CN105431157A - 用于b型腺病毒的给药方案及制剂 - Google Patents

Abstract

本公开提供了治疗人类患者的方法，其包括步骤：在单次治疗周期中全身给予多剂量的有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的胃肠外制剂，其中在每次给药中给予的总剂量为1×10¹⁰至1×10¹⁴个病毒颗粒，以及其中历时1分钟至90分钟的时段给予每一剂量的病毒，例如以2×10¹⁰个颗粒/分钟至2×10¹²个颗粒/分钟的病毒颗粒递送速率。本公开还延伸至所述溶瘤腺病毒的制剂以及该病毒和制剂与其他治疗剂的联合疗法。

Description

用于B型腺病毒的给药方案及制剂

本公开涉及例如使用有复制能力的溶瘤腺病毒治疗患者的方法，所述方法采用设计为使该病毒具有适当的治疗作用和/或使体内不良事件最小化的给药方案。本公开还延伸至本文所述的制剂，制备该制剂的方法，以及该制剂在治疗中、特别是癌症治疗中的用途。

背景

癌症是世界范围内的死亡及严重疾病的主要原因。存在超过200种不同类型的癌症，并且治疗类型取决于癌症类型。通常，治疗会涉及外科手术、化学疗法和/或放射疗法。这些治疗通常是不成功的，或仅是部分成功的，并且具有显著的副作用。癌症的5年存活率根据癌症类型可为低于5％至超过95％(CRUKstatistics,2000-2001)。例如，在2005年至2009年期间，在英国，患有结肠直肠癌的患者，其在英国男性和女性的所有癌症中占13％，具有约55％的5年存活率。对于患有转移性结肠直肠癌的患者而言这降低至仅为12％。

转移性癌症的管理主要是姑息性的，并且涉及姑息性外科手术、化学疗法、放射和支持性护理的组合。诸如总体存活、反应和毒性的临床结果是重要的，但诸如无进展存活、生活品质、便利性、可接受性和患者选择的其他结果也是重要的。显然需要新的疗法来改善这些结果。

在转化期间，癌细胞获得某些突变，所述突变使癌细胞变得更加允许被病毒感染。癌细胞还诱导宿主抗肿瘤活性的抑制。肿瘤细胞和局部微环境之内的改变产生了潜在易损性并使肿瘤暴露于病毒的感染(Liu等人2007；Liu等人2008；Roberts,2006)。

存在使用病毒来治疗癌症的悠久历史，起始于在自然病毒感染或病毒疫苗接种之后暂时性癌症缓解的轶事报道。最早的报道似乎是1912年记述的针对狂犬病而接种疫苗的患者中宫颈癌的消退。类似的结果见于接受天花疫苗接种的癌症患者中，或在诸如流行性腮腺炎或麻疹的自然病毒感染之后的癌症患者中。基于这些报道以及动物数据，在20世纪40年代晚期及20世纪50年代早期开始将活病毒接种入患者之中以用于癌症治疗。

然而，惯常经验是在偶然暂时性肿瘤消退之后，肿瘤再生长并且患者死亡。这些接种极少产生长效的完全缓解。在1957年，开发出口服脊髓灰质炎活疫苗的AlbertB.Sabin,M.D.评论到“最令人失望的方面是这样的事实，即，即使在病毒是溶瘤的且其在肿瘤中打孔时，个体对病毒的免疫反应出现得如此之快，使得效果被迅速消除且肿瘤继续生长”。

此时，已经确认大量的溶瘤病毒，但迄今被批准在世界任何地方用于临床用途的唯一的病毒是安科瑞(Oncorine(H101))，即，能够使P53-缺陷性癌细胞条件性复制的通过E1B-55KD缺失而修饰的C亚群腺病毒(H101是ONYX015的密切类似物，如Bischoff等人1996所述)。对于头颈癌，安科瑞通过肿瘤内注射而给药。

Talimogenelaherparepvec(Tvec)是基于携带ICP34.5&ICP47缺失的1型单纯疱疹病毒的溶瘤病毒，其表达作为立早基因的US11并编码GM-CSF。OPTiM试验是多国家、非盲、随机研究，其被设计为评价在患有不可切除的III期(b-c)和IV期(M1a-c)疾病的患者中使用talimogenelaherparepvec的治疗(作为肿瘤内治疗)与皮下给予的GM-CSF相比的功效和安全性。根据期中分析，talimogenelaherparepvec引发16％的患者的持久反应率，与之相比，在接受GM-CSF的患者中为2％。

目前正在开发的用于肿瘤内给药的其他溶瘤病毒包括(Sheridan2013)：

·Reolysin，3血清型溶瘤呼肠孤病毒(Dearing病毒种)

·PV701，溶瘤新城病病毒

·CG0070，编码GM-CSF的条件性复制腺病毒

·Pexastimogenedevacirepvec(Pexa-Vec,JX-594)，编码GM-CSF的删除胸苷激酶的牛痘病毒

·Cavatak，未修饰的柯萨基病毒A21

·Seprehvir(HSV1716)，携带ICP34.5缺失的条件性复制1型单纯疱疹病毒

·DNX-2401，编码结合整合素的肽的条件性复制腺病毒

·CGTG-102，编码GM-CSF的条件性复制腺病毒

ColoAd1是嵌合(Ad11/Ad3)B血清群腺病毒，其使用定向进化的方法而开发，并被认为适于治疗上皮来源的癌症及其转移形式，包括结肠直肠癌(Kuhn,I等人.2008)。

迄今为止，溶瘤病毒的临床研究已主要研究病毒的肿瘤内注射。在Aghi&Martuza(2005)的临床研究的综述中，36次研究中25次研究采用肿瘤内注射来给予病毒。然而，该方法仅对治疗易及的肿瘤实用，并且仅在其中肿瘤的结构如组织基质及其中的坏死区域不限制病毒在肿瘤内传播(Ries&Korn2002)的患者中实用。

源于癌症的死亡通常归因于不可及的肿瘤或转移瘤。肿瘤内给予的溶瘤病毒依赖于从肿瘤的全身散播，从而达到这些继发性肿瘤。然而，散播已证实是短暂的，并且常常是无效的(Ferguson等人2012)。

因此，肿瘤内注射仅适用于有限数量的肿瘤，并且不适于治疗例如诸多转移性肿瘤。

在已经普遍采用溶瘤病毒的静脉内给药的情况下，其已经与急性毒性和迅速清除相关。例如，对于C群腺病毒Ad5，其摄取由普遍存在的柯萨奇-腺病毒受体(CAR)介导，已经常报道包括急性肝毒性、流感样疾病和血液学变化在内的副作用，同时还充分描述了迅速肝清除和免疫学中和。

目前确立的观点是需要重复给药以产生并维持功效。在正在研究的所有溶瘤癌症治疗中，通常假设该治疗会是长期的，并且历时数周、数月或数年来重复给药。例如，对于PV701，至少一个患者中的治疗在约10个月内持续数个周期，并且在完成前一治疗周期与开始下一治疗周期之间有6天。

Neumanatis等人(2001)报道向癌症患者给予ONYX-015静脉内输注的至多24次每周周期。在正在进行的III期临床研究(Clinicaltrials.govidentifierNCT01708993)中，(溶瘤病毒呼肠孤病毒)在第1至3天历时1小时来输注，然后每3周历时1小时来输注，直至进展为止。在最近报道的I期临床试验(Clinicaltrials.govidentifierNCT01380600)中，在四个时机每2周静脉内给予JX-594，并且在第二次正在进行的I/II期临床试验(Clinicaltrials.govidentifierNCT01394939)中，每周静脉内给予JX-594，持续5周，然后向患有转移性结肠直肠癌的患者的肝转移瘤进行至多3次肿瘤内加强。在正在进行的OPTIM临床试验中，每两周肿瘤内给予talimogenelaherparepvec，至多18个月(Clinicaltrials.govidentifierNCT00769704)。

发明概述

本公开的第一方面，提供了治疗人类患者的方法，所述方法包括步骤：

在单次治疗周期中全身给予多剂量的有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的胃肠外制剂，

其中在每次给药中给予的总剂量为1×10¹⁰至1×10¹⁴个病毒颗粒/剂量，以及

其中给予每一剂量的病毒，以使病毒颗粒递送速率为2×10¹⁰个颗粒/分钟至2×10¹²个颗粒/分钟。

在独立的方面，本公开涉及用于治疗卵巢癌的ColoAd1，例如采用本文所述的给药方案例如向患有卵巢癌的患者给予治疗有效量的ColoAd1。

其他独立的方面，本公开涉及包括B型溶瘤腺病毒例如ColoAd1和不干扰该腺病毒活性例如病毒体内复制的化学治疗剂的联合疗法。

在一实施方案中，所述联合疗法用于治疗癌症，尤其是本文所述的癌症，尤其是结肠直肠癌或卵巢癌，包括其转移形式在内。

在一实施方案中，联合疗法中的ColoAd1根据本文所述的方案给药。

还提供了用于在本文所述的治疗中的有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的胃肠外制剂。

本公开还延伸至有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的胃肠外制剂在制造本文所述的药物中的用途以及在本文所述的治疗中的用途。

一方面，还提供了有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的1×10¹⁰至1×10¹⁴个，例如6×10¹²个病毒颗粒的单位剂量。

还提供了用于给予病毒颗粒的2×10⁹至2×10¹²个病毒颗粒(VP)/分钟，例如1.5×10¹¹个VP/分钟的输注速率或注射速率。

附图简要说明

图1示出在新鲜的全人血的存在下对ColoAd1的A549细胞的细胞毒性谱。

图2注射后24小时在正常BalbC小鼠中ColoAd1的1e11(1×10¹¹)个颗粒的生物分布。

图3注射后1小时和72小时在CD46转基因小鼠中ColoAd1和ColoAd1CJ132的生物分布。

图4在随后的65天，ColoAd1从表达CD46的小鼠中的主要器官肝脏、脾脏和肺的清除动力学。

图5在使用或不使用中和血清的共给予的情况下ColoAd1在小鼠中的动力学。

图6在CD-1小鼠的临床前毒理学研究中于第一剂量及随后的相等治疗剂量之后的细胞因子水平。

图7A-C在ColoAd1的静脉内给药之后于患有转移性实体上皮肿瘤的人类癌症患者中随时间的细胞因子水平(ng/L)(TNF(A)、γ干扰素(B)和IL6(C))。

图8A在患有转移性实体上皮肿瘤的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图8B在患有转移性实体上皮肿瘤的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图9A历时5分钟的给予1e10(1×10¹⁰)个ColoAd1病毒颗粒的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图9B历时5分钟的给予1e11(1×10¹¹)个ColoAd1病毒颗粒的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图9C历时5分钟的给予1e12(1×10¹²)个ColoAd1病毒颗粒的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图9D历时5分钟的给予1e13(1×10¹³)个ColoAd1病毒颗粒的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图9E历时5分钟的给予3e12(3×10¹²)个ColoAd1病毒颗粒的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图9F历时20分钟的给予3e12(3×10¹²)个ColoAd1病毒颗粒的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图9G历时40分钟的给予6e12(6×10¹²)个ColoAd1病毒颗粒的人类癌症患者中ColoAd1(基因组拷贝/mL血液)的全身药代动力学。

图10相同剂量的输注越慢，在输注结束时cMax水平越低(群组5相较于群组6)。

图11在ColoAd1的静脉内给药之后于患有转移性实体上皮肿瘤的人类癌症患者中随时间的MCP1水平(ng/L)。

图12示出细胞中ColoAd1复制周期的示意图。

图13癌细胞的ColoAd1感染被显示为在用病毒体外感染之后于结肠直肠细胞系中的细胞核染色。

图14A在由IT给予ColoAd1之后来自患有结肠直肠癌的患者的结肠直肠组织中的ColoAd1的细胞核染色(六联体染色)。

图14B图14A的同种型对照染色。

图14C结肠直肠组织(六联体染色)显示在基质细胞(在向结肠直肠癌患者静脉内给予ColoAd1之后)中没有细胞核染色。

图14D图14C的同种型对照。

图15320种化合物(临床批准的或正在开发的化合物)，其被分析对病毒复制的影响。

图16A-D体内鼠科模型显示紫杉醇和ColoAd1联合疗法(及对照)的作用。

图17-18鼠科模型中ColoAd1和化学疗法的体内数据。

发明详述

在一实施方案中，所给予的剂量为1×10¹⁰至1×10¹³个，例如1×10¹⁰至1×10¹²个病毒颗粒。

在一实施方案中，在一个治疗周期中所给予的总剂量为1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²或9×10¹²个病毒颗粒。

在一实施方案中，在一个治疗周期中所给予的总剂量为6×10¹²个病毒颗粒。

本发明人假设，功效的最关键之处是在早期例如在出现抗病毒免疫反应之前于肿瘤内建立生产性感染。

因此给药方案必须权衡递送足量病毒，以例如在长至足以在癌细胞中接种病毒感染的时段内产生充足的病毒血浆水平，同时在患者中不引发毒性和严重的不良事件(或使其最小化)。

本发明人已经首次表明可以通过静脉内给予病毒颗粒剂量来建立B型腺病毒对肿瘤的感染。本文提供了对该结论的支持，其中在染色细胞的六联体时以及还在由PCR进行独立分析时，静脉内接受使用ColoAd1治疗的患有结肠直肠癌的患者表现出在癌细胞的细胞核中具有病毒感染。细胞核中的病毒表明病毒的病毒寿命周期正在进展中，并且患者中的病毒载量的增加表明病毒能够复制。

当向患者全身给予溶瘤腺病毒时，需要考虑许多的给药变量。这些给药变量包括但不限于：病毒给予途径；所给予的病毒的剂量；每一剂量的病毒给药速率；在给定周期中个别病毒给予之间的间隔；每一治疗周期的病毒给予的数量；治疗周期之间的间隔；治疗周期的数量；以及最后，用于增强功效或使副作用最小化的任何联合药物(co-medicaments)或其他支持性护理的使用。每次给药参数转而取决于正在研究的溶瘤病毒的类型的具体特性。

关键参数将包括，但不限于：相对于非肿瘤细胞，病毒与肿瘤细胞的任何结合的相对程度和亲合力；相对于非肿瘤细胞，病毒在肿瘤细胞中的相对选择性和效能；网状内皮组织细胞(例如肝库普弗细胞)对病毒的主动摄取和清除的速率，以及血液成分对病毒的任何特异性或非特异性结合。

这些关键参数转而被具体病毒类型的重要物理和表型特性驱动，所述重要物理和表型特性包括但不限于：病毒的受体特异性；在病毒外壳上携带的电荷；包膜的存在或不存在；病毒颗粒的尺寸；病毒颗粒的免疫原性；病毒颗粒的炎症性可能性；病毒的肿瘤特异性；病毒的复制速率；以及病毒的杀灭效能。

因此，任何给定的给药方案的适用性将随着病毒的不同类型而变化，并且最适宜的方案可以针对于所给予的病毒的类型。例如，Zhang等人(2012)描述了这样的Ad5-Ad48嵌合病毒，建立该嵌合病毒以降低与凝血因子X的六联体结合，从而消除肝脏扣留、增强循环并降低毒性，同时维持抗肿瘤活性。同样地，Shashkova等人(2009)描述了当作为潜在抗癌剂研究时，野生型人类腺病毒血清型5、6、11和35之间的显著差异。因此，预期不同的病毒类型当向人类全身给予时会表现出显著差异，并因此在没有体内数据和优选的支持性临床数据的情况下不能预先预测最佳的给药策略。

当与例如更加有规律地间隔且长期重复的给药的当前实践相比，本文所述的给药方案可以尤其适于对B群腺病毒实现这样的情况。

对给定的溶瘤腺病毒的优化给药方案的目的因此是使病毒向肿瘤细胞的递送最大化，同时使副作用(不良事件)的诱导和抗病毒免疫力最小化，从而产生适当的风险效益治疗谱，同时还根据治疗酌情允许重复病毒给予。优化给药方案因此将在病毒类型之间存在差异，并且具体地由于病毒外壳的差异而在腺病毒亚型之间存在差异。

现有技术已基于Ad5进行许多工作，所述Ad5是C亚群腺病毒，其传染性由柯萨奇-腺病毒受体介导。当全身递送时，超过90％的所递送的剂量由肝脏占据。针对肝脏的迅速且大量的损失降低了被肿瘤摄取的病毒并减小治疗功效。该剂量的绝大部分被产生细胞因子的固有免疫细胞，例如库普弗细胞，其是寄存于肝脏中的特有巨噬细胞，所占据。Ad5也表现出肝毒性并且导致坏死及随后的库普弗细胞消耗。

Shoshkova等人2009表明通过随后递送Ad5载体，Ad5对库普弗细胞的消耗增加了肝细胞转导的水平，并且还建议关于Ad5所阐明的机制不必相关联于来自B亚群的腺病毒，例如Ad11和Ad35。其中的数据建议C亚群腺病毒与库普弗细胞以类似方式相互作用，而B亚群腺病毒未被库普弗细胞完全识别或者不能导致这些细胞死亡。特别地，Shoshkova建议使用基于Ad11的病毒的预先给药(pre-dosing)对库普弗细胞不具有与Ad5相同的有益作用。该论文推断尽管可能存在着对B亚群腺病毒(包括Ad11)的一些结合，其影响实际上是极小的。

尽管不希望受理论限制，但本发明人确信与现有技术的建议相反，产生细胞因子的固有免疫细胞如库普弗细胞可以在B亚群腺病毒清除方面发挥作用。

此外，凝血因子X与Ad5六联体的结合是肝细胞感染的机制，并且该机制还关联于体内其他腺病毒(参见例如MolecularTherapyvol.17no.10,1683-1691,2009年10月)，但通常不是来自B亚群的腺病毒的肝摄取的机制。

Ad5的高总体血清阳性率(在人类群体中的高Ad5中和抗体滴定度)以及某些其他腺病毒血清型代表了对全身施用基于高血清阳性率腺病毒的疗法的着重关注，因此此类血源性病毒能够被预先存在的抗体中和，Vogels等人JournalofVirology,Aug2003Vol77,No.15第8263-8271页。

B亚群腺病毒在此方面具有某些固有的优势，因为它们与更低的血清阳性率相关(Stone等人JournalofVirology2005Vol79No.8page5090-5104)并具有更低的炎症性可能性。起始给药因此可以比例如Ad5更加有效。然而，在全身递送之后回避免疫系统的能力可能仍变成与重复给药相关的问题。因此，甚至在癌症局部抑制免疫系统的情况下，对免疫系统的回避仍可能是基于B亚群腺病毒的溶瘤病毒疗法的长期成功的最大障碍。

本发明人生成的数据支持了这样的观点，即，B亚群的溶瘤腺病毒的治疗作用因此可以得到改善和/或可以通过采用适宜的给药方案来使免疫系统对腺病毒的中和的消除最小化。

在一实施方案中，本文的给药方案还可以使副作用例如流感样症状和炎症性反应最小化。

在一实施方案中，在已经出现特异性抗病毒免疫反应之前，在早期“给药窗口”期间重复给予具有复制能力的腺病毒，并且当特异性抗病毒免疫反应再次衰落时，可以再次利用稍后的给药窗口。即，在短时间段内的多次治疗，随后是一时间段，然后开始后续的治疗周期。

有利地，通过以这样的方式给予具有复制能力的腺病毒，病毒血液水平足以在肿瘤(已知是免疫抑制的环境)内建立自我扩增的感染，由此潜在地避免对使用溶瘤病毒的长期重复给药的需求。为了在肿瘤内建立自我扩增的感染，有益地将患者血流内的病毒水平尽可能长久地但在不产生不良事件的情况下维持在高于有效感染浓度的水平。该构思类似于确定病毒的治疗窗口，即，在优化治疗作用且使副作用最小的情况下的剂量范围或给药方案。

这可以通过优化所给予的剂量和病毒输注速率而实现。在一实施方案中，病毒的输注速率等于或大于人体对病毒的清除速率。

一旦在肿瘤内建立感染，则病毒被相对保护以免于中和抗体，并且被提供了潜在许可的环境以进行复制并在没有剂量限制性毒性的情况下产生治疗作用。

此外，发明人假设病毒浓度的峰值(C_max)造成副作用，并且更平坦的药理学曲线是期望的。

在一实施方案中，C_max被保持低于特定值，例如3×10⁸个DNA拷贝/ml。似乎高于相关阀值的C_max水平在某些患者中更可能诱导严重的不良事件或毒性。

在一实施方案中，输注速率与所给予的病毒的绝对量相比更加有影响。

基于在临床中生成的数据，本发明人还确信可以在延长的时段，例如高至72小时或更久(其中所递送的病毒的总剂量高于6×10¹²个病毒颗粒)内，以高于清除速率且高至1.5至2×10¹¹个病毒颗粒/分钟的速率递送病毒，而在患者中不引发严重的不良事件。

在一实施方案中，在血液中的病毒基因组的C_max被维持在小于3×10⁸个基因组/ml血液的水平。

本发明人已经评估在许多情境中的病毒的初始清除速率，并确信估算的α-半衰期为18分钟。

在溶瘤病毒疗法中使用预防性抗炎剂是有争议的。一方面，已经提议它们的使用可以使不良事件最小化，并由此增加溶瘤新城病病毒的耐受性(Lorence等人2007)。另一方面，已经报道发热的出现可能与腺病毒的增强的溶瘤功效相关(Yu等人2007)。

本发明人已经发现，在该治疗周期中所给予的预防性或治疗性药剂(包括抗炎剂、类固醇、止吐剂、止泻剂或镇痛剂)的使用可能增强该方案的耐受性，尤其允许更高或更频繁的剂量。

在一实施方案中，在治疗周期中给予类固醇。

本发明人由此假设单独地或协同地使用的6个参数对于实现溶瘤B亚群腺病毒的适当递送的目标是重要的。

a)每一剂量所给予的病毒颗粒的数量，

b)给予每一病毒剂量的速率(每分钟所递送的病毒颗粒的数量)，

c)治疗周期中单独病毒剂量的数量，

d)治疗周期内每一单独剂量之间的间隔，

e)治疗周期中预防性抗炎药物的使用，以及

f)治疗周期之间的时间段。

这些参数可以彼此相平衡，即，可以以更慢的输注速率来给予增加的剂量以抵消该增加造成的负面作用。

如果剂量过低，则病毒颗粒的水平不足以建立对癌细胞的有效感染。如果给药速率过慢，则病毒颗粒可以容易地被天然病毒陷阱(viralsinks)(例如产生细胞因子的固有免疫细胞，诸如库普弗细胞或血液组分)清除，并且未实现对癌症/肿瘤细胞的有效感染。如果病毒剂量过高和/或如果给药速率过快，则不良事件的数量可能由于病毒颗粒的高浓度而增加。后者则诱导炎症性细胞因子反应，这可以增加患者所经历的副作用。适度输注速率因此可以优化所递送的剂量。

平均而言，B型腺病毒例如ColoAd1的清除速率具有约18分钟的半衰期。

病毒的单次剂量可能不能建立感染，但可以充分地占据或去除病毒陷阱(例如产生细胞因子的固有免疫细胞，诸如库普弗细胞或血液组分)。如果病毒陷阱已被充分地占据或去除，并且如果之后不久便给予后续计量，则稍后剂量的病毒动力学可以被改变，并且循环半衰期更长和/或峰值血浆水平更高。在这种情况下，在第一剂量之后短期内给予的一次或多次剂量可以更有效地建立对癌细胞的有效感染。

然而，如果给予的后续剂量间隔过大(例如，大于14天的间隔)，则病毒陷阱可能有时间补充，并且先前剂量的益处可能丧失和/或可能已出现特异性抗病毒免疫反应。使用这种形式的给药方案，例如产生细胞因子的固有免疫细胞例如肝库普弗细胞的消耗可以具有重要的二次益处，因为对于后续病毒剂量，库普弗介导的细胞因子释放可以被大幅降低，从而即使面对更高的病毒血浆水平也会更好地耐受这些剂量。

因此，本发明人提倡历时相对短的时段来给予规定的治疗周期，例如下文所述。

根据本发明人完成的工作，似乎对于B群腺病毒，在治疗周期中的多剂量适于在最小毒性的情况下使用溶瘤B型腺病毒感染癌细胞，其中在相对短的时间段内给予每一剂量，以适度快的输注的形式给予每一剂量，任选地与预防性药剂组合，以及每一剂量间隔相对短的时间段。

可以酌情重复治疗周期。

本发明人已经监测作为急性毒性的标记物炎症性细胞因子TNF、γ干扰素、IL-6和MCP-1，并确信通过第或后续剂量，在每一情况下毒性降低并且病毒感染癌细胞的可能性增加，因为非癌性病毒陷阱被第一次剂量和第二剂量去除或占据，条件是这些剂量以适宜的剂量水平、速率和频率来给予。

在一实施方案中，在治疗周期中采用三次剂量，并且在其他实施方案中，在治疗周期中采用多于三次的剂量。

在一实施方案中，在第1、3、5、14和21天中的任一天或全部天给予剂量。

在另一实施方案中，以维持剂量或加强剂量的形式给予后续剂量，例如两周一次、每周一次、每隔两周或每三周一次，诸如每周一次或每三周一次，持续适当的时段，尤其在治疗作为维持疗法益于患者时，例如在患者保持缓解时。

技术人员会认识到可以根据个体患者的需要对治疗周期进行各种调整。

本公开还延伸至用于通过在单次治疗周期中全身给予至少一次剂量例如多剂量的包含腺病毒的胃肠外制剂来治疗人类患者的有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒，其中在每次给药中给予的总剂量为1×10¹⁰至7×10¹²，例如1×10¹⁰至5×10¹²个病毒颗粒，并且历时1分钟至90分钟的时段给予。

其他方面，本公开延伸至有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒在制造通过在单次治疗周期中全身给予至少一次剂量例如多剂量的包含该腺病毒的胃肠外制剂来治疗人类患者的药物中的用途，其中在每次给药中给予的总剂量为1×10¹⁰至1×10¹³，例如1×10¹⁰至7×10¹²，如1×10¹⁰至5×10¹²，或6×10¹²个病毒颗粒，并且历时1分钟至90分钟的时段给予。

在一实施方案中，在给定周期的治疗中的第一剂量低于该周期的后续治疗中给予的剂量。

与Shoshkova的建议相反，基于在小鼠中的工作，使用基于Ad11的病毒的预先给药对诸如库普弗细胞的产生细胞因子的固有免疫细胞不具有有益的促发效应。实际上，对剂量以及B群溶瘤腺病毒剂量的给药之间的时序的优化可以用于使副作用最小化，由此是有益的。

在一实施方案中，所给予的剂量为6×10¹²，例如历时20分钟至60分钟，诸如40分钟的时段。

在一实施方案中，高的第一剂量和第二剂量(即，这可以对应于常见治疗剂量)可期望完全占据产生细胞因子的固有免疫细胞如库普弗细胞(和/或其他病毒陷阱)，因此优化后续剂量的递送。换句话说，第一剂量和第二剂量可以是相同的。

在一实施方案中，所给予的所有剂量包含等数量的病毒颗粒。这可以是尤其有利的，因为其简化了病毒制剂的制造、降低了给药错误的风险、并且实际上可以提供高度有效的治疗方案。

在一实施方案中，在完成先前治疗周期之后1个月至6个月提供后续治疗周期，例如之后2、3、4、5个月，从而使免疫反应衰退。

在一实施方案中，后续周期可以是每周一次或每两周一次给予的单次剂量，持续1个月至5年的时段，例如6、7、8、9、10、11、12、18、24、30或36个月。

在一实施方案中，后续治疗周期在给予第一治疗周期的最后剂量的约14天内开始。

后续周期还可以以维持剂量形式发挥作用，由此有助于将病毒载量保持在足以提供治疗作用的水平。

在一实施方案中，有1、2、3、4、5个或更多个后续治疗周期，例如1或2个。

在一实施方案中，仅有一个治疗周期，没有后续治疗周期。

在一个实施方案中，提供了用于输注或注射有复制能力的溶瘤B亚群腺病毒(例如ColoAd1)的液体胃肠外制剂，其中所述制剂提供了1×10¹⁰至1×10¹⁴个病毒颗粒/体积剂量，例如6×10¹²个病毒颗粒/剂量的剂量。

还公开了通过给予本公开的胃肠外制剂来治疗患者的方法，所述胃肠外制剂包含有复制能力的溶瘤B亚群腺病毒，例如包含本文所述的剂量，例如6×10¹²个病毒颗粒/剂量。

还公开了由所给予的本公开的胃肠外制剂治疗患者的方法，所述胃肠外制剂包含有复制能力的溶瘤B亚群腺病毒，所述方法包括向所述患者共同给予选自抗炎剂、类固醇、抗组胺剂、退热剂以及用于水合作用的液体中的一种或多种物质或药物。

还公开了测定何时适于向个体给予本公开的胃肠外制剂的后续周期的方法，所述胃肠外制剂包含有复制能力的溶瘤B亚群腺病毒，所述方法包括步骤：测定在第一次治疗周期之前患者的特异性抗病毒免疫力的预先存在的滴定度，

连续测定在第一次治疗周期之后的患者的特异性抗病毒免疫力，以及

延迟任何后续治疗周期，直至患者的特异性抗病毒免疫力已经降低至基线的预先设定的百分数。

本文所用的术语“连续测定”系指在多个时点测定患者的抗病毒免疫力，所述时点可以有规律地或者无规律地间隔开。例如在特定时间段内，所获得的多个读数可以用于生成平均滴定度。

本文所用的术语“基线的预先设定的百分数”系指这样的病毒滴定度，考虑到诸如在开始治疗之前所测量的基线、患者的预后、正在进行的癌症疗法、任何不良副作用等的因素，该病毒滴定度被定义为针对特定患者的阀值或限度。

在一实施方案中，“基线的预先设定的百分数”是患者的基线病毒滴定度的90％或更低，例如80％或更低、70％或更低、60％或更低、50％或更低、40％或更低、30％或更低、20％或更低、或者10％或更低。

在其他实施方案中，在给予后续治疗周期之前不进行测试。

在一实施方案中，提供了内部容积为3ml至50ml的玻璃或塑料注射器的用途，所述注射器包含胃肠外制剂，所述胃肠外制剂包含1×10¹⁰至1×10¹⁴，例如1×10¹⁰至7×10¹²(诸如1×10¹⁰至6×10¹²、或1×10¹⁰至5×10¹²、或1×10¹⁰至4×10¹²、或1×10¹⁰至3×10¹²、或1×10¹⁰至2×10¹²、或1×10¹⁰至1×10¹²)个有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的病毒颗粒，其中所述制剂是无菌的，并且在无菌条件下被装填入该注射器，以用于治疗，尤其用于制造能够向人类个体注射或静脉内输注的药物。

技术人员会认识到该制剂可以包含过量的病毒颗粒，例如以补偿可能粘附于注射器表面并且随后不被给予的病毒颗粒。

有利地，这样的预装填的注射器通过消除对使用昂贵资源的专业制药学例如专业仪器(包括排气罩)和受过训练的人员中的剂量配制的需求，从而显著增加了所制造的B亚群溶瘤腺病毒的可用性和成本效率。

本公开还延伸至所述制剂的预装填的小瓶，尤其是各自包含在本文所定义的范围内的单次剂量的小瓶。

在一实施方案中，将病毒制剂提供为适于在向患者给药之前由无菌等渗稀释剂例如盐水、葡萄糖或类似物本地稀释的浓缩物形式，例如浓缩液。

有利地，本文的给药方案适于向癌症靶标递送治疗有效量的B亚群溶瘤病毒。特别地，本文的给药方案可以最小化例如血源性试剂、陷阱(sinks)、产生细胞因子的固有免疫细胞例如库普弗细胞、和免疫系统对溶瘤病毒的中和和/或清除。后者可导致溶瘤病毒的治疗剂量的更好的有效性，总体而言为患者改善的预后和/或改善的存活。有利地，本文的方案还可以通过使治疗期间的不良事件和/或副作用最小化而向患者提供改善的生活品质。

在一实施方案中，与接受在申请时通用的标准治疗的患者相比，接受本公开的治疗的患者表现出提高的存活率，例如存活的统计学显著的增加。

在一实施方案中，与申请时的标准治疗相比，接受本公开的治疗的患者表现出降低的肿瘤负荷，例如统计学显著的降低。

在一实施方案中，与申请时的标准治疗相比，接受本公开的治疗的患者表现出增加的得到缓解的可能性，例如统计学显著的增加。

在一实施方案中，与申请时的标准治疗相比，在接受本公开的治疗的患者中，转移瘤的量或程度是降低的，例如是统计学显著降低的。

尽管不希望受理论限制，但认为单核吞噬细胞系统的细胞，尤其是产生细胞因子的固有免疫细胞例如库普弗细胞，可以负责B型溶瘤病毒从循环中的清除，尽管现有技术建议了其他方式。

此外，由本发明人进行小鼠研究使其确信，在治疗方案中的第一或第二剂量之后，产生细胞因子的固有免疫细胞例如库普弗细胞被消耗或占据，从而它们不能有效地清除例如第三剂量和后续剂量，条件是在第二剂量之后的短时间框架内给予那些剂量，或者可以观察到更低的毒性，或者两种情况均有。假设细胞因子标记物指示后者，因为当与第一剂量相比时，在给予第二或第三剂量之后细胞因子的水平未显著升高，条件是在相对短的时间段内给予所述剂量。本发明人认为这表示用于清除该病毒的机制可能在第一和第二剂量之后被减弱。

尽管在小鼠中的研究不能总匹配在人类系统中所见的情况，尤其在病毒内，但在此实例中，人类观察结果似乎与在由本发明人进行的鼠科模型中的观察结果完全相关联。本发明人也已经在人类个体中例证了给药方案对ColoAd1的细胞因子反应和药代动力学的影响。

如本文所用，“通过全身给药来治疗患者的方法”意指向人类给予治疗剂以使该实体进入患者循环系统的方法，特别其中该治疗意欲阻止或减缓恶性肿瘤如癌症或与其相关的并发症或症状的进展、减轻或治愈恶性肿瘤如癌症或与其相关的并发症或症状，例如通过静脉内给药向循环系统直接给药。

在一实施方案中，全身递送提供了治疗原发性肿瘤，任何明显的、不可及的或未确诊的肿瘤、和/或转移瘤的机遇。这是尤其有利的，因为其可以产生患者的更好的总体预后和/或改善的存活。

因此本文所用的全身递送不是指定位于肿瘤中或体腔例如腹膜腔内的治疗。全身递送的实例包括静脉内输注以及肌肉内和皮下注射。

胃肠外制剂是指经设计既不通过胃肠道递送也不通过局部给药的制剂。典型的胃肠外递送途径包括注射、植入或输注。在一实施方案中，制剂以用于推注(bolus)递送的形式提供。

在一实施方案中，胃肠外制剂的形式为注射剂。注射包括静脉内注射、皮下注射、肿瘤内注射或肌肉内注射。本文所用的注射是指经由注射器将液体插入体内。在一实施方案中，本公开的方法不涉及肿瘤内注射。注射通常涉及在短时间段例如1.5分钟以下内给予150mL以下的流体。

在一实施方案中，将制剂递送入腹膜腔。

对于头颈癌或者上皮癌的脑转移瘤，颅内注射可能是必须的。

在一实施方案中，胃肠外制剂的形式为输注剂。

本文所用的输注是指通过点滴、输注泵、注射器驱动器或等效装置以更慢的速率来给予流体。在一实施方案中，历时1.5分钟至90分钟的时段给予输注，例如3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。

在一实施方案中，所给予的制剂的体积是100mL或更少，尤其是50mL或更少，例如30mL、10mL、5mL或更低，如3mL，例如通过注射器驱动器来进行给予。后者可以被称为缓慢注射。

在一实施方案中，以0.5至6ml/分钟，例如0.76ml/分钟的速率递送输注剂。

在一实施方案中，以2×10⁹至2×10¹²个病毒颗粒(VP)/分钟，例如1.5×10¹¹个VP/分钟的速率递送输注剂。

在一实施方案中，以缓慢注射的形式，例如历时1.5至30分钟或1.5至40分钟时段给予注射剂。

在一实施方案中，制剂用于静脉内给药。该途径尤其有效地递送溶瘤病毒，因为其允许迅速到达大部分器官和组织，并且尤其可用于治疗转移瘤，例如确立的转移瘤，尤其是位于高度血管化区域例如肝脏和肺部中的转移瘤。

在一实施方案中，采用给药方法的组合，例如静脉内和肿瘤内、或者腹腔内和肿瘤内、或者静脉内和腹腔内。

因此，在一实施方案中，本公开的全身给药可以同时地或依次地与其他给药途径例如肿瘤内给药组合使用，例如第一预治疗周期可以是肿瘤内给药，而第二治疗周期可以是本公开的全身给药。或者，根据情况，第一治疗周期可以基于本公开，而后续周期或加强可以是肿瘤内给药。治疗制剂通常会是无菌的且在制造和储存条件下是稳定的。组合物可以被配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适于向人类给药的胃肠外制剂，并且可以配制成预装填装置，例如注射器或小瓶，尤其配制成单次剂量。

在一实施方案中，在治疗周期中使用2次或更多的剂量，例如在每一治疗周期中采用2、3、4、5或6次剂量，并且例如可以以试剂盒形式提供。

在给定的治疗周期中给予的每一剂量在本文可以被称为治疗。

在一实施方案中，与在周期中给予的后续剂量相比，采用更低的第一剂量，例如更低的剂量可以为后续剂量的30至95％，例如50％、60％、70％或80％。

在一实施方案中，与在周期中给予的后续剂量相比，采用更高的第一剂量，这可以期望完全占据产生细胞因子的固有免疫细胞例如库普弗细胞，因此优化后续剂量的递送。

更高的剂量是指超过后续剂量的100％，例如后续剂量的105至150％，诸如后续剂量的110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％或145％。

在一实施方案中，所给予的1、2、3次或所有剂量包含等数量的病毒颗粒。这可以是尤其有利的，因为其简化了病毒制剂的制造，并且实际上可以提供高度有效的治疗方案。

在一实施方案中，“相同剂量”，即在一次或多次剂量，例如治疗周期中的所有剂量中给予相同数量的病毒颗粒，然而，可以以不同速率给予该剂量，例如本文所述。

本文所用的治疗周期是根据计划表而重复的疗程中的休息期与其间的休息期之间的治疗期。治疗周期通常是指作为治疗的程序或计划表的一部分而给予的多次(即至少两次)治疗，在相对短的时间段例如约1至4周，如3周、2周或1周内给予。通常，给定的治疗周期会是较大的治疗方案的一部分。

在一实施方案中，治疗周期是14天或更少的时段，例如10、9、8、7或5天，如7或5天。

在一实施方案中，每一其他剂量是以约48小时的间隔给予的，例如每隔40至56小时。这是有利的，因为其允许在正常工作周内或门诊环境内进行给药。

在一实施方案中，在第1天给予第一剂量，并且之后每隔一天给予其他治疗剂量，例如在第1、3、5、7、9、11和13天，或者之后每隔约48小时给予一次，例如每隔40至56小时。

在一实施方案中，在给予剂量(例如第二或后续剂量)之后在患者中病毒的血浆水平是至少2×10⁶个病毒颗粒/ml，例如持续15分钟或更久，例如20、30、40、50、60分钟或更久。

由本发明人进行的体外研究(参见图1)建议对于在37℃的人类全血中的病毒颗粒，在<2×10⁶个颗粒/ml的情况下，杀灭下降至低于50％。此外，使用空斑检定，本发明人已经能够表明当病毒基因组水平高于例如1.6e6至1e8时在患者血液中存在活病毒颗粒，并且可以一致地检测到。

在一实施方案中，在治疗周期之间存在至少14天。

制剂通常将包含药学可接受的稀释剂或载体，例如无毒等渗载体，其与病毒相容且其中病毒在必要时间段内是稳定的。

载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用分散剂或表面活性剂例如卵磷脂或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯80或40来维持适当的流动性。在分散剂中，可以通过表面活性剂的存在来辅助维持所需的粒径。示例性等渗试剂在组成方面包括糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。

在一实施方案中，采用无菌等渗稀释剂，例如盐水或葡萄糖(例如使用5％葡萄糖)。

在一实施方案中，所述方法中采用的胃肠外制剂可以包含以下一种或多种：缓冲剂，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、磷酸盐缓冲剂和/或Tris缓冲剂；糖，例如右旋糖、甘露糖、蔗糖或类似物；盐，例如氯化钠、氯化镁或氯化钾；清洁剂，例如非离子表面活性剂，如PS-80、PS-40或类似物。制剂还可以包含防腐剂，例如EDTA或乙醇或EDTA和乙醇的组合，其被认为防止一种或多种可能的降解途径。

在一实施方案中，制剂将包含纯化的溶瘤病毒，例如1×10¹⁰至1×10¹⁴个病毒颗粒/剂量，例如1×10¹⁰至7×10¹²个病毒颗粒/剂量，尤其是1×10¹⁰至1×10¹²个病毒颗粒/剂量，包括酌情过量的情况。

在一实施方案中，本公开的制剂包含6×10¹²个病毒颗粒。

在一实施方案中，制剂中的病毒的浓度为2×10⁸至2×10¹⁴vp/mL，例如2×10¹²vp/ml。

在一实施方案中，胃肠外制剂包含丙三醇。

在一实施方案中，制剂包含来自B亚群的溶瘤腺病毒、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)、丙三醇和缓冲剂。

在一实施方案中，胃肠外制剂由病毒、HEPES例如5mM、丙三醇例如5-20％(v/v)、盐酸例如用于将pH调节至7-8和注射用水组成。

在一实施方案中，将浓度为2×10¹²vp/mL的0.7mLColoAd1配制于5mMHEPES、20％丙三醇中，并且最终pH为7.8。

可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来产生可注射组合物的延长吸收。

因此，可以在定时释放制剂，例如在包含缓释聚合物的组合物中来给予本文所用的溶瘤病毒。可以与载体一起配制溶瘤腺病毒，所述载体将保护该溶瘤腺病毒使其免于中和和/或防止迅速释放，例如控释制剂，如植入物和微胶囊化递送系统。

可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLG)。还可以使用生物相容性不可降解的聚合物，例如聚乙二醇和聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)。用于制备此类制剂的诸多方法对于本领域技术人员是已知的。

可以通过将所需量的溶瘤腺病毒并入适宜的溶剂例如具有本文所述的与之相关的成分之一或成分的组合，然后过滤灭菌，从而制备无菌的可注射溶液。通常，通过将溶瘤腺病毒并入包含基础分散介质和所需的其他成分的无菌载剂中，从而制备分散体。

通常，本公开的胃肠外制剂是基本不含颗粒的无菌液体制剂如水性制剂，例如通过经过0.2微米过滤器而无菌制备和灭菌的。

在一实施方案中，给予治疗性胃肠外制剂以使制剂与患者上皮的接触最小化，例如采用双套针管(sheathedneedle)或经由插管。这种预防措施被认为通过使与皮肤中的郎格罕细胞的接触最小化而使患者对溶瘤病毒的免疫反应最小化。

本文所述的有复制能力是能够在宿主细胞中复制的病毒。在一实施方案中，有复制能力包括复制竞争性病毒和复制选择性病毒。

本文所用的复制竞争性意欲表示这样的溶瘤腺病毒，其能够在人类细胞例如癌细胞中复制，而与野生型病毒所需的复制没有任何额外的互补，例如不依赖于有缺陷的细胞机器(cellularmachinery)。即，与非肿瘤细胞相比，它们通过优先感染肿瘤细胞而是肿瘤选择性的。ColoAd1是复制竞争性病毒的实例。

本文所用的复制选择性或选择性复制意欲表示这样的溶瘤腺病毒，其能够利用对癌细胞特异的成分或在其中上调的成分例如有缺陷的细胞机器，如p53突变而在癌细胞中复制，由此允许相对于健康/正常细胞的选择度。

本文所用的B亚群溶瘤腺病毒系指至少包含与正常细胞相比优先感染和/或溶解肿瘤细胞的来自B亚群的六联体和纤维(参见Shenk等人和表1)的腺病毒。因此，本文所用的B亚群溶瘤腺病毒包括具有B群腺病毒的纤维和六联体且保留溶瘤特性的嵌合体、突变体或变体。

本文所用的腺病毒或腺病毒血清型是指目前已知的(51)或将来分离的任何人类腺病毒血清型。参见例如Strauss(1984)和Shenk(2001)。腺病毒血清型被分类为如表1所示的亚群。

表1示出腺病毒血清型的划分：

B亚群病毒的实例包括Ad11(野生型)，例如Ad11a和Ad11p(GenbankAccessionNo:AF532578)和嵌合腺病毒ColoAd1。后者公开于WO2005/118825中，并且该病毒的完整序列在其中的SEQIDNO:1中提供。

因此，在一实施方案中，本公开的方法中采用的病毒是嵌合病毒。

本文所用的嵌合腺病毒是指这样的腺病毒，其具有来自两种以上的不同腺病毒血清型的DNA的腺病毒，例如使用通过援引并入本文的WO2005/118825的方法而生成的那些。

在一实施方案中，嵌合腺病毒是ColoAd1。ColoAd1被认为通过与细胞凋亡相比更紧密地类似于坏死的机制来杀灭肿瘤细胞(由牛津大学产生的未公开的数据)。这具有多种潜在的有益作用(Kirn等人2001；Small等人2006；Reid等人2002；Liu等人2007；Ferguson等人2012)：

·ColoAd1已经表现出在耐多种药物的癌细胞系中以及在癌干细胞样细胞中有效，所述耐多种药物的癌细胞系和癌干细胞样细胞已知对细胞凋亡具有抗性；

·炎症性坏死细胞死亡可能更适于生成特异性抗肿瘤免疫反应；

·ColoAd1非常迅速地离开肿瘤细胞，甚至在靶标细胞死亡之前，由此可以具有增强的传播能力。

ColoAd1是Ad11和Ad3的嵌合体，但具有与Ad11的外膜完全同源的外荚膜。ColoAd1的病毒动力学、炎性可能性和免疫学特性由此与Ad11及其他B亚群腺病毒最紧密地类似且进行预知。

在一实施方案中，在本公开的方法中采用的溶瘤病毒在其E3和/或E4区域被删除或部分被删除。这可为有益的，因为其可以使病毒在体内更迅速地复制。

此外，E3删除可以促进病毒从非癌细胞的迅速清除，因为E3区域编码可能有关于回避宿主免疫力的蛋白质。

在一实施方案中，在本公开的方法中采用的病毒基于Ad11或从其衍生，从而六联体和纤维基本类似于Ad11，例如Ad11p。此外，因为腺病毒的血清型指定是基于病毒的外部性质，即六联体和纤维性质，因此本公开可用于具有类似表面性质的B型腺病毒。

在一实施方案中，B型腺病毒为OvAd1或OvAd2，其分别公开于通过援引并入本文的WO2008/080003中的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。

本文所用的基本类似系指相关的蛋白质的氨基酸序列，其相对于特定蛋白质的“整体”是至少95％相同的(例如，96％、97％、98％、99％或100％相同的)。被比较的蛋白质可以是较大实体的一部分，但该比较将是相关片段或组分的整个长度。

5型腺病毒(Ad5)通常经由柯萨奇-腺病毒受体(CAR)而进入细胞。然而，腺病毒血清型11(Ad11)是靶向在所有的有核细胞中以低水平表达的不同受体(CD46)的B亚群腺病毒。在正常细胞中，CD46通常隐藏在细胞的基底外侧表面上，因此不可用于病毒结合(VarelaJC等人IntJCancer2008Sep15；123(6):1357-63；Maisner等人.,1997)。然而，在肿瘤细胞中，其通常具有增强的表面表达，尤其在更晚期和侵袭性肿瘤中(Kinugasa等人1999)。因此，Ad11有效地感染例如来自肺上皮癌(A549cells)、肝癌(HepG2)、前列腺癌(DU145和LNCaP)、喉癌(Hep2)和乳癌(CAMA和MG7)的癌细胞系，并且还感染恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤和成神经细胞瘤的癌细胞系(Mei等人2003)。因此，Ad11优先地感染肿瘤细胞，并且从其衍生的病毒被认为可用于治疗至少一种或多种上述癌症。作为Ad11和Ad3的嵌合体，ColoAd1与Ad11共享这些特性。

在一实施方案中，在本公开的方法中采用的病毒包括转基因(特别是一种或多种转基因)，例如治疗性转基因，以用于体内表达。本文所用的转基因基因意指在母体或野生型病毒中未找到的基因。此类基因可以发挥作为用于追踪病毒感染的功效的标记物或受体的作用。或者，该基因可以在改善病毒的功效方面发挥作用。或者，该基因可以向细胞递送细胞毒素剂。

治疗性转基因可以在细胞中表达治疗剂，例如siRNA；shRNA；多肽；肿瘤相关性抗原(TAA)、细胞因子；抗体；或抗血管生成因子。

治疗性抗体的实例包括抗-VGEF抗体，例如贝伐单抗；抗-EGFR抗体，例如西妥昔单抗；抗-CD20抗体，例如利妥昔单抗；或免疫系统活化剂调节剂，例如抗-CTLA4(例如依匹单抗)、抗-PD-1和抗-PD-L1等。还可以编码单链抗体、抗体亚基、抗体片段和TRAP，以及全长抗体。对本公开重要的是，包含这些蛋白质不改变病毒的表面性质，因此可以容易地并入基因组，而对本文所述的给药没有有害的作用，同时提供额外的用于攻击癌细胞的治疗性机制。

细胞因子的实例包括干扰素-α、干扰素-γ和IL-2等。

因为将在肿瘤内表达RNA、抗体、多肽、TAA或细胞因子，所以认为这代表了改变肿瘤的微环境但避免所递送的试剂的全身性副作用的机遇。例如，可以刺激局部免疫系统以攻击癌症。可以通过改变该细胞是否分泌RNA、抗体、多肽、TAA或细胞因子以及其在病毒生命周期中何时表达，从而调节这种局部作用。

在一实施方案中，转基因编码例如来自非人类来源或胞嘧啶脱氨酶例如来自细菌来源或来自酵母的胸苷激酶。

在一实施方案中，抗体、多肽或细胞因子或类似物是非人类来源并且未被人源化。后者不可能有害地影响实体在癌细胞中的活性，并且具有这样的优势，即，可逃避癌细胞的物质会局部地吸引免疫系统的注意并会被迅速清除。

在一实施方案中，病毒体内编码和表达可见的或可视化的蛋白质，例如荧光蛋白质，如GFP或类似物。考虑到病毒选择性感染癌细胞，当其表达可见的或可视化的蛋白质时，则其可用于突出癌组织的区域，以用于切除或放射。

在一实施方案中，病毒可以具有能够引发抗肿瘤免疫功能、抑制肿瘤新血管化、或前药活化的治疗性基因。本文所用的治疗剂量系指溶瘤腺病毒当用于适当的治疗方案中时适于实现意欲的治疗作用例如改善疾病的症状或病况的量。当细胞颗粒的数量可以足以产生以下情况时，剂量被认为是在治疗癌症或转移瘤的治疗剂量：肿瘤或转移瘤的生长被减缓或终止；或肿瘤或转移瘤被发现尺寸缩小；和/或患者的生命期被延长。合适的治疗剂量通常是治疗作用与可耐受的毒性之间的权衡，例如副作用和毒性在考虑到该疗法所实现的益处时是可耐受的情况。

在一实施方案中，治疗剂量不具有剂量限制性毒性。

本文所用的剂量限制性毒性表示在治疗期间出现的副作用严重到足以阻止以下任一情况：进一步增加剂量、频率或强度，或在任何剂量水平下阻止治疗的继续。不可耐受的毒性作用，例如与高剂量相关的毒性作用，表示后者不适于用作本公开的上下文中的治疗剂量。

在一实施方案中，预先存在的对Ad11衣壳的免疫力是弱的，允许在第7天或在7天后有效地给予其他治疗剂量。

在一实施方案中，Ad11衣壳的不良免疫刺激性质允许在第7天或第7天后有效地给予其他治疗剂量。

在一实施方案中，在抗病毒免疫原性方面，与病毒的皮下或肌肉内递送相比，病毒的静脉内递送是免疫原性更弱的。

通常确信，Ad11的毒性低于某些其他腺病毒，例如Ad5。这连同较低的血清阳性率一起是有益的，但这可能不足以使Ad11规避免疫反应。尽管文献建议B亚群腺病毒对肝细胞是无毒的，但可能的是，在全身递送后，肺部、肝脏(库普弗细胞)和脾脏中的巨噬细胞清除溶瘤病毒。

认为至少两次剂量的溶瘤病毒的迅速递送可有益地产生足够水平的病毒，所述水平被持续使靶标细胞即癌细胞被充分感染的时段。

迅速连续地提供至少两次剂量可以允许出现以下有益事件中的一个或多个：a)由第一剂量占据免疫机制，这可以随后使第二剂量逃避免疫系统的全部攻击以达到靶标；和/或b)迅速连续的至少两次剂量使病毒的生物分布达到足够的水平，持续足够的时间，从而达到体内靶标细胞，以任一方式，一旦病毒达到并感染靶标细胞，则其能够复制。

本文所用的生物分布表示体内的分布。

尽管不希望受理论的限制，发明人确信病毒的第一剂量可以下调清除率，例如诸如采用产生细胞因子的固有免疫细胞如库普弗细胞的那些机制的机制，由此改善其他治疗剂量的生物利用度。病毒的第一剂量因此“消耗”用于循环病毒的吞噬细胞“陷阱”，由此实现更好的递送和/或增加的功效。消耗吞噬细胞陷阱还降低了对随后剂量释放细胞因子的趋势，由此允许实现更高的病毒血液水平，而没有过度的毒性。

本文所用的生物利用度表示病毒可用于进行其意欲的体内治疗功能的量。

在一实施方案中，本文的其中给予至少三次剂量的方法使患者的副作用和/或毒性最小化。

在一实施方案中，通过用聚合物包被腺病毒来隐蔽腺病毒，例如以至少部分地回避患者的免疫系统。

本文所用的隐蔽(stealthed)表示腺病毒外表面已被修饰以避免患者的免疫反应，例如采用聚合物。合适的聚合物的实例公开于通过援引并入本文的WO98/19710、WO00/74722、WO2010/067041、WO2010/067081和WO2006/008513。

在一实施方案中，溶瘤病毒缀合于细胞毒性或免疫调节性试剂。

在一实施方案中，提供聚乙二醇化的溶瘤腺病毒，例如以降低免疫原性和/或增加半衰期。

在一实施方案中，该治疗方法用于治疗肿瘤。

本文所用的肿瘤意指由不可控的或侵袭性的过量细胞分裂造成的组织的异常包块，也称为赘生物。它们可以是良性(非癌性的)或恶性的。肿瘤包括癌症和转移瘤的所有形式。

在一实施方案中，肿瘤是实体瘤。该实体瘤可以是局部的或转移的。

在一实施方案中，肿瘤具有上皮来源。

在一实施方案中，肿瘤是实体瘤。

在一实施方案中，肿瘤是恶性肿瘤，例如结肠直肠癌、肝细胞瘤(肝癌)、前列腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。

在一实施方案中，肿瘤是结肠直肠恶性肿瘤。

本文所用的恶性肿瘤表示癌性细胞。

在一实施方案中，该癌症是结肠直肠癌和/或其转移形式，例如肝转移瘤。

在一实施方案中，该癌症是肝癌和/或其转移形式。

在一实施方案中，该癌症是肺癌和/或其转移形式。

在一实施方案中，该癌症是卵巢癌和/或其转移形式，例如肺转移瘤。

在一实施方案中，该癌症是肾癌和/或其转移形式。

在一实施方案中，该癌症是膀胱癌和/或其转移形式。

在一实施方案中，该癌症是喉癌。

在一实施方案中，该癌症是皮肤癌，例如黑色素瘤。在一实施方案中，该癌症是血癌。在一实施方案中，该癌症是恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤或成神经细胞瘤。在一实施方案中，该癌症是神经内分泌癌。在一实施方案中，该癌症是霍金奇或非霍金奇淋巴瘤。

在一实施方案中，溶瘤腺病毒用于治疗或预防转移瘤。

在一实施方案中，本文所述的溶瘤腺病毒适于治疗已迁移至淋巴结的癌性细胞。本发明人已经表明向结肠直肠癌患者给予的溶瘤病毒可以感染已经迁移至淋巴结的癌性细胞。

在一实施方案中，本公开的病毒、制剂和方案适于治疗异常的癌前细胞。

在一实施方案中，本文的方法或制剂用于治疗耐药性癌症。

在一实施方案中，该方法或制剂用于使耐药性癌症对该药物敏感。

癌症类型详述

肺癌

肺癌根据组织学类型来归类，并由组织病学家在显微镜下所看到的恶性细胞的尺寸和外观来分类。对于治疗目的，区分两大类：非小细胞肺癌和小细胞肺癌。

在一实施方案中，上皮癌是肺癌，例如小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。

非小细胞肺癌-NSCLC的三个主要亚型是腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。

将近40％的肺癌是腺癌，其通常起源于外周肺组织。腺癌的亚型，即细支气管肺泡癌，最常见于女性非吸烟者，并且可以具有更好的长期存活。

鳞状细胞癌占肺癌的约30％。它们通常紧邻大气道出现。在肿瘤的中心处通常发现空腔及相关的细胞死亡。约9％的肺癌是大细胞癌。这些如此命名是因为癌细胞是大的，具有过量的细胞质、大的细胞核和明显的核仁。

小细胞肺癌-在小细胞癌(SCLC)中，细胞包含致密的神经分泌颗粒(包含神经内分泌激素的囊泡)，其向该肿瘤给予内分泌/副肿瘤综合征结合体(syndromeassociation)。大部分情况出现于较大气道(主支气管和次支气管)中。这些癌症迅速生长并在病程的早期扩散。60至70％在就诊时(atpresentation)具有转移性疾病。

在一实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌。

肝癌

在一实施方案中，该癌症是肝癌，例如从原发性癌症例如结肠癌，其已扩撒到肝脏的肝转移瘤。在一实施方案中，肝癌是肝细胞癌(HCC)。

肾癌

在一实施方案中，提供了使用本文公开的溶瘤腺病毒的肾癌例如肾细胞癌和/或泌尿道上皮癌的治疗。肾癌的其他实例包括鳞状细胞癌、近肾小球细胞瘤(肾素瘤)、血管平滑肌脂肪瘤、肾嗜酸细胞瘤、贝利尼导管癌、肾透明细胞肉瘤、中胚层肾瘤、肾母细胞瘤、混合性上皮间质瘤、透明细胞腺癌、移行细胞癌、内翻性乳头状瘤、肾淋巴瘤、畸胎瘤、癌肉瘤和肾盂类癌瘤。

膀胱癌

在一实施方案中，该癌症是膀胱癌，例如是由膀胱的上皮衬里(即，尿道上皮)产生的多种类型的恶性肿瘤中的任一种。约90％的膀胱癌是移行细胞癌。其他10％是鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、小细胞癌和来自身体其他地方的癌症的次生沉积物。下文给出分期。

T(原发性肿瘤)

·TX不能评估原发性肿瘤

·T0无原发性肿瘤的迹象

·Ta非侵袭性乳头状癌

·Tis原位癌(‘扁平型肿瘤(flattumour)’)

·T1肿瘤侵袭上皮下结缔组织

·T2a肿瘤侵袭表层肌(内半)

·T2b肿瘤侵袭深层肌(外半)

·T3肿瘤侵袭膀胱周边组织：

·T3a用显微镜的

·T3b宏观的(膀胱外包块)

·T4a肿瘤侵袭前列腺、子宫或阴道

·T4b肿瘤侵袭盆壁或腹壁

N(淋巴结)

·NX不能评估局部淋巴结

·N0没有局部淋巴结转移瘤

·N1单个淋巴结中的转移瘤的最大尺寸为2cm或更小

·N2单一淋巴结中的转移瘤的最大尺寸大于2cm但不超过5cm，或多个淋巴结中的转移瘤的最大尺寸无一超过5cm

·N3淋巴结中的转移瘤的最大尺寸超过5cm

M(远端转移瘤)

·MX不能评估远端转移瘤

·M0没有远端转移瘤

·M1远端转移瘤

本公开延伸至膀胱癌的任一期。

卵巢癌

在独立的方面，本公开涉及用于治疗卵巢癌的ColoAd1、其制剂或包含ColoAd1的联合疗法，例如采用本文所述的给药方案例如向患有卵巢癌的患者给予治疗有效量的ColoAd1。

有多于30种的不同类型的卵巢癌，其根据它们所起始的细胞的类型而归类。癌性卵巢瘤可以起始于三种常见的细胞类型：

·表面上皮-覆盖卵巢衬里的细胞

·胚细胞-注定形成卵的细胞

·基质细胞-释放激素并连接卵巢的不同结构的细胞

本公开涉及来自任何来源的卵巢癌的治疗，例如如本所述，尤其来自上皮细胞。上皮卵巢癌(EOC)占所有卵巢癌的85至90％。

常见上皮瘤-上皮卵巢瘤从覆盖卵巢外表面的细胞发展而来。大部分上皮卵巢瘤是良性的(非癌性的)。存在多种类型的良性上皮瘤，包括浆液性腺癌、粘液性腺癌和布伦内罗氏瘤。癌上皮肿瘤是癌-即，它们开始于用作卵巢衬里的组织。这些是所有类型的卵巢癌中最常见且最危险的。不幸的是，几乎70％的患有常见上皮卵巢癌的女性未被诊断出，直至疾病成为晚期。

有多种卵巢上皮瘤，其外观在显微镜下不能明确地将其确定为癌性的。这些被称为低恶性可能性的交界瘤(LMP肿瘤)。本公开的方法包括后者的治疗。

胚细胞肿瘤-卵巢胚细胞瘤从产生卵细胞或卵的细胞发展而来。大部分胚细胞瘤是良性的(非癌性的)，但某些是癌性的，并且可能威胁生命。最常见的胚细胞恶性肿瘤是成熟的畸胎瘤、无性细胞瘤和内胚窦瘤。胚细胞恶性肿瘤最常出现于青少年和二十几岁的女性。当今，90％的患有卵巢胚细胞恶性肿瘤的患者已经被治愈，并且他们的生育率得到保留。

基质瘤-卵巢基质瘤是从将卵巢保持在一起的结缔组织细胞以及产生女性激素、雌激素和孕酮的结缔组织细胞发展而来的肿瘤的罕见类别。最常见的类型是粒层细胞-膜肿瘤和支持-间质细胞瘤。这些肿瘤是非常罕见的，并且通常被认为低级的癌症，并且约70％展现为I期疾病(癌症仅限于一个或两个卵巢)。

原发性腹膜癌-对人的卵巢的摘除消除了卵巢癌的风险，但未消除被称为原发性腹膜癌的较不常见的癌症的风险。原发性腹膜癌与上皮卵巢癌(最常见的类型)密切相关。其发展于来自腹膜(腹膜衬里)的细胞，并且在显微镜下看起来是一样的。其在症状、扩散和治疗方面是类似的。

卵巢癌的分期

一旦诊断患有卵巢癌，则当医生可以告知该癌症是否已经扩散到卵巢外部时，在外科手术期间可以确定肿瘤的分期。有四期卵巢癌-I期(早期疾病)至IV期(晚期疾病)。将由所患有的癌症分期来确定治疗计划和预后(疾病的可能的进程和结果)。

以下是卵巢癌的各种分期的描述：

I期-癌症的生长限于卵巢。

IA期-生长限于一个卵巢，并且肿瘤被限于卵巢内部。在卵巢的外表面上没有癌症。不存在包含恶性细胞的腹水。荚膜是完整的。

IB期-生长限于两个卵巢，而在它们的外表面上没有任何肿瘤。不存在包含恶性细胞的腹水。荚膜是完整的。

IC期-肿瘤被归类为IA期或IB期，并且存在以下中的一种或多种：(1)肿瘤存在于一个或两个卵巢的外表面上；(2)荚膜已破裂；以及(3)有包含恶性细胞的腹水或者具有阳性腹膜冲洗液。

II期-癌症的生长涉及一个或两个卵巢并且骨盆扩展。

IIA期-癌症已延伸至和/或涉及子宫或输卵管，或二者。

IIB期-癌症已延伸至其他骨盆器官。

IIC期-肿瘤被归类为IIA期或IIB期，并且存在以下中的一种或多种：(1)肿瘤存在于一个或两个卵巢的外表面上；(2)荚膜已破裂；以及(3)有包含恶性细胞的腹水或者具有阳性腹膜冲洗液。

III期-癌症的生长涉及一个或两个卵巢，并且存在以下中的一种或两种：(1)癌症已经扩散超出骨盆而达到腹腔的衬里；以及(2)癌症已经扩散至淋巴结。肿瘤限于真正的骨盆，但组织结构上证实向小肠或网膜的恶性扩展。

IIIA期-在分期操作期间，从业者可以看到癌症涉及一个或两个卵巢，但在腹腔中没有癌症是非常明显的，并且其未扩散至淋巴结。然而，当在显微镜下检查活组织切片时，在腹腔腹膜表面中发现非常小的癌症沉积物。

IIIB期-肿瘤在一个或两个卵巢中，并且在腹膜中存在癌症沉积物，其大到足以让外科医生看见，但直径不超过2cm。癌症未扩散至淋巴结。

IIIC期-肿瘤在一个或两个淋巴结中，并且存在以下中的一种或两种：(1)癌症已经扩散至淋巴结；和/或(2)癌症的沉积物的直径超过2cm并且在腹膜中被发现。

IV期-这是卵巢癌的最晚期。癌症的生长涉及一个或两个卵巢，并且已经出现远端转移瘤(癌症向位于腹膜腔外部的器官扩散)。在胸膜液(来自肺部周围的腔)中发现卵巢癌细胞也是IV期疾病的迹象。

在一实施方案中，卵巢癌是：I型，例如IA、IB或IC；II型，例如IIA、IIB或IIC；III型，例如IIIA、IIIB或IIIC；或IV型。

本公开涉及任一期卵巢癌的治疗，尤其如本文所述。

联合疗法

在一实施方案中，与其他癌症治疗或疗法的给予组合地给予病毒。

如本文所用过的“组合地(的)”意欲包括在癌症治疗或疗法之前、同时和/或之后给予溶瘤病毒的情况。

在一实施方案中，与高强度聚焦超声(HIFU)治疗组合地使用溶瘤腺病毒。

癌症疗法包括外科手术、放射疗法、靶向疗法和/或化学疗法。

如本文所用的癌症治疗系指使用治疗性化合物或生物试剂的治疗，例如意欲治疗癌症的抗体和/或其维持疗法。

在一实施方案中，癌症治疗选自任何其他抗癌疗法，包括化学治疗剂、靶向抗癌剂、放射疗法、放射性同位素疗法或其任何组合。

其他独立的方面，本公开涉及包括B型溶瘤腺病毒例如ColoAd1和不干扰该腺病毒活性的化学治疗剂的联合疗法。如本文所用的B型腺病毒，例如ColoAd1，包括其制剂，例如其药物制剂。

如本文所用的活性系指病毒的任何有益的性质或特性，例如溶瘤活性和/或病毒在癌细胞中复制的能力，例如体内病毒复制。

在一实施方案中，联合疗法中的ColoAd1根据本文所述的方案给药。

通常，联合疗法将提供腺病毒的制剂和化学治疗剂的制剂。因此，给予腺病毒和化学治疗剂将适当地是单独事件。这些给药可以处于同一天或不同的天。

在一实施方案中，在一周内以适当的方案给予腺病毒，并且后面的周例如下一周给予化学治疗剂。

在一个或多个实施方案中，化学治疗剂和腺病毒可以具有协同的治疗作用。

溶瘤腺病毒可以用作诸如外科手术(新辅助疗法)的疗法的预先治疗，从而缩小肿瘤以治疗转移瘤和/或预防转移瘤或其他转移瘤。可以在诸如外科手术(辅助疗法)的疗法之后使用溶瘤腺病毒，以治疗转移瘤和/或预防转移瘤或其他转移瘤。

本文所用的同时是在与溶瘤腺病毒制剂相同的时间或大致相同的时间给予额外的癌症治疗。该治疗可以包括在相同的制剂内或以单独的制剂形式来给予。

在一实施方案中，与化学治疗剂例如本文所述的诸如紫杉醇、abraxane或类似物的给予组合地给予病毒。

本文所用的化学治疗剂意指选择性破坏恶性细胞和组织的特定的抗肿瘤化学剂或药物。例如，烷基化试剂、抗代谢物、蒽环类药物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和其他的抗肿瘤试剂。化学疗法的其他实例包括阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇、卡培他滨、伊立替康和铂类(platins)如顺铂和奥沙利铂。优选的剂量可以由从业者基于被治疗的癌症的性质来选择。

令人惊讶地，本发明人已经确定某些类别的治疗剂可以抑制病毒复制，例如拓扑异构酶或聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制剂可以抑制病毒体内复制。考虑到认为期望在癌细胞中建立病毒感染以使病毒能够复制，则抑制病毒复制的化合物的共同给予可能是不期望的。

在一实施方案中，化学治疗剂不是酶抑制剂。因此，在一实施方案中，联合疗法不采用拓扑异构酶抑制剂。

在一实施方案中，化学治疗剂不是聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制剂。

在一实施方案中，联合疗法采用包含铂的化学治疗剂，例如顺铂、卡铂或奥沙利铂。

在一实施方案中，该组合采用微管抑制剂，例如硫酸长春新碱、埃博霉素A、N-[2-[(4-羟基苯基)氨基]-3-吡啶基]-4-甲氧基苯磺酰胺(ABT-751)、紫杉酚衍生的化学治疗剂如紫杉醇、abraxane或多西他赛，或者它们的组合。

在一实施方案中，该组合采用mTor抑制剂。mTor抑制剂的实例包括：依维莫司(RAD001)、WYE-354、KU-0063794、纳巴霉素(西罗莫司)、替西罗莫司、雷帕霉素(MK-8669)、AZD8055和BEZ235(NVP-BEZ235)。

在一实施方案中，该组合采用Pi3激酶抑制剂。Pi3激酶抑制剂的实例包括：GDC-0941、ZSTK474、PIK-90、LY294002、TG100-115、XL147、GDC-0941、ZSTK474、PIK-90、LY294002、TG100-115、XL147、AS-605240、PIK-293、AZD6482、PIK-93、TGX-221、IC-87114、AS-605240、PIK-293、AZD6482、PIK-93、TGX-221、IC-87114以及在通过援引并入本文的WO2011/048111中公开的化合物，所述化合物包括2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)己-5-炔酸；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；3-((2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)甲基)苄腈；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(3-(2-吗啉基乙氧基)丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(3-氯苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(3-氯苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(2-氟苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(2-氟苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(3-甲氧基苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(3-甲氧基苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(3-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(3-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(4-氯苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(4-(甲基磺酰基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(4-(甲基-磺酰基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(4-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；3-((2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-4-氧代-喹唑啉-3(4H)-基)甲基)苄腈；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(3-(甲基-磺酰基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；3-((2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-4-氧代-喹唑啉-3(4H)-基)甲基)苄腈；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(4-氯苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(4-氯苄基)-5-(3-甲氧基-丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(3-甲氧基苄基)-5-(3-甲氧基丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(3-甲氧基丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(4-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(3-(2-甲氧基乙氧基)丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(3-氯-2-氟-苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2,6-二氟苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(4-氯-2-氟苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-氟-4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-甲氧基丙-1-炔基)-3-(3-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(4-氟苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(3-环戊基丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(苄基氧基)丙-1-炔基)-3-(2-氯-苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(5-羟基戊-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(2-氟-5-甲氧基苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(3,4-二氯苄基)-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-苄基-5-乙炔基喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(2-三氟甲基苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(4-甲氧基苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；4-((2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)甲基)苄腈；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-乙炔基-3-(2-氟-4-甲氧基苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；1-(3-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)丙-2-炔基)脲；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氟苄基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-氟-3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-乙炔基-喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(3-苯氧基丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氟苄基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；6-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-(2-甲氧基乙基)己-5-炔酰胺；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(7-吗啉基-7-氧代庚-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(5-吗啉基-5-氧代戊-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-((5-甲基吡嗪-2-基)甲基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-氧代-6-(哌啶-1-基)己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N,N-二乙基己-5-炔酰胺；7-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯-苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)庚-6-炔酸；2-乙酰氨基-N-(3-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)丙-2-炔-1-基)乙酰胺；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(3-甲氧基-5-(三氟甲基)苄基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-甲氧基苯乙基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(苯并[b]噻吩-2-基甲基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氟-3-甲氧基苄基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；3-((2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)甲基)苯甲甲酯；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(苯并呋喃-5-基甲基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-((2-甲基噻唑-4-基)甲基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-(4-吗啉基哌啶-1-基)-6-氧代己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；5-(6-(4-乙酰基哌嗪-1-基)-6-氧代己-1-炔-1-基)-2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；N-(4-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)丁-3-炔-1-基)吗啉-4-甲酰胺；5-(6-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-6-氧代己-1-炔-1-基)-2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；N-(4-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)丁-3-炔-1-基)吗啉-4-甲酰胺；2-((4-氨基-3-(4-羟基-苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(5-(bis(2-甲氧基乙基)氨基)戊-1-炔基)-3-(2-氯苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-环戊基己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-(2-吗啉基乙基)己-5-炔酰胺；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-(4-(2-甲氧基乙基)哌嗪-1-基)-6-氧代己-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-(吡啶-4-基)己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-(吡啶-4-基)己-5-炔酰胺；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-6-氧代己-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N,N-双(2-甲氧基乙基)己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N,N-双(2-甲氧基乙基)己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-甲基-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-异丙基己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-异丙基己-5-炔酰胺；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N,N-二甲基己-5-炔酰胺；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-氧代-6-(吡咯烷-1-基)己-1-炔-1-基)喹唑啉-4(3H)-酮；6-(2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-5-基)-N-(吡咯烷-3-基)己-5-炔酰胺；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)-6-氧代己-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)-6-氧代己-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(4-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-6-氧代己-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮；2-((4-氨基-3-(3-羟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-6-氧代己-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮、2-((4-氨基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-5-(6-吗啉基-6-氧代己-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮，或其药学上可接受的盐，包括其所有立体异构体、互变异构体和同位素衍生物。

在一实施方案中，组合利用MEK抑制剂。MEK抑制剂的实例包括：AS703026、CI-1040(PD184352)、AZD6244(司美替尼)、PD318088、PD0325901、AZD8330、PD98059、U0126-EtOH、BIX02189或BIX02188。

在一实施方案中，组合利用AKT抑制剂。AKT抑制剂的实例包括：MT-2206和AT7867。

在一实施方案中，组合利用极光激酶(aurorakinase)抑制剂。极光激酶抑制剂的实例包括：极光A抑制剂I、VX-680、AZD1152-HQPA(巴拉塞替(Barasertib))、SNS-314甲磺酸盐、PHA-680632、ZM-447439、CCT129202和Hesperadin。

在一实施方案中，组合利用p38抑制剂，例如WO2010/038086中公开的，例如N-[4-({4-[3-(3-叔-丁基-1-p-甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲基]萘-1-基氧基}甲基)吡啶-2-基]-2-甲氧基乙酰胺。

在一实施方案中，组合利用Bcl-2抑制剂。Bcl-2抑制剂的实例包括：obatoclax甲磺酸盐、ABT-737、ABT-263(navitoclax)和TW-37。

在一实施方案中，组合利用抗代谢剂。抗代谢剂的实例包括：卡培他滨(希罗达)、磷酸氟达拉滨，氟达拉滨(福达华)，地西他滨，雷替曲塞(拓优得)，盐酸吉西他滨和克拉屈滨。

在一实施方案中，治疗剂为更昔洛韦，其可辅助控制免疫应答和/或肿瘤维管形成。

在一实施方案中，在本文的方法中利用的一种或多种疗法为有节奏的，其为用低剂量抗癌药的连续或频繁治疗，通常与其他疗法并存给予。

B亚群溶瘤腺病毒，特别是Ad11和由其衍生的那些，诸如ColoAd1，可以与化学疗法特别协同，因为它们似乎具有高度依赖细胞凋亡的作用机制，通过占优势的坏死机制杀死癌细胞。此外，在化学疗法期间发生的免疫抑制可允许溶瘤病毒更有效地起作用。

在一实施方案中，肠胃外给予化学治疗剂。

在一实施方案中，与病毒分开给予化学治疗剂，在时间上分开或通过不同的给药方法或以上二者。治疗可为同时发生的或依次的。

在一实施方案中，癌症治疗为靶向剂，例如单克隆抗体如贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗，或抗体结合物如抗体药物结合物，尤其是其中抗体或结合片段与毒素连接的类型。

在一实施方案中，癌症治疗为免疫治疗剂，例如易普单抗(ipilimumab)或其他抗-CTLA4、抗-PD-1、抗-PD-L1或其他检查点抑制剂，或者细胞因子或细胞因子类似物。

本文所用的检查点抑制剂意指抑制从T细胞膜蛋白的信号转导的试剂，其作用于抑制或下调T细胞活化和功能。

在一实施方案中，病毒与放射疗法的给予共同给予。

本文所用的辐射疗法意指电离辐射的医学应用。

癌细胞通常为未分化的和干细胞样的，它们比大多数健康的分化细胞更多地复制，并且具有较弱的修复亚致死损伤的能力。因此DNA损伤通过细胞分化而传代，癌症细胞DNA的损伤积累，导致它们死亡或更慢地复制。

在一实施方案中，同时给予放射疗法。

在一实施方案中，依次给予放射疗法。

在一实施方案中，病毒与附加于癌症疗法的疗法共同给予，例如恶病质如癌症恶病质治疗，例如S-吲哚洛尔、S-甲吲洛尔或S-波吲洛尔。合适的剂量可以为每天以单一剂量提供或以一天内给予多次剂量的多剂量给予2.5mg至100mg，例如2.5mg至50mg。

在一实施方案中，病毒与一种或多种预防剂的给予共同给予，例如选自退热剂、抗组胺剂、止吐剂、止泻剂、类固醇和镇痛剂。

退热剂包括阿司匹林和非类固醇抗炎剂，例如布洛芬、萘普生和酮洛芬。

抗组胺剂包括阿伐斯汀、氮卓斯汀、溴苯那敏、布克力嗪、溴苯海拉明、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、赛克利嗪、氯苯那敏、氯苯海拉明、氯马斯汀、赛庚啶、地氯雷他定、右溴苯那敏、脱氯苯那敏(deschlorpheniramine)、右氯苯那敏、茶苯海明、二甲茚定、苯海拉明、多西拉敏、依巴斯汀、恩布拉敏、非索非那定、左西替利嗪、氯雷他定、氯苯甲嗪、米氮平、奥洛他定、pheninidamine、非尼拉敏、苯托沙敏、异丙嗪、美吡拉敏、喹硫平、卢帕他定、曲吡那敏和曲普利啶。

止吐剂包括多拉司琼、格拉司琼、昂丹司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼、米氮平、多潘立酮、奥氮平、氟哌利多、甲氧氯普胺、阿立必利、丙氯拉嗪。在一些情况下，抗组胺药可用作止吐药。

止泻剂包括甲基纤维素、绿坡缕石、碱式水杨酸铋、阿托品/地芬诺酯、洛哌丁胺、以及其他类罂粟碱如可待因和吗啡。

镇痛剂包括非类固醇抗炎药，对乙酰氨基酚，cox-2抑制剂，阿片制剂以及吗啡样作用药，例如吗啡、可待因、羟考酮、氢可酮、双氢吗啡、哌替啶、丁丙诺啡、曲马多等。

在一实施方案中，病毒治疗与类固醇疗程一起应用。

类固醇包括氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松等。

本文所用的预防意指预防性药物或护理，例如由用于预防或改善给予病毒期间或之后的副作用的措施组成。

在一实施方案中，与病毒分开给予预防，在时间上分开或通过不同的给药方法或以上二者。治疗可为同时发生的或依次的。

在一实施方案中，与病毒的给予同时地或依次地提供另外的输液。

本文所用的另外的输液意指向患者供应除制剂中包括的流体之外的流体。这可以是任何形式的合适的流体，例如盐水或葡萄糖输注。

在一实施方案中，本文的病毒疗法与抗炎剂共同给予，例如类固醇或非类固醇抗炎剂。

在一实施方案中，本公开的病毒疗法与退热剂共同给与。

在一实施方案中，病毒治疗与输液疗法共同给予，例如静脉内给予流体，特别是等渗盐水或葡萄糖。

在一实施方案中，该方法适于治疗作为门诊病人的病人。

本文所用的门诊病人是在治疗期间未住院的病人，而是来到医师的办公室、诊所，或日间手术来治疗。

在一实施方案中，提供了使用本文所述的包含ColoAd1的药物制剂来治疗患者的方法，所述方法包括向所述患者静脉内给药的步骤：第1天1剂量、第3天1剂量、以及第5天第三剂量。

在一实施方案中，提供了通过给予第一剂量本文所述的制剂，然后是一次或多次其他治疗剂量来治疗例如肿瘤和/或恶性肿瘤和/或癌症治疗的本文所述的有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的肠胃外制剂，其中第一剂量和其他剂量在14天的周期内给予，特别是如上所述。

在一实施方案中，提供了有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的多治疗周期的用途。治疗周期在本文解释为在相对短的周期内给予一系列的病毒剂量，然后评估患者的应答。治疗周期可以重复多次，只要风险收益确定为对患者最有利。

在一实施方案中，提供了评估用有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的重复治疗周期的适用性的方法，其通过确定特定的抗病毒滴度水平并将其与治疗前的滴度比较，从而低于治疗前滴度的特定百分比的滴度将表明再治疗的阳性风险收益曲线。

在一实施方案中，提供了有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的肠胃外制剂在制备通过利用本文所述的治疗方案治疗肿瘤和/或恶性肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

在一实施方案中，制剂用于转移灶的治疗或预防。

在一实施方案中，提供了以合适剂量和体积无菌预装填和包装的注射器呈现的制剂，从而防止需要在给予患者之前在无菌条件下和使用合适的空气处理如排气罩的复杂和昂贵的剂量配置。

在本说明书的语境中，“包含(comprising)”意指“包括(including)”。

包括某些要素的本发明的方面也意在扩展至由相应要素“组成”或“基本上组成”的替代性实施方案。

本文所述的任何阳性实施方案或其组合可以为阴性排除即放弃的基础。

实施例

临床前效力和选择性

表2示出ColoAd1对多种上皮细胞系的IC₅₀。

ColoAd1对一系列上皮来源的癌症和正常细胞的IC₅₀。使用标准的6天MTS试验体外测定杀死50％细胞所需的ColoAd1颗粒的数量(IC₅₀)。

1由ScheringAG完成并公布于Kuhn等人2008的结果。

2由牛津大学进行的重复和额外的研究(未公布)。

表3示出ColoAd1对多种非上皮细胞系的IC₅₀。

ColoAd1对一系列非上皮来源的癌症的IC₅₀。使用标准的5天MTS试验体外测定杀死50％细胞所需的颗粒的数量(IC₅₀)。

1由ScheringAG完成并公布于Kuhn等人2008的结果。

2由牛津大学进行的重复和额外的研究(未公布)。

表4示出多种正常的非癌症人细胞系中ColoAd1复制。

将体外单层生长的人细胞暴露于ColoAd172小时。然后通过qPCR测定ColoAd1基因组拷贝的总数。将数据表示为总基因组拷贝数并且表达为相对于癌细胞阳性对照(HT29)的％。然后检测来自这些正常人细胞的ColoAd1材料对HT29癌细胞的活力。在所有情况下，这样回收的ColoAd1未能显示在HT29细胞中复制。

临床前循环动力学

在CD-1小鼠中获得ColoAd1循环动力学。通过尾静脉向小鼠(每组3只)给予病毒颗粒并通过定量PCR(qPCR)测定全血样品中循环基因组。该模型中ColoAd1半衰期为剂量依赖的。在低输入剂量(在多个给药天1×10⁹至2×10¹⁰)，平均α半衰期为1.8+/-0.5分钟，与其他腺病毒之前报道的值(Green2004)一致。在较高剂量下(高于2×10¹¹)，似乎出现清除饱和，产生更长的循环水平(平均α半衰期7.8+/-2分钟)。本文所述的ColoAd1研究中的饱和由多个药代动力学参数反映。

表5说明了当以高于2×10¹¹给予ColoAd1剂量时，曲线下面积(AUC)、半衰期和在30分钟时间点保留的颗粒的百分比的显著增加。特别注意到，与低先导剂量然后较高剂量相反，当给予3个相等的高剂量时，全部实现最优动力学(AUC、在30分钟时保留的颗粒百分比和平均αt1/2)。从该数据，假定人中血液循环时间显著长于小鼠中，预期人中半衰期将显著更长并且低先导剂量不可能对B亚群腺病毒有价值。此外，在荷瘤人患者中，预期该病毒在癌细胞中复制，随后释放，也将导致病毒在较晚时间点的进一步扩增。相应地计划了临床研究。

表5：在CD-1小鼠中多次静脉内注射后ColoAd1的循环动力学(每组3只小鼠)

临床前相互作用研究

病毒颗粒可以与人血中的组分相互作用，包括抗体、补体和血细胞，导致快速中和作用(Lyons2005,Carlisle2009)。这些事件为物种特异性的并且不能在动物中有效地模拟。

为评估在人血中的中和作用，在应用于允许细胞(HT29结肠直肠肿瘤细胞)之前，可将ColoAd1在来自个体的新鲜分离的人全血中孵育。选择一系列病毒浓度以覆盖目标临床剂量范围(2×10⁶至2×10⁹个颗粒/ml人血，并假定人血体积范围)。通过细胞毒性测定残留的病毒效力并与不存在人血中孵育的情况(仅培养基)下的病毒感染比较，希望在2×10⁶至2×10⁹个病毒颗粒/ml的浓度范围的效力水平。

图1中的数据进一步证明ColoAd1仅被人血微幅影响。使用肝素锂管从9名个体(A-I)收集新鲜人血。向血液样品中以从2×10⁹VP/mL10倍稀释添加ColoAd1病毒颗粒，其反映了假定剂量在总血液体积(假定为5L血液)中完全稀释的1×10¹³潜在等效人剂量。在37℃孵育20分钟后，将病毒/血液混合物添加至在96孔板中生长的A549肿瘤细胞。然后，5天后测定仍然存活的A549细胞的比例并绘制为百分比。在大约等效于2×10⁶VP/mL的病毒血液浓度的水平发生IC₅₀。因此将该病毒水平测定为最低目标水平以在人临床研究中实现。

还进行ColoAd1与人血细胞的相互作用的数项体外研究。新鲜血液获自4名个体，将红细胞、血小板和白细胞以生理细胞浓度(分别为5×10⁹、2×10⁸和6×10⁶/mL)在PBS中洗涤和重悬浮以用于单独实验。qPCR分析揭示超过80％(82％±8％)的ColoAd1与人血细胞结合，主要与红细胞和白细胞结合。在5分钟或30分钟孵育后，与血细胞结合的ColoAd1的分数没有显著变化。Ad5显示比ColoAd1显著更高的与人血细胞结合的水平(95.5±1.2％)。基于相对荧光，ColoAd1-gfp与人血细胞预孵育30分钟显著抑制(>90％)仅表达低水平的CD46(ColoAd1的细胞受体)的SW480肿瘤细胞的感染。表达高水平CD46的HT29细胞的感染被抑制到相当低的程度(约41％)，可能是因为ColoAd1受体在这些肿瘤细胞上较高水平的表达。最终，使用ColoAd1-gfp评估可能表达高水平的CD46并因此作为ColoAd1的“陷阱”的白细胞的感染，以确定转基因表达的程度。24小时后，在白细胞中没有观察到转基因表达的证据。相比之下，之前的研究已经显示Ad5在体外相同条件下能够有效地感染单核细胞。简言之，这些研究表明ColoAd1与血液细胞组分的相互作用首先并且与Ad5显著不同。再次，考虑到这些设计了临床研究。

临床前ColoAd1的生物分布

在正常小鼠和表达主要病毒受体CD46(在正常小鼠中不表达的B群腺病毒的受体)的转基因小鼠中测定ColoAd1的生物分布和清除。在向正常小鼠尾静脉给予1×10¹¹病毒颗粒后，24小时后主要在肝、脾和肺中发现病毒颗粒。(图2)表明病毒拷贝/mg，因此这些较大的器官代表基于百分比的总病毒体内分布的主要区域。在CD46转基因小鼠中观察到相同靶器官的类似分布(图3)，显示CD46受体不是分布的主要决定因素。非复制突变体(ColoAd1CJ132)的分布与ColoAd1的分布相同，表明复制不对该分布效果负任何责任。然而，在荷瘤人患者中，预期该病毒在癌细胞中复制，随后释放，也将导致病毒在较晚时间点的进一步扩增，据此相应地计划了临床研究。

临床前病毒清除

为鉴定完全病毒清除的时间，在正常Balbc小鼠中进行长期颗粒清除研究。选择病毒分布的主要器官：肝、脾和肺用于分析。再次，在每个时间点将每个器官的总病毒颗粒记录为输入剂量的百分比，使得结果不相对于器官重量标准化。1小时后，输入病毒的大部分已经从肝中消退，脾中为少于5％，肺中为少于0.1％。注射后24小时，病毒可以已经从这些器官快速地清除，残留输入病毒基因组的少于1％。注射后65天后，在任何组织中没有可检测到的显著水平的病毒，并且水平不显著高于背景。在给予后65天，从任何组织不能回收病毒颗粒。病毒清除的动力学(数据显示为每个器官中输入剂量的％)在图4中总结。

以1×10¹⁰vp/小鼠的剂量通过尾静脉向CD46转基因小鼠单次给予ColoAd1。每个时间点动物n＝3。基因组拷贝(通过qPCR测量)表达为输入基因组拷贝剂量的百分比。

临床前免疫原性

特异性抗病毒免疫应答的发展可能显著影响循环动力学是可能的。为检查这种可能性，在数月内向一组小鼠反复给予ColoAd1，以产生超免疫血清池。然后使用超免疫血清通过静脉注射给予10μl或20μl来针对ColoAd1被动免疫第二组小鼠。然后，使这些小鼠在被静脉注射给予5×10¹⁰ColoAd1之前休息10分钟。在注射ColoAd1后2、10和30分钟从每只小鼠收集血液，然后通过qPCR分析。结果示于图5中并且显示对ColoAd1的免疫应答对ColoAd1的动力学和递送有显著影响，因此证明在发生这样的应答之前给予剂量的重要性。

临床前安全性和毒性

对ColoAd1进行数项安全性和毒性研究，包括CD-1和Balb/c小鼠、CD46转基因小鼠中的先导性研究。在雄性和雌性CD-1小鼠中的最终毒性研究中，历时5天时段(在第1、3和5天)以三次剂量给予ColoAd1以模拟预期的临床给药方案。雄性和雌性CD-1小鼠接受静脉内推注(剂量体积＝100μL)ColoAd1或表6中所示的制剂缓冲液，其显示最终研究设计中，在两组中4只雄性在第1天的不定期死亡后导致降低该特定组的剂量。

表6.毒性研究设计

周期地进行安全性终点的标准集合，包括临床体征、体重、血浆细胞因子水平、临床病理学、以及肉眼观察和显微镜检查。在第6天和第17天尸体解剖收集标准的组织和器官列表。

在任何治疗天，在组1、2或3中的雄性和雌性中没有观察到任何显著的临床体征。在组4中在第1天第一次给药2.2×10¹¹和6.96×10¹⁰vp/动物剂量后观察到副作用的临床指征，但除了1个组4雄性，在第3天没有见到进一步的不良临床指征。在除了组2雄性之外的所有ColoAd1治疗组见到剂量相关的体重减轻，尽管随后在任何治疗组体重不受影响。在记录时，在较长时程发生血液学和肝功能改变，但在恢复期终点已经回至正常范围。简言之，在第一次给药后见到最显著的临床指征，而后续给药良好耐受。

在该研究中随时间的细胞因子应答示于图6中。细胞因子MCP-1的升高最显著并见于组3和组4，在第1天第一次治疗后6小时和24小时，以及在第5天治疗后6小时。在组2动物可见任何其他细胞因子的不一致的升高。仅在组3和组4动物中见到IL-6、IFNγ和TNFα的较小但计量相关的升高，与MCP-1相比在低剂量更常见并且经常仅在每一给药组的某些动物，特别是组3。

因此，在该研究中见到的细胞因子模式与观察到的临床指征一致，显示在第一次给药后，每一后续给药良好耐受，尽管剂量相同。

临床研究

在提交申请时，进行两项临床研究以检查当静脉内递送至具有转移癌的人个体时ColoAd1的安全性和效力。

Evolve研究(ColoAd1-1001)是I/II期临床研究，其具有在患有上皮来源的转移肿瘤(任何来源)并且没有其他治疗选择的患者中进行的I期剂量逐步上升部分。在研究的该I期剂量逐渐上升部分的患者已经在第1、3和5天三次等量静脉内给予ColoAd1(间隔48小时)。使用缓慢静脉内输注，在早期群组，每个患者历时5分钟时段输注30ml病毒悬浮液(6ml/分钟)。最初，以从1×10¹⁰病毒颗粒/剂量开始1个log增加来向每个群组中三名患者给药，直到不良事件表现剂量限制性毒性。每一患者还接受症状预防的方案，包括补充液体和一套抗炎剂方案(扑热息痛/对乙酰氨基酚和布洛芬)。使用生理检查(包括血压、脉搏和温度)，通过消除所有不良事件以及通过评估血液学、生物化学和细胞因子谱改变来评估这一给药方案在每一剂量水平的安全性和耐受性。使用常规血、尿、大便和痰样品评估病毒动力学和排泄。通过系列CT成像根据客观标准评估效力。该研究的后期将持续检查ColoAd1的静脉内最大耐受剂量(MTD)在患有转移结肠直肠癌的患者中的安全性和效力。

第二临床研究(ColoAd1-1002)为0期“机会窗口”研究，以在具有新近诊断的原发(非转移的)结肠直肠肿瘤的患者中比较ColoAd1的静脉内递送和直接肿瘤内递送。在手术前向该研究中的患者给予ColoAd1，然后在手术后检查切除的肿瘤，以检查在两个不同的递送和给药方案之后，病毒递送、复制和扩散的程度。在该研究中安全性和病毒动力学的量值与ColoAd1-1001中的那些大致相似。

向研究ColoAd1-1001中的I期剂量逐步上升患者以高达并包括1×10¹³病毒颗粒的剂量水平静脉内给予ColoAd1，分下面表7所示的7个患者群组(即群组1至7)。

表7：ColoAd1-1001临床研究的I期剂量逐步上升部分的群组1至7的给药方案。

在该研究中ColoAd1的副作用谱包括发热、流感样疾病、转氨酶升高、血小板减少、中性白细胞减少、腹泻和呕吐。然而，历时5分钟输注1×10¹³病毒颗粒的剂量水平，剂量未被良好耐受。具体地，两名患者在该剂量经历剂量依赖性毒性(DLT)包括细胞因子介导的急性肺损伤，并且不能耐受多于单一剂量。一名患者需要类固醇以治疗该状况。在该剂量水平的患者也经历寒颤、高血压、疼痛、转氨酶升高、PPT延长、和D-二聚体增加，尽管均随时间消退。作为在该耐受性差的剂量的这些毒性作用的结果，降低ColoAd1的剂量然后使用较慢的输注速率再次逐渐升高。使用该策略，历时5分钟(群组5)或20分钟(群组6)输注3×10¹²VP剂量和历时40分钟输注6×10¹²VP剂量(群组7)均显示良好耐受。

该安全性数据在撰写时是初步的，但是被在小鼠中见到的十分类似的曲线支持。然而，尽管没有进行中的给药，某些患者持续具有发热和虚弱直到第二周，其为与人肿瘤中进行中的病毒复制一致的现象(在非荷瘤小鼠中未见到的现象)。因此，预期人的最终最大耐受剂量为以高至6×10¹¹VP/min的输注速率在第1、3和5天给予1×10¹²至1×10¹³病毒颗粒，每一患者还根据ColoAd1-1001方案接受预防性抗炎剂药物治疗和静脉输液。最终最优给药方案是目前的进一步确认性研究的目标。

表8总结了通过qPCR对ColoAd1-1001临床研究的I期剂量逐渐升高部分中的每一患者测量的关键病毒药代动力学参数。这些结果与临床前数据基本上一致。简言之，有剂量依赖性cMAX和AUC，并且平均α半衰期为约18分钟，尽管存在在研究的更高剂量有可能的饱和动力学的指征。

表8：群组1至7的ColoAd1药代动力学

*每名患者的指示编号

nd:未测定。

图7示出了ColoAd1-1001临床研究中在初始剂量逐步升高期给药的癌症患者中观察到的细胞因子模式(高至并包括剂量限制性毒性的鉴定)。与小鼠研究中相同，在人中见到炎性细胞因子应答在第一次给予ColoAd1后达到峰值，然后在后续给予时降低。有趣的是，这一初始ColoAd1先导效应在较低剂量并未确定地可见而在较高剂量显然可见，支持了这样的主张：相同剂量水平的重复的高剂量方案可为向人癌症患者的B亚群腺病毒的静脉内给药的最佳方案。

具体地，图7示出了具有转移性实体上皮肿瘤的人癌症患者中ColoAd1静脉内给药后随时间的细胞因子水平(μg/L)，以在第1、3和5天(由箭头指示的给药点)在4种不同剂量水平(分别为1e10、1e11、1e12和1e13病毒颗粒)5分钟输注30ml病毒悬浮液给予ColoAd1。每一患者也接受预防性抗炎剂药物治疗和静脉输液。在高至并包括1e12的剂量的患者良好耐受这些剂量，但接受1e13剂量的4名患者中的2名经历细胞因子介导的剂量限制性毒性并且不能再接受一剂。对于单独的患者，升高的TNF和γ干扰素水平与耐受性良好相关，但升高的IL6不相关(数据未显示)。因此，确定了高至2e11个病毒颗粒/分钟的速率可以被认为是良好耐受的输注速率。图A：TNF；图B：γ干扰素；图C：IL-6。

图8示出患有转移实体上皮肿瘤的人癌症患者中ColoAd1的全身药代动力学(每mL血液的基因组拷贝)。通过qPCR测量基因组拷贝。

具体地，图8A示出了来自ColoAd1-1001的三名患者的平均血浆水平，在第1、3和5天(以箭头指示给药时间点)向所述患者5分钟输注30ml病毒悬浮液以2e11VP/min给予ColoAd1的等量静脉内剂量，以给予耐受良好的剂量给予(每剂1e12VP)。在每一后续剂量增加病毒浓度峰值的趋势是典型的。

这清楚地表明所要求保护的给药方案对病毒药代动力学的有益效果，第二次给药和第三次给药之后的病毒峰值水平越来越高于第一次给药之后病毒的峰值水平。这证明用较早给药占据或移除非癌症病毒陷阱的益处。这一给药在这三名患者中良好耐受。

图8B示出ColoAd1-1001临床研究的患者群组1至4(分别1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²和1×10¹³个病毒颗粒)的四个不同给药水平的第一次病毒给药之后，平均初始药代动力学(病毒DNA拷贝/ml)。在每一情况下，历时5分钟给予剂量并且病毒输注速率从最低剂量的2×10⁹个病毒颗粒/分钟增加到最高剂量的2×10¹²个病毒颗粒/分钟。在最高的两个剂量，对于延长的时间段，血液病毒浓度保持在高于2×10⁶个病毒颗粒/mL。这是有效地建立肿瘤内感染的最低血液水平(从临床前研究预测并示于图1)。对于1×10¹²剂量，该目标水平实现1至2小时，而对于1×10¹³剂量，该目标水平保持超过6小时。然而，以2×10¹²个病毒颗粒/分钟给予的1×10¹³病毒颗粒剂量耐受性差，两名患者经历急性细胞因子介导的剂量限制性毒性，因此这一给药方案不是最佳的。使用耐受良好的输注速率(例如2×10¹¹个病毒颗粒/分钟或更慢)的给药方案可允许高至1×10¹³个病毒颗粒并可能更高的剂量的给药。使用这一数据，随后可将药代动力学模拟用于显示历时1小时输注1×10¹³个病毒颗粒的剂量(1.67×10¹¹个病毒颗粒/分钟)将在大部分患者中保持高于2×10⁶目标水平的病毒血液水平3小时或更长。

图9A至9H示出了ColoAd1-1001临床试验中患者的药代动力学。向患者给予第一剂量的ColoAd1，然后用qPCR测量系列血液抽出物的病毒负载。测试以下治疗方案。

图9A：历时5分钟给予1e10(1×10¹⁰)病毒颗粒(群组1)；图9B：历时5分钟给予1e11(1×10¹¹)病毒颗粒(群组2)；图9C：历时5分钟给予1e12(1×10¹²)病毒颗粒(群组3)；图9D：历时5分钟给予1e13(1×10¹³)病毒颗粒(群组4)；图9E：历时5分钟给予3e12(3×10¹²)病毒颗粒(群组5)；图9F：历时20分钟给予3e12(3×10¹²)病毒颗粒(群组6)；图9G：历时40分钟给予6e12(6×10¹²)病毒颗粒(群组7)。

每一曲线表示在接受ColoAD1之前和治疗后高至约6小时的每一单位时间对单个测试个体测量的病毒血液水平。

当病毒血液水平超过约3e8病毒基因组/mL的阈值时，在患者中首次观察到不良副作用。

因此，将约3e7至3e8病毒基因组/mL的范围确定为理想的治疗范围，并且将病毒血液水平尽可能长地保持在该水平内的方案将使病毒血液水平最大化，同时使毒性副作用最小化。

如可从药代动力学曲线看出，图9G(历时40分钟给予6e12颗粒)显示特别合适的曲线，病毒血液水平在治疗范围内保持最长。

图10示出当以较慢输注或较快输注给予ColoAd1-1001研究中的患者相同剂量时，C_Max水平之间的比较。向群组5和6均给予3×10¹²病毒颗粒的总剂量，但对于群组5，历时5分钟输注剂量(快速输注)，而对于群组6，历时20分钟输注剂量(慢速输注)。可看出减慢输注速率可以有效地导致C_Max的较少变化和较低的平均C_Max水平，因此限制B群腺病毒的输注速率关系到最高C_Max水平何时与毒性相关。

图11示出在ColoAd1-1001临床研究中，在第1、3和5天给予ColoAd1静脉内给药(箭头指示给药点)之后，人癌症患者中随时间的MCP1水平(μg/L)。图表显示分别给予表7中显示的不同给药方案的不同患者群组(1至7)之间的比较。

在以下时间点之后进行MCP1水平(μg/L)的测量：0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、54小时、60小时、72小时、96小时、102小时、108小时、120小时、168小时和336小时。这一人类数据反映了在小鼠中见到的相似模式，对于每一测试的剂量，在每次给药之后MCP1的降低水平，因此支持了要求保护的给药方案的特殊益处。

在图12中见到的细胞因子模式与之前小鼠研究中观察到的细胞因子模式(参见图6)一致，显示在第一剂量之后，每一后续剂量被更好地耐受，即使当3次剂量的每一次相等时。

研究表明通过静脉内给予病毒颗粒的给药能够建立肿瘤的B型腺病毒感染

图12示出腺病毒典型的复制循环。腺病毒结构蛋白如六联体，其构成病毒壳体的90％，仅在复制已经发生之后的感染期间晚期表达。随后蛋白被运送到核用于组装。因此，核具有最高浓度的六联体和复制期间的其他结构蛋白。因此，核六联体染色可用于腺病毒的定量，和作为已被ColoAd1成功感染的细胞的标志物。

在ColoAd1-1002临床研究中，患有原发(非转移)结肠直肠肿瘤的患者通过肿瘤内(IT)递送或静脉内(IV)递送接受ColoAd1。在IT组，以高至1e8VP的剂量作为多次注射(实际剂量取决于肿瘤尺寸)通过结肠镜给予病毒。在IV组，剂量为以在第1、3和5天历时5分钟的输注给予的1e12VP。然后，在第一次ColoAd1给药之后7至14天，切除原发肿瘤并送去病理检查，包括ColoAd1六联体的免疫组织化学(IHC)染色。

使用抗六联体抗体(ab8251)分析福尔马林固定、石蜡包埋的人肿瘤样品的切片中病毒的存在。

使用具有VentanaBenchmarkUltra的验证实验进行染色。强核染色表明经历壳体组装的六联体的存在。

同时在相同条件下处理同种型对照。

图13示出用ColoAd1体外感染的结肠直肠癌细胞系的透射EM图像。

图14A示出已用ColoAd1肿瘤内注射(IT)后感染，然后针对六联体染色的肿瘤样品的细胞染色图像。可以看出，在癌细胞中有显著的核染色，而在间质细胞中没有核染色。图14B示出相应的同种型对照。这些切片共同显示直接肿瘤内递送后，ColoAd1选择性地感染肿瘤细胞而不感染正常细胞。

图14C示出已用ColoAd1静脉内(IV)给予后感染，然后针对六联体染色的肿瘤样品的细胞染色图像。可以看出，在癌细胞中有显著的核染色，而在间质细胞中没有核染色。图14D为相应的同种型对照。

因此，这些图像提供明显的证据，当使用要求保护的静脉内给药方案时，ColoAd1可以与肿瘤内递送等价的方式选择性地递送至肿瘤细胞。

实施例2药物组合

在结肠癌细胞系HT29中评估在320种临床批准的化合物或正在开发的化合物的存在下ColoAd1病毒的复制。将HT-29细胞以3.0e4/孔的密度接种于96孔板，并在37℃、5％CO₂孵育。4-6小时孵育后，将在细胞培养基中制备的病毒和药物化合物混合物稀释于细胞上，以得到每个细胞10ColoAd1病毒颗粒和0.1μM药物化合物的最终浓度。将细胞孵育18小时然后通过qPCR评估细胞内总病毒基因组。在图15中对于所有化合物绘制了ColoAd1复制与单独ColoAd1病毒相比的相对倍数变化。插图显示在微管抑制剂的存在下18小时后病毒复制的增高，和在拓扑异构酶抑制剂的存在下病毒复制的降低。

在卵巢癌的IP模型中评估肿瘤模型中紫杉醇或顺铂治疗对ColoAd1效力的影响。向SCID小鼠植入2.5e6表达荧光素酶的SKOV-3人卵巢癌细胞。通过荧光素酶表达评估肿瘤负荷。在第5天、每组治疗之前一天和研究持续期间至少每5至7天对小鼠成像。使用由腹膜内注射递送的5e9病毒颗粒进行所有ColoAd1治疗，并且在联合治疗组中，在病毒治疗后一天递送紫杉醇(0.4mg)或顺铂(0.04mg)。使用IVIS成像系统通过荧光素酶成像评估疾病进展。用PBS(A)、紫杉醇(B)、ColoAd1(C)或紫杉醇和ColoAd1(D)通过IP注射给药的小鼠中相对荧光的成像示于图16并且每一给药组的随时间追踪的相对荧光示于图17。用PBS(组1)、ColoAd1然后顺铂(组2)、顺铂然后ColoAd1(组3)或紫杉醇和ColoAd1(组4)通过IP注射给药的小鼠中相对荧光的成像示于图18。给药程序表在图17和18中详述。

Claims (27)

1.用于治疗人类患者的方法，所述方法包括步骤：

在单次治疗周期中全身给予多剂量的有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的胃肠外制剂，

其中在每次给药中给予的总剂量为1×10¹⁰至1×10¹⁴个病毒颗粒/剂量，以及

其中给予每一剂量的病毒，以使病毒颗粒递送速率为2×10¹⁰个颗粒/分钟至2×10¹²个颗粒/分钟。

2.如权利要求1所述的方法，其中在每次给药中给予的所述总剂量为1×10¹²至1×10¹³个病毒颗粒/剂量，例如在每次给药中给予的所述总剂量为3×10¹²至9×10¹²个病毒颗粒/剂量，特别其中在每次给药中给予的所述总剂量为6×10¹²个病毒颗粒/剂量。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中每一剂量给药之间的时段为6小时至72小时，例如48小时。

4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述多剂量为在单次治疗周期中2次、3次、4次、5次、6次或7次剂量。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述治疗周期为14天或更少的时段，例如7天或5天。

6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中给予每一病毒剂量，以使对于每一剂量，所述病毒颗粒递送速率为1×10¹¹个病毒颗粒/分钟至3×10¹¹个病毒颗粒/分钟，例如2×10¹¹个病毒颗粒/分钟或1.67×10¹¹个病毒颗粒/分钟，尤其给予每一病毒剂量，以使对于每一剂量，所述病毒颗粒递送速率为1.5×10¹¹个病毒颗粒/分钟。

7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中对于每一剂量，历时60分钟的时段给予1×10¹³个病毒颗粒，或者其中对于每一剂量，历时40分钟的时段给予6×10¹²个病毒颗粒。

8.如权利要求1至7中任一权利要求项所述的方法，其中在给予第二和任选的后续剂量之后的病毒的血浆水平达到至少2×10⁶个病毒颗粒/mL的水平。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述病毒颗粒的血浆水平维持15分钟或更久，例如20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟。

10.如权利要求1至9中任一权利要求项所述的方法，其中所给予的所述制剂的体积为100mL或更少，例如30mL或更少，如约3mL或5mL。

11.如权利要求1至10中任一权利要求所述的方法，其中在第1天给予第一剂量，并且之后每隔一天给予其他治疗剂量，例如其中在第1天给予所述第一剂量，在第3天和第5天给予所述其他治疗剂量。

12.如权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中所述腺病毒是嵌合腺病毒，例如其中所述嵌合腺病毒是ColoAd1。

13.如权利要求1至12中任一权利要求所述的方法，其中与任何其他抗癌疗法的给予组合地给予所述病毒，所述抗癌疗法包括化学治疗剂、免疫治疗剂如抗体或其片段、小分子抑制剂如激酶抑制剂或mTOR抑制剂、放射疗法、放射同位素疗法或其任何组合。

14.如权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中与一种或多种预防剂的给予组合地给予所述病毒，所述预防剂例如选自退热剂、止吐剂、类固醇和镇痛剂。

15.如权利要求1至14中任一权利要求所述的方法，其用于治疗肿瘤，例如实体肿瘤，如结肠直肠恶性肿瘤。

16.如权利要求1至23中任一权利要求所述的方法，其中第一且治疗性剂量为10⁹至10¹⁴个病毒颗粒。

17.如权利要求1至16中任一权利要求所述的方法，其中所述腺病毒被制成至少部分地回避所述患者的免疫系统。

18.如权利要求1至17中任一权利要求所述的方法，其中所述腺病毒包含转基因。

19.如权利要求1至17中任一权利要求所述的方法，其中所述治疗导致所述癌细胞的坏死，并伴随有血浆细胞因子水平的升高。

20.使用包含ColoAd1的药物制剂治疗患者的方法，其包括步骤：向所述患者

在第1天静脉内给予第一治疗剂量，然后

在第3天静脉内给予第二治疗剂量，以及

在第5天静脉内给予第三治疗剂量。

21.治疗人类患者的方法，所述方法包括在单次治疗周期中全身给予多剂量的包含有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的胃肠外制剂，其中在每次给药中给予的总剂量为1×10¹⁰至1×10¹³个病毒颗粒，并且历时1分钟至90分钟的时段给予，例如其中在每次给药中给予的所述总剂量为6×10¹²个病毒颗粒，并且历时40分钟给予。

22.用于通过在单次治疗周期中全身给予多剂量的包含腺病毒的胃肠外制剂来治疗人类患者的有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒，其中在每次给药中给予的总剂量为1×10¹⁰至1×10¹⁴或者1×10¹⁰至1×10¹³个病毒颗粒，并且历时1分钟至90分钟的时段给予。

23.用于权利要求22的有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的胃肠外制剂，其中所给予的所述总剂量为1×10¹⁰至1×10¹⁴个病毒颗粒/剂量，并且给予每一病毒剂量，以使所述颗粒递送速率为2×10¹⁰个颗粒/分钟至2×10¹²个颗粒/分钟。

24.有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒在制造通过在单次治疗周期中全身给予多剂量的包含所述腺病毒的胃肠外制剂来治疗人类患者的药物中的用途，其中在每次给药中给予的总剂量为1×10¹⁰至6×10¹²个病毒颗粒，并且历时1分钟至90分钟的时段给予。

25.内部容积为3ml至50ml的玻璃或塑料注射器的用途，所述注射器包含胃肠外制剂，所述胃肠外制剂包含1×10¹⁰至6×10¹²个有复制能力的B亚群溶瘤腺病毒的病毒颗粒，其中所述制剂是无菌的并且在无菌条件下装填入所述注射器以用于治疗，尤其用于制造能够向人类患者注射或静脉内输注的药物，例如用于权利要求1至21中任一权利要求。

26.用于治疗卵巢癌的ColoAd1，例如采用本文所述的给药方案例如向患有卵巢癌的患者给予治疗有效量的ColoAd1。

27.联合疗法，其包括溶瘤B型腺病毒如ColoAd1，以及不干扰所述腺病毒活性如体内病毒复制的化学治疗剂。