指大的肽，优选指含有多于100个氨基酸残基的肽，但是通常术语“肽”、“多肽”和“蛋白”是同义词，并且在本文中可互换使用。
根据本发明，关于肽、多肽或蛋白的术语“修饰”涉及与亲本序列如野生型的肽、多肽或蛋白的序列相比，肽、多肽或蛋白中的序列改变。该术语包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和氨基酸取代变体，优选氨基酸取代变体。所有这些根据本发明的序列变化可能产生新的表位。
氨基酸插入变体包括在具体氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。
氨基酸添加变体包括在氨基端和/或羧基端融合一个或多个氨基酸，如1、2、3、4或5个，或者更多个氨基酸。
氨基酸缺失变体的特征为一个或多个氨基酸从序列中的移除，如1、2、3、4或5个，或者更多个氨基酸的移除。
氨基酸取代变体的特征为序列中至少一个残基被移除，并且在其部位插入另一残基。
根据本发明，用于在本发明的方法中测试的修饰或修饰的肽可来源于含有修饰的蛋白。
术语“来源的”意为根据本发明，具体的实体，特别是具体肽的序列存在于其来源的物体中。至于氨基酸序列，特别是具体的序列区域，“来源的”特别意为相关氨基酸序列来源于其存在的氨基酸序列。
用于在本发明的方法中测试的修饰或修饰的肽的可能来源的含有修饰的蛋白可以是新抗原。
根据本发明，术语“新抗原”涉及与亲本肽或蛋白相比，含有一种或多种氨基酸修饰的肽或蛋白。例如，新抗原可以是肿瘤相关新抗原，其中术语“肿瘤相关新抗原”包含含有由肿瘤特异的突变导致的氨基酸修饰的肽或蛋白。
根据本发明，术语“肿瘤特异的突变”或“癌症特异的突变”涉及存在于肿瘤细胞或癌细胞的核酸中但不不存在于相应的正常细胞(即非肿瘤细胞或非癌细胞)的核酸中的体细胞突变。术语“肿瘤特异的突变”与“肿瘤突变”以及术语“癌症特异的突变”与“癌症突变”在本文可互换使用。
术语“免疫应答”指针对靶标如抗原的综合身体应答，并且优选指细胞免疫应答或者细胞以及体液免疫应答。免疫应答可以是保护性的/防止性的/预防性的和/或治疗性的。
“诱导免疫应答”可意为在诱导之前不存在免疫应答，但是也可意为在诱导之前有一定水平的免疫应答且诱导之后所述免疫应答增强。因此，“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。优选地，在对象中诱导免疫应答之后，保护所述对象不发生疾病如癌症，或者通过诱导免疫应答来改善疾病病况。例如，可以在患有癌症的患者或者处于患癌症的风险的对象中诱导针对肿瘤表达抗原的免疫应答。此种情况下诱导免疫应答可能意味着对象的疾病病况得到了改善，所述对象不发生转移，或者处于患癌症风险的对象不患癌症。
术语“细胞免疫应答”和“细胞应答”或者类似的术语指针对细胞的免疫应答，所述细胞的特征为由I类或II类MHC递呈抗原，包括作为“辅助”或“杀手”的T细胞或T-淋巴细胞。辅助性T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答来发挥主要作用，杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀死病变细胞如癌细胞从而阻止更多病变细胞的产生。在优选实施方案中，本发明包括刺激针对表达一种或多种肿瘤表达抗原的肿瘤细胞的抗肿瘤CTL应答，并且优选地利用I类MHC递呈此类肿瘤表达抗原。
根据本发明的“抗原”涵盖任何物质，优选肽或蛋白，其为免疫应答的靶标和/或诱导免疫应答，如与抗体或T-淋巴细胞(T细胞)的特异反应。优选地，抗原包含至少一种表位，如T细胞表位。优选地，本发明上下文中的抗原可以是分子，任选地其在加工之后，诱导优选对所述抗原(包括表达所述抗原的细胞)具有特异性的免疫反应。抗原或其T细胞表位优选地由细胞递呈，优选地由抗原递呈细胞递呈，当为MHC分子时，所述细胞包括病变细胞，特别是癌细胞，其导致针对抗原(包括表达所述抗原的细胞)的免疫应答。
在一个实施方案中，抗原为肿瘤抗原(在本文中也称为肿瘤表达抗原)，即肿瘤细胞的一部分如肿瘤细胞中表达的蛋白或肽，其可能来源于细胞质、细胞表面或细胞核，特别是主要存在于细胞内的那些或者肿瘤细胞的表面抗原。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胚胎性硫糖蛋白、α2-H-铁蛋白以及γ-胎蛋白。根据本发明，肿瘤抗原优选包括表达于肿瘤或癌症以及肿瘤细胞或癌细胞中，并任选地以其针对肿瘤或癌症以及肿瘤细胞或癌细胞的类型和/或表达水平为特征的任何抗原，即肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，术语“肿瘤相关抗原”涉及在正常条件下在有限数量的组织和/或器官或者特定发展阶段特异表达的蛋白，例如，肿瘤相关抗原可以在正常条件下在胃组织中特异表达，优选地在胃粘膜中，在生殖器官中，例如在睾丸中，在滋养层组织中，例如在胎盘或生殖谱系细胞中特异表达，并在一种或多种肿瘤组织或癌组织中表达或异常表达。关于这点，“有限数量”优选意为不多于3个，更优选不多于2个。在本发明的情况下的肿瘤抗原包括，例如分化抗原，优选细胞类型特异的分化抗原，即在正常条件下，在某一细胞类型的某一分化阶段特异表达的蛋白，癌症/睾丸抗原，即在正常条件下，在睾丸有时在胎盘中特异表达的蛋白，以及生殖细胞特异的抗原。优选地，根据肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴定癌症细胞。在本发明的情况下，对象(例如患有癌症的患者)的癌细胞表达的肿瘤抗原，优选为所述对象的自身蛋白。在优选实施方案中，在本发明的情况下的肿瘤抗原，在正常条件下在非必需的组织或器官中特异表达，即当被免疫系统损伤时，不导致对象死亡的组织或器官，或者在不能或者几乎不能被免疫系统接近的身体的器官或结构中表达。
根据本发明，术语“肿瘤抗原”、“肿瘤表达抗原”、“癌症抗原”以及“癌症表达抗原”是等同的，并且在本文中可互换使用。
术语“免疫原性”涉及优选与治疗如针对癌症的治疗有关的免疫应答诱导的相对有效性。如本文所使用的，术语“免疫原性的”涉及具有免疫原性的特性。例如，用于肽、多肽或蛋白中的术语“免疫原性的修饰”涉及所述肽、多肽或蛋白诱导由所述修饰引起的和/或直接针对所述修饰的免疫应答的有效性。优选地，非修饰的肽、多肽或蛋白不诱导免疫应答，诱导不同的免疫应答或者诱导不同水平优选较低水平的免疫应答。
术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHCI类和MHCII类分子，并涉及存在于所有脊椎动物中的一系列基因。MHC蛋白或分子对于免疫反应中的淋巴细胞和抗原递呈细胞或病变细胞之间信号转导很重要，其中MHC蛋白或分子与肽结合并将其递呈以被T细胞受体识别。MHC编码的蛋白表达于细胞表面，并且向T细胞显示自身抗原(来自细胞自身的肽片段)以及非自身抗原(例如入侵微生物的片段)。
MHC范围分为三个亚组：I类、II类和III类。MHCI类蛋白含有α-链和β2-微球蛋白(不是染色体15编码的MHC的一部分)。它们向细胞毒性T细胞递呈抗原片段。在大部分免疫系统细胞上，特别是在抗原递呈细胞上，MHCII类蛋白含有α-链和β-链，并且它们向辅助性T细胞递呈抗原片段。MHCIII类区域编码其它的免疫组分如补体成分，一些编码细胞因子。
MHC是多基因的(存在几种MHCI类和MHCII类基因)和多态的(每一基因有多种等位基因)。
如本文所使用的，术语“单倍型”指在一条染色体上发现的HLA等位基因及其编码的蛋白。单倍型还指存在于MHC内的任一位点的等位基因。用几个位点来表示每一类型的MHC：例如对于I类，HLA-A(人类白细胞抗原-A)、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L、HLA-P和HLA-V；以及对于II类，HLA-DRA、HLA-DRB1-9、HLA-、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA和HLA-DOB。在本文中，术语“HLA等位基因”与“MHC等位基因”可互换使用。
MHC显示出极端多态性：在人类中，在每一基因位点存在大量的包含不同等位基因的单倍型。不同多态性的I类和II类MHC等位基因都具有不同的肽特异性：每一等位基因编码与显示特殊序列类型的肽结合的蛋白。
在本发明所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子是HLA分子。
在本发明的情况下，术语“MHC结合肽”包括MHCI类和/或II类结合肽或者可被处理以产生MHCI类和/或II类结合肽的肽。在I类MHC/肽复合体的情况下，结合肽的长度通常为8-12个，优选8-10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可能是有效的。在II类MHC/肽复合体的情况下，结合肽的长度通常为9-30个，优选10-25个氨基酸，并且特别是13-18个氨基酸，然而更长或更短的肽可能是有效的。
如果肽将被直接呈递，即不经处理，特别是不经剪切，则其长度适合与MHC分子结合，特别是与I类MHC分子结合，并且优选长度为7-30个氨基酸，如长度为7-20个氨基酸，更优选长度为7-12个氨基酸，更优选长度为8-11个氨基酸，特别是长度为9个或10个氨基酸。
如果肽是含有其它序列的较大实体的一部分，例如疫苗序列或多肽的一部分，并且将在处理之后被呈递，特别是在剪切之后，则处理产生的肽的长度适合与MHC分子特别是MHCI类分子结合，并且优选长度为7-30个氨基酸，如长度为7-20个氨基酸，更优选长度为7-12个氨基酸，更优选长度为8-11个氨基酸，特别是长度为9或10个氨基酸。优选地，将在处理之后被呈递的肽的序列来源于用于疫苗接种的抗原或多肽的氨基酸序列，即它的序列与抗原或多肽的片段基本对应，并优选完全相同。
因此，在一个实施方案中，MHC结合肽包含与抗原片段基本对应并优选完全相同的序列。
术语“表位”指分子如抗原中的抗原决定簇，即被免疫系统识别的分子的一部分或其片段，例如被T细胞识别的，特别是当由MHC分子递呈时。蛋白如肿瘤抗原的表位优选包含所述蛋白的连续或不连续部分，并且长度优选为5-100个，优选为5-50个，更优选为8-30个，最优选为10-25个氨基酸，例如表位长度可以优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在本发明的情况下的表位特别优选为T细胞表位。
根据本发明，表位可能与MHC分子结合，如细胞表面的MHC分子，因此其可能是“MHC结合肽”。
本文所用的术语“新表位(neo-epitope)”指在参考如正常的非癌细胞或生殖细胞中不存在，但在癌细胞中存在的表位。特别地，这包括下述情况：在正常的非癌细胞或生殖细胞中存在对应的表位，然而，由于癌细胞的一种或多种突变，表位的序列发生改变，从而产生新表位。
如本文所使用的，术语“T细胞表位”指与被T细胞受体识别的结构的MHC分子结合的肽。通常，T细胞表位存在于抗原递呈细胞的表面。
如本文所使用的，术语“预测T细胞表位”指预测肽是否与MHC分子结合并被T细胞受体识别。术语“预测T细胞表位”与短语“预测肽是否是免疫原性的”基本同义。
根据本发明，T细胞表位可能作为较大实体如疫苗序列和/或包含多个T细胞表位的多肽的一部分存在于疫苗中。在合适的处理之后产生递呈的肽或T细胞表位。
可以在T细胞表位的一个或多个残基对其进行修饰，所述残基对TCR识别或与MHC的结合是非必需的。可将此类修饰的T细胞表位认为是免疫等价的。
优选地，当被MHC递呈并被T细胞受体识别时，在合适的共刺激信号存在的情况下，T细胞表位能够诱导携带特异性识别肽/MHC复合体的T细胞受体的T细胞的克隆扩增。
优选地，T细胞表位包含与抗原片段的氨基酸序列基本对应的氨基酸序列。优选地，所述抗原片段是由MHCI类和/或II类递呈的肽。
根据本发明的T细胞表位优选涉及能够刺激免疫应答的抗原的一部分或片段，优选地为针对抗原或以所述抗原的表达为特征的细胞的细胞免疫应答，以及优选地通过抗原(如病变细胞特别是癌细胞)递呈来实现。优选地，T细胞表位能够刺激针对以由I类MHC递呈抗原为特征的细胞的细胞应答，并且优选地能够刺激抗原应答的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
“抗原处理”或“处理”指肽、多肽或蛋白降解为处理产物，其为所述肽、多肽或蛋白的片段(例如多肽降解为肽)，并且这些片段中的一种或多种与MHC分子相连(例如通过结合)，用于通过细胞，优选地通过抗原递呈细胞向特定的T细胞递呈。
“抗原递呈细胞”(APC)是递呈在其细胞表面与MHC分子相连的蛋白抗原的肽片段的细胞。一些APC可激活抗原特异的T细胞。
专职抗原递呈细胞在内化抗原方面十分有效，其通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用，然后在其细胞膜上显示与II类MHC分子结合的抗原片段。T细胞识别抗原递呈细胞表面的抗原-II类MHC分子复合体并与之相互作用。然后抗原递呈细胞产生另外的共刺激信号，导致T细胞激活。共刺激分子的表达是专职抗原递呈细胞的定义性特征。
专职抗原递呈细胞的主要类型是树突细胞、巨噬细胞、B细胞以及某些激活的上皮细胞，其中树突细胞具有最广泛范围的抗原递呈，并且可能是最重要的抗原递呈细胞。树突细胞(DC)是通过MHCII类和I类抗原递呈通路向T细胞递呈周围组织中捕获的抗原的白细胞群。众所周知树突细胞是免疫应答的有效诱导物，并且这些细胞的激活是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。将树突细胞方便地分类为“未成熟的”和“成熟的”细胞，可将其用作区别两种研究透彻的表型的简单方法。然而，这一命名不应被解释为将分化的所有可能的中间阶段排除在外。未成熟的树突细胞的特征为具有高的抗原摄取和处理能力的抗原递呈细胞，其与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达有关。成熟表型的典型特征为这些标志物的低表达，和负责T细胞激活的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86以及4-1BB)的高表达。树突细胞成熟指树突细胞激活的状态，在此状态下，此类抗原递呈树突细胞导致T细胞启动，同时未成熟的树突细胞的递呈导致耐受。树突细胞成熟主要由下述原因引起：通过遗传受体检测到具有微生物特征的生物分子(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎性细胞因子(TNF、IL-1、IFN)、在树突细胞表面通过CD40L连接CD40以及经受应激细胞死亡的细胞释放的物质。可通过用细胞因子体外培养骨髓细胞得到树突细胞，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α。
非专职抗原递呈细胞不持续表达与初始T细胞相互作用所需的MHCII类蛋白；这些蛋白仅在非专职抗原递呈细胞被某些细胞因子如IFNγ刺激时才表达。
可通过用核酸转导细胞，使抗原递呈细胞装载I类MHC递呈的肽，所述核酸为编码包含被递呈的肽的肽或多肽的核酸，优选为RNA，例如编码用于疫苗接种的抗原或多肽的核酸。
在一些实施方案中，可向患者施用包含靶向树突细胞或其它抗原递呈细胞的核酸递送媒介物的药物组合物或疫苗，从而导致体内转染。树突细胞的体内转染，例如通常可采用本领域已知的任何方法来实施，如在WO97/24447中描述的那些，或者Mahvietal.ImmunologyandcellBiology75:456-460,1997中所述的基因枪法。
根据本发明，术语“抗原递呈细胞”也包括靶细胞。
“靶细胞”意为免疫应答如细胞免疫应答的靶标细胞。靶细胞包括递呈抗原(即来源于抗原的肽片段)的细胞，并且包括任何非期望的细胞如癌细胞。在优选实施方案中，靶细胞是表达本文所述的抗原的细胞，并且优选由I类MHC递呈所述抗原。
术语“部分(portion)”指一部分(fraction)。关于具体结构如氨基酸序列或蛋白，术语其“其部分”可指所述结构的连续部分或不连续部分。优选地，氨基酸序列的一部分包含所述氨基酸序列的至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，优选至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％以及最优选至少90％的氨基酸。优选地，如果所述部分是不连续部分，所述不连续部分由结构的2、3、4、5、6、7、8个或更多个部分组成，每一部分是所述结构的连续元件。例如，氨基酸序列的不连续部分可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8个或更多个，优选不多于4个部分组成，其中每一部分优选包含所述氨基酸序列的至少5个连续氨基酸，至少10个连续氨基酸，优选至少20个连续氨基酸，优选至少30个连续氨基酸。
在本文中术语“部分(part)”与“部分(fragment)”可互换使用，并且其指的是连续元件。例如，结构如氨基酸序列或蛋白的一部分指所述结构的连续元件。结构的一部分(aportionof)、一部分(apartof)或一部分(afragmentof)优选包含所述结构的一种或多种功能特性。例如，表位、肽或蛋白的一部分优选与其来源的表位、肽或蛋白是免疫等价的。在本发明的情况下，结构(如氨基酸序列)的一“部分”优选包含，优选由整个结构或氨基酸序列的至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少94％，至少96％，至少98％，至少99％组成。
本发明上下文中的术语“免疫反应细胞(immunoreactivecell)”涉及在免疫反应过程中发挥效应器功能的细胞。“免疫反应细胞”优选能够与抗原或以递呈抗原或其肽片段(例如T细胞表位)并介导免疫应答为特征的细胞结合。例如，此类细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，分泌抗体，识别癌细胞，并且任选地消除此类细胞。例如，免疫反应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞以及树突细胞。优选地，在本发明的情况下，“免疫反应细胞”为T细胞，优选为CD4+和/或CD8+T细胞。
优选地，“免疫反应细胞”识别抗原或其肽片段，识别具有一定程度的特异性，特别是如果由MHC分子递呈，如在抗原递呈细胞或病变细胞如癌细胞的表面。优选地，所述识别使得识别抗原或其肽片段的细胞是应答性的或是反应性的。如果细胞是含有识别抗原或其肽片段的受体的辅助性T细胞(CD4+T细胞)，在MHCII类分子的情况下，此类应答或反应可能包括细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的激活。如果细胞是CTL，此类应答或反应可能包括由MHCI类分子递呈的细胞的清除，即以由I类MHC递呈抗原为特征的细胞，例如通过细胞凋亡或者穿孔素介导的细胞溶解。根据本发明，CTL应答可包括持续的钙流出，细胞分裂、细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生、激活标志物如CD44和CD69的上调以及抗原表达靶细胞的特异性细胞溶解杀伤。CTL应答还可利用准确显示CTL应答的人工报告基因来确定。此类识别抗原或抗原片段并且为应答性或反应性的CTL在本文中也被称为“抗原应答性CTL(antigen-responsiveCTL)”。如果细胞是B细胞，此类应答可能包括免疫球蛋白的释放。
在本文中术语“T细胞”与“T淋巴细胞”可互换使用，并且包括辅助性T细胞(CD4+T细胞)和包含溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)。
T细胞属于被称为淋巴细胞的白血细胞群，并在细胞介导的免疫中发挥核心作用。可通过被称作T细胞受体(TCR)的特殊受体在其细胞表面的存在来将它们与其它淋巴细胞类型区分开来，如B细胞和自然杀伤细胞。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了一些不同的T细胞亚群，每种具有不同功能。
在免疫过程中，辅助性T细胞帮助其它白血细胞，除其它功能外，包括B细胞成熟为浆细胞以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。这些细胞也被称作CD4+T细胞，因为它们在其表面表达CD4蛋白。当辅助性T细胞面对由表达于抗原递呈细胞(APC)表面的MHCII类分子递呈的肽抗原时，其被激活。一旦激活，它们迅速分裂并分泌调节或帮助主动免疫应答的被称作细胞因子的小蛋白。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还与移植排斥有关。由于这些细胞在其表面表达CD8糖蛋白，因而它们也被称作CD8+T细胞。这些细胞通过与MHCI类相关的抗原结合来识别它们的目标，MHCI类存在于身体的几乎每个细胞表面。
大部分T细胞具有作为一些蛋白的复合体存在的T细胞受体(TCR)。真正的T细胞受体由两条分开的肽链组成，其由单独的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称作α-TCR链和β-TCR链。γδT细胞(γδT细胞)代表了在其表面具有不同的T细胞受体(TCR)的小的T细胞亚群。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ-链和一条δ-链组成。这一T细胞群比αβT细胞群较不常见(总T细胞的2％)。
T细胞激活中的第一信号通过T细胞受体与由另一细胞上的MHC递呈的短肽的结合来提供。这确保了仅具有对该肽有特异性的TCR的T细胞被激活。伴侣细胞通常是抗原递呈细胞如专职抗原递呈细胞，在初始应答的情况下通常是树突细胞，尽管B细胞和巨噬细胞是重要的APC。
根据本发明，如果分子对预定靶标具有显著亲和力并在标准分析中与所述预定靶标结合，则分子能够与所述靶标结合。通常通过平衡解离常数(KD)来测定“亲和力”或“结合亲和力”。如果分子对所述靶标不具有显著亲和力并且在标准分析中不与所述靶标显著结合，则分子不能(基本上)与所述靶标结合。
可通过在体内将抗原或其肽片段掺入抗原递呈细胞来体内产生细胞毒性T淋巴细胞。抗原或其肽片段可表现为蛋白、DNA(例如载体内的)或RNA。可对抗原进行处理以产生MHC分子的肽伙伴，而不需对其片段进行进一步处理就可将其片段递呈。后者是特殊情况，如果它们能够与MHC分子结合。通常，通过皮内注射向患者施用是可能的。然而，也可通过淋巴结结内注射来实施注射(Maloyetal.(2001),ProcNatlAcadSciUSA98:3299-303)。产生的细胞递呈目标复合体，并且被自体细胞毒性T淋巴细胞识别，然后自体细胞毒性T淋巴细胞增殖。
可通过多种方法来检测CD4+或CD8+T细胞的特异性激活。检测特异性T细胞激活的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子(例如淋巴因子)的产生或者细胞溶解活性的产生。对于CD4+T细胞，检测特异性T细胞激活的优选方法是检测T细胞的增殖。对于CD8+T细胞，检测特异性T细胞激活的优选方法是检测细胞溶解活性的产生。
通过“以抗原递呈为特征的细胞”或“递呈抗原的细胞”或者类似的表述，意为在MHC分子特别是MHCI类分子的情况下，细胞如病变细胞(例如癌细胞)或抗原递呈细胞递呈它表达的抗原或来源于所述抗原的片段，例如通过处理抗原。类似地，术语“以抗原递呈为特征的疾病”表示涉及以抗原递呈特别是由I类MHC递呈为特征的细胞的疾病。通过细胞递呈抗原可能受用核酸如编码所述抗原的RNA转染细胞的影响。
通过“递呈的抗原的片段”或者类似的表述，意为所述片段可被MHCI类或II类递呈，优选被MHCI类递呈，例如当直接加至抗原递呈细胞时。在一个实施方案中，片段是被表达抗原的细胞天然递呈的片段。
术语“免疫等价的”意为免疫等价的分子如免疫等价的氨基酸序列表现出相同的或基本相同的免疫特性和/或表现出相同的或基本相同的免疫效果，例如关于免疫效果的类型如体液和/或细胞免疫应答的诱导、诱导的免疫反应的强度和/或持续时间或诱导的免疫反应的特异性。在本发明的情况下，术语“免疫等价的”优选用于关于用于免疫的肽的免疫效果或特性。例如，如果当氨基酸序列暴露于对象的免疫系统时诱导了对于与参考氨基酸序列的反应具有特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与参考氨基酸序列是免疫等价的。
在本发明上下文中的术语“免疫效应器功能”包括由免疫系统组分介导的任何功能，其导致例如肿瘤细胞的杀伤、或肿瘤生长的抑制和/或肿瘤发展的抑制，包括肿瘤散播和转移的抑制。优选地，本发明上下文中的免疫效应器功能是T细胞介导的效应器功能。此类功能包括，当为辅助性T细胞(CD4+T细胞)时，在MHCII类分子的情况下，抗原或抗原片段被T细胞受体的识别、细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的激活，以及当为CTL时，在MHCI类分子的情况下，抗原或抗原片段被T细胞受体的识别、由MHCI类分子递呈的细胞(即以由I类MHC递呈抗原为特征的细胞，例如通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解)的清除、细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞溶解杀伤。
根据本发明，术语“评分”涉及测试或检查的结果，通常以数字表示。术语如“评分较好”或“评分最好”涉及测试或检查的较好结果或最好结果。
术语如“预测(predict)”、“预测(predicting)”或“预测(prediction)”涉及可能性的测定。
根据本发明，确定肽与一种或多种MHC分子结合的评分包括测定肽与一种或多种MHC分子结合的可能性。
可通过利用任何肽：MHC结合预测工具来确定肽与一种或多种MHC分子结合的评分。例如可利用免疫表位数据库分析资源(IEDB-AR:http://tools.iedb.org)。
通常针对一组MHC分子进行预测，如一组不同的MHC等位基因，如所有可能的MHC等位基因或者存在于患者中的、优选具有修饰的、并将根据本发明测定其免疫原性的一组MHC等位基因或其子集。
根据本发明，确定当存在于MHC-肽复合体中时的修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合的评分包括测定当存在于与MHC分子形成的复合体中时的肽与T细胞受体结合的可能性。
可针对一种T细胞受体如存在于患者中的T细胞受体进行预测，或者优选针对一组T细胞受体如一组未知的不同的T细胞受体或存在于患者中的优选具有修饰并将根据本发明测定其免疫原性的一组T细胞受体或其子集进行预测。
此外，通常针对一组MHC分子进行预测，如一组不同的MHC等位基因，如所有可能的MHC等位基因或者存在于患者中的优选具有修饰并将根据本发明测定其免疫原性的一组MHC等位基因或其子集。
存在于MHC-肽复合体中的修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合的评分可通过评估修饰对给定(未知)T细胞受体库的T细胞受体-肽-MHC复合体结合的影响来确定。当存在于MHC-肽复合体中时的修饰的肽与一种或多种T细胞受体结合的评分通常被定义为给定肽-MHC分子对匹配的T细胞受体的识别的一种表示。
当存在于MHC-肽复合体中时的修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合的评分可通过修饰的氨基酸与非修饰的氨基酸之间的物理化学差异来确定。例如，可使用取代矩阵。此类矩阵描述了序列中的一个氨基酸随时间变为其它氨基酸状态的速率。
可使用例如对数-几率矩阵，如基于进化的对数-几率矩阵：具有低对数几率评分的取代比具有高对数几率评分的取代从(未知)T细胞受体分子池中找到匹配的T细胞受体的机会更大(由于匹配非修饰的肽的T细胞受体的阴性选择)。然而存在其它确定该评分的方法。例如，考虑突变在肽中的位点(一些位点可能比其它位点对结合的影响更小)，将取代的氨基酸的最近邻考虑在内(其可能影响取代的氨基酸的二级结构)，将全部肽序列考虑在内，将MHC分子中的肽的全部结构信息考虑在内等。确定评分还包括T细胞受体库的确定(如患者的T细胞受体库或其子集)，例如通过NGS以及实施T细胞受体-肽-MHC复合体的对接模拟。
本发明还可包括对包含相同的修饰和/或不同修饰的不同的肽实施本发明的方法。
在一个实施方案中，术语“包含相同的修饰的不同的肽”涉及包含修饰的蛋白的不同片段或由其组成的肽，所述不同片段包含蛋白中存在的相同的修饰，但长度和/或修饰位点不同。如果蛋白在位点x有修饰，则认为所述蛋白的每条都包含涵盖所述位点x的所述蛋白的不同的序列窗的两条或更多条片段是包含相同的修饰的不同的肽。
在一个实施方案中，术语“包含不同修饰的不同的肽”涉及包含同种和/或不同蛋白的不同修饰的相同和/或不同长度的肽。如果蛋白在位点x和y有修饰，则认为包含涵盖位点x或位点y的所述蛋白的序列窗的所述蛋白的两条片段是包含不种修饰的不同的肽。
本发明还可包括将含有修饰(根据本发明测定其免疫原性)的蛋白序列裂解为适合MHC结合的肽长度，以及确定包含相同和/或不同蛋白的同种和/或不同修饰的不同修饰的肽与一种或多种MHC分子结合的评分。可将输出进行排名，并且结果可能由一系列肽和显示它们的结合可能性的预测评分组成。
可随后实施确定非修饰的肽与一种或多种MHC分子结合评分的步骤和/或确定存在于MHC-肽复合体中的修饰的肽与一种或多种T细胞受体结合评分的步骤，可对包含相同和/或不同修饰的所有不同修饰的肽、其子集进行实施，例如那些与一种或多种MHC分子结合的评分最高的包含相同和/或不同修饰的修饰的肽，或者仅是与一种或多种MHC分子的结合评分最高的一种修饰的肽。
在所述其它步骤之后，可将结果进行排列，并且结果可能由一系列肽和显示它们为免疫原性的可能性的预测评分组成。
优选地，在此类排列中，修饰的肽与一种或多种MHC分子结合的评分的权重高于存在于MHC-肽复合体中的修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合评分，优选地权重高于非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸之间的化学和物理相似性评分，并且存在于MHC-肽复合体中的修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合评分，优选地非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸之间的化学和物理相似性评分，的权重高于非修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分。
氨基酸修饰(根据本发明测定其免疫原性)可能由细胞中核酸的突变导致。可通过已知的测序技术鉴定此类突变。
在一个实施方案中，突变是癌症患者的肿瘤样本的癌症特异的体细胞突变，其可通过确定肿瘤样本的基因组、外显子组和/或转录组与非肿瘤样本的基因组、外显子组和/或转录组之间的序列差异来测定。
根据本发明，肿瘤样本涉及任何样品，如来源于包含或可能包含肿瘤细胞或癌细胞的患者的身体样品。身体样品可以是任何组织样品如血液、从原发性肿瘤或从肿瘤转移中获得的组织样品或者包含肿瘤细胞或癌症细胞的任何其它样品。优选地，身体样品是血液，并且测定血液中包含的一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)中的癌症特异的体细胞突变或序列差异。在另一实施方案中，肿瘤样本涉及一种或多种分离的肿瘤细胞或癌细胞如循环肿瘤细胞(CTC)，或者包含一种或多种分离的肿瘤细胞或癌细胞如循环肿瘤细胞(CTC)的样品。
非肿瘤样本涉及任何样品如来源于患者或其它个体的身体样品，其它个体优选为与患者同一类的个体，优选为不包含或不可能包含肿瘤细胞或癌细胞的健康个体。身体样品可以是任何组织样品如血液或者来源于非肿瘤组织的样品。
本发明可包括患者癌症突变标记的测定。术语“癌症突变标记”可指存在于患者的一种或多种癌症细胞中的全部癌症突变或者它可仅指存在于患者的一种或多种癌症细胞中的一部分癌症突变。因此，本发明可包括鉴定存在于患者的一种或多种癌症细胞中的全部癌症特异的突变或者可包括仅鉴定存在于患者的一种或多种癌症细胞中的一部分癌症特异的突变。通常，本发明的方法提供多个突变的鉴定，其提供了包含于本发明的方法中的足够数量的修饰或修饰的肽。
优选地，根据本发明鉴定的突变是非同义突变，优选在肿瘤细胞或癌症细胞中表达的蛋白的非同义突变。
在一个实施方案中，测定基因组中的癌症特异的体细胞突变或序列差异，优选肿瘤样本的整个基因组。因此，本发明可包括鉴定基因组的癌症突变标记，优选一种或多种癌症细胞的整个基因组。在一个实施方案中，鉴定癌症患者肿瘤样本的癌症特异的体细胞突变的步骤包括鉴定全基因组癌症突变谱。
在一个实施方案中，测定外显子组中的癌症特异的体细胞突变或序列差异，优选肿瘤样本的整个外显子组。因此，本发明可包括鉴定外显子组的癌症突变标记，优选一种或多种癌细胞的整个外显子组。在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤样本的癌症特异的体细胞突变的步骤包括鉴定全外显子组癌症突变谱。
在一个实施方案中，测定转录组中的癌症特异的体细胞突变或序列差异，优选肿瘤样本的整个转录组。因此，本发明可包括鉴定转录组的癌症突变标记，优选一种或多种癌细胞的整个转录组。在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤样本的癌症特异的体细胞突变的步骤包括鉴定全转录组癌症突变谱。
在一个实施方案中，鉴定癌症特异的体细胞突变或鉴定序列差异的步骤包括一个或多个，优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个甚至更多个癌细胞的单细胞测序。因此，本发明可包括鉴定所述一种或多种癌细胞的癌症突变标记。在一个实施方案中，癌细胞是循环肿瘤细胞。可在单细胞测序之前分离癌细胞如循环肿瘤细胞。
在一个实施方案中，鉴定癌症特异的体细胞突变或鉴定序列差异的步骤包括使用第二代测序(NGS)。
在一个实施方案中，鉴定癌症特异的体细胞突变或鉴定序列差异的步骤包括对肿瘤样本的基因组DNA和/或RNA进行测序。
为了显示癌症特异的体细胞突变或序列差异，优选地将从肿瘤样本获得的序列信息与参考如从正常非癌细胞如生殖细胞的核酸(如DNA或RNA)测序获得的序列信息进行比较，所述细胞可从患者或不同个体获得。在一个实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)中获得正常的基因组种系DNA。
术语“基因组”涉及有机体或细胞的染色体中的遗传信息的总量。
术语“外显子组”涉及由外显子形成的有机体基因组的一部分，其为表达基因的编码部分。外显子组提供用于蛋白和其它功能性基因产物合成的基因蓝图。它是基因组的与功能最相关的部分，因此它最可能影响有机体的表型。据评估，人基因组的外显子组包含总基因组的1.5％(Ng,PCetal.,PLoSGen.,4(8):1-15,2008)。
术语“转录组”涉及全部RNA分子组，包括一个细胞或细胞群中产生的mRNA、rRNA、tRNA以及其它非编码RNA。在本发明的情况下，转录组意为一个细胞、细胞群，优选癌细胞群或者在某一时间点给定个体的全部细胞中产生的全部RNA分子组。
根据本发明“核酸”优选为脱氧核糖核酸(DNA或核糖核酸(RNA)，更优选为RNA，最优选为体外转录的RNA(IVTRNA)或合成的RNA。根据本发明核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。根据本发明，核酸可以单链或双链以及线性或共价环状闭合分子的形式存在。根据本发明，核酸可以是分离的。根据本发明，术语“分离的核酸”意为核酸(i)是体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)；(ii)是通过克隆重组产生的；(iii)是纯化的，例如通过剪切以及通过凝胶电泳分离；或者(iv)是合成的，例如通过化学合成。可将核酸用于向细胞引入，即转染，特别地以可通过从DNA模板体外转录来制备的RNA的形式。此外在应用之前，可通过稳定序列、加帽以及聚腺苷酸化对RNA进行修饰。
术语“遗传物质”指分离的核酸、DNA或RNA、双螺旋的一段、染色体的一段或者有机体或细胞的整个基因组，特别是它的外显子组或转录组。
术语“突变”指与参考相比核酸序列的改变或差异(核苷酸取代、添加或缺失)。“体细胞突变”可以在除生殖细胞(精子和卵子)外的身体的任何细胞中发生，因此不传给孩子。这些改变可(但不总是)引起癌症或其它疾病。优选地突变为非同义突变。术语“非同义突变”指导致翻译产物中的氨基酸改变(如氨基酸取代)的突变，优选核苷酸取代。
根据本发明，术语“突变”包括点突变、插入和缺失(Indel)、融合、染色体碎裂(chromothripsis)以及RNA编辑(RNAedit)。
根据本发明，术语“插入和缺失”描述了定义为导致核苷酸的插入和缺失以及净得或丢失共存的一类特殊的突变。在基因组的编码区，除非插入和缺失的长度是3的倍数，否则会产生移码突变。插入和缺失可与点突变形成对比；其中插入和缺失将核苷酸从序列中插入和删除，而点突变是替换一个核苷酸的一种取代形式。
融合可产生由两条先前单独的基因形成的杂交基因。它可以由易位、中间缺失或染色体倒位导致。通常，融合基因是致癌基因。致癌融合基因可产生具有新功能或与其来源的两条融合基因的功能的基因产物不同。可选地，将原癌基因与强启动子融合，因此通过上游融合部分的强启动子引起的上调，致癌作用开始发挥。致癌融合转录本也可由反式剪接或通读事件引起。
根据本发明，术语“染色体碎裂”指一种遗传现象，通过该现象，基因组的特定区域破碎，然后经由单个毁灭性事件连接在一起。
根据本发明，术语“RNA编辑(RNAedit)”或“RNA编辑(RNAediting)”指通过碱基组成的化学变化，RNA分子中的信息内容被改变的分子过程。RNA编辑包括核苷修饰如胞嘧啶核苷(C)至尿嘧啶核苷(U)以及腺嘌呤核苷(A)至次黄嘌呤核苷(I)的脱氨基作用，以及非模板核苷酸的添加和插入。mRNA中的RNA编辑有效地改变了编码的蛋白的氨基酸序列，从而与通过基因组DNA序列预测的不同。
术语“癌症突变标记”指与非癌参考细胞比较时，存在于癌细胞中的一组突变。
根据本发明，“参考”可用于将用本发明的方法从肿瘤样本中获得的结果进行关联和比较。通常，可基于一种或多种正常样本获得“参考”，特别是从患者或者一个或多个不同的个体，优选健康个体，特别是同一物种的个体中获得的未受癌症影响的样本。可通过测试足够大量的正常样本，根据经验来确定“参考”。
根据本发明，可将任何合适的测序方法用于测定突变，优选第二代测序(NGS)技术。未来第三代测序可能取代NGS技术，以加快方法中测序步骤的速度。为了阐明的目的：本发明的上下文中的术语“第二代测序”或“NGS”意为所有的高通量测序技术，与被称为桑格尔化学法(Sangerchemistry)的“传统”测序方法学相比，其通过将整个基因组分为小片段，沿着整个基因组并行随机读取核酸模板。此类NGS技术(也被称作大规模并行测序技术)能够在非常短的时间段内递送整个基因组、外显子组、转录组(基因组的全部转录序列)或甲基化组(基因组的全部甲基化序列)的核酸序列信息，例如在1-2周内，优选在1-7天内或者最优选在少于24小时内，并且原则上允许单细胞测序方法。在本发明的情况下可使用多种市售的NGS平台或文献中提及的NGS平台，例如Zhangetal.2011:Theimpactofnext-generationsequencingongenomics.J.GenetGenomics38(3),95-109；或Voelkerdingetal.2009:Nextgenerationsequencing:Frombasicresearchtodiagnostics.Clinicalchemistry55,641-658中详细描述的那些。此类NGS技术/平台的非限制性实例为：
1)用于例如Roche联营公司454LifeSciences的GS-FLX454GenomeSequencerTM(Branford,Connecticut)中的被称为焦磷酸测序的合成测序技术，其首次描述于Ronaghietal.1998:Asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate".Science281(5375),363-365中。该技术利用乳液PCR(乳液PCR扩增)，其中通过强力涡流将单链DNA结合珠包封进含有被油包围的PCR反应物的水性胶束中以进行乳液PCR扩增。在焦磷酸测序过程中，将在核苷酸掺入时由磷酸分子发射的光记录为聚合酶合成的DNA链。
2)由Solexa(现在是IlluminaInc.,SanDiego,California的一部分)研发的合成测序方法，基于可逆染料终止剂，并且应用于例如Illumina/SolexaGenomeAnalyzerTM和IlluminaHiSeq2000GenomeAnalyzerTM中。在该技术中，在流动池通道内向寡核苷酸引物簇片段同时添加所有四种核苷酸和DNA聚合酶。桥扩增用所有四种荧光标记的核苷酸延伸簇链用于测序。
3)连接测序方法，例如用于AppliedBiosystems(现在的LifeTechnologiesCorporation,Carlsbad,California)的SOLidTM平台的连接测序方法。在该技术中，根据测序位点标记固定长度的全部可能的寡核苷酸池。将寡核苷酸退火并连接；通过DNA连接酶进行的匹配序列的优先连接产生该位点核苷酸的信号信息。在测序之前，通过乳液PCR扩增扩增DNA。将得到的每个仅含有相同DNA分子的拷贝的珠子置于载玻片上。作为第二实例，DoverSystems(Salem,NewHampshire)的PolonatorTMG.007平台也应用了连接测序方法，通过利用随机排列的、基于珠子的乳液PCR扩增来扩增DNA片段以进行并行测序。
4)单分子测序技术，例如用于PacificBiosciences(MenloPark,California)的PacBioRS系统或用于HelicosBiosciences(Cambridge,Massachusetts)的HeliScopeTM平台中的单分子测序技术。该技术的显著特点是其在不扩增的情况下对单DNA或RNA分子进行测序的能力，将其定义为单分子实时(SMRT)DNA测序。例如，HeliScope利用高灵敏性的荧光检测系统直接检测合成时的每个核苷酸。VisigenBiotechnology(Houston,Texas)已经研发出了基于荧光共振能量转移(FRET)的类似技术。其它基于荧光的单分子技术来自U.S.Genomics(GeneEngineTM)和Genovoxx(AnyGeneTM)。
5)用于单分子测序的纳米技术，其中使用不同的纳米结构，其例如排列在一个芯片上从而监测复制过程中单链上聚合酶分子的移动。基于纳米技术的方法的非限制性实例是OxfordNanoporeTechnologies(Oxford,UK)的GridONTM平台、Nabsys(Providence,RhodeIsland)研发的杂交辅助的纳米孔测序(HANSTM)平台，以及被称作组合探针锚定连接(cPALTM)的具有DNA纳米球(DNB)技术的基于专有连接酶的DNA测序平台。
6)基于电子显微镜的单分子测序技术，例如LightSpeedGenomics(Sunnyvale,California)以及HalcyonMolecular(RedwoodCity,California)研发的那些单分子测序技术。
7)基于DNA聚合过程中释放的氢离子的检测的离子半导体测序。例如，IonTorrentSystems(SanFrancisco,California)以大规模并行的方式利用微机械孔的高密度阵列来实施这一生物化学过程。每个孔含有不同的DNA模板。孔下是离子敏感层，离子敏感层之下是专有离子传感器。
优选地，将DNA和RNA制备物用作NGS的起始材料。此类核酸可从样品如生物材料中容易地获得，例如从新鲜的、快速冷冻的或福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织(FFPE)或者从新鲜分离的细胞或者从患者外周血中存在的CTC中获得。可从正常的体细胞组织中提取正常的非突变的基因组DNA或RNA，然而在本发明的情况下优选生殖细胞。可从患有非血液恶性肿瘤的患者的外周血单核细胞(PBMC)中提取种系DNA或RNA。尽管从FFPE组织或新鲜分离的单细胞中提取的核酸是高度片段化的，但是它们适合NGS应用。
文献中描述了一些外显子组测序的针对性的NGS方法(为了回顾，参见例如TeerandMullikin2010:HumanMolGenet19(2),R145-51)，其全部可与本发明结合使用。这些方法中的许多(描述为例如基因组捕获、基因组分区、基因组富集等)利用杂交技术，并且包括基于阵列的杂交方法(例如Hodgesetal.2007:Nat.Genet.39,1522-1527)和基于液体的杂交方法(例如Choietal.2009:Proc.Natl.Acad.SciUSA106,19096-19101)。DNA样品制备的商业试剂盒和后续的外显子组捕获也是可获得的：例如，IlluminaInc.(SanDiego,California)提供TruSeqTMDNA样品制备试剂盒和外显子组富集试剂盒TruSeqTM外显子组富集试剂盒。
为了降低癌症特异的体细胞突变或序列差异检测中的假阳性结果的数量，当将例如肿瘤样品序列与参考样品序列如生殖细胞样品序列进行比较时，优选测定这些样品类型的一种或两种的复制序列。因此，优选地将参考样品的序列如生殖系样品的序列测定两次、三次或更多次。可选地或此外，将肿瘤样品的序列测定两次、三次或更多次。还可能通过至少测定一次基因组DNA序列和至少测定一次所述参考样品和/或所述肿瘤样品中的RNA序列来多次测定参考样品的序列(如生殖系样品的序列)和/或肿瘤样品的序列。例如，通过测定参考样品如生殖系样品的复制物之间的变化，可以估计作为统计量的假阳性(FDR)体细胞突变的预期速率。样品的技术重复应当产生相同结果，并且在该“相同与相同比较”中的任何检测的变化都是假阳性。特别地，为了测定肿瘤样品相对于参考样品的体细胞突变检测的错误发现率，可将参考样品的技术重复用作参考来估计假阳性的数量。此外，可利用机器学习方法将不同质量相关的度量标准(例如覆盖或SNP质量)与单一质量评分组合。对于给定的体细胞变异，可计算具有超出质量评分的所有其它变异，这使得能够在数据集中对所有变异进行排列。
在本发明的情况下，术语“RNA”涉及包含至少一个核糖核苷酸残基的分子，并且优选为全部或基本上由核糖核苷酸残基组成。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基团的2’-位点含有羟基基团的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(如部分或完全纯化的RNA)、基本纯化的RNA、合成RNA以及重组产生的RNA如修饰的RNA，其通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA。此类改变可包括非核苷酸物质的添加，如向RNA末端或内部的添加，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或者脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称作类似物或者天然存在的RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并优选涉及“mRNA”。术语“mRNA”意为“信使-RNA”并且涉及利用DNA模板产生的“转录本”，并编码肽或多肽。典型地，mRNA包含5’-UTR、蛋白编码区以及3’-UTR。mRNA在细胞中以及在体外仅具有有限的半衰期。在本发明的情况下，mRNA可由DNA模板的体外转录产生。体外转录方法学对技术人员是已知的。例如有各种市售的体外转录试剂盒。
根据本发明，可视需要改进RNA的稳定性和翻译效率。例如，可通过一种或多种具有稳定效果和/或增加翻译效率的RNA修饰来稳定化RNA并增强翻译。此类修饰描述于，例如PCT/EP2006/009448中，将其以引用的方式并入本文。为了增加根据本发明使用的RNA的表达，可对编码区进行修饰，即编码表达的肽或蛋白的序列，优选不改变表达的肽或蛋白的序列，以增加GC-含量，从而增强mRNA的稳定性以及实施密码子最优化，并因此增强细胞中的翻译。
在用于本发明的RNA的情况下，术语“修饰”包括在所述RNA中非天然存在的任何RNA修饰。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不含有未加帽的5'-三磷酸盐。可通过用磷酸酶处理RNA来实现此类未加帽的5'-三磷酸盐的移除。
根据本发明的RNA可含有修饰的核糖核苷酸以增加它的稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，用5-甲基胞嘧啶核苷部分或完全取代，优选完全取代胞嘧啶核苷。可选地或此外，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，用假尿苷部分或完全取代，优选完全取代尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及向RNA提供5’-帽子或5’-帽子类似物。术语“5’-帽子”指在mRNA分子5’-端发现的帽子结构，并且通常由通过不寻常的5’至5’三磷酸连接而连接至mRNA的鸟嘌呤核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟嘌呤核苷在7-位点是甲基化的。术语“常规的5’-帽子”指天然存在的RNA5’-帽子，优选指7-甲基鸟嘌呤核苷帽子(m7G)。在本发明的情况下，术语“5’-帽子”包括与RNA帽子结构类似的5’-帽子类似物，并对其进行修饰以具有稳定RNA和/或增强RNA翻译的能力(如果其上附有)，优选在体内和/或在细胞中。
提供具有5’-帽子或5’-帽子类似物的RNA可通过在所述5’-帽子或5’-帽子类似物存在的情况下，DNA模板的体外转录来实现，其中所述5’-帽子共转录并入产生的RNA链中，或者所述RNA可通过例如体外转录产生，并且可利用加帽酶，例如牛痘病毒的加帽酶在转录后将5’-帽子连接至RNA。
RNA可包含其它修饰。例如，用于本发明的RNA的其它修饰可以是天然存在的多聚(A)尾巴的延伸或截断或者是5’-或3’-非翻译区(UTR)的改变，如与所述RNA的编码区不相关的UTR的引入，例如存在的3’-UTR的改变或者一个或多个，优选来源于球蛋白基因(如α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白，优选β-球蛋白，更优选人β-球蛋白)的3’-UTR的两个拷贝的插入。
具有未掩蔽的多聚-A序列的RNA比具有掩蔽的多聚-A序列的RNA的转录更高效。术语“多聚(A)尾巴”或“多聚-A序列”涉及通常位于RNA分子3’-端的腺嘌呤(A)残基序列，“未掩蔽的多聚-A序列”意为在RNA分子3’端的多聚-A序列的末端为多聚-A序列的A并且除位于3’端的A之外在其之后，即多聚-A序列的下游，不含核苷酸。此外，约120个碱基对的长多聚-A序列产生最佳的RNA转录本稳定性和翻译效率。
因此，为了增强根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可进行修饰从而以与多聚-A序列相连的形式存在，多聚-A序列优选长度为10-500个，更优选30-300个，甚至更优选65-200个，并且特别是100-150个腺苷残基。在特别优选的实施方案中，多聚-A序列的长度为约120个腺苷残基。为了进一步增强根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，多聚-A序列可以是未掩蔽的。
此外，将3’-非翻译区(UTR)并入RNA分子的3’-非翻译区可导致翻译效率的提高。通过并入两个或更多个此类3’-非翻译区可以实现协同效应。3’-非翻译区与其引入的RNA可以是自体的或者是异源的。在一个具体实施方案中，3’-非翻译区来源于人β-球蛋白基因。
上文所述修饰的组合，即多聚-A序列的并入、多聚-A序列的未掩蔽以及一个或多个3’-非翻译区的并入的组合，对RNA的稳定性和翻译效率的增强有协同影响。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的半衰期。“半衰期”涉及清除活性、量或分子数量的一半所需的时间段。在本发明的情况下，RNA的半衰期显示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可影响RNA“表达的持续”。可期望的是，具有长半衰期的RNA会表达延长的时期。
当然，如果根据本发明希望降低RNA的稳定性和/或翻译效率，可以对RNA进行修饰以干扰如上文所述的增强RNA的稳定性和/或翻译效率的元件的功能。
根据本发明使用的术语“表达”是其最常用的含义，并且包括RNA和/或肽、多肽或蛋白的产生，例如通过转录和/或翻译。关于RNA，术语“表示”或“翻译”特别涉及肽、多肽或蛋白的产生。它还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或是稳定的。
根据本发明，术语表达还包括“异常表达(aberrantexpression)”或“异常表达(abnormalexpression)”。“异常表达(aberrantexpression)”或“异常表达(abnormalexpression)”意为根据本发明，表达被改变，优选与参考相比表达增加，例如与未患有与某种蛋白(例如肿瘤抗原)的异常(aberrant)或异常(abnormal)表达有关的疾病的对象的状态相比。表达增加指至少10％的增加，特别是至少20％，至少50％或至少100％或更多的增加。在一个实施方案中，表达仅存在于病变组织中，而在健康组织中的表达被抑制。
术语“特异表达的”意为蛋白基本上仅在特定的组织或器官中表达。例如，在胃粘膜中特异表达的肿瘤抗原意为所述蛋白主要在胃粘膜中表达，并且不在其它组织中表达或者在其它组织或器官类型中不能表达至显著程度。因此，仅在胃粘膜细胞中表达并且在任何其他组织如睾丸中表达程度明显较低的蛋白是在胃粘膜细胞中特异表达的蛋白。在一些实施方案中，在正常条件下，肿瘤抗原在多种组织类型或器官中也可能是特异表达的，如在2种或3种组织类型或器官中，但是优选在不多于3种不同的组织或器官类型中。在这种情况下，然后肿瘤抗原在这些器官中特异地表达。例如，如果在正常条件下，肿瘤抗原优选在肺和胃中表达至大约等同的程度，则所述抗原在肺和胃中是特异表达的。
在本发明的情况下，术语“转录”涉及DNA序列中的遗传密码转录为RNA的过程。随后，RNA可以翻译为蛋白。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及在无细胞系统中体外合成RNA特别是mRNA的过程，优选利用合适的细胞提取物。优选地，将克隆载体用于转录本的产生。通常将这些克隆载体指定为转录载体，并且根据本发明包含于术语“载体”中。根据本发明，用于本发明的RNA优选为体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可通过合适的DNA模板的体外转录获得。控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例为T7、T3和SP6RNA聚合酶。优选地，根据本发明体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可通过核酸特别是cDNA克隆获得，并将其引入合适的用于体外转录的载体中。可通过RNA反转录获得cDNA。
根据本发明术语“翻译”涉及细胞核糖体中信使RNA链指导氨基酸序列装配以产生肽、多肽或蛋白的过程。
根据本发明，可与核酸功能上相连的表达控制序列或调节序列，与所述核酸可以是同源的或异源的。如果编码序列受调节序列的控制或者受调节序列的影响，则编码序列和调节序列“功能上”连接在一起。如果编码序列将被翻译为功能性蛋白，伴随着调节序列与编码序列功能上相连，调节序列的诱导导致编码序列的转录，而不引起编码序列的阅读框移位或者不引起编码序列不能翻译为期望的蛋白或肽。
根据本发明，术语“表达控制序列”包括启动子、核糖体结合序列以及控制核酸转录或获得的RNA的翻译的其它控制元件。在本发明的某些实施方案中，可控制调节序列。调节序列的精确结构可根据物种或根据细胞类型而改变，但通常包含涉及转录或翻译的起始的5’-未转录序列以及5’-和3’-未翻译序列，如TATA-框、加帽序列、CAAT序列等。特别地，5’-未转录调节序列包含含有功能结合基因转录控制的启动子序列的启动子区。调节序列也可包含增强子序列或上游激活子序列。
优选地，根据本发明，将在细胞中表达的RNA引入所述细胞。在根据本发明方法的一个实施方案中，通过合适的DNA模板的体外转录获得将被引入细胞的RNA。
根据本发明，在本文中术语如“能够表达……的RNA”和“编码……的RNA”可互换使用，并且关于具体的肽或多肽，意为如果存在于合适的环境中，优选在细胞中，RNA能够表达从而产生所述肽或多肽。优选地，根据本发明RNA能够与细胞翻译机制相互作用，从而提供它能够表达的肽或多肽。
在本文中术语如“转移(transferring)”、“引入(introducing)”或“转染(transfecting)”可互换使用，并且涉及向细胞引入核酸，特别是外源的或异源的核酸，特别是RNA。根据本发明，细胞可形成器官、组织和/或有机体的一部分。根据本发明，核酸的施用通过裸露的核酸或与施用试剂组合来实现。优选地，以裸露的核酸的形式施用核酸。优选地，将RNA与稳定物质如RNA酶抑制剂组合施用。本发明还预想向细胞重复引入核酸以允许持续表达延长的时间。
可用RNA可与之相连的任何载体转染细胞，例如通过与RNA形成复合体或者形成媒介物，其中RNA是封闭的或是被包封的，这导致与裸露的RNA相比，RNA的稳定性增加。根据本发明可用的载体包括，例如含有脂质的载体，如阳离子脂质(阳离子脂质)、脂质体、阳离子脂质体和胶束以及纳米颗粒。阳离子脂质可与带负电荷的核酸形成复合体。根据本发明可使用任何阳离子脂质。
优选地，将编码肽或多肽的RNA引入细胞，特别是引入体内存在的细胞，导致所述肽或多肽在细胞内表达。在具体实施方案中，优选靶向具体细胞的核酸。在此类实施方案中，应用于向细胞施用核酸的载体(例如逆转录病毒或脂质体)显示目标分子。例如，可将靶细胞上的表面膜蛋白特异的分子(如抗体)或靶细胞上的受体的配体并入核酸载体或者可与其结合。在通过脂质体施用核酸的情况下，可将与内吞作用相关表面膜蛋白结合的蛋白并入脂质体制剂，从而能够靶向和/或摄取。此类蛋白包含对特定细胞类型特异的衣壳蛋白片段、针对内化蛋白的抗体、靶向细胞内位点的蛋白等。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选完整的细胞，即具有还未释放其正常的细胞内组分如酶、细胞器或遗传物质的完整膜的细胞。完整的细胞优选活细胞，即能够行使其正常的代谢功能的活细胞。根据本发明，所述术语优选涉及可用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明，术语“细胞”包括原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、HEK293细胞、HELA细胞、酵母细胞以及昆虫细胞)。外源核酸在细胞内可能以下述形式存在(i)自由分散的，(ii)并入重组载体，或(iii)整合进宿主细胞基因组或线粒体DNA。特别优选哺乳动物细胞，如来自人、小鼠、仓鼠、猪、羊以及灵长类的细胞。细胞可来源于多种组织类型，并且包括原代细胞和细胞系。具体实例包括角质细胞、外周血淋巴细胞、骨髓干细胞以及胚胎干细胞。在其它实施方案中，细胞为抗原递呈细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达由所述核酸编码的肽或多肽。
术语“克隆扩增”指特定实体增多的过程。在本发明的情况下，该术语优选用于淋巴细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特定淋巴细胞扩增的免疫应答的情况。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化。
术语如“降低”或“抑制”涉及引起水平整体降低，优选降低5％或更多，10％或更多，20％或更多，更优选50％或更多并且最优选75％或更多的能力。术语“抑制”或类似的短语包括完全或基本完全抑制，即降低至零或基本降低至零。
术语如“增加”、“增强”、“促进”或“延长”优选涉及增加、增强、促进或延长约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少80％，优选至少100％，优选至少200％，并且特别是至少300％。这些术语也可涉及从零或者不可测量或不可检测水平增加、增强、促进或延长至多于零的水平或者至可测量或可检测的水平。
本发明提供基于通过本发明的方法预测为是免疫原性的氨基酸修饰或修饰的肽来设计的疫苗，如癌症疫苗。
根据本发明，术语“疫苗”涉及药物制剂(药物组合物)或产品，其在施用时诱导识别并攻击抗原或病变细胞如癌症细胞的免疫应答，特别是细胞免疫应答。疫苗可用于疾病的预防或治疗。术语“个性化癌症疫苗(personalizedcancervaccine)”或“个性化癌症疫苗(individualizedcancervaccine)”涉及具体癌症患者，其意为适用于个体癌症患者的需要或特殊情况的癌症疫苗。
在一个实施方案中，根据本发明提供的疫苗可包含肽或多肽或者编码所述肽或多肽的核酸，优选RNA，其中所述修饰或修饰的肽含有通过本发明的方法预测为是免疫原性的一种或多种氨基酸修饰或者一种或多种修饰的肽。
根据本发明提供的癌症疫苗，当向患者施用时，提供适合刺激、起始和/或扩增患者肿瘤特异的T细胞的一种或多种T细胞表位。T细胞优选针对表达T细胞表位来源于的抗原的细胞。因此，本文所述的疫苗优选能够引起或促进针对以由I类MHC递呈一种或多种肿瘤相关新抗原为特征的癌症的细胞应答，优选细胞毒性T细胞活性。由于根据本发明提供的疫苗靶向癌症特异的突变，因此其对患者肿瘤是特异的。
根据本发明提供的疫苗涉及疫苗，当向患者施用所述疫苗时，优选提供一种或多种T细胞表位，如2种或更多种，5种或更多种，10种或更多种，15种或更多种，20种或更多种，25种或更多种，30种或更多种，并且优选高至60种，高至55种，高至50种，高至45种，高至40种，高至35种或高至30种T细胞表位，其合并有通过本发明的方法预测为是免疫原性的氨基酸修饰或修饰的肽。在本文中此类细胞表位也被称为“新表位”。这些表位通过患者的细胞特别是抗原递呈细胞的递呈，当与MHC结合时优选导致靶向所述表位的T细胞，因此患者的肿瘤优选原发性肿瘤以及肿瘤转移，表达所述T细胞表位来源的抗原，并递呈肿瘤细胞表面上的相同表位。
本发明的方法可包括测定鉴定的氨基酸修饰或修饰的肽在癌症疫苗中的可用性的其它步骤。因此其它步骤可包括下述中的一种或多种：(i)评估修饰是否位于已知的或预测的MHC递呈的表位内；(ii)体外和/或电脑模拟测试修饰是否位于MHC递呈的表位内，例如测试修饰是否是处理为和/或以MHC递呈的表位所递呈的肽序列的一部分；和(iii)体外测试预想的修饰的表位，特别是当以其天然序列存在时，例如当侧翼连接有在天然存在的蛋白中也在其侧翼连接的表位的氨基酸序列时，以及当表达于抗原递呈细胞时，是否能够刺激T细胞如具有期望的特异性的患者的T细胞。每条此类侧翼序列可包含3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个，并优选高至50个，高至45个，高至40个，高至35个或高至30个氨基酸，以及可在N-端和/或C-端侧翼连接有表位序列。
可将根据本发明测定的修饰的肽根据其作为癌症疫苗表位的可用性进行排列。因此，一方面，本发明的方法包括手工或基于计算机的分析过程，其中对鉴定的修饰的肽进行分析并选择其在各自提供的疫苗中的可用性。在优选实施方案中，所述分析过程是基于计算算法的过程。优选地，所述分析过程包括根据表位的免疫原性能力的预测确定表位和/或对其进行排列。
根据本发明鉴定的以及由本发明的疫苗所提供的新表位优选以包含所述新表位的多肽的形式存在，如多表位多肽或编码所述多肽的核酸，特别是RNA。此外，新表位可以以疫苗序列的形式存在于多肽中，即存在于其天然序列环境中，例如侧翼连接有在天然存在的蛋白中与所述表位侧翼连接的氨基酸序列。每条此类侧翼序列可包含5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个，并且优选高至50个、高至45个、高至40个、高至35个或高至30个氨基酸，以及可以在N-端和/或C-端侧翼连接有表位序列。因此，疫苗序列可包含20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个，并优选高至50个、高至45个、高至40个、高至35个或高至30个氨基酸。在一个实施方案中，新表位和/或疫苗序列在多肽中按头-至-尾排列。
在一个实施方案中，新表位和/或疫苗序列由连接子隔开，特别是中性连接子。根据本发明术语“连接子”涉及在两个肽结构域如表位或疫苗序列之间添加的用于连接所述肽结构域的肽。关于连接子序列没有特别的限制。然而，优选的是，连接子序列降低两个肽结构域之间的空间位阻，被很好地翻译，并且支持或允许处理所述表位。此外，连接子应当不含免疫原性的序列元件或仅含有较低免疫原性的序列元件。连接子优选不应产生可能产生非期望的免疫反应的(如邻近的新表位之间的连接缝合产生的那些)非内源的新表位。因此，多表位疫苗应当优选含有能够降低非期望的NHC结合连接表位数量的连接子序列。Hoyt等人(EMBOJ.25(8),1720-9,2006)和Zhangetal.(J.Biol.Chem.,279(10),8635-41,2004)已经显示富含甘氨酸的序列损害蛋白酶体处理，因此富含甘氨酸的连接子序列的应用将可被蛋白酶体处理的包含连接子的肽的数量最小化。此外，观察到甘氨酸可抑制MHC结合槽位点内的强结合(Abastadoetal.,J.Immunol.151(7),3569-75,1993)。Schlessinger等人(Proteins,61(1),115-26,2005)已经发现氨基酸序列中包含的甘氨酸和丝氨酸导致产生更高效地被翻译和被蛋白酶体处理的更灵活的蛋白，使得能够更好地接近编码的新表位。每个连接子可包含3个或更多个、6个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个，并且优选高至50个，高至45个，高至40个，高至35个或高至30个氨基酸。优选地，连接子富含甘氨酸和/或丝氨酸。优选地，连接子的氨基酸中至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或者至少95％是甘氨酸和/或丝氨酸。在一个优选实施方案中，连接子基本由甘氨酸和丝氨酸组成。在一个实施方案中，连接子包含氨基酸序列(GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e，其中a、b、c、d和e是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数字，并且其中a+b+c+d+e不为0且优选为2或更多、3或更多、4或更多、或者5或更多。在一个实施方案中，连接子包含含有实例中所述的连接子序列如序列GGSGGGGSG的如本文所述的序列。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明，将合并有一种或多种新表位的多肽如多表位多肽以核酸的形式向患者施用，优选RNA，如体外转录或合成的RNA，其可在患者细胞如抗原递呈细胞中表达以产生所述多肽。本发明还预想一种或多种多表位多肽的施用，为了本发明的目的，其包含术语“多表位多肽”，优选以核酸的形式施用，优选RNA如体外转录或合成的RNA，其可在患者细胞如抗原递呈细胞中表达以产生一种或多种多肽。在施用多种多表位多肽的情况下，由不同多表位多肽提供的新表位可以不同或部分重叠。一旦存在于患者的细胞如抗原递呈细胞中，根据本发明处理多肽以产生根据本发明鉴定的新表位。施用根据本发明提供的疫苗可提供MHCII类递呈的表位，所述表位能够引起针对表达MHC递呈表位的来源抗原的细胞的CD4+辅助性T细胞应答。可选地或此外，施用根据本发明提供的疫苗可提供MHCI类递呈的表位，所述表位能够引起针对表达MHC递呈表位的来源抗原的细胞的CD8+T细胞应答。此外，施用根据本发明提供的疫苗可提供一种或多种新表位(包括已知的新表位和根据本发明鉴定的新表位)以及不包含癌症特异的体细胞突变但由癌细胞表达的并且优选诱导针对癌细胞的免疫应答(优选癌症特异的免疫应答)的一种或多种表位。在一个实施方案中，施用根据本发明提供的疫苗提供新表位，所述新表位是MHCII类递呈的表位和/或能够引起针对表达MHC递呈表位的来源抗原的细胞的CD4+辅助性T细胞应答，以及提供不包含癌症特异的体细胞突变的表位，所述表位是MHCI类递呈的表位和/或能够引起针对表达MHC递呈表位的来源抗原的细胞的CD8+T细胞应答。在一个实施方案中，不包含癌症特异的体细胞突变的表位来源于肿瘤抗原。在一个实施方案中，新表位和不包含癌症特异的体细胞突变的表位在癌症的治疗中具有协同效应。优选地，根据本发明提供的疫苗适用于细胞毒性T细胞和/或辅助性T细胞应答的多表位刺激。
根据本发明提供的疫苗可以是重组疫苗。
在本发明的情况下术语“重组的”意为“通过基因工程产生的”。优选地，在本发明的情况下，“重组实体”如重组多肽不是天然存在的，并且优选是将天然状态下不组合的实体如氨基酸或核酸组合的结果。例如，在本发明的情况下重组多肽可包含数个氨基酸序列，如来源于融合在一起(例如通过肽键或合适的连接子)的不同蛋白或相同蛋白的不同部分的新表位或疫苗序列。
本文使用的术语“天然存在的”指的是对象可天然存在的事实。例如，存在于有机体(包括病毒)中的，可从天然来源中分离的，并且还未被实验人员有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
可使用本文所述的试剂、组合物和方法来治疗患有疾病的对象，例如以表达抗原的病变细胞的存在和抗原片段的递呈为特征的疾病。特别优选的疾病是癌症。还可将本文所述的试剂、组合物和方法用于免疫或疫苗接种，从而预防本文所述的疾病。
根据本发明，术语“疾病”指任何病理状态，包括癌症，特别是本文所述的那些形式的癌症。
术语“正常的”指健康对象或组织的健康状态或状况，即，非病理状况，其中“健康的”优选指非癌的。
根据本发明，“涉及表达抗原的细胞的疾病”意为在病变的组织或器官的细胞中检测到了抗原的表达。在病变的组织或器官的细胞中的表达与健康组织或器官中的状态相比可以是增加的。增加指增加至少10％，特别是至少20％，至少50％，至少100％，至少200％，至少500％，至少1000％，至少10000％或者甚至更多。在一个实施方案中，表达仅发现于病变的组织中，而在健康组织中的表达被抑制。根据本发明，包含表达抗原的细胞或与表达抗原的细胞有关的疾病包括癌症。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”指细胞(称为赘生性细胞、肿瘤产生细胞或肿瘤细胞)的异常生长，优选形成肿胀或病变。“肿瘤细胞”意为通过快速、不受控制的细胞增殖来生长，并且在起始新生长停止的刺激之后继续生长的异常细胞。肿瘤显示部分或完全丧失正常组织的结构性组织(structuralorganization)和功能性协调(functionalcoordination)的，并且通常形成分离的组织块，其可以是良性的、恶变前的或是恶性的。
癌症(医学术语：恶性肿瘤)是一组细胞表现出不受控制的生长(分裂超出正常限制)，侵袭(邻近组织的侵入和破坏)以及有时转移(经由淋巴或血液扩散至身体的其它部位)的一类疾病。癌症的这三个恶性特性将它们与自限的且不侵袭或转移的良性肿瘤区分开来。大部分癌症形成肿瘤，但是一些如白血病不形成肿瘤。恶性肿瘤(Malignancy)、恶性肿瘤(malignantneoplasm)以及恶性肿瘤(malignanttumor)与癌症基本同义。
肿瘤(neoplasm)是瘤形成(neoplasia)导致的异常组织块。瘤形成(希腊语中的新生长)是细胞的异常增殖。细胞的生长超过周围的正常组织并且与其周围的正常组织不协调。甚至即使在刺激停止之后，所述生长继续以相同的过度方式进行。它通常引起肿块或肿瘤。肿瘤可以是良性的、恶变前的或是恶性的。
根据本发明“肿瘤的生长”或“肿瘤生长”涉及肿瘤增加其大小的趋势和/或肿瘤细胞增殖的趋势。
为了本发明的目的，术语“癌症”和“癌症疾病”与术语“肿瘤”和“肿瘤疾病”可互换使用。
根据类似肿瘤的细胞的类型以及假定的肿瘤起源的组织将癌症进行分类。它们分别是组织学和部位。
根据本发明术语“癌症”包括癌(carcinomas)、腺癌、胚细胞瘤、白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经胚细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌(lymphnodecancer)、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌以及它们的转移。它们的实例为肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌或者以上所述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明术语癌症还包括癌症转移和癌症复发。
通过“转移”意为癌细胞从其原始部位向身体其它部分的扩散。转移的形成是十分复杂的过程，并且依赖于恶性细胞从原发性肿瘤的分离，细胞外基质的侵袭，渗透内皮基膜进入体腔和血管，然后在被血液运输之后，靶器官的渗入。最后，新肿瘤即继发性肿瘤或转移性肿瘤在目标部位的生长依赖于血管发生。肿瘤转移经常发生，甚至发生在移除原发性肿瘤之后，因为肿瘤细胞或组分可残留并发展转移潜力。在一个实施方案中，根据本发明术语“转移”涉及“远距离转移”，其涉及远离原发性肿瘤和局部淋巴结系统的转移。
继发性肿瘤或转移性肿瘤的细胞同原始肿瘤中的那些细胞一样。这意味着，例如如果卵巢癌转移至肝脏，继发性肿瘤由异常的卵巢细胞组成，而非由异常的肝脏细胞组成。然后将肝脏中的肿瘤称为转移性卵巢癌，而非肝癌。
术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”涉及从原发性肿瘤或肿瘤转移中分离并在血液中循环的细胞。CTC可构成其它肿瘤(转移)在不同组织中的后续生长的种子细胞。患有转移性疾病的患者中循环肿瘤细胞发现的频率为大约每mL全血1-10个CTC。已经发展出了分离CTC的研究方法。本领域已经描述了一些研究方法以分离CTC，例如应用上皮细胞通常表达正常血细胞中不存在的细胞粘附蛋白EpCAM这一事实的技术。基于免疫磁珠的捕获包括用与磁性颗粒连接的EpCAM抗体处理血液样本，然后在磁场中分离标记的细胞。然后用另一上皮标志物细胞角蛋白以及常见的白细胞标志物CD45的抗体将分离的细胞染色，从而将少量的CTC与污染性的白血细胞区分开。该稳健和半自动化的方法以约1个CTC/mL的平均收率以及0.1％的纯度识别CTC(Allardetal.,2004:ClinCancerRes10,6897-6904)。分离CTC的第二种方法利用基于微流体的CTC捕获装置，其包括使全血流经嵌有80,000个微球的室，通过用EpCAM抗体包被所述微球而将其功能化。然后用针对细胞角蛋白或组织特异的标记物(如前列腺癌中的PSA或乳腺癌中的HER2)的第二抗体将CTC染色，以及通过在多个平面沿三维坐标对微球进行自动扫描以可视化。CTC-芯片能够识别患者中的细胞角蛋白阳性的循环肿瘤细胞，其平均收率为50个细胞/ml，纯度范围为1–80％(Nagrathetal.,2007:Nature450,1235-1239)。分离CTC的另外可能性是利用Veridex,LLC(Raritan,NJ)的CellSearchTM循环肿瘤细胞(CTC)检测，其捕获、识别和计数管内血液中CTC。CellSearchTM系统是美国食品与药品监督管理局(FDA)批准的用于全血中CTC计算的方法，其基于免疫磁性标记与自动数字显微镜的组合。在文献中描述了其它分离CTC的方法，其全部可与本发明连同使用。
当人再次受过去对其造成影响的情况影响时，发生复发(relapse)或复发(recurrence)。例如，如果患者遭受过肿瘤疾病，接受过对所述疾病的成功治疗，并再次患有所述疾病，则可将所述新患有的疾病看做复发(relapse)或复发(recurrence)。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发(relapse)或复发(recurrence)可能但不必须发生在原始肿瘤疾病部位。因此，例如如果患者遭受了卵巢肿瘤并已经接受了成功的治疗，则复发(relapse)或复发(recurrence)可能是卵巢肿瘤或肿瘤在不同于卵巢的部位的发生。肿瘤的复发(relapse)或复发(recurrence)还包括肿瘤在不同于原始肿瘤部位的部位以及在原始肿瘤部位发生的情况。优选地，患者已经接受过治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，位于不同于原始肿瘤部位的部位的肿瘤是继发性肿瘤或转移性肿瘤。
通过“治疗”意为向对象施用如本文所述的化合物或组合物以预防或清除疾病，包括降低对象中肿瘤的大小或数量；预防或减缓对象的疾病；抑制或减缓对象中新疾病的发展；降低当前患有疾病或先前曾经患有疾病的对象的症状和/或复发的频率和严重性；和/或延长，即增加对象的寿命。特别地，术语“疾病治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、预防、减缓或抑制进程或恶化，或者预防或延缓疾病或其症状的发作。
通过“处于……的风险”意为对象，即患者被鉴定为，与一般人群相比，其患疾病特别是癌症的可能性高于正常可能性。此外，曾经患有或当前患有疾病特别是癌症的对象是患疾病的可能性增加的对象，因为此类对象可能继续患有疾病。当前患有或曾经患有癌症的对象，其癌症转移的可能性也增加。
术语“免疫疗法”涉及包括特异性免疫反应激活的治疗。在本发明的情况下，术语如“保护”、“预防”、“预防性的”、“防止性的”或“保护性的”涉及对象的疾病的预防或治疗或者发生和/或传播这两项，特别地，以将患者患病的可能性最小化或者延缓疾病的发展。例如，如上文所述的处于患癌症风险的人是预防癌症的治疗的候选人。
免疫疗法的预防性施用，例如本发明的疫苗的预防性施用，优选地保护接受者不患疾病。免疫疗法的治疗性施用，例如，本发明的疫苗的治疗性施用可导致疾病发展/生长的抑制。这包括减缓疾病的发展/生长，特别是破坏疾病的发展，其优选导致疾病的清除。
可采用各种技术中的任何技术来实施免疫疗法，其中本文提供的试剂的功能是从患者中移除病变细胞。此类移除可由于增强或诱导患者的对抗原或表达抗原的细胞具有特异性的免疫应答而发生。
在某些实施方案中，免疫疗法可以是主动免疫疗法，其中治疗依赖于免疫应答-修饰剂(如本文所述的多肽和核酸)的施用对内源性宿主免疫系统的体内刺激，从而针对病变细胞发生作用。
本文提供的试剂和组合物可单独使用或者与常规的治疗方案如手术、放射、化学治疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、异基因的或者不相关的)组合使用。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述了治疗对象的过程，其目的是为治疗或预防的原因诱导免疫应答。
术语“体内”涉及对象内部的位置。
术语“对象”、“个体”、“有机体”或“患者”可互换使用，并且涉及脊椎动物，优选哺乳动物。例如，在本发明的情况下哺乳动物是人，非人的灵长类，家养动物如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等，实验用动物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，以及圈养动物如动物园中的动物。本文使用的术语“动物”也包括人。术语“对象”也可包括患者，即动物，优选患有优选如本文所述的疾病的人。
使用术语“自体”来描述来源于同一对象的任何事物。例如，“自体移植”指来源于同一对象的组织或器官移植。此类方案是有利的，因为它们克服了否则会导致排斥的免疫屏障。
使用术语“异源的”来描述由多种不同的元件组成的事物。作为实例，将一个个体的骨髓移植进不同个体就构成了异源移植。异源基因是来源于所述对象之外的来源的基因。
作为用于免疫或疫苗接种的组合物的部分，优选将本文所述的一种或多种试剂与一种或多种佐剂共同施用，以诱导免疫应答或增加免疫应答。术语“佐剂”涉及延长或增强或促进免疫应答的化合物。优选在不添加佐剂的情况下发挥本发明的组合物的作用。但是，本发明的组合物可含有任何已知的佐剂。佐剂包括一组异质性的化合物如油乳剂(例如弗氏佐剂)、无机化合物(如明矾)、细菌产物(如百日咳杆菌(Bordetellapertussis)毒素)、脂质体以及免疫刺激复合物。佐剂的实例是单磷酰脂质A(MPLSmithKlineBeecham)。皂苷如QS21(SmithKlineBeecham)、DQS21(SmithKlineBeecham；WO96/33739)、QS7、QS17、QS18以及QS-L1(Soetal.,1997,Mol.Cells7:178-186)，弗氏不完全佐剂，弗式完全佐剂，维生素E，montanid，明矾，CpG寡核苷酸(Kriegetal.,1995,Nature374:546-549)，以及从生物可降解的油类中制备的不同的油包水乳剂如角鲨烯和/或生育酚。
也可施用刺激患者免疫应答的其它物质。可能的是，例如由于细胞因子对淋巴细胞的调节特性，在疫苗接种中使用细胞因子。此类细胞因子包括，例如白介素-12(IL-12)、GM-CSF以及IL-18，其中白介素-12显示增加疫苗的保护作用(cf.Science268:1432-1434,1995)。
存在许多增强免疫应答的化合物，因此可将其用于疫苗接种中。所述化合物包括以蛋白或核酸形式提供的共刺激分子如B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)。
根据本发明，身体样品可以是组织样品，包括体液和/或细胞样品。此类身体样品可以由常规方式获得如通过活体组织检查，包括钻取活体组织检查，以及通过获得血液、支气管抽吸物、痰、尿、粪便或其它体液。根据本发明，术语“样品”还包括处理的样品如生物样品的碎片或分离物，例如核酸或细胞分离物。
试剂如本文所述的疫苗和组合物可经由任何常规的途径来施用，包括通过注射或灌输。施用可以通过例如，口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或经皮来实施。在一个实施方案中，施用可以结节内实施，如通过向淋巴结内注射来实施。其它施用形式设想用本文所述的核酸体外转染抗原递呈细胞如树突细胞，然后施用所述抗原递呈细胞。
以有效量施用本文所述的试剂。“有效量”指单独或与其它剂量共同达到期望的反应或期望的效果的量。在具体疾病或具体病况的治疗的情况下，期望的反应优选涉及疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的发展，以及特别地，阻断或逆转疾病的发展。疾病或病况治疗中的期望反应还可以是延缓或预防所述疾病或所述病况的发作。
本文所述试剂的有效量取决于待治疗的病况，疾病的严重性，患者的个体参数包括年龄、生理状况、尺寸和重量，治疗持续时间，伴随治疗的类型(如果存在)，具体给药途径以及类似的因素。因此，本文所述试剂的施用剂量可能取决于不同的此类参数。在初始剂量在患者中引起的反应不足的情况下，可使用更高剂量(或者通过不同的、更局部化的给药途径实现的有效更高剂量)。
本文所述的药物组合物优选是无菌的，并且含有有效量的治疗活性物质，从而产生期望的反应或期望的效果。
本文所述的药物组合物通常以药学可相容的量以及药学可相容的制剂施用。术语“药学可相容的”指不与药物组合物中的活性组分的功能相互作用的无毒物质。该种制剂通常可含有盐、缓冲物质、防腐剂、载体、补充性免疫增强物质如佐剂(例如CpG寡核苷酸、细胞因子、趋化因子、皂苷、GM-CSF和/或RNA)以及合适的其它治疗活性化合物。当用于药物时，所述盐应当是药学可相容的。然而，可将非药学可相容的盐用于制备药学可相容的盐，并且其包含于本发明中。该种药理学和药学可相容的盐以非限制性的方式包括从下述酸中制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、顺丁烯二酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。还可将药学可相容的盐制备为碱性金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。
本文所述的药物组合物可包含药学可相容的载体。术语“载体”指天然的或合成的有机或无机组分，其中将活性组分组合以促进应用。根据本发明，术语“药学可相容的载体”包括适于向患者施用的一种或多种可相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。本发明的药物组合物的组分通常不发生显著削弱期望的药物功效的相互作用。
本文所述的药物组合物可包含合适的缓冲物质如醋酸盐、柠檬酸、硼酸盐和磷酸盐。
药物组合物还可适当地包含合适的防腐剂，如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
药物组合物通常以统一的剂型提供，并且可用本身已知的方式来制备。本发明的药物组合物可以是例如胶囊、片剂、锭剂、溶液、悬液、糖浆剂、酏剂的形式或者是乳剂的形式。
适于肠胃外给药的组合物通常包含活性化合物的无菌水性或非水性制剂，其优选与接受者的血液是等张的。可相容的载体和溶剂的实例是林格氏液和等张氯化钠溶液。此外，通常将无菌的固定油用作溶液或悬液介质。
通过下文的图和实施例对本发明进行详细描述，其仅用于示例说明的目的，并且不具有限制意义。由于描述和实例，本发明包含的其它实施方案对技术人员而言是可用的。
附图
图1.MHC结合预测综述。
图2.作为50个优化的B16F10突变和82个优化的CT26.WT突变(总共132个突变)的Mmut评分的函数的免疫原性分析，其中30个是免疫原性的。用RNA实施所有的疫苗接种。对于B16F10，通过用RNA激发BMDC来分析免疫原性，以及用ELISPOT和FACS测量脾细胞的免疫应答。对于CT26.WT，通过分别用RNA和肽激发BMDC来分析免疫原性，以及用ELISPOT测量脾细胞的免疫应答；如果肽或RNA引起免疫应答，则认为突变是免疫原性的。免疫原性突变的累积分布是Mmut评分的函数。图表显示了低于给定Mmut评分的突变的总量(红色)、这些突变中免疫原性突变的数量(蓝色)以及免疫原性突变在总突变中的百分数(黑色)。B下述范围：≤0.3、(0.3,1]、>1的每个Mmut库的免疫原性突变百分数的直方图。显示的误差是标准误差。
图3.作为Mmut的函数的B16F10和CT26.WT免疫原性分析。免疫原性突变的累积分布是B16(A)以及CT26(C)的Mmut评分的函数。B16(B)以及CT26(D)的下述范围：[0.1,0.3]、(0.3,1]、(1,∞)的每个Mmut库的免疫原性突变百分数的直方图。图A和B基于对50个B16F10优先化突变进行的分析，其中12个是免疫原性的。图C和D基于对82个B16F10优先化突变进行的分析，其中30个是免疫原性的。更多细节参见图2的说明。误差是标准误差。
图4.免疫原性与对照假说模型。用HA表示的I类免疫原性假定WT和MUT表位都由细胞递呈，以及突变足以改变氨基酸的物理化学特性，以使免疫系统记录该变化并产生免疫应答(用闪电球表示)。作为HA对照的Hn假说仅仅是HA假说的相反情况，即突变未显著改变氨基酸的物理化学特性，因此被免疫系统“检测”到并产生免疫应答的可能性较低。在II类免疫原性(HBUHC)中，WT表位未被递呈，但是MUT表位被递呈。分别通过高(T>τ)比低(T≤τ)T评分来区分HB和HC。注意对于α*＝α，免疫原性的HBC1模型(Mmut<β)是所有四组的复合：HBC1＝U[HA,HB,HC,Hn]。
图5.T评分与免疫原性的假设关系。根据I类免疫原性模型，在T细胞发育过程中，与野生型表位强结合的TCR被清除。现存的TCR应当仅显示与野生型表位的弱结合亲和力或无结合亲和力(A)。含有具有高T评分的氨基酸取代的表位与野生型氨基酸具有类似的物理化学特性，因此可能对与现存的TCR的结合的影响很小(B)。含有具有T评分的氨基酸取代的表位，具有更大的增加与现存的TCR的结合亲和力的可能性，因此具有更大的成为免疫原性的可能性(C)。在该示意图中，采用颜色编码来将T细胞与匹配的肽配对。橘黄色/黄色突变表示具有高T评分的突变(与WT类似)，而蓝色/紫色突变表示具有低T评分的突变(与WT相比具有显著的物理化学差异)。
图6.作为Mmut的函数的免疫原性突变的累积分布。A满足本底对照假说HBC1：{Mmut≤β}的免疫原性突变百分数与满足部分假说HA’：HBC1∩{T≤τ}、部分假说HBC2：HBC1∩{Mmut≤α}以及完全假说HA：HBC1∩{Mmut≤α}∩{T≤τ}的免疫原性突变百分数的比较，α＝1，τ＝1.。B满足对照假说HBC1：{Mmut≤β}的免疫原性突变百分数与满足相反部分假说：HBC1∩{T＞τ}和HBC1∩{Mmut＞α}的免疫原性突变百分数的比较。A和B中的分析基于包含132个突变的合并的B16F10和CT26.WT数据集，其中30个是免疫原性的。图表中的每个数据点基于≥4个突变。
图7.作为Mmut评分的函数的免疫原性突变的累积分布。满足本底对照假说HBC1:{Mmut≤β}的免疫原性突变百分数与满足部分假说HA’：HBC1∩{T≤τ}、部分假说HBC2：HBC1∩{Mmut≤α}以及完全假说HA：HBC1∩{Mmut≤α}∩{T≤τ}的免疫原性突变百分数的比较，对于B16(A)以及CT26(C)，给定α＝1，τ＝1。B16(B)与CT26(D)中，满足本底对照假说HBC1：{Mmut≤β}的免疫原性突变百分数与满足相反部分假说：HBC1∩{T＞τ}和HBC1∩{Mmut＞α}的免疫原性突变百分数的比较。
图A和B基于对50个B16F10优先化突变的分析，其中12个是免疫原性的。图C和D基于82个B16F10优先化突变，其中30个是免疫原性的。图表中的每个数据点基于≥4个突变。
图8.WT免疫原性对照。为了检验省略MUT+/WT+方案是否对这些结果产生影响，我们从数据集中排除9个MUT+/WT+突变以及2个未进行WT测量的突变，总共剩余121个突变(43个B16和78个CT26)，其中19个为MUT+/WT-(5个B16和14个CT26)。我们再次发现了与完整数据集中相同的趋势，即，作为Mmut评分、HA假说对部分假说的优势以及相反假说与本底对照HBC1相比的劣势的函数的高度非线性应答。A作为Mmut评分的函数的免疫原性累积分布。B每个Mmut库的免疫原性突变百分数的直方图。C满足本底对照假说HBC1的免疫原性突变百分数与满足HA’、HBC2以及HA的免疫原性突变百分数的比较。D满足本底对照假说HBC1与满足相反假说的免疫原性突变百分数的比较。其它细节参见图5的说明。
图9.作为RPKM的函数的免疫原性突变的比例。红色：未过滤的全部50个B16突变和82个CT26突变(总共132个突变)。蓝色：通过α＝1，β＝0.5，τ＝1的HA假说的突变。B.未过滤的不同RPKM范围的免疫原性突变百分数。RPKM库为：1＝(0,1]，2＝(1,5]，3＝(5,50]，4＝(50,∞)。C.满足α＝1，β＝0.5，τ＝1的HA假说的不同RPKM范围的免疫原性突变百分数。RPKM库为：1＝(0,1]，2＝(1,∞)。误差为S.E。
图10.锚定以及非锚定位点突变的II类免疫原性表位。利用SYFPEITHI分析锚定位点基序。
图11.免疫原性肿瘤相关表位的建议模型。
图12.对突变排位进行加权的方法实例。对于每个突变，其在突变排位列表中的排位可被进一步加权，通过患者HLA类型、HLA类型的可能的窗口长度以及导致低Mmut的方案或者导致HA和/或HBUHC分类的表位内的突变位点的组合的解决方案的数量来加权。由于每个突变的所有解决方案潜在地可以并行提出，因此该权重因素可能是突变排位的重要贡献者。
图13.针对Mmut以及ΔM＝Mmut–Mwt的来自CT26的突变chr14_52837882的所有表位方案散点图的实例
实施例
在此描述了本文使用的技术和方法，或者以本身已知的方式以及如例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y中所述的实施。所有方法包括试剂盒、试剂的使用都根据制造商的信息来实施，除非特别指明。
实施例1：建立用于预测T细胞表位的免疫原性的模型
先前我们研究了B16F10鼠黑色素瘤细胞系中鉴定的50个体细胞突变的免疫原性(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumor疫苗接种.CancerResearch72,1081(2012))。这50个突变选自主要是使MHCI类的表达最大化的563个表达的非同义体细胞突变池(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerResearch72,1081(2012))(也参加实施例2)。当搜索所有可能的MHCI类等位基因空间、潜在的表位长度和序列窗(定位突变位点)时，我们预测了每个突变的最小表位，即具有最低的MHCI类一致性评分的表位(Y.Kimetal.,NucleicAcidsResearch40,W525(2012))(此处定义为Mmut)(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerResearch72,1081(2012))。利用RNA疫苗接种来测量这些突变的免疫原性，然后利用肽疫苗接种确认之前发现的肽读数(参见实施例2)(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerResearch72,1081(2012))，显示50个突变中仅12个(24％)是免疫原性的(表1)，伴随着MUT+/WT-序列仅包含所有测试突变的10％。
表1.B16F10和CT26.WT小鼠品系进行RNA疫苗接种之后免疫原性突变的数量
*该表排除了两种CT26MUT+突变，因为还未测量它们的WT反应性。目前为止82个CT26突变中总共测量了18个MUT+突变，产生了22％的成功率。
B16F10小鼠测试情况的结果显示初始选择具有低Mmut评分(≤3.9)的表达的非同义突变在免疫原性预测方面产生的成功率较低。因此如果靶向肿瘤特异的新抗原的个性化疫苗要成为有效的疗法，则需要更好的理解驱动免疫原性的机制。为了试图发现促成免疫原性的另外的变量，我们研究了小鼠结肠癌细胞系CT26.WT中确定的表达的非同义体细胞突变的免疫原性。总共，基于突变的Mmut评分(低vs.高)、平均RPKM(低vs.高)以及细胞定位(细胞内vs.细胞外)选择了96个突变，并利用RNA疫苗接种，用肽和RNA读数测试了免疫原性(其它细节参见实施例2)。连同B16F10细胞系，我们的数据集包括132表位，离体测量它们对小鼠脾细胞的免疫原性。
MHC一致性评分.为了研究免疫原性对Mmut的依赖性，我们将免疫原性突变的累积百分数制定为Mmut的函数，即Mmut评分小于免疫原性的给定阈值(记为β)的突变的百分数。横跨总共132个突变的B16与CT26数据集的组合的分析显示了免疫原性成功率对Mmut的高度非线性依赖(图2A)。图2A显示免疫原性突变富含十分低的Mmut评分(≤～0.2)。对于Mmut≤0.1，免疫原性突变的百分数的峰在～60％，并且随Mmut的增加迅速衰减，降至Mmut≥2的～25％以下。Mmut≤0.3对>0.3的免疫原性突变的百分数为44.4％对17.1％，为统计学上的显著差异(P值＝0.004，费舍尔精确检验，单尾)。三个Mmut库:≤0.3、(0.3,1]以及>1的免疫原性突变百分数的直方图显示免疫原性突变的百分数随Mmut的增加而下降(图2B)。图2B中的最低库(Mmut≤0.3)的成功率44.4％与中间库的20.7％和最高库(Mmut>1)的15.8％的差异在统计学上是显著的(P值分别＝0.05和0.004，费舍尔精确检验，单尾)，显示对于Mmut>～0.3，成功率以统计学显著的方式降低。当分别分析B16和CT26的突变组(mutanomes)时，也观察到成功率的类似趋势(图3)。
迄今为止我们选择突变的标准集中于递呈，并且我们已经观察到限制突变表位的MHC结合评分允许免疫原性表位预测具有高至60％的精确度。然而递呈是诱导免疫原性的必要不充分条件。通过确定TCR识别的其它标准，我们可能能够进一步提高我们预测的精确度。我们假设了驱动免疫原性的两种互相排斥的机制，我们将其称作I型和II型免疫原性模型。
I类免疫原性.为了使TCR库识别突变的表位以及产生免疫应答，我们猜测必须满足三个条件(HA图4)：(i)在有机体发育过程的某些时间点将野生型表位递呈给免疫系统，通过强TCR/pMHC结合清除匹配的TCR；(ii)递呈突变的表位；和(iii)突变的氨基酸的物理化学特性与野生型氨基酸足够“不同”(通过我们在下文限定的一些度量标准)以使TCR库能够“检测”或“记录”该替代。条件(i)和(ii)确保免疫系统真正暴露于变化中，即突变。条件(iii)需要突变明显改变野生型氨基酸的物理化学特征，以使突变表位与现存的(未清除的)TCR的结合亲和力可能增加，从而启动导致免疫应答的信号级联(图5)。
TCT识别评分.I类免疫原性模型需要度量标准来估计两种氨基酸之间的物理化学差异。在分子进化中已知，互换频繁的氨基酸可能具有化学和物理相似性，而很少互换的氨基酸可能具有不同的物理化学特性。通过对数-几率矩阵测量与给定替代偶然发生的可能性相比，该替代自然发生的可能性。自然选择施加的对数-几率矩阵中观察到的模式“反映在蛋白的三维构象中的氨基酸残基与另一氨基酸残基的弱相互作用中，氨基酸残基功能的相似性”(M.O.Dayhoff,R.M.Schwartz,B.C.Orcutt,Amodelforevolutionarychange.MODayhoff,ed.AtlasofproteinsequenceandstructureVol.5,345(1978))。因此我们利用将其称作“T评分”以反映TCR识别的基于进化的对数-几率矩阵作为癌症相关氨基酸取代的有效评分矩阵。具有正的T评分的取代(即对数-几率)有可能自然发生，并因此对应具有类似物理化学特性的两种氨基酸。I类模型预测具有正的T评分的取代成为免疫原性的可能性更低。相反地，具有负的T评分的取代反映取代有可能自然发生，并因此对应具有显著不同的物理化学特性的两种氨基酸。根据我们的模型，此类替代成为免疫原性的可能性更高。我们将估计对数-几率矩阵的不同方法进行了比较，发现结果相对于选择的确切方法十分稳定。被称作WAG的基于最大可能性(ML)的估计方法(S.Whelan,N.Goldman,Molecularbiologyandevolution18,691(2001))，利用250的PAM(可接受点突变)距离似乎将预测的免疫原性与非免疫原性突变分离地最好，因此我们用该矩阵表示结果(其它细节参见实施例2)。
II类免疫原性.在免疫原性的II类模型中，我们猜测如果免疫系统之前从未见过野生型表位，则突变可能是免疫原性的，并因此受到突变表位的激发。因此在该模型中为了使突变是免疫原性的，我们猜测必须满足两个条件：(i)从未向免疫系统递呈野生型表位，(ii)递呈突变的肽。如果例如突变位于锚定位点因而将“非结合”表位变为“结合表位”，则可以共同满足这些条件。形式上，可将II类免疫原性分为两种亚假说：高T评分(图4中的HB)和低T评分(图4中的HC)。然而，由于假定野生型表位未被递呈，因而不期望氨基酸取代的性质对TCR识别有影响，因此我们将II类免疫原性与一致假说：HBUHC视为是等同的。
测试I类免疫原性.可如下所述对I类免疫原性(图4中的HA)假设进行数学重申：我们需要野生型表位被递呈(Mwt≤α)，突变的表位被递呈(Mmut≤β)，以及氨基酸取代是不重要的(T≤τ)，其中Mwt被定义为用野生型氨基酸取代突变氨基酸的突变表位的MHC一致性评分(相同HLA等位基因和窗口长度)，以及T表示T评分。由于三个条件都是必需的，因而我们期望与单独基于Mmut的分类器(图4中的HBC1)相比或者与部分假说：HBC1∩{Mwt≤α}以及HBC1∩{T≤τ}相比，HA分类器的精确度更高。因此我们将免疫原性突变的百分数(真阳性的数量除以真阳性和假阳性的和)计算为HBC1、部分假说HA’：HBC1∩{T≤τ}以及部分假说HBC2：HBC1∩{Mwt≤α}的β的函数。我们发现≈0.5至1范围内的τ的保守阈值表现最好(WAG250矩阵的范围为-5.1(取代)-+5.4(取代))。我们还发现与β相比，α可以是严格保守的，设定α≈1。图6A的确表明，当考虑B16与CT26的合并突变组时，基于HBC2和HA’的分类器比本底对照假说HBC1得到的精确度更高。此外，基于完全假说HA的分类器比部分假说HBC1和HBC2获得的精确度更高，因而显示出累加效应。当分别分析B16与CT26数据集时，持有相同的结论(图7)。
由于条件Mwt≤α和T≤τ被假定为免疫原性的必要条件，因而期望基于条件HBC1∩{T＞τ}或条件HBC1∩{Mwt＞α}(即否定第二条件)的分析器比HBC1表现更差。确实我们发现当共同分析(图6B)或单独分析(图7)时，对于B16和CT26，情况是这样的。因此我们推断B16和CT26数据集共同支持或单独支持HA假说。省略WTRNA也显示反应性的突变并不影响这些结论(图8)。
HA假说对照.尽管具有高T评分的突变可能仍然是免疫原性的，富含此类突变的假设应当统计学上富含非免疫原性突变。因此如果我们将HA假说(HBC2∩{T≤τ})与它的相反情况HBC2∩{T＞τ}(图4中的Hn)进行比较，我们应当观察到免疫原性突变的统计学显著缺乏。表2确实显示对于Mmut≤β＝0.5，Mwt≤α＝1以及T≤τ＝1，HA胜过Hn,，成功率为52.5％(n＝21)比21.4％(n＝14；P＝0.068，单尾费舍尔精确检验)。
表2.基于包含133个突变的B16与CT26合并数据集的不同假说下的免疫原性突变百分数。
HA也比本底对照HBC2表现更好，其达到了41.2％(n＝35)。由于对β的条件越严格，越多的假阳性被从HA组中移出，因而随着我们降低β，HA与Hn的成功率之间的差异变得更大。例如，对于β＝0.25，与Hn组的成功率17％(n＝6)相比HA组的成功率为67％(n＝14)(P＝0.066，单尾费舍尔精确检验)–参见表3。
表3.133个测量的B16F10/CT26的排名列表.将满足基本对照假说HBC1(Mmut≤0.25)的WT突变分为三个不相交的假说类别：免疫原性突变的HA假说(Mwt≤0.8,T≤0.5)，富含非免疫原性突变的Hn/相反的HA假说(Mwt≤0.8,T>0.5)，以及免疫原性突变的HBUHC假说(Mwt>0.8)。提议基于区分变量的相对重要性对候选HA和HBUHC进行排列。对于HA，提议的顺序为：Mmut(降低)→T评分(降低)→MWT降低。对于HBUHC，提议的顺序为：Mmut(降低)→MWT(升高)。误差为标准误差。
I类免疫原性(HA):67±14％成功率
II类免疫原性(HBUHC):0％成功率
Hn:17±15％成功率
实施例3中给出了可能进一步改善免疫原性排名的其它权重因子的实例。
更通常而言，可将满足HBC1(Mmut≤β)的突变列表分为三类：HA、Hn和HBUHC(表3)，其中HA富含免疫原性突变，Hn富含非免疫原性突变。在B16和CT26的情况下，HBUHC组中的全部三个候选都是非免疫原性的，与我们的预期相反。然而，如果为Mwt选择更适当的阈值α*以使α*>>α,，则将不存在用于HBUHC测试的预测。
免疫原性分类器的最高精确度.根据表1，B16与CT26的组合数据集中的预测免疫原性的平均成功率是22.7％(＝30/132)。通过对Mmut评分应用最严格的阈值(β＝0.1)，免疫原性分类器的精确度升高至60％(＝6/10；表2中的HBC1)。通过将HBC1与Mwt≤α条件或者与T≤τ条件(α＝1,τ＝1)组合，精确度升高至66.7％(＝6/9)。将两个标准都组合的基于HA的分类器导致了累加应答，其将精确度增加至75％(＝6/8)(表2)。
B16表位MUT33.在合并的B16/CT26数据集中，通过所有进化模型(除PAM矩阵之外)，排名最高的HA类表位是B16的MUT33(参见表3)。进一步分析显示MUT33确实引起了MHCI类限制的CD8+应答，并且表现出针对最小预测表位的离体免疫原性(数据未显示)。
基因表达的作用.将免疫原性突变的比例(RPKM值低于给定阈值的免疫原性突变的数量与免疫原性突变总量的比)制定为B16和CT26候选的RPKM值的函数，显示在十分低的RPKM值处该比率有点停滞(图9A)。不管是否应用HA标准，都观察到了该效果。绘制不同RPKM库免疫原性突变的百分比(图9B和C)，表明RPKM值≤～1具有稍微较低的成功率(在应用或未应用HA过滤假说的情况下)，尽管有启发性，应当注意这些结果在误差范围内。
公开的CD8+表位的研究.接下来我们想了解具有单个氨基酸取代的公开的T细胞限定的肿瘤抗原是否引起满足我们的免疫原性模型的CD8+限定应答。在公开的17个表位中(P.VanderBruggen,V.Stroobant,N.Vigneron,B.VandenEynde.(CancerImmun,http://www.cancerimmunity.org/peptide/,2013))(表4)，有5个满足HA标准(α＝0.7,β＝0.2,τ＝0.5)，四个满足HCUHB标准(α＝2.2,β＝0.4)，以及两个满足Hn标准(α＝0.6,β＝0.3,τ＝1.7)。
表4.具有单个氨基酸取代的公开的表位产生CD8+应答.参考文献列表参见实施例2。用红色突出HBUHC组中的锚定位点突变。
*基于WAG250对数-机率矩阵，颜色说明：T≤0.5,0.5<T≤1,T>1
因此，HA与HCUHB假说粗略地共同占公开表位的50％。有趣的是，由于锚定位点突变，满足HCUHB条件(表4中的红框)的4个公开表位中有3个的Mwt评分大于10(图10)。由于HCUHB假说需要在有机体发育过程中任何细胞递呈野生型表位的可能性保持非常小，因而期望Mwt阈值应当保持较高，即α’＞＞α。确实当α从0.8升高至>3时，表3中的B16/CT26假阳性消失。因此HCUHB假说中的Mwt的更合适的阈值可能是3-10。
MZ7-MEL细胞系.为了测试在人肿瘤模型设置中，我们的免疫原性模型预测免疫原性表位的能力，我们研究了1988年从患有恶性黑色素瘤的患者的脾脏转移建立的MZ7-MEL细胞系(V.Lennerzetal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica102,16013(2005))。对来自含有自体肿瘤反应性T细胞的MZ7-MEL细胞的cDNA文库进行筛选，显示至少5个新抗原能够产生CD8+应答(V.Lennerzetal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica102,16013(2005))。这组成了迄今为止从患者来源的CD8+新抗原的最大集合。对这些表位应用我们的免疫原性模型，我们发现3个新抗原被归类为HA表位，以及一个锚定位点突变的新抗原被归类为HBUHC表位(表4中的箭头，以及图10)。因此，这5个表位中有4个可通过我们的免疫原性模型来解释。
为了测试在MZ7-MEL细胞系中我们重新预测这些表位的能力，我们对MZ7-MEL细胞系的外显子组进行了测序(参见方法)。总共确定了743个表达的非同义突变。先前由Lennerz等人(V.Lennerzetal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica102,16013(2005))确定的所有5个突变都被找到。然后我们计算每一突变的T评分、Mmut以及Mwt，还报告了导致给定突变的最小MHC一致性评分的HLA等位基因和表位。利用阈值α＝0.8，β＝0.2，τ＝0.5(加上条件RPKM>0.2)将突变归入三组中的一组：HA、HBUHC以及Hn，然后如表3所述的基于它们为免疫原性的潜能将其排列。我们发现743个突变中，32个突变满足HA标准(表5)，12个满足HBUHC标准(表6)以及15个满足Hn标准。
表5.HA类的MZ7-MEL细胞突变.利用阈值α＝0.8，β＝0.2以及τ＝0.5，MZ7-MEL的743个表达的非同义突变中32个突变被归为HA-免疫原性的。基于Mmut(下降)→T评分(下降)排序方案进行排列。用黄色突出显示由Lennerz等人确定的免疫原性的新抗原。此外RPKM需要超过0.2。
*排列基于Mmut以及T评分
**T评分基于WAG250对数-机率矩阵
表6.HBUHC类的MZ7-MEL细胞突变.利用阈值α*＝0.8，β＝0.2以及RPKM>2，将MZ7-MEL的743个表达的非同义突变中12个突变被归为HBUHC-免疫原性的。基于Mmut(下降)→Mwt(升高)排序方案进行排列。用黄色突出显示由Lennerz等人确定的免疫原性的新抗原。
*排列基于Mmut以及Mwt
在归为HA类的32个突变中，利用Mmut→T评分排列方案，由Lennerz等人确定的三个HA类突变(SIRT2,SNRPD1andRBAF600)在18个排列的类中排在第2、第4以及第13位(参见表3)。在归为HBUHC类的12个突变中，之前的Lennerz等人的突变(SNRP116)排在第3位。此外，如果应用更高(更实际)的Mwt阈值(例如α*～5)，则先前的Lennerz等人的突变排在第1位(与一个另外的锚定位点突变一起–表7)。最后，如Lennerz等人所报告的，预测四个的突变具有正确的HLA等位基因、表位长度以及突变位点。
表7.HBUHC类的MZ7-MEL细胞突变.利用阈值α*＝5，β＝0.2以及RPKM>2，将MZ7-MEL的743个表达的非同义突变中2个突变被归为HBUHC-免疫原性的。基于Mmut(下降)→Mwt(升高)排序方案进行排列。用黄色突出显示由Lennerz等人确定的免疫原性的新抗原。
*排列基于Mmut以及Mwt
结论
B16和CT26数据集的分析支持下述模型：如果满足三个条件：野生型的肽被递呈，突变的肽被递呈以及氨基酸取代具有足够低的对数-几率评分，则赋予免疫原性(图11A)。这一我们称为I类免疫原性的免疫原性模型进一步在人黑色素瘤细胞系模型MZ7-MEL中得到了支持。MZ7-MEL模型和公开的CD8+限制的新抗原支持其中野生型表位不被递呈的我们称为II类免疫原性的第二模型，但是取代(例如在锚定位点)导致MHC一致性评分显著增加(>5至10)，产生新的、之前从未出现的表位(图11B)。该限定免疫原性的框架由三个变量的分类方案(Mmut、Mwt、T评分)得到。利用这一分类方案，我们能够将MZ7-MEL的743个突变减少至一列34个突变，伴随着5个Lennerz等人的表位中的3个排在前5位。
表7显示II类免疫原性突变很稀少。在743个突变中，与大概30个I类免疫原性突变相比，仅有2个被归为II类免疫原性的(利用Mwt的合适阈值)。在鼠黑色素瘤模型中，也观察到了少量HBUHC类突变(表8)。该观察强调了I类免疫原性突变在个性化疫苗中的重要性，其被期望是患者样品中存在的可用于疫苗接种的主要突变类型。同时，Lennerz等人发现的5个表位中的1个是II类免疫原性的事实可能暗示II类免疫原性的突变更有效或者以某种方式被免疫系统选择。
表8.不同肿瘤模型中候选HA和HBUHC突变的数量.(α＝0.8，α*＝0.5，β＝0.2，τ＝0.5)
假说
实施例2：材料和方法
实施例1中使用的材料和方法描述于下文中。
动物
根据动物研究的联邦政策和州政策，在美因茨大学饲养C57BL/6J和Balb/cJ小鼠(CRL)。
用于黑色素瘤和结直肠鼠肿瘤模型的细胞
B16F10黑色素瘤细胞系(产品：ATCCCRL-6475，批号：58078645)和CT26.WT结肠癌细胞系(产品：ATCCCRL-2638，批号：58494154)于2010年购自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)。采用早期传代细胞(第3、第4代)进行测序实验。对细胞进行常规支原体测试。自收到起还未对细胞进行再次确认。MZ7-MEL细胞系(建立于1988年1月)以及自体Epstein–Barr病毒-转化B细胞系从Thomas博士(医学系，血液肿瘤学，约翰尼斯-谷腾堡大学)处获得。
合成肽
肽购自JeriniPeptideTechnologies(Berlin,Germany)或由TRON肽设备合成。合成的肽的长度为27个氨基酸，突变的(MUT)或野生型(WT)氨基酸位于位点14。
免疫小鼠
向年龄匹配的雌性C57BL/6或Balb/c小鼠静脉注射PBS中的配以20μlLipofectamineTMRNAiMAX(Invitrogen)的20μg体外转录的mRNA，总注射体积为200μl(每组3只小鼠)。在第0、3、7、14以及18天免疫小鼠。初次注射23天之后，杀死小鼠并分离脾细胞用于免疫学测试(参见ELISPOT分析)。利用含有位点14的突变的27个氨基酸(aa)的序列构建表现一个(单表位)或两个突变(双表位)的DNA序列，并将其克隆进pST1-2BgUTR-A120主链(S.Holtkampetal.,Blood108,4009(2006))。先前描述了来自该模板的体外转录和纯化(S.Kreiteretal.,CancerImmunology,Immunotherapy56,1577(2007))。
酶联免疫斑点分析
先前描述了酶联免疫斑点(ELISPOT)分析(S.Kreiteretal.,CancerResearch70,9031(2010))以及作为刺激物的同基因骨髓衍生的树突细胞(BMDC)的产生(L.MBetal.,J.Immunol.Methods223,77(1999))。对于B16F10模型，用含有指示的突变的肽、相应的野生型肽或者用对照肽(VSV-NP)对BMDC进行肽脉冲(6μg/ml)。对于CT26模型，除用肽再刺激之外，用相应的体外转录的mRNA转染BMDC，并且也将所述mRNA用于再刺激。对于分析，在用抗IFN-γ抗体(10μg/mL,cloneAN18；Mabtech)包被的微量滴定板中，将5×104的BMDC与5×105的新鲜分离的脾细胞共孵育。37℃孵育18小时之后，用抗IFN-γ抗体(cloneR4-6A2；Mabtech)检测细胞因子的分泌。计数斑点数量，并用S5VersaELISPOT分析仪、ImmunoCaptureTMImageAcquisition软件以及第5版分析软件进行分析。通过学生t检验以及曼-惠特尼检验(非参数检验)进行统计分析。p值<0.05认为应答显著。
细胞内细胞因子分析
将制备的用于ELISPOT分析的等分脾细胞，通过细胞内流式细胞仪用于细胞因子产生的分析。为此将每份样品的2×106个脾细胞置于96孔板中的添加有高尔基体抑制剂布雷菲德菌素A(10μg/mL)的培养基(RPMI+10％FCS)中。在37℃，用2×105肽脉冲的或RNA转染的BMDC再刺激来自每个动物的细胞，持续5h。孵育之后，用PBS洗涤细胞，将细胞在50μlPBS中重悬，并在4℃用下述抗-鼠抗体细胞外染色20分钟：抗-CD4FITC、抗-CD8APC-Cy7(BDPharmingen)。孵育之后，用PBS洗涤细胞，随后在4℃将细胞在100μLCytofix/Cytoperm(BDBioscience)溶液中重悬20分钟以使外膜透化。透化之后，用Perm/Wash-Buffer(BDBioscience)洗涤细胞，在Perm/Wash-Buffer50μL/样品中重悬，并在4℃用下述抗鼠抗体细胞内染色30分钟：抗-IFN-γPE、抗-TNF-αPE-Cy7、抗-IL2APC(BDPharmingen)。用Perm/Wash-Buffer洗涤之后，在含有1％多聚甲醛的PBS中重悬细胞，用于流式细胞仪分析。利用BDFACSCantoTMII血细胞计数器以及FlowJo(版本7.6.3)对样品进行分析。
第二代测序
核酸提取：利用QiagenDNeasyBloodandTissue试剂盒(对于DNA)和QiagenRNeasyMicro试剂盒(对于RNA)从混合细胞中提取DNA和RNA以及从鼠组织中提取DNA。
DNA外显子组测序：如前所述的，实施三次B16F10、C57BL/6J和CT26.WT的外显子捕获以及Balb/cJ的DNA再测序(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerResearch72,1081(2012))。利用基于AgilentXT人全外显子(AgilentXTHumanallExon)50Mb方案的捕获分析实施两次用于MZ7-MEL/EBV-BDNA再测序的外显子组捕获，以捕获全部蛋白编码区。利用CovarisS2超声装置将3μg纯化的基因组DNA(gDNA)分裂为150-200bp。对片段进行末端修复，根据生产商的说明书进行5’磷酸化和3’腺苷酸化。采用10:1的适配子与gDNA摩尔比，将Agilent标引的特异的末端配对适配子与gDNA片段连接。利用Agilent的InPE1.0和SureSelect标引预捕获PCR引物以及HerculaseII聚合酶进行4个循环的预捕获扩增。在65℃，将500ng与适配子连接的、PCR富集的gDNA片段与Agilent的外显子组捕获诱饵杂交24小时。利用链霉亲和素包被的磁珠将杂交的gDNA/RNA诱饵复合物移出，洗涤并且在SureSelect洗脱缓冲液的洗脱过程中剪切RNA诱饵。利用SureSelect标引捕获后PCR(SureSelectIndexingPost-CapturePCR)和标引PCR引物以及HerculaseII聚合酶将洗脱的gDNA片段进行捕获后PCR扩增，扩增10个循环。1.8倍体积的AgencourtAMPureXP磁珠进行所有的清除工作。利用Invitrogen的QubitHS分析进行所有的质量控制，以及利用Agilent的2100BioanalyzerHSDNA分析测定片段大小。利用7pM文库，利用TruseqSRclusterkitv2.5在cBot上聚集富含外显子组的gDNA文库，以及利用TruseqSBS试剂盒在IlluminaHiSeq2000上对1x100bps进行测序。
RNA基因表达谱分析(RNA-Seq)：制备两份条形码标记(barcoded)的mRNA-seqcDNA文库，利用SeramagOligo(dT)磁珠(ThermoScientific)从5μg总RNA中(modifiedIlluminamRNA-seqprotocolusingNEBreagents)分离mRNA，以及利用二价阳离子和热使其断裂。利用随机引物和SuperScriptII(Invitrogen)将产生的片段(160-220bp)转变为cDNA，然后利用DNA聚合酶I和RNaseH进行第二条链的合成。对cDNA进行末端修复，根据NEBRNA文库试剂盒说明书进行5’磷酸化和3’腺苷酸化。采用10:1的适配子与cDNA插入摩尔比，用T4DNA连接酶连接3’单个T突出的Illumina多倍标识符特异的适配子。纯化cDNA文库并选择300bp大小(E-Gel2％SizeSelectgel,Invitrogen)。利用PhusionDNA聚合酶和Illumina特异的PCR引物，通过PCR进行富集、添加Illumina六碱基标引以及流动细胞特异的序列。用1.8倍体积的AgencourtAMPureXP磁珠进行该步骤之前的所有清除。利用Invitrogen的QubitHS分析实施所有的质量控制，以及利用Agilent的2100BioanalyzerHSDNA分析测定片段大小。聚集条形码RNA-Seq库，以及如上文所述对50bps进行测序。
NGS数据分析，基因表达：根据Illumina标准方案对RNA样品的输出序列读取进行预处理，包括过滤低质量的读取。用bowtie(版本0.12.5)将序列读取与mm9(A.T.Chinwallaetal.,Nature420,520(2002))或hg18(F.Collins,E.Lander,J.Rogers,R.Waterston,I.Conso,Nature431,931(2004))参考基因组序列进行比对(B.Langmead,C.Trapnell,M.Pop,S.L.Salzberg,GenomeBiol10,R25(2009))。对于基因组比对，允许两个错配，并且仅报告最佳比对(“-v2–最佳”)；对于转录本比对，使用默认参数。将不与基因组序列匹配的读取与UCSC已知基因的所有可能的外显子-外显子连接序列的数据库进行比对(F.Hsuetal.,Bioinformatics22,1036(2006))。通过下述方法测定表达值：将读取坐标与RefSeq转录本的坐标进行交叉，计数重叠外显子和连接读取，以及标准化为RPKM表达单位(每1百万个定位的读取中定位到到外显子的每1K个碱基上的读取个数)(A.Mortazavi,B.A.Williams,K.McCue,L.Schaeffer,B.Wold,Naturemethods5,621(2008))。
NGS数据分析，探索体细胞突变：如之前所述确定体细胞突变(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerResearch72,1081(2012))。利用bwa(默认选项，版本0.5.8c)将序列读取与mm9或hg18参考基因组进行比对(H.Li,R.Durbin,Bioinformatics25,1754(2009))。移除定位到基因组多个位点的不确定的读取。利用两个软件程序：samtools(版本0.1.8)(H.Li,Bioinformatics27,1157(2011))和SomaticSniper(A.McKennaetal.,GenomeResearch20,1297(2010))的结合确定突变。对于B16F10和C57BL/6J，还包括GATK(A.McKennaetal.,GenomeResearch20,1297(2010))。为在所有各自复制中识别的潜在体细胞变化指定“错误发现率”(FDR)置信值(M.etal.,PLoScomputationalbiology8,e1002714(2012))(仅CT26和MZ7-MEL)。
突变选择和确认
之前已经描述了用于免疫原性测试的50个B16F10突变的选择标准(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerResearch72,1081(2012))。这些突变标准包括：(i)存在于所有三个B16F10复制中且不存在于所有三个C57BL/6复制中；(ii)发生于RefSeq转录本中；(iii)引起非同义改变；(iv)发生于B16F10-表达的基因中(复制中的中值RPKM>10，外显子表达>0)；以及(v)对于每个突变，Mmut评分(参见下文)需要<5。在剩下的59个突变中，产生MHCI类评分、MHCII类评分和转录本表达的分位数排名，以及选择前50个突变(0.1≤Mmut≤3.9)通过PCR进行确认(其他细节参见(J.C.Castleetal.,Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerResearch72,1081(2012)))。进一步完善用于免疫原性测试的96个CT26.WT突变的选择标准，并且包括下述标准：(i)存在于所有三个CT26.WT复制中且不存在于所有三个Balb/cJ复制中；(ii)FDR≤0.05；(iii)发生于UCSC已知基因转录本中；(iv)引起非同义改变；(v)不存在于dbSNP数据库中；(vi)不位于基因组重复区域。从剩余的493个突变中，根据三个特征确定了8个12成员的组：Mmut评分(最低-[0.1,1.9]比最高-[3.9-20.3])、蛋白区室(细胞外、细胞内)以及基因表达(中值7.1RPKM以下比以上)，根据贪心算法选择突变，并相应地调节阈值。将产生的96个突变中的94个通过PCR进行确认，然后进行桑格尔测序。
用于分析的MZ7-ML突变的选择标准包括：(i)存在于两个MZ7-MEL复制中且不存在于两个自体EBV-B复制中，随后是上文描述的CT26.WT的步骤(ii)至(vi)。应用步骤(i)-(vi)将最初～8000个突变的列表减少至743个。
MHC结合预测以及Mmut评分计算
利用IEDB分析资源一致性工具(http://tools.immuneepitope.org/analyze/ html/mhc_binding.html)来实施MHC结合预测(Y.Kimetal.,NucleicAcidsResearch40,W525(2012))，其基于来自ANN(C.Lundegaardetal.,NucleicAcidsResearch36,W509(2008)；M.Nielsenetal.,ProteinScience12,1007(2009))、SMM(B.Peters,A.Sette,BMCbioinformatics6,132(2005))以及还组合了一些等位基因的模型(J.Sidneyetal.,ImmunomeResearch4,2(2008))的基准研究将表现最好的预测方法进行组合(H.H.Lin,S.Ray,S.Tongchusak,E.L.Reinherz,V.Brusic,BMCimmunology9,8(2008)；B.Petersetal.,PLoScomputationalbiology2,e65(2006))，。一致性方法通过产生百分数排名将所有工具的预测评分进行组合，所述百分数排名反映给定肽针对来自SWISSPROT的5百万个随机肽的肽评分的结合预测评分。
对于每个突变，我们计算所有可能的(i)序列窗(定位突变的地点)、(ii)表位测定以及(iii)可能的鼠MHCI类等位基因的预测的MHC一致性评分。将所有MHC一致性评分的最小评分定义为Mmut评分。
计算对数-几率矩阵以及T评分
可从大蛋白数据库的序列比对比较来估计对数-几率矩阵。早期的对数-几率矩阵基于序列的成对比较(BLOSUM62(S.Kreiteretal.,CancerImmunology,Immunotherapy56,1577(2007)))和最大简约法(MP)估计方法(例如PAM250(M.O.Dayhoff,R.M.Schwartz,B.C.Orcutt,Amodelforevolutionarychange.MODayhoff,ed.AtlasofproteinsequenceandstructureVol.5,345(1978))、JTT250(S.Q.Le,O.Gascuel,Molecularbiologyandevolution25,1307(2008))以及Gonnet矩阵(C.C.Dang,V.Lefort,V.S.Le,Q.S.Le,O.Gascuel,Bioinformatics27,2758(2011)))。最近，发展了基于最大可能性(ML)的方法(例如VT160(P.G.Higgs,T.K.Attwood,Bioinformaticsandmolecularevolution.(Wiley-Blackwell,2009))、WAG(S.Whelan,N.Goldman,Molecularbiologyandevolution18,691(2001))以及LG(V.Lennerzetal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica102,16013(2005)))。由于ML不限于仅对密切相关的序列进行比较，基于MP的方法也是这样，因此该估计方法被期望是最精确的。
在别处已经详细描述了对数-几率矩阵的计算(C.C.Dang,V.Lefort,V.S.Le,Q.S.Le,O.Gascuel,Bioinformatics27,2758(2011))。简言之，氨基酸取代的标准模型假定为由20×20的速率矩阵Qij表示Markovian、时间连续的、时间可逆的模型，其中qij(i≠j)是每单位时间从氨基酸i至j的取代数量，并且选择对角元素以满足Q可以是可分解的，以使对于i≠j，Qij＝Sij·πj，其中Si,j是对称可交换矩阵，以及πi是观察到氨基酸i的可能性(C.C.Dang,V.Lefort,V.S.Le,Q.S.Le,O.Gascuel,Bioinformatics27,2758(2011))。最后，将Q标准化以使从而使时间单位t＝1.0与每个位点1.0个期望取代或者与每个位点一个“可接受点突变”相对应，用PAM距离100来表示(M.O.Dayhoff,R.M.Schwartz,B.C.Orcutt,Amodelforevolutionarychange.MODayhoff,ed.AtlasofproteinsequenceandstructureVol.5,345(1978)；S.Q.Le,O.Gascuel,Molecularbiologyandevolution25,1307(2008)；C.C.Dang,V.Lefort,V.S.Le,Q.S.Le,O.Gascuel,Bioinformatics27,2758(2011))。时间t之后，氨基酸i被氨基酸j取代的可能性Pr(i→j|t)＝Pij(t)由20×20可能性矩阵P(t)＝etQ给出(用符号表示矩阵求幂)。计算时间t的对数-几率矩阵由对数-几率20×20矩阵给出(M.O.Dayhoff,R.M.Schwartz,B.C.Orcutt,Amodelforevolutionarychange.MODayhoff,ed.AtlasofproteinsequenceandstructureVol.5,345(1978,1978))。时间可逆的意为πiPij(t)＝πjPji(t)，因此Ti,j是对称的(P.G.Higgs,T.K.Attwood,Bioinformaticsandmolecularevolution.(Wiley-Blackwell,2009))。
在此将取代的T评分定义为Ti,j，并取决于进化模型和时间t。我们研究T评分的了各种模型和PAM距离，包括PAM、BLOSUM62、JTT、VT160、Gonnet、WAG、WAG*以及LG(参见下文参考文献)。该报告中的图是利用基于WAG模型和PAM距离250的T评分产生的。此种大PAM距离意味着氨基酸改变存在很大可能性(P.G.Higgs,T.K.Attwood,Bioinformaticsandmolecularevolution.(Wiley-Blackwell,2009))，并且可用于检测残基可能不同但保留了氨基酸的物理化学特性的序列之间的较远关系(M.O.Dayhoff,R.M.Schwartz,B.C.Orcutt,Amodelforevolutionarychange.MODayhoff,ed.AtlasofproteinsequenceandstructureVol.5,345(1978)；P.G.Higgs,T.K.Attwood,Bioinformaticsandmolecularevolution.(Wiley-Blackwell,2009))。
利用t-分布检验统计数值，我们对表3中的免疫原性与非免疫原性表位的利用多种PAM评分(1、10、25、50、100、150、200以及250)的WAG矩阵平均T评分进行了比较。如预期的，对测试统计数值的分析显示P值随PAM距离单调降低，暗示PAM距离为250是最佳方案(数据未显示)。对除所有进化模型中精确度最低的PAM矩阵之外的所有矩阵而言，归入HA和Hn是相同的。在所有进化模型中，WAG250模型导致表3中的HA表位与Hn表位的最大分离，用测试统计数值测量分离：[最大T评分(HA)-最小T评分(Hn)]/σ(T评分(HA),T评分(Hn))(数据未显示)。与较小PAM距离相比，相同的测试统计数值对PAM距离250也是最大的。
公开的CD8+表位
从由CancerImmunityJournal(P.VanderBruggen,V.Stroobant,N.Vigneron,B.VandenEynde.(CancerImmun,http://www.cancerimmunity.org/peptide/,2013)(http://cancerimmunity.org/peptide/mutations/)公开的突变所导致的肿瘤抗原列表中收集具有单突变氨基酸的CD8+表位。从公开的表中或者从原始论文中(如果后者更精确)获得HLA等位基因。表4中列出的参考文献为下述参考文献：(1)Lennerzetal.PNAS102(44),pp.16013–16018(2005)；(2)Karanikasetal.CancerRes61(9),pp.3718–3724(2001)；(3)Sensietal.CancerRes65(2),pp.632–640(2005)；(4)Linardetal.J.Immunol168(9),pp.4802–4808(2002)；(5)Zornetal.Eur.J.Immunol29(2),pp.592–601(1999)；(6)Grafetal.Blood109(7),pp.2985–2988(2007)；(7)Robbinsetal.J.Exp.Med183(3),pp.1185–1192(1996)；(8)Vigneronetal.CancerImmun2,pp.9(2002)；(9)Echchakiretal.CancerRes61(10),pp.4078–4083(2001)；(10)Hoganetal.CancerRes58(22),pp.5144–5150(1998)；(11)Itoetal.Int.J.Cancer120(12),pp.2618–2624(2007)；(12)etal.Science269(5228),pp.1281–1284(1995)；(13)Gjertsenetal.Int.J.Cancer72(5),pp.784–790(1997)。
实施例3：对突变评分进行加权以改善免疫原性突变的优先化的方案实例
注射进细胞内的RNA，一旦被翻译并剪切成短肽，就可被细胞内不同HLA类型递呈。因此显然预测具有低MHC一致性(或相似性)评分的HLA类型越多，给定突变越可能是免疫原性的，因为它可能并行展示于多种HLA类型上。因此，通过被归为HA和/或HBUHC的HLA类型的数量对突变进行加权，或者甚至仅通过具有低Mmut评分的HLA类型的数量对每个突变进行加权，可能改善免疫原性排名。在最通常的方案中，当我们向细胞注射27聚合体RNA或肽时，不仅有选择HLA类型的自由，还有选择肽长度和该肽的突变位点的自由。因此，可以查看所有可能的HLA类型，所有可能的窗口长度和窗口内突变的所有可能位点，以及计算被归为HA和/或HBUHC的方案的数量(每个给定突变)(图12)。这可能是突变优先化的重要加权因子，从而选择最有效的表位用于疫苗接种。图13显示了作为Mmut以及ΔM＝Mmut–Mwt的函数的所有这些方案的散点图的实例。

Claims (42)

1.预测免疫原性的氨基酸修饰的方法，所述方法包括下述步骤：
a)确定修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分，和
b)确定非修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分，和/或
c)确定存在于MHC-肽复合体中时的修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合评分。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述修饰的肽包含修饰的蛋白的片段，所述片段包含所述蛋白中存在的修饰。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述非修饰的肽在与修饰的肽中的修饰位点相对应的位点含有种系氨基酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中除所述修饰外，所述非修饰的肽与所述修饰的肽是相同的。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述非修饰的肽和修饰的肽的长度为8至15个氨基酸，优选8-12个氨基酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种MHC分子包含不同的MHC分子类型，特别是不同的MHC等位基因。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种MHC分子为MHCI类分子和/或MHCII类分子。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过包括与MHC结合基序数据库进行序列比较的方法来确定所述与一种或多种MHC分子的结合评分。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤a)包括确定所述评分是否满足与一种或多种MHC分子结合的预先确定的阈值。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤b)包括确定所述评分是否满足与一种或多种MHC分子结合的预先确定的阈值。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤a)中应用的所述阈值与步骤b)中应用的所述阈值不同。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述与一种或多种MHC分子结合的预先确定的阈值反映与一种或多种MHC分子结合的可能性。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤c)包括确定所述非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸之间的化学和物理相似性评分。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中步骤c)包括确定所述评分是否满足氨基酸之间的化学和物理相似性的预先确定的阈值。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中基于氨基酸在天然状态下互换的可能性确定所述化学和物理相似性评分。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中天然状态下氨基酸互换的频度越高，则认为所述氨基酸相似性越高。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中利用基于进化的对数-几率矩阵来确定所述化学和物理相似性。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中如果所述非修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分满足指示与一种或多种MHC分子结合的阈值，并且所述修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分满足指示与一种或多种MHC分子结合的阈值，则将所述修饰或修饰的肽预测为是免疫原性的，条件是所述非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸的化学和物理相似性评分满足指示化学和物理不相似性的阈值。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中如果所述非修饰的肽与一种或多种MHC分子结合或者有与一种或多种MHC分子结合的可能性，并且所述修饰的肽与一种或多种MHC分子结合或者有与一种或多种MHC分子结合的可能性，则将所述修饰或修饰的肽预测为是免疫原性的，条件是非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸是化学和物理不相似的或者有为化学和物理不相似的可能性。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述修饰不位于与一种或多种MHC分子结合的锚定位点。
21.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中如果所述非修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分满足指示不与一种或多种MHC分子结合的阈值，并且所述修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分满足指示与一种或多种MHC分子结合的阈值，则将所述修饰或修饰的肽预测为是免疫原性的。
22.如权利要求1至17以及21中任一项所述的方法，其中如果所述非修饰的肽不与一种或多种MHC分子结合或者有不与一种或多种MHC分子结合的可能性，并且所述修饰的肽与一种或多种MHC分子结合或者有与一种或多种MHC分子结合的可能性，则将所述修饰或修饰的肽预测为是免疫原性的。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述修饰位于与一种或多种MHC分子结合的锚定位点。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其包括对两种或更多种不同修饰的肽实施步骤a)，所述两种或更多种不同修饰的肽包含相同的修饰。
25.如权利要求24所述的方法，其中包含相同的修饰的两种或更多种不同修饰的肽包含修饰的蛋白的不同片段，所述不同片段包含所述蛋白中存在的相同的修饰。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中包含相同的修饰的两种或更多种不同修饰的肽包含修饰的蛋白的所有可能MHC结合片段，所述片段包含所述蛋白中存在的相同的修饰。
27.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其还包括从具有与一种或多种MHC分子结合的可能性或最大可能性的包含相同的修饰的两种或更多种不同修饰的肽中选择(所述)修饰的肽。
28.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中包含相同的修饰的两种或更多种不同修饰的肽的长度和/或修饰位点不同。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其包括对两种或更多种不同修饰的肽实施步骤a)，以及任选地实施步骤b)和c)中的一项或两项。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述两种或更多种不同修饰的肽包含相同的修饰和/或包含不同的修饰。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述不同的修饰存在于相同和/或不同的蛋白中。
32.如权利要求24至31中任一项所述的方法，其包括将所述不同修饰的肽中的两种或更多种的评分进行比较。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分的权重高于当存在于MHC-肽复合体时所述修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合评分，优选地高于非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸之间的化学和物理相似性评分，并且当存在于MHC-肽复合体中时所述修饰的肽与一种或多种T细胞受体的结合评分，优选地所述非修饰的氨基酸与修饰的氨基酸之间的化学和物理相似性评分，的权重高于非修饰的肽与一种或多种MHC分子的结合评分。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其还包括鉴定一个或多个蛋白编码区域中的非同义突变。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中通过对一种或多种细胞，如一种或多种癌细胞以及任选地一种或多种非癌细胞，的基因组或转录组进行部分或完全测序，以及鉴定一个或多个蛋白编码区域中的突变，来鉴定修饰。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述突变为体细胞突变。
37.如权利要求34至36所述的方法，其中所述突变为癌症突变。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其用于制备疫苗。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述疫苗来源于通过所述方法预测为是免疫原性的一种或多种修饰或一种或多种修饰的肽。
40.提供疫苗的方法，其包括下述步骤：
通过权利要求1至37中任一项所述的方法来鉴定预测为是免疫原性的一种或多种修饰或一种或多种修饰的肽。
41.如权利要求40所述的方法，其还包括下述步骤：
提供包含肽或多肽或者编码所述肽或多肽的核酸的疫苗，所述肽或多肽含有所述预测为是免疫原性的修饰或修饰的肽。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法生产的疫苗。
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