CN105358700A

CN105358700A - 用于制备α,ω-烷二醇的方法

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Publication number: CN105358700A
Application number: CN201480017847.9A
Authority: CN
Inventors: T.哈斯; P.恩格尔; J.C.普费弗; O.图姆; C.格林
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2014-01-10
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2034-01-10
Also published as: WO2014114505A1; EP2759598A1; CN105358700B; US20150353963A1; EP2948555B1; US10450590B2; EP2948555A1

Abstract

本发明涉及一种用于制备α,ω-烷二醇的方法，所述方法包括下述步骤a)使烷酸与烷醇反应，产生酯，b)通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯，c)氢化该氧化的酯，形成烷二醇和烷醇，和d)蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物，将该烷醇返回到步骤a)中。

Description

用于制备α,ω-烷二醇的方法

本发明涉及一种用于制备α,ω-烷二醇的方法，所述方法包括下述步骤：a)使烷酸与烷醇反应，产生酯，b)通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯，c)氢化该氧化的酯，形成α,ω-烷二醇和烷醇，和d)蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物，和将该烷醇返回到步骤a)中。

胺和二胺是一类在工业上具有高需求的分子，它们常规地在烃的裂化过程中得到。它们用于例如制备聚酰胺，合成的、商购可得的、热塑性物质。

胺和二胺的常规化学技术生产依赖于石化原料的供给，低效并且在该过程中形成大量不希望的副产物。由于所述缺点，已经开发了使用生物催化剂从可再生原料出发得到胺的方法。烷烃或烷醇具体地可用作反应物，其可以通过生物技术方法从可再生的原料制备。在现有技术中描述了多种用于将烷烃和烷醇转化成胺的方法，例如，在欧洲专利申请EP11174729.1和EP11006458.1中。

在现有技术中描述的方法的一个缺点是，用作反应物的烷烃或烷醇的仅部分被转化成产物。相当大部分反应产生不希望的副产物或中间体，或未反应保留在反应混合物中。

在该背景下，本发明要解决的问题是提供一种用于制备α,ω-烷二醇的方法，在所述方法中，将用作反应物的烷醇以尽可能高的比例引入到期望的产物（优选令人感兴趣的α,ω-烷二醇）中。

通过本申请的主题和尤其是通过附带的独立权利要求的主题实现了这些和其它目的，其中实施方案由从属权利要求获悉。

在第一方面中，通过包括下述步骤的方法解决了本发明要解决的问题：

a) 使烷酸与烷醇反应，产生酯，

b) 通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯，

c) 氢化该氧化的酯，形成α,ω-烷二醇和烷醇，

d) 蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物，和

e) 将该烷醇返回到步骤a)中。

在第一方面的第一个实施方案中，通过这样的方法解决了所述问题，其中步骤a)中的烷酸是式H₃C - (CH₂)_n–COOH的烷酸，且其中n > 0，优选2-16。

在第一方面的第二个实施方案（其也是第一个实施方案的一个实施方案）中，通过这样的方法解决了所述问题，其中所述烷酸是丁酸。

在第一方面的第三个实施方案（其也代表第一个至第二个实施方案的一个实施方案）中，通过这样的方法解决了所述问题，其中步骤a)中的烷酸是式C_nH_2n-1COOH的羧基化的环烷烃，其中n > 4，优选5-8。

在第一方面的第四个实施方案（其也代表第一个至第三个实施方案的一个实施方案）中，通过这样的方法解决了所述问题，其中所述烷醇是式C_nOH_2n+2的烷醇，且其中n > 0。

在第一方面的第五个实施方案（其也代表第一个至第四个实施方案的一个实施方案）中，通过这样的方法解决了所述问题，其中步骤a)中的烷酸和烷醇具有相同的碳骨架。

在第一方面的第六个实施方案（其也代表第一个至第五个实施方案的一个实施方案）中，通过这样的方法解决了所述问题，其中步骤a)和/或c)中的全细胞催化剂表达烷烃羟化酶，所述烷烃羟化酶选自：得自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的AlkB及其变体和得自Alcanivorans borkumensis SK2的CYP153及其变体。

在第一方面的第七个实施方案（其也代表第一个至第六个实施方案的一个实施方案）中，通过这样的方法解决了所述问题，其中借助酸催化的酯形成进行步骤a)，优选地在有机溶剂存在下。

在第一方面的第八个实施方案（其也代表第一个至第七个实施方案的一个实施方案）中，通过这样的方法解决了所述问题，其中借助与酯酶、蛋白酶或脂肪酶（优选地以表达酯酶或脂肪酶的全细胞催化剂的形式提供）接触，在水溶液中进行步骤a)。

在第一方面的第九个实施方案（其也代表第一个至第七个实施方案的一个实施方案）中，通过这样的方法解决了所述问题，其中通过将烷烃氧化成烷酸来提供步骤a)中的烷酸。

根据本发明的方法首先在步骤a)中提供烷酸与烷醇的反应，产生酯。该反应的合适反应条件是本领域技术人员已知的。例如，可以直接在酸催化下进行酯化。在该情况下，优选地由与酸和醇的平衡中蒸馏除去酯。所述烷醇优选地是式C_nOH_2n+2的烷醇，其中n大于0，且优选1-4，最优选4，且例如是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22。

优选地在有机溶剂存在下进行步骤a)。特别合适的溶剂是仲醇和叔醇，特别是支化的醇诸如2-甲基-2-丁醇。另外合适的是醚诸如叔丁基甲基醚或环烷烃诸如己烷和甲基己烷或芳族溶剂诸如甲苯。

在一个优选的实施方案中，通过与水解酶接触来进行步骤a)，所述水解酶优选地选自酯酶、蛋白酶或脂肪酶。在现有技术中描述了合适的水解酶。特别合适的是，例如，得自Novozymes的脂肪酶Novozym®435。

在步骤a)之后，在步骤b)中通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“全细胞催化剂”被理解为是指完整的、存活的和有代谢活性的细胞，其提供期望的烷烃羟化酶的酶活性。该全细胞催化剂优选地是原核细胞，优选是细菌细胞。在另一个优选的实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个优选的实施方案中，它是低等真核细胞，优选是酵母细胞。原核细胞的例子包括埃希氏菌属（Escherichia），特别是大肠杆菌（Escherichia coli），和假单胞菌属（Pseudomonas）和棒杆菌属（Corynebacterium）的菌株。低等真核细胞的例子包括酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、子囊菌酵母属（Yarrowia）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces），特别是菌株热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）和酿酒酵母（Saccharomycescerivisiae）。合适的全细胞催化剂、通过基因工程方法制备它们的途径和培养操作是本领域技术人员已知的。

对于步骤b)中的氧化，该全细胞催化剂必须具有烷烃羟化酶。此外有利的是，根据本发明的全细胞催化剂具有有利于烷烃羟化酶的活性的其它酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“烷烃羟化酶”被理解为是指这样的酶：其催化未被取代的包含至少6个、优选12个碳残基的直烷基残基的羟基化。示例性氧化系统尤其描述在PCT/EP 2008/067447中。

烷烃羟化酶优选地是CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。在一个优选的实施方案中，术语“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”被理解为是指这样的细胞溶质氧化酶：其是另外含有铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的3-组分体系的一部分，具有烷烃结合位点和将烷烃羟基化的能力。在一个特别优选的实施方案中，它是：与得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)具有至少80%、优选90%、最优选95%或99 %序列同一性的酶，或者是含有一种多肽序列且另外具有烷烃羟化酶活性的酶，所述多肽序列与得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)具有至少80%、优选90%、最优选95%或99 %序列同一性。如贯穿本申请的，所述数据库代码在这里是指基于NCBI (国家生物技术信息中心, Bethesda, USA)的数据库，更精确讲，2013年1月11日可在线获得的版本。在一个优选的实施方案中，术语“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”被理解为是指非膜结合的氧化酶，其包括用于烷烃、未被取代的直烷基残基（包括至少5个、优选12个碳残基）或单羟基化的烷烃的结合位点，且其多肽链含有基序LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN。在一个优选的实施方案中，本文中使用的“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”是得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)或其变体，其优选地具有烷烃羟化酶活性。

为了给CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶最佳地供给来自还原剂（优选NADH）的电子，优选的是，所述全细胞催化剂的烷烃羟化酶与以下物质一起表达：各自在功能上与它相互作用的铁氧还蛋白还原酶，和在功能上与它相互作用的铁氧还蛋白。在此，它们是共表达的多肽，或是在N-或C-端与CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶融合的多肽。本领域技术人员可以如下容易地确定铁氧还蛋白还原酶或铁氧还蛋白与给定的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶是否在功能上相互作用：与缺少所述3种物质中的至少一种的情况相比，在烷烃底物和所述3种多肽存在下是否会更有效地氧化还原剂。或者可以使用Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M,和Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727描述的酶试验，在功能上相互作用的多肽的情况中，该试验显示出反应速率的显著增加。在一个特别优选的实施方案中，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶源自相同生物体。在一个特别优选的实施方案中，它们是得自Alcanivorax borkumensis SK2的铁氧还蛋白还原酶(数据库代码YP_691923)或其变体、得自Alcanivorax borkumensis SK2的铁氧还蛋白(数据库代码YP_691920)或其变体、和得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)或其变体。

在另一个优选的实施方案中，所述烷烃羟化酶是AlkB单加氧酶。AlkB是首先从得自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkBGT体系已知的氧化还原酶，其依赖于另外2种多肽AlkG和AlkT。AlkT被表征为FAD依赖性的红素氧还蛋白还原酶，其将电子从NADH传递至AlkG。AlkG是一种红素氧还蛋白（含铁的氧化还原蛋白），其作为AlkB的直接电子供体起作用。在一个优选的实施方案中，术语“AlkB单加氧酶”是这样的多肽：其与恶臭假单胞菌Gpo1的AlkB的序列(数据库代码: CAB54050.1；如同在本申请中使用的所有其它数据库代码一样，该数据库代码源自现有技术，即源自NCBI数据库，更精确讲，在2013年1月11日可在线得到的版本)具有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%的序列同源性（按照递增优选的次序给出），且具有氧化烷烃的能力。在一个特别优选的实施方案中，所述AlkB单加氧酶是氧化烷烃的氧化还原酶，其在功能上与得自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkG (CAB54052.1)和AlkT (CAB54063.1)多肽相互作用。为了给AlkB烷烃羟化酶最佳地供给电子，优选的是，所述细胞表达烷烃羟化酶以及在功能上与它相互作用的辅助蛋白，优选AlkG和/或AlkT或它们各自的变体，其中在一个特别优选的实施方案中，这些再次是得自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkG (CAB54052.1)和AlkT (CAB54063.1)多肽。

可用于步骤b)中的氧化的全细胞催化剂还可以用于提供步骤b)中的烷酸。这优选地通过使全细胞催化剂与具有烷酸的期望链长度的烷烃接触完成。在该情况下，全细胞催化剂必须表达烷烃羟化酶，其能够将烷烃的末端碳原子氧化直至成羧基。

本发明的教导不仅可以使用具有精确氨基酸或核酸序列的大分子（将其引入本文中）来实现，或者不仅可以使用相对于各自的野生型具有降低的带精确氨基酸序列的多肽活性的细胞（将其引入本文中）来实现，而且可以使用这样的大分子的变体、或与各个细胞的各自的野生型相比具有降低的多肽变体活性的细胞（其可以通过一个或超过一个氨基酸或核酸的删除、添加或置换而得到）来实现。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语核酸序列或氨基酸序列的“变体”（在下面与术语“同系物”等效地且可交换地使用）是指另一种核酸-或氨基酸序列，其包括或者是这样的序列：其相对于相应的原始野生型核酸-或氨基酸序列，具有70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或更高百分比的同源性（在这里与同一性等效使用），其中优选地，除了形成催化活性中心的氨基酸或者为结构、活性或折叠所必需的那些氨基酸以外的氨基酸被删除或置换，或者它们仅仅被保守地置换，例如用谷氨酸替换天冬氨酸，或用亮氨酸替换缬氨酸。现有技术描述了可以用于计算2个序列的同源性程度的算法，例如Arthur Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版。在本发明的另一个更优选的实施方案中，优选地除了前述序列同源性以外，氨基酸-或核酸序列的变体基本上具有与野生型分子或原始分子相同的酶活性。例如，作为蛋白酶的酶活性多肽的变体具有与该多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽键水解的能力。在一个特殊的实施方案中，术语“基本上相同的酶活性”是指，关于野生型多肽的底物的活性，其明显高于背景活性，或/和与野生型多肽关于相同底物表现出的K_M-和/或k_cat值相差小于3个、更优选2个、还更优选1个数量级。在另一个优选的实施方案中，术语核酸-或氨基酸序列的“变体”包含所述核酸-或氨基酸序列的至少一个活性部分或片段。在另一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“活性部分”是指这样的氨基酸序列或核酸序列：其具有比全长氨基酸序列更小的氨基酸序列或编码比全长氨基酸序列更小的氨基酸序列，其中具有比野生型氨基酸序列更小长度的氨基酸序列或编码的具有比野生型氨基酸序列更小长度的氨基酸序列具有与野生型多肽或其变体（例如蛋白酶）基本上相同的酶活性。在一个具体实施方案中，术语核酸的“变体”包括这样的核酸：其互补链结合野生型核酸，优选地在严谨条件下。对于本领域技术人员而言，杂交反应的严谨性是容易确定的，且通常取决于探针的长度、洗涤温度和盐浓度。一般而言，较长的探针需要较高的杂交温度，而较短的探针与较低温度一起使用。杂交是否发生，通常取决于变性的DNA与在它们附近存在的互补链（更确切地说在解链温度以下）退火的能力。杂交反应的严谨性和相应的条件详细地描述在：F. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.中。借助杂交鉴别DNA序列的说明本领域技术人员尤其可见于Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, 德国, 1993)的手册“The DIG system User’s Guide for Filter Hybridization”和Liebl等人(International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))。在一个优选的实施方案中，所述杂交在严谨条件下进行，也就是说，仅形成这样的杂交体：其中探针和靶序列（即用探针处理的多核苷酸）至少70%是相同的。已知的是，缓冲液组成、温度和盐浓度的变化会影响和/或决定包括洗涤步骤的杂交的严谨性。一般而言，与洗涤步骤相比，在相对低的严谨性下进行杂交反应(Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996)。例如，在约50℃-68℃的温度下，可以使用与5x SSC缓冲液相应的缓冲液用于杂交反应。在此，探针还可以与这样的多核苷酸杂交：所述多核苷酸与所述探针的序列具有小于70%的同一性。这样的杂交体具有更低的稳定性，并且通过在严谨条件下的洗涤来除去。这可以例如如下实现：通过将盐浓度降低至2x SSC，和任选地随后降低至0.5x SSC (The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, 曼海姆, 德国, 1995)，其中按照递增优选次序，设定约50℃- 68℃、约52℃- 68℃、约54℃- 68℃、约56℃- 68℃、约58℃- 68℃、约60℃- 68℃、约62℃- 68℃、约64℃- 68℃、约66℃- 68℃的温度。约64℃-68℃或约66℃-68℃的温度范围是优选的。任选地还可以将盐浓度降低至与0.2x SSC或0.1x SSC相应的浓度。通过使杂交温度以约1-2℃的步长从50℃逐步升高至68℃，可以分离这样的多核苷酸片段：例如，按照递增优选次序，其与使用的核酸分子的序列至少70%、或至少80%、或至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%相同。关于杂交的其它说明，可以在市场上以所谓的试剂盒(例如DIG Easy Hyb，得自公司Roche Diagnostics GmbH, 曼海姆, 德国, 目录号1603558)的形式得到。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语核酸的“变体”包括这样的任意核酸序列：其在遗传密码简并性的范围内，编码与原始核酸相同的氨基酸序列或该氨基酸序列的变体。

在全细胞催化剂的使用中，问题可能出现于：必须使底物与位于细胞内的酶接触，从而发生期望的反应。在长烷烃及其衍生物的情况下，优选的是，全细胞催化剂具有AlkL家族的多肽。在一个优选的实施方案中，本文中使用的“AlkL家族的多肽”是这样的多肽：其在230个相互连续的氨基酸的长度上与得自恶臭假单胞菌的AlkL (数据库代码CAB69081)具有至少80%、优选90%、更优选90%的序列同一性，且优选地具有促进长烷烃向细胞内部输入的能力。在另一个实施方案中，本文中使用的“AlkL家族的多肽”是位于革兰氏阴性细菌的外膜中的多肽，其具有序列基序DXWAPAXQ(V/A)GXR，其中X代表形成蛋白的氨基酸，且优选地另外是得自恶臭假单胞菌的AlkL (数据库代码CAB69081)或其变体。AlkL家族的成员的例子包括得自恶臭假单胞菌(数据库代码CAB69081)、水油海杆菌（Marinobacter aquaeolei）VT8 (数据库代码YP_957722)、亚历山大海洋柄菌（Oceanicaulis alexandrii ） HTCC2633 (数据库代码ZP_00953584)、Marinobacter manganoxydans MnI7-9 (数据库代码ZP_09158756)、柄杆菌（Caulobacter sp.）K31 (数据库代码YP_001672217)、食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）(数据库代码Q00595)的AlkL及其变体。

另外，如果可用具有烷烃羟化酶的全细胞催化剂的未改变野生型菌株施行本发明，优选的是，根据本发明使用的酶是在全细胞催化剂中重组表达的酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“重组的”被理解为是指，编码核酸分子在自然界中不存在，和/或它使用基因工程方法产生。在一个优选的实施方案中，如果对应的多肽由重组核酸编码，则使用术语重组蛋白。在一个优选的实施方案中，本文中使用的重组细胞被理解为是指具有至少一种重组核酸或一种重组多肽的细胞。适合用于生产重组分子或细胞的方法是本领域技术人员已知的，例如在Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版中描述的那些。

分子氧(O₂)必须在步骤b)中作为烷烃羟化酶的底物存在。这优选地如下实现：使大气空气接近在其中进行步骤b)的水溶液。优选地在通气下搅拌该水溶液。

作为水溶液，可使用与全细胞催化剂的活性相容的任何基于水的溶液。其优选地是水性介质，特别优选是基本培养基，其维持全细胞催化剂的代谢活性，但是其包含除了反应物以外尽可能少的其它物质，所述物质会使得到纯形式的反应产物变得困难。例如，可以使用M9培养基。

烷酸可以是在烷基残基上带有可被酯化的羧基的任意有机化合物。特别优选的是式H₃C - (CH₂)_n - COOH的烷酸，其中n是0或更大，优选2-24，特别优选2-16，最优选4, 作为示例是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在另一个优选的实施方案中，烷酸是式C_nH_2n-1COOH的羧基化的环烷烃，其中n是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24，且优选5-8。

关于烷酸和关于在本申请中描述的化学化合物，给出的各个式包括各种化合物的所有盐（质子化的或去质子化的）。例如，丁酸不仅包括质子化形式，而且包括具有所有阳离子的丁酸盐，例如丁酸钠。

根据本发明的方法的步骤c)包括将氧化的酯氢化，形成烷二醇和烷醇。在现有技术中，例如，在专利申请WO97/31882和EP1042259B1中，描述了众多合适的氢化方法，例如使用ZnO/CuO-催化剂、含有Ru或Rh的催化剂，其与无机氢化物诸如LiAlH₄一起使用。

根据本发明的方法的步骤d)包括蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物。后者包含产物烷二醇，其可以随后通过其它分离-和洗涤步骤与培养基和与全细胞催化剂分离。

所述方法的最终步骤包括将在步骤d)中除去的烷醇返回到步骤a)中，即，使所述烷醇与其它烷酸反应，且因此保留在所述方法中。

此外，通过下述附图和非限制性实施例更具体地描述了本发明，从其中可以推知本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。

图1显示了用大肠杆菌W3110 pBT10对正丁烷的生物转化中的丁酸-和1-丁醇浓度的时程，其得自实施例1的操作。

图2显示了使用大肠杆菌W3110 pCOM10[Ab_Fd/CYP153-2/FdOR/alkL]对丁酸丁酯的氧化产物的HPLC-MS分析的质量痕迹（Massenspuren），其中将10 min样品与7 h样品进行了对比，其得自实施例2的操作。

图3显示了使用大肠杆菌W3110 pBT10对丁酸丁酯的氧化产物的HPLC-MS分析的质量痕迹，其中将10 min样品与7 h样品进行了对比，其得自实施例2。

实施例1：通过具有得自恶臭假单胞菌GPO1的单加氧酶(alkBGT)的大肠杆菌W3110 pBT10氧化正丁烷。

a) 以10 l规模生产生物质

前种子培养物: 制备1升LB培养基(5 g/l酵母浸出物、10 g/l蛋白胨、0.5 g/l NaCl，溶解在1 l水中，在121℃高压灭菌20分钟)。

从该溶液，将5 x 25 ml分别装入100 ml具有挡板的摇动烧瓶中，将25µl无菌过滤的卡那霉素溶液(50 g/l)加入每个烧瓶中，且在每种情况下接种200µl大肠杆菌W3110 pBT10的甘油冷冻培养物。包含质粒pBT10的菌株已经详细描述在WO13083412的实施例4中。将这些培养物在37℃和200 rpm (振幅2.5 cm)温育18 h。

种子培养物：制备1升高细胞密度培养基(HCD培养基)，其由1.76 g/l NH₄SO₄、19.08 g/l K₂HPO₄、12.5 g/l KH₂PO₄、6.66 g/l酵母浸出物、1.96 g/l柠檬酸Na₃、17 ml柠檬酸NH₄Fe溶液(1%)、5 ml痕量元素溶液US3 (1升痕量元素溶液US 3由溶解在1 l水中的36.5 g HCl 37%、1.91 g MnCl₂ x 4H₂O、1.87 g ZnSO₄ x 7H₂O、0.8 g Na-EDTA x 2H₂O、0.3 g H₃BO₃、0.25 g Na₂MoO₄ x 2H₂O、4.7 g CaCl₂ x 2H₂O、17.8 g FeSO₄ x 7 H₂O、0.15 g CuCl₂ x 2H₂O组成)、30 ml补料溶液(葡萄糖50%w/v、MgSO₄ x 7 H₂O 0.5%w/v、NH₄Cl 2.2%w/v)和1 ml卡那霉素溶液(50 g/l)组成。将948 ml含有NH₄SO₄至柠檬酸Na₃的溶液高压灭菌，并将剩余成分各自分别无菌过滤，并然后在无菌条件下加入。pH为6.8。

将5 x 75 ml HCD培养基加入1000 ml具有挡板的摇动烧瓶中，给每个烧瓶接种25 ml前种子培养物，并在37℃和200 rpm (振幅2.5 cm)培养30 h。

给无菌的10 l发酵罐装入7 l具有以下组成的无菌培养基：1.75 g/l (NH₄)₂SO₄、19 g/l K₂HPO₄ x 3 H₂O、12.5 g/l KH₂PO₄、6.6 g/l酵母浸出物、2.24 g/l柠檬酸Na₃ x 2H₂O、15 g/l葡萄糖、0.49 g/l MgSO₄ x 7 H₂O、16.6 ml/l柠檬酸NH₄Fe溶液(1%w/v)、15 ml/l痕量元素溶液(如在种子培养物中一样)、1 ml/l卡那霉素溶液(50 mg/l)和2 ml消泡剂Delamex。补料是高压灭菌的补充了10 g/l的MgSO₄ x 7H₂O的葡萄糖溶液(50%w/v)，用0.5M H₂SO₄和25%NH₄OH校正pH。

将得自摇动烧瓶的培养物在无菌条件下合并，并经由转移瓶接种进发酵罐中。将发酵条件设为pO₂ 30%、气流6 nlpm、搅拌器400 - 1200 rpm、温度37℃、pH 7，8 h开始补料，补料速率150 - 250 g/h。19 h以后，将温度降低至30℃，并用0.4 mM DCPK诱导。23小时以后，发酵罐中的OD600是约100，在无菌条件下取出培养液，并将500 ml在1000 ml离心烧瓶中在8000 rpm离心。抛弃上清液，并将沉淀物等分进Falcon试管中，每个试管含有10 g。将沉淀物在-80℃冷冻用于以后使用。

b) 将正丁烷氧化成1-丁醇和丁酸

将10 g如在a)中所述的冷冻的生物质再悬浮于50 ml 70 mM磷酸铵缓冲液pH 7 (组成：8 g/l (NH₄)H₂PO₄、0.5 g/l NaCl、0.49 g/l MgSO₄ x 7H₂O、1 ml痕量元素溶液US3和50 μg/l卡那霉素)中。在此用5%NH₄OH调节pH。

将含有约3滴高压灭菌的消泡剂(Delamex)的130 ml 70 mM磷酸铵缓冲液pH 7 (组成：8 g/l (NH₄)H₂PO₄、0.5 g/l NaCl、0.49 g/l MgSO₄ x 7H₂O、1 ml痕量元素溶液US3和50 μg/l卡那霉素。用5%氨溶液将pH调至7.0)装入300 ml发酵罐中。经由具有0.2µm孔径的金属烧结perlator，用由25%正丁烷和75%合成空气组成的气体混合物以9 lN/h的流速充气（begast）发酵罐。将发酵罐在水浴中加热至30℃，并通过900 rpm的磁力搅拌器进行搅拌。用2.5%氨溶液将pH调至7.0。连续地补入葡萄糖溶液(葡萄糖补料速率为0.9 g/lh)。使排出气体穿过冰冷却的含有150 ml水的洗瓶。

将10 g如在a)中所述的冷冻的生物质再悬浮于50 ml磷酸铵缓冲液中并融化。给发酵罐接种混悬液。

生物质浓度具有25的光密度(600 nm)。在不同时间点从发酵罐取出各5 ml样品。将样品在10 000 g和室温下离心10分钟，并将上清液用0.2µm注射器式过滤器过滤。

通过Agilent Technologies 1200系统上的HPLC-RID，进行丁酸和1-丁醇的色谱分析。使用Aminex HPX-87H柱(300 mm x 7.8 mm)。使用10 mM H₂SO₄作为洗脱液，以0.6 ml/min的流速和40℃的柱温度运行该系统。在超纯水中制备所有要分析的物质的标准品，并在相同条件下测量。通过保留时间的对比进行评价。

48 h以后，丁酸浓度是约13.5 g/l，1-丁醇浓度是0.125 g/l (参见图1)。

实施例1c：用含有得自Alcanivorax borkumensis的单加氧酶CYP153的大肠杆菌W3110 pBT10氧化正丁烷。

给3个装有25 ml含卡那霉素的LB培养基(组成：5 g/l酵母浸出物、10 g/l蛋白胨、0.5 g/l NaCl、50 mg/l硫酸卡那霉素)的100 ml挡板烧瓶各自接种100µl具有得自Alcanivorax borkumensis的单加氧酶CYP153的大肠杆菌W3110 pCOM10[Ab_Fd/CYP153-2/FdOR/alkL]的甘油冷冻培养物，并在37℃和200 rpm温育20 h。使用的菌株详细描述于PCT/EP2013/054928的实施例4和实施例1中。

然后将每25 ml培养液用作在1000 ml挡板烧瓶中的75 ml改良M9培养基(组成：15 g/l葡萄糖、6.8 g/l Na₂PO₄、3 g/l KH₂PO₄、0.5 g/l NaCl、2 g/l NH₄Cl、15 g/l酵母浸出物、0.49 g/l MgSO₄*7H₂O、50 mg/l硫酸卡那霉素、15 ml/l痕量元素溶液US3。痕量元素溶液的组成：36.5 g/l 37%盐酸、1.91 g/l MnCl₂*4H₂O、1.87 g/l ZnSO₄*7H₂O、0.84 g/l Na-EDTA*2H₂O、0.3 g/l H₃BO₃ _、0.25 g/l Na₂MoO₄*2H₂O、4.7 g/l CaCl₂*2H₂O、17.3 g/l FeSO₄*7H₂O、0.15 g/l CuCl₂*2H₂O)的接种物。将烧瓶在37℃和200 rpm温育2.5 h。然后将温度降至25℃。在25℃0.5小时以后，用0.4 mM二环丙基酮诱导培养物。将培养物在25℃和200 rpm温育另外16 h。

将培养物合并，转移至50 ml falcon试管，并在5500 g在25℃离心10分钟。抛弃上清液，并将得自300 ml培养物的沉淀物再悬浮于50 ml转化缓冲液pH 7 (组成：8 g/l (NH₄)H₂PO₄、0.5 g/l NaCl、0.49 g/l MgSO₄*7H₂O、50 mg/l硫酸卡那霉素、15 ml/l痕量元素溶液US3；用25%氨溶液将pH调至7.0)中。

类似于1.1，用大肠杆菌W3110 pCOM10[Ab_Fd/CYP153-2/FdOR/alkL]进行转化、取样和分析。

将得自1-b)和1-c)的丁酸和丁醇通过蒸馏从水相分离，并进一步用在实施例1d中。

实施例1d：丁酸和丁醇的共沸酯化

将88 g丁酸和81.4 g 1-丁醇（得自实施例1b和1c，且在丁醇的情况下，任选地得自实施例3）以及5 g对甲苯磺酸混合并加热至沸腾。使用水分离器借助共沸蒸馏在回流下进行反应，直到已经分离定量转化的计算水量(18 mL)。将形成的酯(129.6 g丁酸丁酯)通过蒸馏与过量的1-丁醇和催化剂分离，并转移到实施例2中用于借助全细胞催化剂的氧化。

实施例2：丁酸丁酯的氧化

给每个装有25 ml含卡那霉素的LB培养基(组成：5 g/l酵母浸出物、10 g/l蛋白胨、0.5 g/l NaCl、50 mg/l硫酸卡那霉素)的100 ml挡板烧瓶各自接种100µl大肠杆菌W3110 pCOM10[Ab_Fd/CYP153-2/FdOR/alkL]或大肠杆菌W3110 pBT10的甘油冷冻培养物，并在37℃和200 rpm温育20 h。

然后将完全预培养物各自用作在1000 ml挡板烧瓶中的75 ml改良M9培养基(组成：15 g/l葡萄糖、6.8 g/l Na₂PO₄、3 g/l KH₂PO₄、0.5 g/l NaCl、2 g/l NH₄Cl、15 g/l酵母浸出物、0.49 g/l MgSO₄*7H₂O、50 mg/l硫酸卡那霉素、15 ml/l痕量元素溶液US3。痕量元素溶液的组成：36.5 g/l 37%盐酸、1.91 g/l MnCl₂*4H₂O、1.87 g/l ZnSO₄*7H₂O、0.84 g/l Na-EDTA*2H₂O、0.3 g/l H₃BO₃ _、0.25 g/l Na₂MoO₄*2H₂O、4.7 g/l CaCl₂*2H₂O、17.3 g/l FeSO₄*7H₂O、0.15 g/l CuCl₂*2H₂O)的接种物。将烧瓶在37℃和200 rpm温育2.5 h。然后将温度降至25℃。在0.5小时以后，用0.4 mM二环丙基酮诱导培养物。将培养物在25℃和200 rpm温育另外16 h。

将培养物转移至50 ml falcon试管，并在5500 g在25℃离心10分钟。抛弃上清液，并将得自每种菌株的沉淀物再悬浮于50 ml转化缓冲液pH 7 (组成：8 g/l (NH₄)H₂PO₄、0.5 g/l NaCl、0.49 g/l MgSO₄*7H₂O、50 mg/l硫酸卡那霉素、15 ml/l痕量元素溶液US3；用25%氨溶液将pH调至7.0)中，并在500 ml挡板烧瓶中在30℃和180 rpm温育。

为了开始反应，将2 g/l丁酸丁酯和5 g/l葡萄糖加入每个烧瓶中。将含有缓冲液、丁酸丁酯和葡萄糖且不含细胞的烧瓶温育作为阴性对照。

生物质浓度具有2.5的光密度(600 nm)。在10 min和7 h以后分别取2 ml样品。将样品在10 000 g在室温离心10分钟，并用0.2µm注射器式过滤器过滤上清液。

通过HPLC-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific)，进行丁酸丁酯的氧化产物的筛选。由于它们的准确质量和由此推导出的经验式，可以鉴别丁酸丁酯和由此衍生出的氧化产物。在两个实验批次中，尤其可以检测出单端和两端羟基化的酯(参见图2和3)。

实施例3：氧化的丁酸丁酯的还原氢化，形成1,4-丁二醇：

将740 mg氢化铝锂预先装入50 mL干燥的乙醚中，并将10 g得自实施例2的氧化的酯在0℃缓慢地逐滴加入。在完全加入后，将混合物加热至沸腾，并在回流下搅拌直到完全转化。

将得到的醇通过蒸馏进行分离。得到7.41 g 1,4-丁二醇和1.77 g 1-丁醇。将丁醇再循环至实施例1d并在那里酯化。

Claims

1.包括以下步骤的方法：

a) 使烷酸与烷醇反应，产生酯，

c) 氢化该氧化的酯，形成α,ω-烷二醇和烷醇，和

d) 蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物，和

e) 将该烷醇返回到步骤a)中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的烷酸是式H₃C - (CH₂)_n–COOH的烷酸，且其中n > 0，优选2-16。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述烷酸是丁酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的烷酸是式C_nH_2n-1COOH的羧基化的环烷烃，其中n > 4，优选5-8。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述烷醇是式C_nOH_2n+2的烷醇且n > 0。

6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中步骤a)中的烷酸和烷醇具有相同的碳骨架。

7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中步骤a)中的全细胞催化剂表达烷烃羟化酶，所述烷烃羟化酶选自：得自恶臭假单胞菌的AlkB及其变体，和得自Alcanivorans borkumensis SK2的CYP153及其变体。

8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中借助酸催化的酯形成进行步骤a)，优选在有机溶剂存在下。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中借助与酯酶、蛋白酶或脂肪酶的接触，在水溶液中进行步骤a)，所述酯酶、蛋白酶或脂肪酶优选地以表达酯酶或脂肪酶的全细胞催化剂的形式提供。

10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中通过将烷烃氧化成烷酸，提供步骤a)中的烷酸。