CN105339493B - 来自秋叶氏芽孢杆菌的密码子改性淀粉酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用用于表达来自秋叶氏芽孢杆菌成熟淀粉酶AX856的密码子改性多核苷酸构建体，对该淀粉酶进行编码的一种分离的合成多核苷酸。
Description
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及编码成熟淀粉酶的分离的合成多核苷酸、包括该多核苷酸的多核苷酸构建体、用所述多核苷酸或多核苷酸构建体转化的或包括所述多核苷酸或多核苷酸构建体的重组宿主细胞，以及用于生产成熟淀粉酶的方法，所述方法包括如在有助于表达该淀粉酶的条件下培养宿主细胞的步骤。
发明背景
在酶的高度竞争性工业制造中，不断地改进产率或产量是至关重要的。出于此目的，已经将基因操作或基因工程化投入使用多年，其中已经将编码感兴趣的多肽的基因置于异源的或合成的启动子的转录控制下，已经在不同宿主细胞中用异源信号肽表达它们，并且已经以多个拷贝将它们整合进宿主细胞基因组中，以便达到所谓的mRNA饱和。
已经基于旨在其表达的宿主细胞的情况，并且基于不同理论mRNA熔点或三级结构计算，将用来增加酶产量的另一熟知技术用于优化酶编码DNA序列中的密码子使用。
虽然如此，仍对鉴别新方式以便改进感兴趣的酶的表达具有显著的兴趣。由于酶制造业中高度竞争性的环境，即使微小的改进也是希望的。
发明概述
我们构建了地衣芽孢杆菌亲本宿主菌株，用于编码与来自AmyL淀粉酶的异源信号肽融合的、感兴趣的成熟淀粉酶多肽的多核苷酸的三个相同的拷贝的位点特异性整合。
然后通过将天然秋叶氏芽孢杆菌(Bacillus akibai)AX856成熟淀粉酶编码基因(SEQ ID NO:1)的三个相同拷贝连同AX856淀粉酶编码基因的三个不同的合成密码子优化版本(分别是Syn1(SEQ ID NO:2)、Syn2(SEQ ID NO:3)和Syn3(SEQ ID NO:4))引入亲本菌株，构建四种子代菌株。令我们惊讶的是，合成基因之一，Syn3(SEQ ID NO:4)，表现极大地优于另两种合成基因几乎两倍的一个因子。
相应地，在一个第一方面，本发明提供了编码成熟淀粉酶的分离的合成多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:4中示出的核苷酸序列。
在一个第二方面，本发明涉及一种核酸构建体，该核酸构建体包括如在第一方面中限定的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至提供该多核苷酸在所选择的宿主细胞中的表达的控制序列。
在一个第三方面，本发明涉及用如在第一方面中限定的多核苷酸或如在第二方面中限定的多核苷酸构建体转化的或包括该多核苷酸或该多核苷酸构建体的一种重组宿主细胞，其中所述宿主细胞生产该成熟淀粉酶。
在最后一个方面，本发明涉及用于生产成熟淀粉酶的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在有助于表达该淀粉酶的条件下培养如在第三方面中限定的宿主细胞；以及任选地
b)回收淀粉酶。
定义
编码序列：术语“编码序列”是指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，该成熟多肽是由具有SEQ ID NO:4中示出的DNA序列的多核苷酸编码的。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:4。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
发明的详细说明
多核苷酸
本发明还涉及编码成熟淀粉酶多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods andApplication)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。使用熟知的方法，天然淀粉酶编码多核苷酸可以克隆自秋叶氏芽孢杆菌的菌株。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主生物体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。
相应地，在一个第一方面，本发明涉及编码成熟淀粉酶的一种分离的合成多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:4中示出的核苷酸序列；优选地，该分离的合成多核苷酸由SEQ ID NO:4中示出的核苷酸序列组成。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’-末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化裂解或自动催化裂解前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
相应地，在一个第二方面，本发明涉及一种核酸构建体，该核酸构建体包括如在第一方面中限定的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至提供该多核苷酸在所选择的宿主细胞中的表达的控制序列；优选地，这些控制序列包括三串联启动子；更优选地，这些控制序列包括编码与指导淀粉酶进入宿主细胞分泌通路的淀粉酶N末端融合的信号肽的多核苷酸区；并且最优选地，该信号肽是amyL信号肽。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
相应地，在一个第三方面，本发明涉及用如在第一方面中限定的多核苷酸或如在第二方面中限定的多核苷酸构建体转化的或包括该多核苷酸或该多核苷酸构建体的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞生产该成熟淀粉酶。
生产方法
本发明还涉及用于生产由本发明的合成多核苷酸编码的成熟淀粉酶的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在有助于表达该淀粉酶的条件下培养如在第三方面中限定的宿主细胞；以及任选地
b)回收淀粉酶。
在一个优选实施例中,宿主细胞是芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用本领域已知的、特异性针对淀粉酶的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面中，回收包括该多肽的发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包括本发明的多肽的一种发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。
在一个方面中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。
实例
实例1.来自不同合成基因的成熟淀粉酶的表达
菌株：
已经构建了地衣芽孢杆菌亲本宿主菌株，用于编码感兴趣的多肽的多核苷酸的三个相同的拷贝的位点特异性整合。然后通过将天然AX856淀粉酶编码基因的三个相同拷贝连同AX856淀粉酶编码基因的三个不同合成密码子优化版本(分别是Syn1-Syn3)引入亲本菌株，构建四种子代菌株：
·地衣芽孢杆菌PP3570亲本宿主菌株。
·地衣芽孢杆菌JA 3716：(用天然秋叶氏芽孢杆菌AX856淀粉酶基因转化的PP3570)。
·地衣芽孢杆菌JA 3718：(用Syn1淀粉酶基因转化的PP3570)。
·地衣芽孢杆菌JA 3720：(用Syn2淀粉酶基因转化的PP3570)。
·地衣芽孢杆菌JA 3722：(用Syn3淀粉酶基因转化的PP3570)。
菌株构建：
地衣芽孢杆菌PP3570：
如下构建亲本地衣芽孢杆菌菌株PP3570：在地衣芽孢杆菌宿主中，删除aprL、glu特异性蛋白酶mprL、sacB、σF因子spo2AC和cypX基因。通过核糖体结合位点(RBS)的突变，破坏forD翻译。
通过将染色体上三个分开的基因座中的强三串联启动子(如在WO 9943835中所披露)的拷贝位点特异性地插入这三个基因座中的每一个，然后插入包含来自乳球菌噬菌体TP901-1的attB位点的另外的DNA。将attB识别序列用于将编码感兴趣的多肽的多核苷酸的拷贝同时插入染色体上的这三个基因座，这样结果是，通过基因座中已经存在的三串联启动子可操作地连接它们。通过如在WO 06042548中所披露的噬菌体TP901-1重组酶的瞬时表达，完成多核苷酸拷贝的插入。
使用了亲本菌株和噬菌体整合方法，我们构建了以下四种菌株：JA3716、JA3718、JA3720和JA3722，其中所有四种都是同基因的，除了每种菌株中的三个插入的多核苷酸拷贝的DNA序列之外。以下提供了菌株构建的细节。
地衣芽孢杆菌JA3716：
将编码秋叶氏芽孢杆菌AX856淀粉酶的基因克隆进噬菌体整合载体中，在下游侧翼插入attP位点用于整合，并且在上游侧翼插入cry3A区，后者旨在用于通过完整构建体整合后的同源重组进行载体唯一性删除。在SEQ ID NO:1中示出了编码淀粉酶的成熟部分的DNA序列。淀粉酶的成熟部分被表达为具有AmyL信号肽的融合多肽。所得质粒pJA3688用于将淀粉酶基因插入至在亲本地衣芽孢杆菌染色体上的三个attB位点的三串联启动子之后。所得3拷贝淀粉酶菌株被表示为JA3716。
JA3716菌株具有在染色体中的三个不同位置的、编码成熟淀粉酶AX856的SEQ IDNO:1的多核苷酸的三个拷贝。
地衣芽孢杆菌JA3718：
将编码AX856淀粉酶的第一合成密码子优化基因(Syn1)克隆进噬菌体整合载体中，在下游侧翼插入attP位点用于整合，并且在上游侧翼插入cry3A区，后者旨在用于通过完整构建体整合后的同源重组进行载体唯一性删除。在SEQ ID NO:2中示出了编码淀粉酶的成熟部分的DNA序列。淀粉酶的成熟部分被表达为具有AmyL信号肽的融合多肽。所得质粒pJA3691用于将淀粉酶基因插入至在亲本地衣芽孢杆菌染色体上的三个attB位点的三串联启动子之后。所得3拷贝淀粉酶菌株被表示为JA3718。
JA3718菌株具有在染色体中的三个不同位置的、编码成熟淀粉酶AX856的SEQ IDNO:2的合成多核苷酸的三个拷贝。
地衣芽孢杆菌JA3720：
将编码AX856淀粉酶的第二合成密码子优化基因(Syn2)克隆进噬菌体整合载体中，在下游侧翼插入attP位点用于整合，并且在上游侧翼插入cry3A区，后者旨在用于通过完整构建体的整合后的同源重组进行载体唯一性删除。在SEQ ID NO:3中示出了编码淀粉酶的成熟部分的DNA序列。淀粉酶的成熟部分被表达为具有AmyL信号肽的融合多肽。所得质粒pJA3692用于将淀粉酶基因插入至在亲本地衣芽孢杆菌染色体上的三个attB位点的三串联启动子之后。所得3拷贝淀粉酶菌株被表示为JA3720。
JA3720菌株具有在染色体中的三个不同位置的、编码成熟淀粉酶AX856的SEQ IDNO:3的合成多核苷酸的三个拷贝。
地衣芽孢杆菌JA3722：
将编码AX856淀粉酶的第三合成密码子优化基因(Syn3)克隆进噬菌体整合载体中，在下游侧翼插入attP位点用于整合，并且在上游侧翼插入cry3A区，后者旨在用于通过完整构建体的整合后的同源重组进行载体唯一性删除。在SEQ ID NO:4中示出了编码淀粉酶的成熟部分的DNA序列。淀粉酶的成熟部分被表达为具有AmyL信号肽的融合多肽。所得质粒pJA3694用于将淀粉酶基因插入至在亲本地衣芽孢杆菌染色体上的三个attB位点的三串联启动子之后。所得3拷贝淀粉酶菌株被表示为JA3722。
JA3722菌株具有在染色体中的三个不同位置的、编码成熟淀粉酶AX856的SEQ IDNO:4的合成多核苷酸的三个拷贝。
发酵：如以下所述用地衣芽孢杆菌进行分批补料发酵。所有生长培养基通过本领域中已知的方法进行灭菌。除非另外描述，使用自来水。在下面的配方中提及的成分浓度是任何接种之前的浓度。
第一接种物培养基：SSB4琼脂：大豆蛋白胨SE50MK(DMV)10g/l；蔗糖10g/l；磷酸氢二钠，2H2O 5g/l；磷酸二氢钾2g/l；柠檬酸0,2g/l；维生素(硫胺盐酸盐11,4mg/l；核黄素0,95mg/l；烟酰胺7,8mg/l；泛酸钙9,5mg/l；盐酸吡哆醛1,9mg/l；D-生物素0,38mg/l；叶酸2.9mg/l)；痕量金属(MnSO4，H2O 9.8mg/l；FeSO4，7H2O 39,3mg/l；CuSO4，5H2O 3,9mg/l；ZnSO4，7H2O 8,2mg/l)；琼脂25g/l。使用去离子水。使用NaOH将pH调节至pH 7.3至7.4。
转移缓冲液：M-9缓冲液(使用去离子水)：磷酸氢二钠，2H2O 8.8g/l；磷酸二氢钾3g/l；氯化钠4g/l；硫酸镁，7H2O 0.2g/l。
接种物摇瓶培养基(浓度是接种之前的浓度)：PRK-50：110g/l大豆粗磨粉；磷酸氢二钠，2H2O 5g/l；在灭菌之前，使用NaOH/H3PO4将pH调节至8.0。
组成培养基(浓度是接种之前的浓度)：胰蛋白胨(来自Difco的酪蛋白水解物)30g/l；七水硫酸镁，7H2O 4g/l；磷酸氢二钾7g/l；磷酸氢二钠，2H2O 7g/l；硫酸二铵4g/l；硫酸钾5g/l；柠檬酸0.78g/L；维生素(硫胺盐酸盐34,2mg/l；核黄素2,8mg/l；烟酰胺23,3mg/l；泛酸钙28,4mg/l；盐酸吡哆醛5.7mg/l；D-生物素1.1mg/l；叶酸2.5mg/l)；痕量金属(MnSO4，H2O 39.2mg/l；FeSO4，7H2O 157mg/l；CuSO4，5H2O 15.6mg/l；ZnSO4，7H2O 32,8mg/l)；消泡剂(SB2121)1.25ml/l；在灭菌之前，使用NaOH/H3PO4将pH调节至6.0。
补料培养基：蔗糖708g/l；
接种步骤：首先，在37℃下，使菌株在SSB-4琼脂斜面上生长1天。然后，使用M-9缓冲液洗涤琼脂，并且在650nm处测量所得细胞悬浮液的光密度(OD)。使用OD(650nm)x ml细胞悬浮液＝0.1的接种物来接种接种物摇瓶(PRK-50)。将摇瓶在37℃下、在300rpm处培养20hr。通过用来自该摇瓶的生长培养物接种主发酵罐来开始主发酵罐(发酵器)中的发酵。接种体积是组成培养基的11％(对于720ml组成培养基而言，是80ml)。
发酵罐设备：使用配备以下项的标准实验室发酵罐：温度控制系统，使用氨水和磷酸的pH控制，用于贯穿整个发酵过程测量氧饱和度的溶氧电极。
发酵参数：
温度：38℃
使用氨水和磷酸将pH保持在6.8与7.2之间
对照：6.8(氨水)；7.2磷酸
通气：1.5升/min/kg培养液重量
搅拌：1500rpm
补料策略：
0hr。接种之后，0.05g/min/kg初始培养液
8hr。接种之后，0.156g/min/kg初始培养液
结束：接种之后，0.156g/min/kg初始培养液
实验装置：
在恒定搅拌下将培养运行两天，并且在此时期，在线跟踪氧张力。并排比较不同菌株。
结果：
下表列出了相对于来自天然编码序列的产率，来自三个合成编码序列的淀粉酶产率。
表中的产率清晰地示出合成淀粉酶编码序列令人惊讶地比另两个表现更好。与天然编码基因相比，“syn3”淀粉酶基因提供了远远更高的淀粉酶产率，并且几乎是另两个合成基因的两倍之多。
Claims (10)
1.一种编码成熟淀粉酶的分离的合成多核苷酸，所述多核苷酸由SEQ ID NO:4中示出的核苷酸序列组成。
2.一种多核苷酸构建体，包括如在权利要求1中限定的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至提供该多核苷酸在所选定的宿主细胞中的表达的控制序列上。
3.如权利要求2所述的多核苷酸构建体，其中这些控制序列包括三串联启动子。
4.如权利要求2或3所述的多核苷酸构建体，其中这些控制序列包括编码与指导淀粉酶进入宿主细胞分泌通路的淀粉酶N末端融合的信号肽的多核苷酸区。
5.如权利要求4所述的多核苷酸构建体，其中所述信号肽是amyL信号肽。
6.用如在权利要求2-5中任一项限定的多核苷酸构建体转化的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞生产该成熟淀粉酶。
7.包括如在权利要求1中限定的多核苷酸的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞生产该成熟淀粉酶。
8.如权利要求6或7所述的宿主细胞，该宿主细胞是芽孢杆菌属细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，该宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。
10.一种用于生产成熟淀粉酶的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在有助于表达该淀粉酶的条件下培养如在权利要求6、7、8或9中限定的宿主细胞；以及任选地
b)回收淀粉酶。
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