CN105441371B

CN105441371B - 一种基因工程菌及其在生产辅酶q10中的应用

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Publication number: CN105441371B
Application number: CN201410406759.XA
Authority: CN
Inventors: 陈召峰; 胡伟江; 于凯; 朱永强; 于洪巍; 陆文强; 杨梢烽; 吕家樑
Original assignee: SHANGYU XINHECHENG BIO-CHEMICAL Co Ltd
Current assignee: SHANGYU XINHECHENG BIO-CHEMICAL Co Ltd
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2014-08-19
Publication date: 2018-11-30
Anticipated expiration: 2034-08-19
Also published as: CN105441371A

Abstract

本发明公开了一种基因工程菌及其在生产辅酶Q10中的应用。所述基因工程菌包括辅酶Q10产生菌和转入所述辅酶Q10产生菌中的目的基因，所述目的基因为去甲基萘醌甲基转移酶基因、2‑八异戊二烯‑3‑甲基‑6‑甲氧基‑‑1,4‑对苯二酚羟化酶基因和3‑去甲基泛醌‑93‑甲基转移酶基因。本发明将辅酶Q10合成途径中限速酶基因UbiE，UbiG，UbiF基因转入类球红细菌中，利用这三个基因串联过表达来强化其自身的辅酶Q10合成能力；与未转化有目的基因的类球红细菌相比，利用本发明的基因工程菌生产辅酶Q10，辅酶Q10的产量提高了20％以上。

Description

一种基因工程菌及其在生产辅酶Q10中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因工程菌及其在生产辅酶Q10中的应用。

背景技术

辅酶Q是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物,不同来源的辅酶Q其侧链异戊烯单位的数目不同,人类和哺乳动物是10个异戊烯单位,故称辅酶Q10，其结构式如式(Ⅰ)所示：

辅酶Q10是生物细胞呼吸链中的重要递氢体，是一种良好的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最近，研究者发现CoQ10具有抗衰老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。

辅酶Q10的制备方法主要有三种，即动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动植物辅酶Q10含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法技术上比较成熟，主要是以来源较丰富的茄尼醇为原料合成的，但其产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，合成生物活性高的CoQ10尚未达到工业化生产的程度。微生物发酵法合成的辅酶Q10成本低、无光学异构体，生物学活性高，大规模生产应用效果好。

常用的微生物包括红螺菌，土壤杆菌，类球红细菌，根瘤菌等。其中类球红细菌培养简单，是辅酶Q10高效的生产菌之一。在细菌中，辅酶Q由两部分组成：醌环部分和异戊二烯侧链部分。醌环骨架由分支酸途径合成，前体是对羟基苯甲酸。侧链由异戊二烯途径合成，侧链的长短决定了辅酶Q的种类的不同。在类球红细菌中，异戊二烯焦磷酸异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)与9分子异戊二烯焦磷酸(IPP)依次在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶及聚十异戊二烯胶磷酸合酶的催化下生成聚十异戊二烯胶磷酸(DPP)。聚十异戊二烯胶磷酸和对羟基苯甲酸缩合形成辅酶Q10的前体物，该前体物的苯环经修饰之后形成目标产物辅酶Q10。

利用代谢工程手段对辅酶Q10的生物合成途径进行遗传修饰和改造，可以提高微生物的辅酶Q10产率。辅酶Q10的生物合成途径中存在较多的限速步骤，增强催化限速反应的酶的表达量或活性是提高辅酶Q10产率的一种方法。

但现有通过代谢工程改造手段获得的基因工程菌，其合成辅酶Q10的能力还有待提高。

发明内容

本发明提供了一种基因工程菌，该基因工程菌利用UbiE，UbiF，UbiG基因串联过表达来强化辅酶Q10产生菌的辅酶Q10合成能力。

一种基因工程菌，包括辅酶Q10产生菌及转入所述辅酶Q10产生菌的目的基因，所述目的基因为去甲基萘醌甲基转移酶基因(UbiE)、2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因(UbiF)和3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因(UbiG)。

辅酶Q10的苯环修饰反应是辅酶Q10合成的限速步骤之一。其中，去甲基萘醌甲基转移酶(Demethylmenaquinone methyltransferase，UbiE)催化生成C1位上的甲基(甲基化反应)，2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶(2-octaprenyl-3-methyl-6-methoxy-1,4-benzoquinol hydroxylase，UbiF)催化生成C3位上的羟基(羟基化反应)，3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶(3-demethylubiquinone-93-methyltransferase，UbiG)进一步将C3位上的羟基转变为甲氧基(甲基化反应)。本发明创造性地将UbiE，UbiF，UbiG基因构建于辅酶Q10产生菌中，利用UbiE，UbiF，UbiG基因串联过表达来强化辅酶Q10产生菌的辅酶Q10合成能力。

作为优选，所述去甲基萘醌甲基转移酶基因、3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因和2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因依次连接在表达载体的同一启动子下游。

作为优选，所述表达载体为泛宿主性质粒。泛宿主性质粒能在多种不同种属的细胞中生存，因此可选用多种受体菌来构建本发明的基因工程菌。

所述泛宿主性质粒可选用pBBR1MCS-2。

由于所述表达载体为泛宿主性质粒，因此本发明基因工程菌的宿主菌可选种类多样。作为优选，所述辅酶Q10产生菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。在辅酶Q10的常用产生菌中，类球红细菌不仅培养简单，而且合成辅酶Q10的效率较高。

作为优选，所述目的基因来源于类球红细菌。目的基因与受体菌同源，可进一步提高所述目的基因的转录效率。

本发明中，所述去甲基萘醌甲基转移酶基因(UbiE)的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因(UbiF)的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因(UbiG)的碱基序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明还提供了所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)从供体菌中提取总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，分别获得所述去甲基萘醌甲基转移酶基因、2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因和3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因；

(3)将所述去甲基萘醌甲基转移酶基因、3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因和2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因依次连接于质粒pBBR1MCS-2的启动子下游，获得表达载体；

(4)将所述表达载体转化大肠杆菌，将已转化的大肠杆菌与宿主菌进行接合转移，获得转化子；

(5)从所述转化子中筛选出所述基因工程菌。

其中，扩增去甲基萘醌甲基转移酶基因(UbiE)所采用的引物为：

上游引物：5’-TCTAGAGCATCAACGGAGGTTCAGGGTGGTGAATGAGCGACGAAACTTCCAAC-3’(下划线处为XbaI酶切位点)(SEQ ID No.4)；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCGAGCTCCGGCCGCTACTAGTTGCGAACCAGCCGCCAGA-3’(下划线处为HindIII酶切位点)(SEQ ID No.5)；

扩增3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因(UbiG)所采用的引物为：

上游引物：5’-CCAAGCTTCATCAACGGAGGAGGAGTTTGCAATGGAATCGT-3’(下划线处为HindIII酶切位点)(SEQ ID No.6)；

下游引物：5’-GGACTAGTTCAGCTGCGCCGCACGCTCGCGGTAACGT-3’(下划线处为SpeI酶切位点)(SEQ ID No.7)；

扩增2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因(UbiF)所采用的引物为：

上游引物：5’-CAAGCTTTCTAGAGCATCAACGGAGGTTCAGGGTGGTGAATGACAAATCAACCAACGGA-3’(下划线处为HindIII酶切位点)(SEQ ID No.8)；

下游引物：5’-CGAGCTCCGGCCGCTACTAGTAGGCTACAACCCTAACGCAT-3’(下划线处为SacI酶切位点)(SEQ ID No.9)。

本发明还提供了所述基因工程菌在生产辅酶Q10中的应用。

所述应用包括：

(1)将所述基因工程菌经活化后接种于种子培养液中，进行一级种子培养，获得一级种子液；

作为优选，所述种子培养液的配方为(100ml)：(NH₄)₂SO₄ 0.25g，玉米浆0.05g，酵母提取物0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖0.3g，K₂HPO₄0.05g，KH₂PO₄ 0.05g，MgSO₄ 0.1g，FeSO₄0.01g，CoCl₂ 0.003g，MnSO₄ 0.0001g，CaCO₃ 0.8g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2；

作为优选，所述一级种子培养的条件为：在30℃、200r/min下培养23h；适当的培养条件使一级种子培养结束时，一级种子液中的较多菌体处于对数生长期。

(2)将所述一级种子液接种于种子培养液中，进行二级种子培养，获得二级种子液；

所述一级种子液的接种量优选为1％。通过二级培养可以使二级种子液中菌体状态更为均匀，基本处于对数生长期，便于后续发酵培养的进行。二级种子培养的条件与一级种子培养的条件相同。

(3)将所述二级种子液接种于发酵培养液中，进行发酵培养；

所述二级种子液的接种量优选为为1％。

作为优选，所述发酵培养液的配方为(100ml)：(NH₄)₂SO₄ 0.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖4g，KH₂PO₄ 0.15g，味精0.3g，MgSO₄ 0.63g，玉米浆0.4g，FeSO₄ 0.12g，CoCl₂ 0.005g，CaCO₃ 0.6g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2；

作为优选，所述发酵培养的条件为：在30℃、200r/min下培养120h。

作为进一步优选，所述发酵培养的条件为：在30℃、200r/min下培养120h。

(4)收集菌液，从菌液中分离纯化获得辅酶Q10。

与未转化有目的基因的类球红细菌相比，利用本发明的基因工程菌生产辅酶Q10，辅酶Q10的产量提高了20％以上。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明将辅酶Q10合成途径中限速酶基因UbiE，UbiG，UbiF基因转入类球红细菌中，利用这三个基因串联过表达来强化其自身的辅酶Q10合成能力；与未转化有目的基因的类球红细菌相比，利用本发明的基因工程菌生产辅酶Q10，辅酶Q10的产量提高了20％以上。

附图说明

图1为原始质粒pBBR1MCS-2的图谱；

图2为重组质粒pBBR1MCS-2-UbiE-UbiG-UbiF的图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对发明作进一步详细说明。

实施例1重组质粒的构建

1设计引物

用Primer5引物设计软件设计了用于扩增三个目的基因的引物序列，其中，

扩增去甲基萘醌甲基转移酶基因(UbiE)所采用的引物为：

上游引物：5’-TCTAGAGCATCAACGGAGGTTCAGGGTGGTGAATGAGCGACGAAACTTCCAAC-3’；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCGAGCTCCGGCCGCTACTAGTTGCGAACCAGCCGCCAGA-3’；

其中，上游引物添加有XbaI酶切位点(下划线部分)，下游引物有添加HindIII酶切位点(下划线部分)；

扩增3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因(UbiG)所采用的引物为：

上游引物：5’-CCAAGCTTCATCAACGGAGGAGGAGTTTGCAATGGAATCGT-3’；

下游引物：5’-GGACTAGTTCAGCTGCGCCGCACGCTCGCGGTAACGT-3’；

其中，上游引物添加有HindIII酶切位点(下划线部分)，下游引物添加有SpeI酶切位点(下划线部分)；

上游引物：5’-CAAGCTTTCTAGAGCATCAACGGAGGTTCAGGGTGGTGAATGACAAATCAACCAACGGA-3’；

下游引物：5’-CGAGCTCCGGCCGCTACTAGTAGGCTACAACCCTAACGCAT-3’。

其中，上游引物添加HindIII酶切位点(下划线部分)，下游引物添加SacI酶切位点(下划线部分)。

2提取类球红细菌CGMCC No.5997的基因组

所用试剂均来自Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒，提取步骤如下：

1)吸取0.5-4ml细菌(最多5×10⁹个细菌)，13500r/min离心1分钟，尽可能吸净上清。

2)加入100μl EL Buffer，使用tip头吹打均匀。

3)37℃温育40分钟。

4)加入100μl RS Buffer,随后加入10μl PK Solution,充分混匀。

5)于56℃环境中温浴15分钟，然后移出。

6)加200μl GA Buffer并混合均匀。

7)于12000r/min离心1分钟。将上清液转移到一个新的1.5ml离心管。

8)加400μl的BA Buffer，并混合均匀。

9)将混合液体转移至Spin column。于10000r/min离心1分钟，并弃去接液管中液体。

10)向Spin column中加入500μl的G Binding Buffer。于10000r/min离心30秒，并弃去接液管中液体。

11)向Spin column中加入500μl的Wash Buffer。于10000r/min离心30秒，并弃去接液管中液体。

12)再向Spin column中加入500μl的Wash Buffer。于10000r/min离心30秒，并弃去接液管中液体。

13)再次将Spin column于10000r/min离心1分钟，并将Spin column转移至一个新的1.5ml离心管。

14)向Spin column中加入100μl Elution Buffer，并于室温温育1分钟。

15)于12000r/min离心1分钟，并弃去Spin column。1.5ml离心管中剩余液体即含有基因组DNA。

3扩增UbiE基因

用高保真酶primerstar扩增，采用标准反应体系：GC缓冲液25μl，水16μl，dNTP混合液4μl，上游引物1.5μl(10μM)，下游引物1.5μl(10μM)，类球红细菌基因组1.5μl，primerstar酶0.5μl。扩增程序为：30个循环，每个循环包含98℃变性10秒，60℃退火5秒，72℃延伸2分钟。

4.PCR产物和质粒进行酶切(所用试剂来自AxyPrep PCR清洁试剂盒)

将PCR产物取出，各加入150μl PCR A，然后均加入离心柱中，取一支空白离心柱加入400μl水，一起13500r/min离心1分钟，加入BUFFER W2 700μl,13500r/min离心1分钟，弃清液，再加入W2 700μl，再13500r/min离心1分钟；弃清液，再空离1分钟，彻底甩干离心柱，加入34μl Eluent；然后取2支离心管，一支加入UbiE 34μl，另一只加入pBBR1MCS-2 34μl，两支离心管中均加入XbaI和HindIII各1μl，BUFFER 4μl。放入37℃水浴酶切1.5小时。

5.电泳

1)制备1％琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0％琼脂糖凝胶液。冷却到65℃左右加入GelGreen染色剂3μl。

2)胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止。

3)加样：在点样板上将酶切的PCR产物和质粒与上样缓冲液混合，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。并加入10μlDNA marker-D作为对照。

4)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

5)电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察,显示750bp处有明显条带。证实UbiE的PCR扩增成功。

6.割胶回收(所用试剂来自AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)

1)割下对应条带的胶。

2)将胶放入1.5ml离心管中，计算凝胶重量(需提前记录离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(100mg＝100μl)；再加入3个凝胶体积的BUFF DE-A，混合后75℃加热融化(约6-8分钟)，期间间断混合；再加入0.5个BUFFER DE-A体积的BUFFER DE-B，混合均匀。

3)将混合液转入DNA制备管，13500r/min离心1分钟，弃滤液；加入500μl BUFFERW1，13500r/min离心30秒，弃滤液；加700μl BUFFER W2,13500r/min离心30秒，弃滤液；再加700μl BUFFER W2,13500r/min离心1分钟，弃滤液；然后再13500r/min离心1分钟；将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加入25μl Eluent，室温静置1分钟，13500r/min离心1分钟洗脱DNA。

7.T4连接酶连接，构建重组质粒

取割胶回收得到的UbiE基因5.5μl，pBBR1MCS-2质粒(其质粒图谱见图1)3μl，T4连接酶0.5μl，T4连接酶BUFFER 1μl混合，22℃水浴连接30分钟，获得重组质粒pBBR1MCS-2-UbiE。

8.PCR扩增UbiG基因并构建重组质粒

利用与上述第3～6部分相同的方法获取UbiG基因。取割胶回收得到的UbiG基因5.5μl,重组质粒pBBR1MCS-2-UbiE 3μl，T4连接酶0.5μl，T4连接酶BUFFER 1μl混合，22℃水浴连接30分钟，获得重组质粒pBBR1MCS-2-UbiE-UbiG。

9 PCR扩增UbiF基因并构建重组质粒

利用与上述第3～6部分相同的方法获取UbiF基因。取割胶回收得到的UbiF 5.5μl，重组质粒pBBR1MCS-2-UbiE-UbiG 3μl，T4连接酶0.5μl，T4连接酶BUFFER 1μl混合，22℃水浴连接30分钟，获得重组质粒pBBR1MCS-2-UbiE-UbiG-UbiF(其质粒图谱见图2)。

实施例2构建基因工程菌

1重组质粒转化到大肠杆菌S17-1

取出大肠杆菌S17-1感受态2管，冰浴10分钟后加入重组质粒pBBR1MCS-2-UbiE-UbiG-UbiF，冰浴20分钟，热击90秒，冰浴5分钟，加入600μl LB液体培养基，37℃培养45分钟后5000r/min离心5分钟，弃300μl上清液，将剩余液体涂布到卡那平板上。

2接合转移

1)接种类球红细菌CGMCC No.5997于含10ml NHU-液体培养基的试管中，于30℃、200r/min下培养36h。NHU-液体培养基的配方为(100ml)：酵母提取物0.8g，FeSO₄ 0.01g，K₂HPO₄ 0.13g，CoCl₂0.003g，NaCl 0.2g，MnSO₄ 0.0001g，MgSO₄ 0.025g，葡萄糖0.3g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg，pH调节为7.2。

2)第二天晚上接种已转化大肠杆菌S17-1的阳性克隆至LB培养液中，于37℃、200r/min下过夜培养。

3)第三天早上转接大肠杆菌S17-1，每管5ml LB培养基加入100μl菌液，并加入5μl卡那霉素，放入37℃摇床培养。培养3-4小时。

4)取4ml类球红细菌菌液和2ml大肠杆菌菌液，分装至2ml离心管中，每管1ml。

5)5000r/min离心5分钟。

6)各弃上清，加入1ml新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体。

7)5000r/min离心5分钟。

8)各弃上清，加入1ml新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体。

9)按类球红细菌和大肠杆菌的比例为100:10,100:20,100:50，100:100的比例混匀菌液。

10)在LB平板中央贴滤膜(0.22μm)，并将混合菌液浇注于滤膜中心区域。

11)将LB平板小心移至32℃培养箱中培养过夜。

12)用镊子将滤膜转移至2ml离心管中。

13)用700μl LB培养液将滤膜上的菌体冲洗下来并吹散。

14)分装涂布到含NK的NHU-液体培养基平板上，每板350μl菌液。放入32℃培养箱中培养72小时；

3接合转移完检验是否为阳性克隆

1)挑取2个生长良好的菌落至LB培养液中，培养30～48小时。

2)转接，再培养2～4小时后提取质粒(所用试剂来自AxyPrep质粒DNA小量试剂盒)。

①取2ml菌液加入离心管。13400r/min离心1分钟，弃上清。再加入2ml菌液，13400r/min离心1分钟，弃上清。

②加入250μl Buffer S1(需确认S1中已加入RNaseA)悬浮细菌沉淀，不留小的菌块。

③加250μl Buffer S2，温和并充分上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液(注：此步骤不宜超过5分钟，Buffer S2需尽量减少与空气的接触)。

④加350μl Buffer S3，温和并充分的上下翻转混合6-8次，13400r/min离心14分钟。

⑤取上清液转至制备管，置于2ml离心管中，13400r/min离心1分钟，弃上清。

⑥加入500μl Buffer W1，13400r/min离心1分钟，弃上清。

⑦加700μl Buffer W2，13400r/min离心1分钟，弃上清；再加700μl Buffer W2，13400r/min离心1分钟，弃上清(注：需确认Buffer W2已加入无水乙醇)。

⑧13400r/min空离1分钟，将制备管移入新的1.5ml离心管中，加入80μl已预热到65度的Eluent，室温静置1分钟，13400r/min离心1分钟，质粒提取完成。

⑨取1支离心管，加入步骤⑧获得的质粒34μl，BglII和PvuI各加入1μl，加入4μlBUFFER。放入37℃水浴酶切1.5小时。

⑩酶切后进行电泳检测，电泳显示在1400bp，2800bp处有明显条带，与预期相符，证实为阳性克隆。

实施例3利用基因工程菌制备辅酶Q10

利用实施例2获得的基因工程菌NHU-EFG菌株进行发酵，并以原始未经改造的类球红细菌CGMCC No.5997、仅构建有UbiE基因的类球红细菌NHU-E、仅构建有UbiF基因的类球红细菌NHU-F、仅构建有UbiG基因的类球红细菌NHU-G、仅构建有UbiE和UbiG基因的类球红细菌NHU-EG为对照，比较四种菌株的辅酶Q10产量。

具体发酵方法如下：

1、一级种子培养：挑取NHU-EFG菌株单克隆(阳性克隆)接种于含50ml种子培养液的250ml摇瓶中，在30℃、200r/mn下培养23h，获得一级种子液；

种子培养液的配方为(100ml)：(NH₄)₂SO₄0.25g，玉米浆0.05g，酵母提取物0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖0.3g，K₂HPO₄ 0.05g，KH₂PO₄0.05g，MgSO₄ 0.1g，FeSO₄ 0.01g，CoCl₂0.003g，MnSO₄ 0.0001g，CaCO₃ 0.8g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2；

2、二级种子培养：将一级种子液按1％的比例转接至含50ml种子培养液的250ml摇瓶中，在30℃，200r/min的条件下培养23h，获得二级种子液；

3、发酵培养：将二级种子液以1％的比例接种至含100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在30℃，200r/min的条件下培养120h；

发酵培养液的配方为(100ml)：(NH₄)₂SO₄0.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖4g，KH₂PO₄0.15g，味精0.3g，MgSO₄ 0.63g，玉米浆0.4g，FeSO₄ 0.12g，CoCl₂ 0.005g，CaCO₃ 0.6g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2；

4、收集菌液。

利用HPLC检测四种菌液中Q10的产量，结果见表1。

表1菌株改造前后Q10产量对比

	辅酶Q10产量
		原始菌株	2800mg/L
NHU-E	2937mg/L
		NHU-F	2900mg/L

NHU-G	2950mg/L
		NHU-EG	3045mg/L
NHU-EFG菌株	3360mg/L

由上表可见，相对于原始菌株，NHU-E、NHU-F、NHU-G菌株的辅酶Q10产量均表现出不同幅度的增加，分别增长了4.9％、3.6％、5.4％；而NHU-EG菌株的辅酶Q10产量又比NHU-E、NHU-G菌株有所增加，分别增长了3.7％、3.2％。与五个对照菌株相比，UbiE、UbiF、UbiG共表达的NHU-EFG菌株的辅酶Q10产量增加幅度最大，分别增长了20％、14.4％、15.9％、13.9％、10.3％。表明UbiE、UbiF、UbiG共表达能够显著提高类球红细菌的Q10生产量。

Claims

1.一种基因工程菌，包括辅酶Q10产生菌及转入所述辅酶Q10产生菌的目的基因，其特征在于，所述目的基因为去甲基萘醌甲基转移酶基因、2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因和3-去甲基泛醌-9 3-甲基转移酶基因，

所述去甲基萘醌甲基转移酶基因、3-去甲基泛醌-9 3-甲基转移酶基因和2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因依次连接在表达载体的同一启动子下游，

所述表达载体为泛宿主性质粒，所述泛宿主性质粒为pBBR1MCS-2，

所述辅酶Q10产生菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，

所述去甲基萘醌甲基转移酶基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基--1,4-对苯二酚羟化酶基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述3-去甲基泛醌-9 3-甲基转移酶基因的碱基序列如SEQ ID No.3所示。

2.如权利要求1所述的基因工程菌在生产辅酶Q10中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：

(3)将所述二级种子液接种于发酵培养液中，进行发酵培养；

(4)收集菌液，从菌液中分离纯化获得辅酶Q10。