CN105424636B - 一种粮食真菌污染情况的快速检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种粮食真菌污染情况的快速检测方法及其应用，涉及用微生物检测领域。所述方法,包括如下步骤：将污染有对照真菌的粮食分别与无菌粮食混合均匀，得到污染各对照真菌的粮食样品或污染不同浓度对照真菌的粮食样品；采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪，采集污染各样品在特征波段的红外光谱图及数据；对各样品的红外光谱数据进行主成分分析，提取主成分分值，运用线性判别分析或偏最小二乘判别分析建立不同类别或不同浓度真菌鉴别模型，验证鉴别模型的可靠性；采集待测粮食样品在所述特征波段的红外光谱图及数据，采用所述模型确定待测粮食样品中污染的真菌种类或浓度。本发明方法可以迅速对粮食中污染霉菌进行定性和大致定量。
Description
技术领域
本发明涉及用红外光谱检测微生物的方法，一种粮食真菌污染情况的快速检测方法及其应用。
背景技术
粮食在适宜条件下极易发霉变质，不仅造成经济损失，且多数产毒霉菌的次级代谢产物严重威胁人畜健康。目前，粮食中霉菌污染的检测方法主要包括：平板菌落计数法、高效液相色谱法、气相色谱与质谱联用法、PCR和免疫法等，然而，上述方法存在或操作繁琐、灵敏性低，或成本高且耗时长等不足，难以实时监测粮食中霉菌的生长状况。因此，急需发展一种能够快速识别粮食中污染霉菌的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有检测粮食中霉菌污染方法过程复杂，耗时过长或成本较高的问题，提供了一种可以迅速对粮食中污染霉菌进行定性和大致定量的方法。
本发明采用如下技术方案实现。
一种粮食中真菌污染情况的快速检测方法,包括如下步骤：
(1)将污染有对照真菌的粮食分别与无菌粮食混合均匀，得到污染各对照真菌的粮食样品或污染不同浓度对照真菌的粮食样品；
(2)采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪，采集污染各对照真菌的粮食样品或污染不同浓度对照真菌的粮食样品在特征波段的红外光谱图及数据；所述特征波段为4000～800cm-1和/或10000～4000cm-1波段；
(3)对各样品的红外光谱数据进行主成分分析，提取主成分分值，运用线性判别分析或偏最小二乘判别分析建立不同类别或不同浓度真菌鉴别模型，验证鉴别模型的可靠性；
(4)采集待测粮食样品在所述特征波段的红外光谱图及数据，采用步骤(3)中建立的模型确定待测粮食样品中污染的真菌种类或浓度。
所述特征波段为1800～900cm-1、1800～1485cm-1和10000～4000cm-1中一个或两个以上波段。
采用留一交互验证法验证鉴别模型的可靠性。
步骤(2)中采集红外光谱图过程中，光谱分辨率为4cm-1，在各波段对每个样品至少检测3次，取每个样品的平均光谱；样品的每次检测中，至少扫描32次。
所述主成分分析是指二维主成分分析。
每种粮食样品取5个以上的平行样。
所述对照真菌为灰绿曲霉、亮白曲霉、黄灰青霉菌、扩展青霉、尖孢镰刀菌。
采用本发明方法可以快速分析粮食中污染的霉菌种类并进行大致定量，操作简便、耗时短、成本较低。
附图说明
图1 7种霉菌孢子悬浮液样品的ATR-FTIR光谱图。
图2 7种霉菌孢子悬浮液样品的PCA得分图(1800～900cm-1)。
图3 7种霉菌孢子悬浮液样品红外光谱信息的LDA得分图(1800～900cm-1)。
图4不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图(1800～900cm-1)，各图标分别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量为0。
图5不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA得分图(1800～900cm-1)，各图标分别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量为0。
图6不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图(1800～1485cm-1)，各图标分别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量为0。
图7不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA得分图(1800～1485cm-1)，各图标分别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量为0。
图8不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图(10000～4000cm-1)，各图标分别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量为0。
图9不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA得分图(10000～4000cm-1)，各图标分别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量为0。
图10三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图(1800～900cm-1)。
图11三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图(1800～1485cm-1)。
图12三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图(10000～4000cm-1)。
图13多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图(1800～900cm-1)，图标表示各无菌稻谷中添加灰绿曲霉1污染稻谷粉末的质量。
图14多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图(1800～1485cm-1)，图标表示各无菌稻谷中添加灰绿曲霉1污染稻谷粉末的质量。
图15多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图(10000～4000cm-1)，图标表示各无菌稻谷中添加灰绿曲霉1污染稻谷粉末的质量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。在该部分选取稻谷中常见有害霉菌的一种或多种进行实验：包括：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的灰绿曲霉CGMCC3.3975(缩写为灰绿曲霉1)、灰绿曲霉CGMCC3.0100(缩写为灰绿曲霉2)和黄灰青霉CGMCC3.5243，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的亮白曲霉CICC40475(缩写为亮白曲霉)、青霉CICC41489(以下简写为青霉1)、扩展青霉CICC41063(缩写为扩展青霉)、尖孢镰刀菌CICC2532(缩写为尖孢镰刀菌1)、尖孢镰刀菌CICC41029(缩写为尖孢镰刀菌2)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的青霉ACCC30106(缩写为青霉2)、尖孢镰刀菌ACCC31369(缩写为尖孢镰刀菌3)。
实施例1 七种真菌孢子悬液的红外光谱检测
1.霉菌的培养
采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养。500mL三角瓶装入400mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基，经121℃灭菌20min后，待培养基冷却到55℃左右时，将培养基倒入到灭菌过的一次性培养皿中，待培养皿中的培养基凝固后，将灰绿曲霉1、亮白曲霉、黄灰青霉、扩展青霉、尖孢镰刀菌1、尖孢镰刀菌2、尖孢镰刀菌3分别接种到PDA培养基上，在培养箱中培养，培养温度为28℃。
2.孢子悬浮液的收获与处理
将培养5d后的霉菌取出，取4mL灭菌的甘油水溶液(甘油与水体积比为1:10)于培养基表面，轻微震荡后，移取培养基表面的孢子悬浮液于EP管中，置于-20℃保藏备用。
3.计数
将孢子悬浮液置于微型旋涡混合仪上振荡10s，取50uL孢子悬浮液于血球计数板上，在EX 30生物显微镜(舜宇光学科技(集团)有限公司)下观察并计数，七种霉菌孢子初始悬液的浓度分别为：扩展青霉：(5.5±0.3)×106cfu/mL，黄灰青霉：(5.4±0.2)×106cfu/mL，尖孢镰刀菌1：(1.9±0.1)×107cfu/mL，尖孢镰刀菌2：(1.4±0.1)×107cfu/mL，尖孢镰刀菌3：(6.9±0.2)×106cfu/mL，灰绿曲霉1：(3.4±0.3)×106cfu/mL，亮白曲霉：(1.1±0.2)×107cfu/mL，即七种霉菌孢子悬浮液的浓度相近。为验证ATR-FTIR对霉菌光谱特异性以及不同孢子悬浮液浓度的影响，分别对以上样品稀释10倍和20倍，每个稀释度取三个平行样，共计得到63份样品，进行检测分析。
4.ATR-FTIR光谱采集
利用德国布鲁克公司的FTIR仪(傅里叶变换红外光谱仪，型号TENSOR27)，结合红外ATR(衰减全反射)附件(Pike公司，美国)采集63份样品的红外光谱信息。先扫描背景(空气)，然后移取4uL的样品于红外ATR附件上进行检测，扫描32次，分辨率为4cm-1，光谱范围4000～800cm-1，每个样品至少检测3次，取平均光谱建模。不同样品间需用无水乙醇擦拭平台以避免交叉污染。
图1是63份样品的ATR-FTIR光谱图。对光谱图分析可知，在3700～2996cm-1处是与O-H、N-H伸缩振动有关的吸收，1800～1450cm-1处是关于蛋白质酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的吸收，1185～900cm-1处为C-O-C和C-O-P的伸缩振动带。仔细观察可知，不同霉菌样品的光谱图在1800～900cm-1存在一定差异，表明其内部成分存在细微差异。
5.数据分析
采用TQAnalyst v6、SPSS 16.0软件对所有样品的光谱数据进行分析，包括：运用TQAnalyst v6对原始红外光谱数据进行主成分分析，提取各样品原始红外光谱主成分分值，然后把主成分分值导入到SPSS 16.0软件中，分别采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和线性判别分析(LDA)建立鉴别模型。最后采用留一交互验证法对各鉴别模型性能进行验证。主成分分析是指二维主成分分析。
图2为63份样品光谱信息的前两个主成分的得分图。结果显示，从菌属来看，尖孢镰刀菌属、青霉属和曲霉属3种菌属间的差异较为明显，曲霉类样品可完全区分于其他2类。除了个别来自青霉菌属的样品与其他类别混在一起之外，大部分样品能够被很好的区分。进一步观察7类霉菌样品的聚类趋势可知，除了3种尖孢镰刀菌样品及黄灰青霉样品间存在部分重叠之外，其余3种霉菌可区分良好。结果表明，不同霉菌样品悬浮液的红外光谱吸收强度存在区别，PCA可以提取不同样品间的差异信息，采用ATR-FTIR法识别稻谷中的不同霉菌具有可行性。
图3为7种霉菌孢子红外光谱信息的LDA函数得分图。结果显示，不同类别霉菌样品在水平方向的位置相距较远，差异明显，除青霉菌属间和曲霉菌属间出现部分重叠外，其余样品均能被完全区分，其结果优于PCA。运用线性判别分析建立的鉴别模型，采用留一交互验证评价该模型的可靠性，结果如表1所示，整体判别正确率为87.1％，其中仅尖孢镰刀菌3的判别正确率偏低，3个样误判为尖孢镰刀菌1，其余结果均大于或等于80％。尖孢镰刀菌1和黄灰青霉的判别正确率最高，均为100％。另外，仔细观察发现，误判均发生在不同菌属内，3类菌属间的判别正确率同为100％。
表1 7种霉菌孢子悬浮液样品的LDA模型留一交互验证结果
运用PLS-DA判别分析建立鉴别模型，该模型对各样品的判别结果如表2所示。结果显示，模型对尖孢镰刀菌1和灰绿曲霉两类样品的判别精度最佳，对尖孢镰刀菌3、扩展青霉和亮白曲霉的精度稍差。7类样品的判别正确率为79.2％～99.1％之间，整体平均判别正确率为87.3％，与LDA方法类似。
表2 7类霉菌样品的留一交互验证PLS-DA模型判别结果
本实施例说明采用本发明方法鉴定稻谷中真菌的种类和浓度是可行的。
实施例2 稻谷中污染灰绿曲霉的定性和定量检测
1.含有灰绿曲霉的稻谷样品的制备：将灰绿曲霉1接种到经辐照灭菌的无菌稻谷上于28℃培养，接种后第十天取出培养的稻谷，用高速万能粉碎机(型号FW100，天津市泰斯特仪器有限公司)粉碎备用；同时将辐照灭菌的无菌稻谷粉碎作为对照稻谷样品。在无菌稻谷中分别加入上述制得的含有灰绿曲霉的稻谷粉末2g、5g、10g、20g和50g，混合均匀后制得含有不同浓度灰绿曲霉的稻谷样品，每份稻谷样品的总质量均为50g，经PDA培养基传统培养计数，各浓度稻谷样品中污染的灰绿曲霉数量分别为770、1 300、3 500、5 000和92000cfu/g。
2.红外光谱数据的采集与分析：
采用德国布鲁克公司的FTIR仪(型号TENSOR 27)，结合ATR附件(Pike公司，美国)直接采集上述各稻谷样品(包括对照稻谷样品)在特征波段的的红外光谱数据，此处特征波段是指1800～900cm-1、1800～1485cm-1和10000～4000cm-1波段。
采用TQAnalyst v6、SPSS 16.0软件对所有样品的光谱数据进行分析，包括：运用TQAnalyst v6对原始红外光谱数据进行主成分分析，提取各样品原始红外光谱主成分分值，然后把主成分分值导入到SPSS 16.0软件中，分别采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和线性判别分析(LDA)建立鉴别模型。最后采用留一交互验证法对各鉴别模型性能进行验证。主成分分析是指二维主成分分析。
图4和图5分别是在1800～900cm-1波段不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图和LDA得分图，表3是在1800～900cm-1不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果；
表3 不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(1800～900cm-1)
图6和图7分别是在1800～1485cm-1波段不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图和LDA得分图，表4是在1800～1485cm-1不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果；
表4 不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(1800～1485cm-1)
图8和图9分别是在10000～4000cm-1波段不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图和LDA得分图，表5是在10000～4000cm-1不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果。
表5 不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(10000～4000cm-1)
由以上实验结果可知，应用中红外波段(1800～900cm-1、1800～1485cm-1波段)的光谱数据和近红外波段(10000～4000cm-1波段)的光谱数据均可以实现稻谷中灰绿曲霉浓度的有效判别，但近红外光谱数据的判别准确率更高。
上述结果说明，采用本实施例方法可以准确鉴别稻谷中灰绿曲霉的含量。
对于感染灰绿曲霉浓度未知的稻谷样品，直接用高速万能粉碎机粉碎，采集光谱数据后，代入本实施例中通过LDA法建立的鉴别模型，通过模型的验证结果确定样品中灰绿曲霉的污染程度。
实施例3 稻谷中污染不同霉菌的检测研究
含有灰绿曲霉的稻谷样品的制备：将灰绿曲霉1、灰绿曲霉2和一株青霉接种到经辐照灭菌的无菌稻谷上于28℃培养，接种后第十天取出培养的稻谷，用高速万能粉碎机(型号FW100，天津市泰斯特仪器有限公司)粉碎成粉末；同时将辐照灭菌的无菌稻谷粉碎作为对照稻谷样品。在无菌稻谷中分别加入灰绿曲霉1、灰绿曲霉2和一株青霉的稻谷粉末，混合均匀后制得含有不同霉菌的稻谷样品，每份稻谷样品的总质量均为50g，经PDA培养基传统培养计数，各霉菌污染稻谷中的带菌量分别为：灰绿曲霉2污染的稻谷带菌量为1300cfu/g；灰绿曲霉1污染的稻谷带菌量为370cfu/g；青霉污染的稻谷带菌量为60cfu/g。
使用实施例2中方法采集与分析各稻谷样品的红外光谱数据。
图10、图11和图12分别为在光谱波段为1800～900cm-1，1800～1485cm-1和10000～4000cm-1时三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图。
表6、表7和表8分别为在光谱波段为1800～900cm-1，1800～1485cm-1和10000～4000cm-1时三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果。
表6 三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(1800～900cm-1)
表7 三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(1800～1485cm-1)
表8 三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(10000～4000cm-1)
由以上实验结果可知，应用中红外波段(1800～900cm-1、1800～1485cm-1波段)的光谱数据和近红外波段(10000～4000cm-1波段)的光谱数据均可以有效鉴别稻谷中感染的真菌种类，但近红外光谱数据的判别准确率更高。
实施例4稻谷中污染多种不同霉菌后对其中某一种真菌的检测与定量研究
使用与实施例3相同的方法和步骤进行试验，不同之处在于辐照灭菌的稻谷中分别接种灰绿曲霉1、灰绿曲霉2、青霉1和青霉2。取灰绿曲霉2、青霉1和青霉2单独污染的稻谷粉末各1g，分别与灰绿曲霉1污染的稻谷粉末0.1、1、10、30和47g混合，然后加入至相应的无菌稻谷粉末中，制成总质量为50g的待检稻谷粉末，检测不同红外波段光谱数据对四种霉菌污染稻谷的检测结果，其中，污染稻谷中灰绿曲霉的带菌量分别约为：50、500、3000、10 000和100 000cfu/g。
图13、图14和图15分别为在光谱波段为1800～900cm-1、1800～1485cm-1和10000～4000cm-1时的多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图。
表9、表10和表11分别为在光谱波段为1800～900cm-1，1800～1485cm-1和10000～4000cm-1时的多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果。
表9 多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(1800～900cm-1)
表10 多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(1800～1485cm-1)
表11 多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(10000～4000cm-1)
由以上结果可知，无论是对接种不同种菌株的稻谷样品，还是对接种同一种菌株但不同浓度的稻谷样品，傅立叶红外和近红外光谱都能将其区分开来，且正确判别率均大于80％。近红外正确判别率更高，几乎为100％。
Claims (5)
1.一种粮食中真菌污染情况的快速检测方法,其特征在于包括如下步骤：
（1）将污染有对照真菌的粮食分别与无菌粮食混合均匀，得到污染各对照真菌的粮食样品或污染不同浓度对照真菌的粮食样品；
（2）采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪，采集污染各对照真菌的粮食样品或污染不同浓度对照真菌的粮食样品在特征波段的红外光谱图及数据；所述特征波段为10000～4000 cm-1波段；
（3）对各样品的红外光谱数据进行主成分分析，提取主成分分值，运用线性判别分析或偏最小二乘判别分析建立不同类别或不同浓度真菌鉴别模型，验证鉴别模型的可靠性；
（4）采集待测粮食样品在所述特征波段的红外光谱图及数据，采用步骤（3）中建立的模型确定待测粮食样品中污染的真菌种类或浓度；
所述对照真菌为灰绿曲霉、亮白曲霉、黄灰青霉、扩展青霉、尖孢镰刀菌。
2.根据权利要求1所述粮食中真菌污染情况的快速检测方法，其特征在于采用留一交互验证法验证鉴别模型的可靠性。
3.根据权利要求2所述粮食中真菌污染情况的快速检测方法，其特征在于步骤（2）中采集红外光谱图过程中，光谱分辨率为4 cm-1，在各波段对每个样品至少检测3次，取每个样品的平均光谱；样品的每次检测中，至少扫描32次。
4.根据权利要求3所述粮食中真菌污染情况的快速检测方法，其特征在于所述主成分分析是指二维主成分分析。
5.根据权利要求4所述粮食中真菌污染情况的快速检测方法，其特征在于每种粮食样品取5个以上的平行样。
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