CN105297141A - 瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种瓜上10种病害的微阵列芯片。本发明还同时公开了利用上述芯片进行的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，对每个待测样品依次进行以下步骤：1)、提取待测样品的DNA；2)、引物荧光标记PCR反应；3)、将步骤2)所得的至少2种病菌对应的PCR扩增产物等体积混合；4)、芯片杂交与洗涤：将步骤2)所得的每种病菌对应的PCR扩增产物或者将步骤3)所得的混合物95℃变性5min，然后冰浴5min，得预处理后PCR扩增产物；然后将上述预处理后PCR扩增产物进行芯片杂交与洗涤；所述芯片杂交为45℃杂交1h；5)、芯片扫描，获得检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害检测领域，特别是瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针。
背景技术
随着分子生物学技术的发展，植物病害的检测技术由传统的形态学鉴定发展到现在的分子检测水平，从检测的速度、灵敏度准确性等各个方面都有很大的进步。血清学检测、普通PCR检测技术、荧光PCR检测技术的应用使得病害的检测在灵敏度、特异性、准确性上更进一步，但这类检测技术已不能完全满足大量、快速、灵敏对植物病害检测的要求，基因芯片技术的出现，将样品检测和分析过程实现连续化、集成化和微型化，且具有高通量、高灵敏度检测水平，能够同时对多种样品中多种病原进行检测。
基因芯片技术是20世纪90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术，是各学科交叉综合的崭新科学。其原理是将大量DNA探针片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析。它是一种快速、高效、高通量分析生物信息的工具。基因芯片在核酸序列测定、基因突变的检测、基因表达情况的分析、疾病诊断、病原菌检测、药物开发和筛选等诸多领域的研究中得到了广泛应用，受到人们的普遍重视。当前随着经济全球化和世界贸易量的持续增长，一些病原微生物也开始快速流行。
瓜类是我国重要的经济作物。随着我国近年来对外贸易的快速发展，瓜类种子进口量逐步上升，有害生物随进境瓜类种子传入我国的可能性加大。在引种的过程中加强对病原物的检疫，防止疫病传播蔓延是我们的重要工作之一。因此建立快速、高效、灵敏、特异的检测方法对加强进出口瓜类种子检疫有十分重要的意义。
甜瓜黑点根腐病菌(MonosporascuscannonballusP.)、瓜蔓枯病菌(MycosphaerellamelonisC.)、瓜炭疽病(Colletotrichumorbiculare)、黄瓜黑星病菌(Cladosporiumcucumerinum)、黄瓜黑色根腐病菌(Phomopsissclerotioides)这类真菌，瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliW.)、瓜细菌性角斑病菌(Psendomonassyringaepv.lachrymans)这类细菌以及南瓜花叶病毒(Sqashmosaicvirus)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus)这类病毒是危害瓜类的重要病原物。在新疆局瓜种子出口贸易中，这10种病害每年都有上百批的的检测需求，在面对大量检测样品时，尤其在同一样品要求检测多种病害的情况下，难以实现高通量快速同步多病害检测，尤其是真菌、细菌病害分离周期非常长，经验要求很高，阳性样品确定难度大，灵敏度不高，极大的影响了最终的检测结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针，本发明能实现检验检疫准确、快速、简便、高通量的技术要求。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种瓜上10种病害的微阵列芯片，该芯片包含如下寡核苷酸探针中的至少一类(涉及瓜炭疽病菌时，瓜炭疽病菌T-GAPDHx、瓜炭疽病菌T-GSx必须同时使用)；
瓜蔓枯病菌Db-Px：CCATTGTAAGCCGCTGTTGTTGAGAAGTGAAA；
甜瓜黑点根腐病菌Mc-Px：CCACAACTACAGGGTAGCTACCGGGTAGGCTACTCTAGAGT；
瓜炭疽病菌T-GAPDHx：CGTAATGCCAGAGATCCCGGGAAGAGGA；
瓜炭疽病菌T-GSx：CTGACAGAACTGGACCAGACGTGCAATACCC；
瓜细菌性果斑病菌aac-Px：AAGAGGATCGTTCGAGAGAAGCGGCCTTC；
黄瓜黑色根腐病菌Phs-Px：CATCAGGTTGTTTTGTCGGGTGTGTGTGTG；
黄瓜黑星病菌Cc-Px：TGTCCAGCGTGTGGTGGAGGGTG；
瓜细菌性角斑病菌Psl-px：GCCATGCCGGTGAGTTTGCCTGC；
黄瓜花叶病毒CMV-Px：AGCGGGACGCGGAAGAACTCCCG；
南瓜花叶病毒SqMV-Px：GAACTGGGAAAGAAGCCACAACAAAACCCAGA；
黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-Px：GGAGGTTTAGAATGCCGCTTACCACGACCAC。
本发明还同时提供了利用上述芯片进行的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，对每个待测样品依次进行以下步骤：
1)、提取待测样品的DNA；配置成浓度为5-20ng/μl作为模板；
2)、引物荧光标记PCR反应：
反应体系25μl：10×PCRBuffer2.5μl，25mMMgCl22.5μl，dNTP0.5μl，10μM上下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，模板1.0μl；
PCR反应程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min；
上下游引物分别为以下(每种病菌对应一套引物，即具体为：瓜炭疽病菌对应2对引物，其余病菌对应1对引物)：
瓜蔓枯病菌Db-3x：CGTAAGTAGACCTCCACCAC
Db-5x：CAAGGGAAGCGTGTCAT；
甜瓜黑点根腐病菌Mc-1x：CATTAAAGAGTTATCCAACTCC
Mc-2x：ATGATAATTATTCAGAAGTGCC；
瓜炭疽病菌GAPDH-3x：CCCTTCATTGAGACCAAGT
GAPDH-4x：GTACTTGAGCATGTAGGCCT；
瓜炭疽病菌GS-3x：TTCGTTCTCGAACACGAT；
GS-4x：GAGACATGACGACCTTGTTC；
瓜细菌性果斑病菌aac-1x：CTGGGAGCGATCTTCATC
aac-2x：GTCAGGAGGGTGAGTAGCA；
黄瓜黑色根腐病菌Phs-1x：CAACCACTCCCTCCCTT；
Phs-2x：GGCGGCTGTGTACAAGA；
黄瓜黑星病菌Cc-3x：ATCGAGAAGTTCGAGAAGG；
Cc-4x：GTGATACCACGCTCACG；
瓜细菌性角斑病菌Psl-1x：GGCGACGCAATCAATGAT；
Psl-2x：TTCTTCGGCGGTGGTTT；
黄瓜花叶病毒CMV-1x：TCCGAGGAATTAAATGTTGA；
CMV-2x：TCGCGTCACAGATGTCTAC；
南瓜花叶病毒SqMV-1x：ACTTTGAAGTGGCTGGAAA；
SqMV-2x：AGGCTTCTAAAGCGAACTG；
黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-1x：CAGTTATAGGTCTAGGTCGCAG；
Cgmmv-2x：GAACATAAGAAGCACTAAACGC；
备注：上游引物标记Cy3；
3)、将步骤2)所得的至少2种病菌对应的PCR扩增产物等体积混合；
备注说明：假设当为瓜炭疽病菌和另一种病菌时，共获得3种PCR扩增产物，将此3种PCR扩增产物按照1:1:1的体积比进行等体积混合；其余依次类推；
4)、芯片杂交与洗涤：
将步骤2)所得的每种病菌对应的PCR扩增产物(备注说明：当为瓜炭疽病菌时，由于其有对应2对引物，因此，需要将2对引物所对应的PCR扩增产物等体积混合；其余病菌，均只有一种PCR扩增产物)或者将步骤3)所得的混合物95℃变性5min，然后冰浴5min；得预处理后PCR扩增产物；
然后将上述预处理后PCR扩增产物进行芯片杂交与洗涤；所述芯片杂交为45℃杂交1h；
5)、芯片扫描，获得检测结果。
作为本发明的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法的改进：
步骤5)为：
以每条探针重复点的均值计算信号强度值；若肉眼观察有信号，信号绝对值大于500，信噪比大于3，判为阳性；若信号绝对值小于500，信噪比小于2，判为阴性；如果信号模糊，信噪比介于2和3之间，判为可疑，需重复实验进行验证。
作为本发明的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法的进一步改进：
步骤4)中，芯片杂交时所配制的杂交反应液为：6μl预处理后PCR扩增产物，300nM杂交阳性对照1μl与7μl杂交液充分混合；
所述杂交液为：2.5％甲酰胺，2×SSC/4×SSC/6×SSC/8×SSC/10×SSC(优选6×SSC)0.2％SDS。
举例备注说明：2.5％甲酰胺，2×SSC，0.2％SDS，即为：在100ml的2×SSC中加入2.5g甲酰胺和0.2gSDS(十二烷基硫酸钠)。
为了满足我国当前对瓜类上病原物高通量检测方法的迫切需要，有效控制瓜类上病原物的发生和促进瓜类进出口贸易的发展，设计了本发明所述的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针。本发明符合检验检疫准确、快速、简便、高通量的技术要求，从接收样品算起，一次性检测10种病原物，总耗时不超过1天，大大缩短不同病原物的鉴定过程，这对于有效控制病原物的入侵、蔓延起关键作用，为控制疫病疫情、加快口岸验放速度赢得宝贵的时间。
本发明首次对瓜类植物上的十种病害进行了基因芯片检测技术的探索，从而建立一种可直接对这十种病害进行准确检测的新方法，同时为基因芯片技术能够更广泛地应用于其他病害研究打下基础。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为引物荧光标记PCR扩增结果图；
上：1.DL2000Marker；2.Cladosporiumcucumerinum-1；3.Cladosporiumcucumerinum-2；4.Cladosporiumcucumerinum-3；5.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-1；6.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-2；7.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-3；8.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-4；9.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-5；10.Colletotrichumorbiculare-1(GAPDH)；11.Colletotrichumorbiculare-2(GAPDH)；12.Colletotrichumorbiculare-3(GAPDH)；13.Colletotrichumorbiculare-4(GAPDH)；14.Colletotrichumorbiculare-1(GS)；15.Colletotrichumorbiculare-2(GS)；16.Colletotrichumorbiculare-3(GS)；17.Colletotrichumorbiculare-4(GS)；18.Didymellabryoniae-1；19.Didymellabryoniae-2；20.Didymellabryoniae-3，21.Didymellabryoniae-4；22.DL2000Marker
下：1.DL2000Marker；2.Monosporascuscannonballus-1；3.Monosporascuscannonballus-2；4.Cucumbergreenmottlemosaicvirus-1；5.Cucumbergreenmottlemosaicvirus-2；6.Cucumbergreenmottlemosaicvirus-3；7.Phomopsissclerotioides-1；8.Phomopsissclerotioides-2；10.Squashmosaicvirus-1；11.Squashmosaicvirus-2；12.Squashmosaicvirus-3；13.Psendomonassyringaepv.lachrymans-1；14.Psendomonassyringaepv.lachrymans-2；15.Psendomonassyringaepv.lachrymans-3；16.Cucumbermosaicvirus-1；17.Cucumbermosaicvirus-2；18.Cucumbermosaicvirus-3；19.DL2000Marker
图2为芯片杂交前预扫描结果。
图3为不同杂交时间对信号强度的影响；
a:30min；b:60min；c:90min；d:120min。
图4为不同杂交温度对信号强度的影响；
a：40℃；b：45℃；c：50℃；d：55℃。
图5为不同SSC浓度对杂交信号的影响；
a：2×SSC；b：4×SSC；c：6×SSC；d：8×SSC；e：10×SSC。
图6为瓜蔓枯病菌芯片灵敏度检测；
1：890pg(10-1)；2：89pg(10-2)；3：8.9pg(10-3)；4：890fg(10-4)；5：89fg(10-5)；6：8.9fg(10-6)；7：890ag(10-7)。
图7为荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：890pg(10-1)；3：89pg(10-2)；4：8.9pg(10-3)；5：890fg(10-4)；6：89fg(10-5)；7：8.9fg(10-6)；8：890ag(10-7)。
图8为甜瓜黑点根腐病菌芯片灵敏度检测；
1：3356pg(10-1)；2：335.6pg(10-2)；3：33.56pg(10-3)；4：3356fg(10-4)；5：335.6fg(10-5)；6：33.56fg(10-6)；7：3356ag(10-7)。
图9为荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：3356pg(10-1)；3：335.6pg(10-2)；4：33.56pg(10-3)；5：3356fg(10-4)；6：335.6fg(10-5)；7：33.56fg(10-6)；8：3356ag(10-7)；9：0。
图10为瓜炭疽病芯片灵敏度检测；
1：3.96ng(10-1)；2：396pg(10-2)；3：39.6pg(10-3)；4：396fg(10-4)；5：3.96pg(10-5)；6：39.6fg(10-6)；7：3.96fg(10-7)。
图11为GAPDH荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：3.96ng(10-1)；3：396pg(10-2)；4：39.6pg(10-3)；5：396fg(10-4)；6：3.96pg(10-5)；7：39.6fg(10-6)；8：3.96fg(10-7)；9：0。
图12为GS荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：3.96ng(10-1)；3：396pg(10-2)；4：39.6pg(10-3)；5：396fg(10-4)；6：3.96pg(10-5)；7：39.6fg(10-6)；8：3.96fg(10-7)；9：0。
图13为瓜细菌性果斑病菌芯片灵敏度检测；
1：2.52ng(10-1)；2：252pg(10-2)；3：25.2pg(10-3)；4：2.52pg(10-4)；5：252fg(10-5)；6：25.2fg(10-6)；7：2.52fg(10-7)。
图14为荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：2.52ng(10-1)；3：252pg(10-2)；4：25.2pg(10-3)；5：2.52pg(10-4)；6：252fg(10-5)；7：25.2fg(10-6)；8：2.52fg(10-7)；9：0。
图15为黄瓜黑色根腐病菌芯片灵敏度检测；
1：1.72ng(10-1)；2：172pg(10-2)；3：17.2pg(10-3)；4：1.72pg(10-4)；5：172fg(10-5)；6：17.2fg(10-6)；7：1.72fg(10-7)。
图16为荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：1.72ng(10-1)；3：172pg(10-2)；4：17.2pg(10-3)；5：1.72pg(10-4)；6：172fg(10-5)；7：17.2fg(10-6)；8：1.72fg(10-7)；9：0。
图17为黄瓜黑星病菌芯片灵敏度检测；
1：1.28ng(10-1)；2：128pg(10-2)；3：12.8pg(10-3)；4：1.28pg(10-4)；5：128fg(10-5)；6：12.8fg(10-6)；7：1.28fg(10-7)。
图18为荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：1.28ng(10-1)；3：128pg(10-2)；4：12.8pg(10-3)；5：1.28pg(10-4)；6：128fg(10-5)；7：12.8fg(10-6)；8：1.28fg(10-7)；9：0。
图19为瓜细菌性角斑病菌芯片灵敏度检测；
1：2.9ng(10-1)；2：290pg(10-2)；3：29pg(10-3)；4：2.9pg(10-4)；5：290fg(10-5)；6：29fg(10-6)；7：2.9fg(10-7)。
图20为荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：2.9ng(10-1)；2：290pg(10-2)；3：29pg(10-3)；4：2.9pg(10-4)；5：290fg(10-5)；6：29fg(10-6)；7：2.9fg(10-7)；8：0；9：DL2000Marker。
图21为黄瓜花叶病毒芯片灵敏度检测；
1：3.72ng(10-1)；2：372pg(10-2)；3：37.2pg(10-3)；4：3.72pg(10-4)；5：372fg(10-5)；6：37.2fg(10-6)；7：3.72fg(10-7)。
图22为荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：3.72ng(10-1)；3：372pg(10-2)；4：37.2pg(10-3)；5：3.72pg(10-4)；6：372fg(10-5)；7：37.2fg(10-6)；8：3.72fg(10-7)；9：0。
图23为南瓜花叶病毒芯片灵敏度检测；
1：2.68ng(10-1)；2：268pg(10-2)；3：26.8pg(10-3)；4：2.68p(10-4)；5：268fg(10-5)；6：26.8fg(10-6)；7：2.68fg(10-7)；
图24荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：2.68ng(10-1)；3：268pg(10-2)；4：26.8pg(10-3)；5：2.68p(10-4)；6：268fg(10-5)；7：26.8fg(10-6)；8：2.68fg(10-7)；9：0。
图25为黄瓜绿斑驳花叶病毒芯片灵敏度检测；
1：1.58ng(10-1)；2：158pg(10-2)；3：15.8pg(10-3)；4：1.58pg(10-4)；5：158fg(10-5)；6：15.8fg(10-6)；7：1.58fg(10-7)。
图26为荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
1：DL2000Marker；2：1.58ng(10-1)；3：158pg(10-2)；4：15.8pg(10-3)；5：1.58pg(10-4)；6：158fg(10-5)；7：15.8fg(10-6)；8：1.58fg(10-7)9：0。
图27为瓜蔓枯病菌芯片特异性检测结果；
1：Didymellabryoniae-1；2：Didymellabryoniae-2；3：Didymellabryoniae-3；4：Didymellabryoniae-4；5：Colletotrichumorbiculare-1；6：Fusriumoxysporumf.sp.melonis；7：phomabetae。
图28为甜瓜黑点根腐病菌芯片特异性检测结果；
1：Monosporascuscannonballus-1；2：Monosporascuscannonballus-2；3：Didymellabryoniae-1；4：Colletotrichumorbiculare-1。
图29为瓜炭疽病病菌芯片特异性检测结果；
1：Colletotrichumorbiculare-1；2：Colletotrichumorbiculare-2；3：Colletotrichumorbiculare-3；4：Colletotrichumorbiculare-4；5：Didymellabryoniae-1；6：Fusriumoxysporumf.sp.melonis；7：Colletotrichumlindemuthianum。
图30为瓜细菌性果斑病菌芯片特异性检测结果；
1：Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-1；2：Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-2；3：Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-3；4：Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-4；5：Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-5；6：Acidovoraxavenaesubsp.cattleyae。
图31为黄瓜黑色根腐病菌芯片特异性检测结果；
1：Phomopsissclerotioides-1；2：Phomopsissclerotioides-2；3：Didymellabryoniae-1；4：Colletotrichumorbiculare-1。
图32为黄瓜黑星病菌芯片特异性检测结果；
1：Cladosporiumcucumerinum-1；2：Cladosporiumcucumerinum-2；3：Cladosporiumcucumerinum-3；4：Didymellabryoniae-1；5：Colletotrichumorbiculare-1。
图33为瓜细菌性角斑病菌芯片特异性检测结果；
1：Psendomonassyringaepv.lachrymans-1；2：Psendomonassyringaepv.lachrymans-2；3：Psendomonassyringaepv.lachrymans-3；4：Psendomonassyringaepv.tomato；5：Psendomonassyringaepv.syringae。
图34为黄瓜花叶病毒芯片特异性检测结果；
1：Cucumbermosaicvirus-1；2：Cucumbermosaicvirus-2；3：Cucumbermosaicvirus-3；4：Squashmosaicvirus-1。
图35为南瓜花叶病毒芯片特异性检测结果；
1：Squashmosaicvirus-1；2：Squashmosaicvirus-2；3：Squashmosaicvirus-3；4：Cucumbermosaicvirus-1。
图36为黄瓜绿斑驳花叶病毒芯片特异性检测结果；
1：Cucumbergreenmottlemosaicvirus-1；2：Cucumbergreenmottlemosaicvirus-2；3：Cucumbergreenmottlemosaicvirus-3；4：Cucumbermosaicvirus-1。
图37为瓜蔓枯病菌芯片对样品的检测结果；
1：带瓜蔓枯病菌甜瓜茎杆；2：带瓜蔓枯病菌种子；3：西瓜种子-1；4：甜瓜种子-1；5：西瓜种子-2；6：甜瓜种子-2。
图38为甜瓜黑点根腐病菌芯片对样品的检测结果；
1：带甜瓜黑点根腐病菌种子；2：西瓜种子-1；3：甜瓜种子-1；4：西瓜种子-2；5：甜瓜种子-2。
图39为瓜炭疽病菌芯片对样品的检测结果；
1：带瓜炭疽病西瓜病果；2：带瓜炭疽病叶片；3：带瓜炭疽菌种子；4：西瓜种子-1；5：甜瓜种子-1；6：西瓜种子-2；7：甜瓜种子-2。
图40为瓜细菌性果斑病菌芯片对样品的检测结果；
1：带瓜细菌性果斑病菌甜瓜病果；2：带瓜细菌性果斑病菌叶片；3：带瓜细菌性果斑病菌种子；4：西瓜种子-1；5：甜瓜种子-1；6：西瓜种子-2；7：甜瓜种子-2。
图41为黄瓜黑色根腐病菌芯片对样品的检测结果；
1：带黄瓜黑色根腐病菌种子；2：西瓜种子-1；3：甜瓜种子-1；4：西瓜种子-2；5：甜瓜种子-2。
图42为黄瓜黑星病菌芯片对样品的检测结果；
1：带黄瓜黑星病菌种子；2：西瓜种子-1；3：甜瓜种子-1；4：西瓜种子-2；5：甜瓜种子-2。
图43为瓜细菌性角斑病菌芯片对样品的检测结果；
1：带瓜细菌性角斑病菌种子；2：西瓜种子-1；3：甜瓜种子-1；4：西瓜种子-2；5：甜瓜种子-2。
图44为黄瓜花叶病毒芯片对样品的检测结果；
1：西瓜种子-1；2：甜瓜种子-1；3：西瓜种子-2；4：甜瓜种子-2。
图45为南瓜花叶病毒芯片对样品的检测结果；
1：西瓜种子-1；2：甜瓜种子-1；3：西瓜种子-2；4：甜瓜种子-2。
图46为黄瓜绿斑驳花叶病毒芯片对样品的检测结果；
1：西瓜种子-1；2：甜瓜种子-1；3：西瓜种子-2；4：甜瓜种子-2。
图47为芯片对7种病害的检测结果。
具体实施方式
实验1、
1材料与方法
1.1供试材料
实验中菌株的来源、寄主和分类地位见表1，病果、病叶、西甜瓜出口用种子及实验室自制带菌种子为本研究建立的芯片检测方法的待检样品。
带真菌种子制备：取50g干净的西瓜种子放入三角瓶中，经高压灭菌后，接种PDA培养的真菌病菌菌块到瓶中，加入100mL马铃薯葡萄糖液体培养基，放置于25℃培养箱中振荡培养5～6d，将该种子和另一份灭菌的西瓜种子按照1：5的比例混合制成带菌种子样品。
带细菌种子制备：取50g干净的西瓜种子放入三角瓶中，经高压灭菌后，加入2ml细菌菌悬液到瓶中，加入100mL金氏B液体培养基，放置于25℃培养箱中振荡培养4～5d，将该种子和另一份灭菌的西瓜种子按照1：5的比例混合制成带菌种子样品。
实验中菌株的来源、寄主和分类地位，实验中检测所用的出口种子情况见下表。
表1供试菌株的病原名称、寄主和来源地
表2、病菌供试植株、种子情况一览表
1.2主要仪器
超净工作台(新加坡ESCO)，高速冷冻离心机(日本HITACHI公司)，pH酸度计(TRANSWIGGENS)，水浴锅(优莱博技术有限公司)，微量移液器(eppendorf公司)，ConcentratorPlus-真空浓缩仪(eppendorf公司)，制冰机(宁波雪花)，超低温冰箱(Thormer公司)，PCR扩增仪(ABIVeriti96公司)，电泳仪(北京君意东方电泳设备公司)，通用凝胶成像系统(IntasGelJetImager)，超声波清洗仪(基因有限公司)，OmniGridAccentTM通用型生物芯片点样仪(基因有限公司)，晶芯醛基基片(博奥生物有限公司)，BioMixerTMⅡ核酸杂交仪(博奥生物有限公司)，SlideWasherTM8芯片洗干仪(博奥生物有限公司)，LuxScanTM10K芯片扫描仪(博奥生物有限公司)
1.3主要试剂
MgC12，dNTP，TapDNA聚合酶，10×PCR缓冲液，DL2000Marker，以上试剂均由Takara大连宝生物有限公司提供。
植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)，细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)，植物总RNA提取试剂盒(DP432)，均由天根生化科技(北京)有限公司提供。
基因芯片点样液(博奥生物有限公司)
杂交液：2.5％甲酰胺，2×SSC/4×SSC/6×SSC/8×SSC/10×SSC，0.2％SDS
其它各种化学试剂国产分析纯
所有引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。
1.4核酸提取
真菌：植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)
细菌：细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)
病毒：植物总RNA提取试剂盒(DP432)
1.5基因芯片引物和探针设计
(1)芯片引物设计
在GeneBank数据库中检索这十种病原物相关的序列进行比对，在其特异区间设计引物，用于扩增片段的引物设计时要参照以下要求：
1)引物长度最好为20个碱基左右；
2)引物扩增序列以200-500碱基为宜；
3)碱基组成G+C含量以40％-60％为宜，ATGC最好均匀分布，尽量避免单个碱基的连续出现；
4)引物3′端的碱基同模板间必需严格要求配对，以避免因引物3′端结合不上而导致PCR失败；
5)尽量避免引物内部出现二级结构和两条引物间出现互补，特别是3′端的互补，否则会形成引物二聚体产生非特异条带。
(2)芯片探针设计
根据GeneBank数据库中十种病原物相关的序列使用Omiga软件设计寡核苷酸探针，设计探针要遵循以下原则：
1)探针长度在18-50个碱基，一般探针长度在30个碱基左右为宜。
2)碱基成分：G+C含量为40％-60％，超此范围就易出现非特异性杂交。
3)尽量避免选择能够形成二级结构和自身二聚体的序列，避免单个碱基的连续出现。
4)特异碱基最好位于探针中央。
5)所有寡核苷酸探针应具有相似的Tm值。
1.6荧光标记PCR反应
引物荧光标记PCR反应
引物荧光标记就是在PCR反应体系中加入荧光修饰的引物，本实验所用荧光标记物为Cy3(如表3所述)。反应体系25μl：10×PCRBuffer2.5μl，25mMMgCl22.5μl，dNTP0.5μl，10μM上下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，模板(5～20ng/μl)1.0μl。
PCR反应程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
表3、10种病原物引物序列
1.7寡核苷酸芯片制备
将每个寡核苷酸探针分别进行如下操作：将探针(表4所述)与点样液1:1混合(探针终浓度为30μM)，取20μL转移至96孔点样板。用芯片点样仪(OmniGridAccentTM)，SMP3点样针将探针点至醛基化基片上，每点体积约为0.5nL，点直径约为100μm。设定点心间距为350μm，点样时保持湿度70％，温度23℃。点样后将芯片置于37℃湿盒中放置12小时以上固定。固定后在0.2％SDS洗液中用水平摇床清洗10min；0.2％NaBH4(1×PBS与25％乙醇混合液配制的0.2％NaBH4溶液)封闭液中封闭5min；再用去离子水清洗2min，重复3次；然后将芯片放入芯片洗干仪中离心干燥。利用芯片装配工具将十区域芯片围栏贴于芯片表面，置于暗盒室温保存。
备注说明：上述0.2％NaBH4配制方法：先加325mL水、50mL10×PBS、125mL无水乙醇，最后再加1gNaBH4。
表4、基因芯片寡核苷酸探针序列
注：固定探针在5′端以氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔臂(10个Poly(dT))相连。
1.8芯片杂交与洗涤
荧光标记PCR产物与芯片杂交时，先将PCR产物置于PCR仪中95℃变性5min，之后迅速冰浴5min，备用。打开芯片杂交盒，在芯片杂交盒中加入300μL去离子水，放上垫片；将点有探针的一面朝上放进杂交盒内两个定位稍之间；对准杂交围栏，放上芯片盖片；通过盖片加样孔将14-20μl杂交反应液注入，不要产生气泡，使其在盖片和芯片之间形成一层杂交膜。杂交反应液的配置如下：6μlPCR产物(即，备用的)，300nM杂交阳性对照(PC)1μl与7μl杂交液充分混合。封闭杂交盒，置于45℃杂交仪1h。
备注说明：该杂交阳性对照的序列(PC)如表4所述。
杂交完毕后，取出芯片，将芯片插入到芯片架内，设定洗液Ⅰ(0.3×SSC，0.1％SDS)温度42℃，清洗时间4min，清洗1次，清洗力度为5；洗液Ⅱ(0.06×SSC)温度42℃，清洗时间2min，清洗2次，清洗力度为5。然后将芯片置于芯片洗干仪中离心干燥，置于暗盒室温保存。
1.9芯片扫描及结果检测
洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪EcosamplerTM扫描。选择绿光通道，激光功率(LaserPower)值为80％，光电倍增系数(PMTGain)值为650nm，分辨率(Resolution)为10μm。扫描图象保存为TIFF格式，进行图象分析，提取数据。数据值主要包括：
SpotMedian图像对应Spot内所有像素信号值的中位值；
SpotMean图像对应Spot内所有像素信号值的均值；
BkgMedian图像对应Spot背景区内所有像素信号值的中位值；
BkgMean图像对应Spot背景区内所有像素信号值的均值；
S-B_Median图像对应Spot与背景区内所有像素信号值中位值之差；
S-B_Mean图像对应Spot与背景区内所有像素信号值均值之差；
信噪比(SNR)图像对应Spot内所有像素信号值均值与背景值均值的比值；
信号强度值以每条探针重复点的均值计算。若肉眼观察有信号，信号绝对值大于500，信噪比大于3，判为阳性；若信号绝对值小于500，信噪比小于2，判为阴性；如果信号模糊，信噪比介于2和3之间，判为可疑，实验需重复验证。
1.10杂交反应体系的优化
1.10.1杂交时间
设4个杂交时间进行优化，分别为30min，60min，90min，120min。
1.10.2杂交温度
在杂交时间为60min时，设4个杂交温度进行优化，分别为40℃，45℃，50℃，55℃。
1.10.3杂交液成分
本实验芯片杂交液只对SSC的浓度进行了优化，共设5个梯度，分别为2×SSC，4×SSC，6×SSC，8×SSC，10×SSC。
1.11芯片灵敏度检测
为了确定该方法所能检测的最低核酸量，测定十种病核酸样品浓度，将此浓度进行10倍梯度稀释到10-7，每个梯度取2μl作为模板进行荧光标记PCR扩增，取3μl扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，观察结果；另取6μl按步骤1.8进行芯片杂交，记录不同模板浓度下探针信号扫描结果。将荧光标记PCR进行检测，同时将PCR产物电泳进行检测。
表5、梯度稀释浓度和对应模板加样量
1.12芯片探针特异性检测
按照上述操作步骤，用所构建的检测芯片分别对供试的10种病原材料进行检测，分析探针的特异性。
2结果与分析
2.1引物、探针设计结果
从GeneBank中选取十种病原物的序列进行多重比对，设计用于扩增相应病害的序列的引物。引物如表3所述。
根据GeneBank数据库中十种病原物的序列分析，瓜蔓枯病菌选取beta-tubulin(tub2)基因设计探针，甜瓜黑点根腐病菌选取核糖体基因设计探针，瓜炭疽病选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和glutaminesynthase(GS)基因设计探针，瓜细菌性果斑病菌选取hypotheticalprotein基因设计探针，黄瓜黑色根腐病菌、黄瓜黑星病菌选取translationelongationfactor1-alpha(tef1)基因设计探针，瓜细菌性角斑病菌选取GAP1基因设计探针，黄瓜花叶病毒、南瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒选取外壳蛋白基因设计探针。除针对这十种病原物的检测探针还设计了一系列质控对照，以便对整个芯片检测过程进行监控。表面化学对照(DW)：5′端有Cy3修饰的探针，用来监控基片与探针的结合；阴性对照(NC)：与十种病原物序列无同源性的33nt核苷酸序列；阳性杂交对照(PC)：合成2条50nt寡核苷酸序列，一条是与基片结合的杂交对照探针，另一条寡核苷酸序列与杂交对照探针序列互补，且5′端Cy3标记；空白对照(CK)：点样缓冲液。所有探针序列如表4。
2.2荧光标记PCR扩增
引物荧光标记PCR反应：用所设计的引物(上游引物5'标记Cy3)对各自病原物进行荧光标记PCR扩增(每种引物对应一种病)，电泳结果如图1(表1所述的32个菌)，十种病原物均产生预期大小的条带，阴性对照健康植株DNA扩增无条带。说明本发明设计的引物可用于基因芯片荧光标记PCR扩增。
2.3寡核苷酸芯片的制备
按照芯片阵列排布(如表6)将各种检测和质控探针点制到醛基基片上，24h固定后，洗涤，扫描。预扫描结果如图2，阳性定位对照样点清晰，均匀，芯片背景低，其它探针位点均未出现荧光信号，符合实验后续杂交使用。
表6、基因芯片探针排布
注：阵列为9行10列，上下排为DW阳性定位对照，其它探针各重复5次。
2.4杂交反应体系的优化
2.4.1杂交时间
设4个杂交时间进行优化，分别为30min，60min，90min，120min。杂交结果如图3。从实验结果中可以看出，当杂交时间设为60min时，杂交信号最均一(图3b)，随着杂交时间的延长，杂交背景也相应增强，还会出现非特异性的杂交(图3d)。杂交时间过短也不行，靶基因与探针的特异性结合不够牢固，容易被洗脱，杂交信号也较弱(图3a)。最终确定60min为最佳杂交时间。
2.4.2杂交温度
在杂交时间为60min时，设4个杂交温度进行优化，分别为40℃，45℃，50℃，55℃。杂交结果如图4。从图4中可以看出杂交温度对杂交信号的影响较大，特别是低温不利于靶基因与探针的结合(图4a)，高温时杂交信号增强，但是背景值也随之升高(图4d)。图4显示：探针在45℃时信号值最大。综合以上因素，在能够得到较强杂交信号的同时尽量降低背景值，选45℃为最终的杂交温度。
2.4.3杂交液成分
本实验芯片杂交液的主要成份为甲酰胺，SDS和SSC，根据对以往基因芯片相关研究报道的总结，甲酰胺和SDS的终浓度一般都在2.5％和0.2％，所以本实验没有对这两种成份进行优化，只对SSC的浓度进行了优化，SSC的主要作用是保持杂交体系中稳定的离子强度和PH值。本实验共设5个梯度，分别为2×SSC，4×SSC，6×SSC，8×SSC，10×SSC。杂交结果如图5所示：5个梯度下所有探针均可检测到杂交信号，信号强度相差不大，说明SSC对杂交结果没有很明显的影响。但结合图4-5可以看出，6×SSC时探针信号要高一些。所以，最终确定6×SSC为最佳杂交浓度。
2.5芯片灵敏度检测
每种病原物每个梯度取2μl作为模板进行荧光标记PCR扩增，取3μl扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，观察结果；另取6μl按步骤1.2.8进行芯片杂交，记录不同模板浓度下探针信号扫描结果。
2.5.1瓜蔓枯病菌芯片灵敏度检测
将瓜蔓枯病菌201923的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量4.45ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明DNA浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有89fg(10-5)的核酸量就可以被检测到(如图6)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为3.56fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-2稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-3的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图7)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.2甜瓜黑点根腐病菌芯片灵敏度检测
将甜瓜黑点根腐病菌26931的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量16.78ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明DNA浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有33.56fg(10-6)的核酸量就可以被检测到(如图8)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为1.34fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-3稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-4的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图9)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.3瓜炭疽病芯片灵敏度检测
将瓜炭疽病菌14724的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量19.8ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明DNA浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有39.6fg(10-6)的核酸量就可以被检测到(如图10)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为1.58fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-3稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-4的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图11、12)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.4瓜细菌性果斑病菌芯片灵敏度检测
将瓜细菌性果斑病菌29625的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量12.6ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明DNA浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有25.2fg(10-6)的核酸量就可以被检测到(如图13)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为1.01fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-3稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-4的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图14)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.5黄瓜黑色根腐病菌芯片灵敏度检测
将黄瓜黑色根腐病菌CBS710.76的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量8.6ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明DNA浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有172fg(10-5)的核酸量就可以被检测到(如图15)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为6.88fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-2稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-3的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图16)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.6黄瓜黑星病菌芯片灵敏度检测
将黄瓜黑星病菌26211的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量6.4ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明DNA浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有128fg(10-5)的核酸量就可以被检测到(如图17)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为5.12fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-2稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-3的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图18)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.7瓜细菌性角斑病菌芯片灵敏度检测
将瓜细菌性角斑病菌NCPPB540的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量14.5ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明DNA浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有29fg(10-6)的核酸量就可以被检测到(如图19)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为1.6fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-3稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-4的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图20)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.8黄瓜花叶病毒芯片灵敏度检测
将黄瓜花叶病毒PV-547的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量18.6ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明核酸浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有37.2fg(10-6)的核酸量就可以被检测到(如图21)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为1.49fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-3稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-4的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图22)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.9南瓜花叶病毒芯片灵敏度检测
将南瓜花叶病毒PV-36的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量13.4ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明核酸浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有26.8fg(10-6)的核酸量就可以被检测到(如图23)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为1.07fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-3稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-4的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图24)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.5.10黄瓜绿斑驳花叶病毒芯片灵敏度检测
将黄瓜绿斑驳花叶病毒PV-41的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量8.6ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，荧光标记PCR后进行芯片检测，结果表明DNA浓度越大，杂交信号越强，25μl体系中有158fg(10-5)的核酸量就可以被检测到(如图25)，说明芯片检测方法所能够检测的最低DNA浓度为6.32fg/μl。荧光标记PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在10-2稀释倍数下还可以看到清晰地条带，10-3的条带非常弱，但是肉眼依然可辨(如图26)。说明芯片检测方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.6芯片探针特异性检测结果
按步骤1.2.8将荧光标记的十种病原物PCR产物分别与芯片杂交，清洗和扫描。在绿光通道Cy3下扫描结果为：所有样品杂交后扫描图均显示杂交阴性对照和空白对照无信号，杂交阳性对照有信号，说明整个芯片检测体系正常，结果可靠。
备注说明：表1中所述的不同来源菌株均分别进行如下检测：
2.6.1瓜蔓枯病菌芯片特异性检测结果
对供试的瓜蔓枯病菌和其他病菌进行检测，结果显示四株瓜蔓枯菌株在Db探针位置出现强阳性杂交信号，phomabetae及瓜上的其他病害瓜炭疽病、香瓜枯萎均无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图27所示。
2.6.2甜瓜黑点根腐病菌芯片特异性检测结果
对供试的甜瓜黑点根腐病菌和瓜上其他病菌进行检测，结果显示两株甜瓜黑点根腐病菌在Mc探针位置出现强阳性杂交信号，瓜上的其他病害瓜蔓枯病、瓜炭疽病均无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图28所示。
2.6.3瓜炭疽病芯片特异性检测结果
对供试的瓜炭疽病和瓜上其他病菌进行检测，结果显示四株瓜炭疽病在双探针位置出现强阳性杂交信号，菜豆炭疽病菌在GAPDH芯片点样位点无杂交信号，但是在GS芯片点样位点却出现强阳性信号，因此需要2对探针共同检测才能有效地将瓜炭疽病菌与其近似病原菌区分开来，胶孢炭疽病菌和黑线炭疽病菌均无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图29所述。
2.6.4瓜细菌性果斑病菌芯片特异性检测结果
对供试的瓜细菌性果斑病菌和近似菌株进行检测，结果显示五株瓜细菌性果斑病菌在aac探针位置出现强阳性杂交信号，近似菌株燕麦嗜酸菌Acidovoraxavenaesubsp.cattleyae无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图30所述。
2.6.5黄瓜黑色根腐病菌芯片特异性检测结果
对供试的黄瓜黑色根腐病菌和瓜上其他病菌进行检测，结果显示两株黄瓜黑色根腐病菌在phs探针位置出现强阳性杂交信号，瓜上的其他病害瓜蔓枯病、瓜炭疽病均无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图31所述。
2.6.6黄瓜黑星病菌芯片特异性检测结果
对供试的黄瓜黑星病菌和瓜上其他病菌进行检测，结果显示三株黄瓜黑星病菌在Cc探针位置出现强阳性杂交信号，瓜上的其他病害瓜蔓枯病、瓜炭疽病均无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图32所述。
2.6.7瓜细菌性角斑病菌芯片特异性检测结果
对供试的瓜细菌性角斑病菌和近似菌株进行检测，结果显示三株瓜细菌性角斑病Psendomonassyringaepv.syringae菌在psl探针位置出现强阳性杂交信号，近似菌株Psendomonassyringaepv.tomato和Psendomonassyringaepv.syringae均无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图33所述。
2.6.8黄瓜花叶病毒芯片特异性检测结果
对供试的黄瓜花叶病毒和其他花叶病毒进行检测，结果显示三个来源的黄瓜花叶病毒毒株在CMV探针位置出现强阳性杂交信号，南瓜花叶病毒无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图34所述。
2.6.9南瓜花叶病毒芯片特异性检测结果
对供试的南瓜花叶病毒和其他花叶病毒进行检测，结果显示三个来源的南瓜花叶病毒毒株在SqMV探针位置出现强阳性杂交信号，黄瓜花叶病毒无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图35所述。
2.6.10黄瓜绿斑驳花叶病毒芯片特异性检测结果
对供试的黄瓜绿斑驳花叶病毒和其他花叶病毒进行检测，结果显示三个来源的黄瓜绿斑驳花叶病毒毒株在cgmmv探针位置出现强阳性杂交信号，黄瓜花叶病毒无杂交信号，说明该芯片检测方法特异性好。如图36所述。
2.7芯片对样品的检测
2.7.1瓜蔓枯病菌芯片对样品的检测结果
对田间采集的带瓜蔓枯病菌的甜瓜茎秆、人为混合带菌种子及实验室的种子样品进行检测，结果显示该方法能够检测出田间带病样本及带菌种子样本，检测信号强，实验室种子样本没有检出该病菌。如图37所述。
判断条件为：
以每条探针重复点的均值计算信号强度值；若肉眼观察有信号，信号绝对值大于500，信噪比大于3，判为阳性；若信号绝对值小于500，信噪比小于2，判为阴性；如果信号模糊，信噪比介于2和3之间，判为可疑，实验需重复验证。
以下判断条件同上。
2.7.2甜瓜黑点根腐病菌芯片对样品的检测结果
对人为混合带菌种子及实验室的种子样品进行检测，结果显示该方法能够检测出带菌种子样本，检测信号强，实验室种子样本没有检出该病菌。如图38所述。
2.7.3瓜炭疽病芯片对样品的检测结果
对田间采集的带瓜炭疽病菌的西瓜病果、叶片，人为混合带菌种子及实验室的种子样品进行检测，结果显示该方法能够检测出田间带病样本及带菌种子样本，检测信号强，实验室种子样本没有检出该病菌。如图39所述。
2.7.4瓜细菌性果斑病菌芯片对样品的检测结果
对田间采集的带瓜细菌性果斑病菌的甜瓜病果、叶片，人为混合带菌种子及实验室的种子样品进行检测，结果显示该方法能够检测出田间带病样本及带菌种子样本，检测信号强，实验室种子样本没有检出该病菌。如图40所述。
2.7.5黄瓜黑色根腐病菌芯片对样品的检测结果
对人为混合带菌种子及实验室的种子样品进行检测，结果显示该方法能够检测出带菌种子样本，检测信号强，实验室种子样本没有检出该病菌。如图41所述。
2.7.6黄瓜黑星病芯片对样品的检测结果
对人为混合带菌种子及实验室的种子样品进行检测，结果显示该方法能够检测出带菌种子样本，检测信号强，实验室种子样本没有检出该病菌。如图42所述。
2.7.7瓜细菌性角斑病菌芯片对样品的检测结果
对人为混合带菌种子及实验室的种子样品进行检测，结果显示该方法能够检测出带菌种子样本，检测信号强，实验室种子样本没有检出该病菌。如图43所述。
2.7.8黄瓜花叶病毒芯片对样品的检测结果
对实验室的种子样品进行检测，样本没有检出该病毒。如图44所述。
2.7.9南瓜花叶病毒芯片对样品的检测结果
对实验室的种子样品进行检测，样本没有检出该病毒。如图45所述。
2.7.10黄瓜绿斑驳花叶病毒芯片对样品的检测结果
对实验室的种子样品进行检测，样本没有检出该病毒。如图46所述。
2.8芯片探针对7种病原物的检测
对7种带菌种子的混合样品进行检测，检测结果表明瓜蔓枯病菌、甜瓜黑点根腐病菌、瓜炭疽病、瓜细菌性果斑病菌、黄瓜黑色根腐病菌、黄瓜黑星病、瓜细菌性角斑病菌7种病害均出现杂交信号，与预期结果一致。如图47所述。
3讨论
3.1探针设计及其特异性问题
在杂交反应中，序列组成、靶标和探针的长度、杂交温度、二级结构、同源性、盐浓度、pH和其他一些因素会影响杂交效率和强度。设计探针是整个实验中的关键，探针序列除要遵循一般设计原则外，在所设计的探针序列范围内应尽可能多的包含差异性位点，差异性位点越多，特异性越强。如果探针和检测样品序列同源性大于或等于70％时就会发生交叉杂交，扫描结果就会出现假阳性。同时基因芯片能够对单个碱基的差异进行区分，区分靶标和探针单碱基差别的能力是基因芯片用于基因分型的基础，设计此类探针时，探针长度必需较短(如15-25个碱基)，且突变位点最好位于探针的中央位置。如果探针过长或突变碱基位于杂交产物的末端，区分单碱基差异的能力就会降低。、
本研究所设计的十种病原物的探针，根据GeneBank数据库的序列进行分析，瓜蔓枯病菌选取beta-tubulin(tub2)基因设计探针，甜瓜黑点根腐病菌选取核糖体基因设计探针，瓜炭疽病选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和glutaminesynthase(GS)基因设计探针，瓜细菌性果斑病菌选取hypotheticalprotein基因设计探针，黄瓜黑色根腐病菌、黄瓜黑星病菌选取translationelongationfactor1-alpha(tef1)基因设计探针，瓜细菌性角斑病菌选取GAP1基因设计探针，黄瓜花叶病毒、南瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒选取外壳蛋白基因设计探针。这十种病原除甜瓜黑点根腐病菌选取核糖体基因，三种病毒选取外壳蛋白基因设计探针，这些都是真菌病毒病害常用的鉴定基因，但是对于其他的病害，这些常用基因无法找到差异位点，所以其他病原均是针对某些功能基因进行设计，从基因拷贝数上来说，这些功能基因的拷贝数相对较低，但是对检测结果灵敏度的影响影响不是非常大。同时瓜炭疽病菌设计了两条探针，因炭疽病种类庞杂，经序列比对，仅有一条探针无法完全将炭疽类病原区别开，GAPDH无法将瓜炭疽和Colletotrichumspinosum、Colletotrichummalvarum区别开，GS无法将瓜炭疽和Colletotrichumlindemuthianum、Colletotrichumtrifolii区别开，所以在实际检测中如果仅有一条探针出现阳性信号，不能判定为检出瓜炭疽病菌，只有两条探针均出现阳性信号，才能判定为检出瓜炭疽病菌。由于受材料收集的局限，没有收集到足够多的近似种进行验证，但是两个探针结合使用，从理论上与其他炭疽病完全区别开是可行的，所以需要收集更多炭疽病原进行进一步验证。
由于没有收集到带菌种子样品，本研究对真菌和细菌病害采用模拟种子带菌进行实验验证，获得了良好的预期效果，但是病毒病害无法进行模拟种子带菌实验，后续还需进一步进行验证。将芯片检测方法应用于实际种子检测中，将极大提高检测的灵敏度，但在实际检测工作中，该方法会受各种外界因素的影响，具体的检测效果还需进一步进行评估。同时本研究供试验证的检测种子样品均为阴性样品，亟需带菌种子样品进行验证实验。
由于本项目研究病害多，时间紧，任务重，对芯片检测方法只是做了初步的实验，很多细节性的关键点还需进一步经费和时间支持，但本研究初步建立的十种病害的微整列芯片检测方法，对建立其他病原芯片检测提供了很好的试点和参考。
3.2样品标记方法的讨论
样品标记主要有由dNTP引入荧光素和引物引入荧光素两种方法。由dNTP引入荧光素方法就是在PCR体系中加入荧光分子修饰的核苷酸单体，引物引入荧光素方法即在引物的5′端加上荧光分子，实现对扩增产物的荧光标记。在本研究中采用的是Cy3修饰的上游引物荧光标记方法。由dNTP引入荧光素方法在加样时相对繁琐些，而引物引入荧光素方法加样与普通PCR相同。荧光引物标记方法的PCR扩增体系要复杂一些，通常采用不对称PCR进行标记，对正反向引物的浓度需要优化，以及引物特异性要求较高，而且受引物扩增区间的限制，使用效率较低。用Cy3-dCTP标记时，由于Cy3的分子量及空间位阻效应大，所以只能用部分Cy3-dCTP取代dCTP，Cy3-dCTP的最适用量是由PCR扩增是否出现特异性条带及产物与探针杂交是否出现特异性信号来决定。另外，通过对PCR产物非模板依赖性的酶促加尾反应在其3′端随机加入荧光修饰的核苷酸[98]，也可以对样品进行标记，但是酶促加尾反应需要严格的反应条件，本实验没有进行探索讨论。两种标记方法对所获得的结果的差异性，扩增效率和杂交信号结果的判定上有什么区别，本研究没有进行探讨。
3.3芯片杂交信号的判定
采用准确，有效的判定标准对芯片杂交信号进行分析是至关重要的一步。由于影响杂交信号的因素有很多，如探针基因序列、杂交条件、扫描参数、芯片质量、扫描仪型号等，因此不同的芯片和实验室在阳性杂交信号的判定上无法确立统一的标准。而单从目标探针的杂交信号值高于空白质控位点和阴性质控位点的杂交信号值，就判定为阳性信号是不够准确的。信噪比(SNR)是芯片检测过程中信号值与噪音值的比值，是分析杂交信号的一个重要指标。信号是探针与靶基因杂交后，扫描仪激光激发荧光素产生的信号总。M.Schena在《生物芯片分析》一书中对信号总量有三种不同的界定，本征信号、非本征信号和标记数量。本征信号是指靶基因分子上标记的荧光分子的固有信号，不同的荧光染料具有不同的物理特性，也就存在不同的本征信号。本研究采用的荧光染料Cy3溶解性较好，适合在PCR反应液中进行酶标反应；非本征信号是由外部贡献的信号，主要因素是激发光源能量、波长、检测驻留时间以及光学系统的效率、检测器以及数模转换器。当激光功率增大时，其信号强度也增大，但背景噪音也随之增大。激发光过强，扫面时间过长，荧光染料分子被破环，也会影响信号的强度，就是所谓的“光漂白”作用。因此要选择适当的光源强度，减少扫描驻留时间；标记数量是指芯片上给定位置存在的标记物数量。由固定的靶基因分子数量和每个固定上的靶基因的荧光分子数量决定。噪音主要有微阵列噪音和系统噪音。微阵列噪音与基片质量、芯片制备环境、标记探针、杂交条件等有关。本研究采用透明且荧光非特异性吸附低的玻璃作为芯片载体，减少了基片噪音。还有在制备过程中要尽量保持芯片的洁净，避免灰尘掉落到芯片上；系统噪音包括暗电流、电子噪音、冲击噪音和光学噪音，是由扫描系统产生的，它与仪器的设计理念、电子线路和光电倍增管等有关，是不可避免的。理想的杂交结果应当是背景值低，而信噪比高。有相关资料在对检测细菌的芯片判定中，采用的标准是SNR<2.0为阴性，2.0～3.0为可疑，3.0～20.0为阳性，20.0～30.0为中阳性，>30.0为强阳性[99]。肖杰文[75]将样品检测点的SNR>1.8作为其构建的四种疫霉检测基因芯片的杂交阳性的判断标准。曹三杰[100]将样品检测点的信噪比与空白对照信噪比的比值≥1.5作为其构建的鸡新城疫和鸡传染性支气管炎检测基因芯片的杂交阳性的判断标准。Murray等[101]确定样本信号强度≥2倍背景噪音时判为真正信号。本研究综合考虑多种参数结果，并对多块芯片上的杂交点进行分析后选用的判定标准有三个方面，一是肉眼观察探针位置是否有信号，二是探针信号值(以探针重复点的均值计算)的大小，三是探针SNR值大小。若肉眼观察有信号，信号值大于500，SNR大于3.0，判为阳性；若信号值小于500，SNR小于2.0，判为阴性；如果信号模糊，信噪比介于2.0和3.0之间，判为可疑，实验需重复验证。
对比例1、将上述本发明芯片所涉及的探针改成如下序列：
瓜蔓枯病菌Db-Px：GGAAGGTATTAGTCGGTTACCCGACCAACCC
甜瓜黑点根腐病菌Mc-Px：TAATGCGCCCTGTCTATATGAGTGATGGAAAG
瓜炭疽病T-GAPDHx：ACCCATAACCGGAGTGCATCCAGTAGGGCTGACTCTAGAGT
瓜炭疽病T-GSx：AGATCAAGTGTCAGAGGGACAGCCGTTGC
瓜细菌性果斑病菌aac-Px：TGCCAAGCTGAAGCAACCGGATATGCACCAC
黄瓜黑色根腐病菌Phs-Px：GATGAGAGACAACACAACAACCAACAGGGACA
黄瓜黑星病菌Cc-Px：TGTTGTGGTTCACATGGTTGGTCGGGTGTT
瓜细菌性角斑病菌Psl-px：GTGCGGCATCGTGGTGTAGGTGG
黄瓜花叶病毒CMV-Px：CATGCGGCGACTGTGTGTGCCCT
南瓜花叶病毒SqMV-Px：GCGGAGTCACCACACGGAGCGGA
黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-Px：CGTAATGCCAGAGATCCCGGGAAGAGGA
对上述2.7.1～2.7.7及2.6.8-2.6.10所述样品进行检测；
发现：对应“2.7.1”所得的检测结果为：对田间采集的带瓜蔓枯病菌的甜瓜茎秆、人为混合带菌种子样品进行检测，结果显示该方法不能检测出田间带病样本及带菌种子样本，无检测信号，没有检出该病菌。
对应“2.7.2”所得的检测结果为：对人为混合带菌种子样品进行检测，结果显示该方法不能检测出带菌种子样本，无检测信号，没有检出该病菌。
对应“2.7.3”所得的检测结果为：对田间采集的带瓜炭疽病菌的西瓜病果、叶片，人为混合带菌种子样品进行检测，结果显示该方法不能检测出田间带病样本及带菌种子样本，无检测信号，没有检出该病菌。
对应“2.7.4”所得的检测结果为：对田间采集的带瓜细菌性果斑病菌的甜瓜病果、叶片，人为混合带菌种子样品进行检测，结果显示该方法不能检测出田间带病样本及带菌种子样本，无检测信号，没有检出该病菌。
对应“2.7.5”所得的检测结果为：对人为混合带菌种子样品进行检测，结果显示该方法不能检测出带菌种子样本，无检测信号，没有检出该病菌。
对应“2.7.6”所得的检测结果为：对人为混合带菌种子样品进行检测，结果显示该方法不能检测出带菌种子样本，无检测信号，没有检出该病菌。
对应“2.7.7”所得的检测结果为：对人为混合带菌种子样品进行检测，结果显示该方法不能检测出带菌种子样本，无检测信号，没有检出该病菌。
对应“2.6.8”所得的检测结果为：三个来源的黄瓜花叶病毒毒株在CMV探针位置没有出现阳性杂交信号，没有检出该病毒。
对应“2.6.9”所得的检测结果为：三个来源的南瓜花叶病毒毒株在SqMV探针位置没有出现阳性杂交信号，没有检出该病毒。
对应“2.6.10”所得的检测结果为：三个来源的黄瓜绿斑驳花叶病毒毒株在cgmmv探针位置没有出现阳性杂交信号，没有检出该病毒。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.瓜上10种病害的微阵列芯片，其特征是：所述芯片包含如下寡核苷酸探针中的至少一类；
瓜蔓枯病菌Db-Px：CCATTGTAAGCCGCTGTTGTTGAGAAGTGAAA；
甜瓜黑点根腐病菌Mc-Px：CCACAACTACAGGGTAGCTACCGGGTAGGCTACTCTAGAGT；
瓜炭疽病菌T-GAPDHx：CGTAATGCCAGAGATCCCGGGAAGAGGA；
瓜炭疽病菌T-GSx：CTGACAGAACTGGACCAGACGTGCAATACCC；
瓜细菌性果斑病菌aac-Px：AAGAGGATCGTTCGAGAGAAGCGGCCTTC；
黄瓜黑色根腐病菌Phs-Px：CATCAGGTTGTTTTGTCGGGTGTGTGTGTG；
黄瓜黑星病菌Cc-Px：TGTCCAGCGTGTGGTGGAGGGTG；
瓜细菌性角斑病菌Psl-px：GCCATGCCGGTGAGTTTGCCTGC；
黄瓜花叶病毒CMV-Px：AGCGGGACGCGGAAGAACTCCCG；
南瓜花叶病毒SqMV-Px：GAACTGGGAAAGAAGCCACAACAAAACCCAGA；
黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-Px：GGAGGTTTAGAATGCCGCTTACCACGACCAC。
2.利用权利要求1所述的芯片进行的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，其特征是：
对每个待测样品依次进行以下步骤：
1)、提取待测样品的DNA；配置成浓度为5-20ng/μl作为模板；
2)、引物荧光标记PCR反应：
反应体系25μl：10×PCRBuffer2.5μl，25mMMgCl22.5μl，dNTP0.5μl，10μM上下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，模板1.0μl；
PCR反应程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min；
上下游引物分别为以下：
瓜蔓枯病菌Db-3x：CGTAAGTAGACCTCCACCAC
Db-5x：CAAGGGAAGCGTGTCAT；
甜瓜黑点根腐病菌Mc-1x：CATTAAAGAGTTATCCAACTCC
Mc-2x：ATGATAATTATTCAGAAGTGCC；
瓜炭疽病菌GAPDH-3x：CCCTTCATTGAGACCAAGT
GAPDH-4x：GTACTTGAGCATGTAGGCCT；
瓜炭疽病菌GS-3x：TTCGTTCTCGAACACGAT；
GS-4x：GAGACATGACGACCTTGTTC；
瓜细菌性果斑病菌aac-1x：CTGGGAGCGATCTTCATC
aac-2x：GTCAGGAGGGTGAGTAGCA；
黄瓜黑色根腐病菌Phs-1x：CAACCACTCCCTCCCTT；
Phs-2x：GGCGGCTGTGTACAAGA；
黄瓜黑星病菌Cc-3x：ATCGAGAAGTTCGAGAAGG；
Cc-4x：GTGATACCACGCTCACG；
瓜细菌性角斑病菌Psl-1x：GGCGACGCAATCAATGAT；
Psl-2x：TTCTTCGGCGGTGGTTT；
黄瓜花叶病毒CMV-1x：TCCGAGGAATTAAATGTTGA；
CMV-2x：TCGCGTCACAGATGTCTAC；
南瓜花叶病毒SqMV-1x：ACTTTGAAGTGGCTGGAAA；
SqMV-2x：AGGCTTCTAAAGCGAACTG；
黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-1x：CAGTTATAGGTCTAGGTCGCAG；
Cgmmv-2x：GAACATAAGAAGCACTAAACGC；
3)、将步骤2)所得的至少2种病菌对应的PCR扩增产物等体积混合；
4)、芯片杂交与洗涤：
将步骤2)所得的每种病菌对应的PCR扩增产物或者将步骤3)所得的混合物95℃变性5min，然后冰浴5min；得预处理后PCR扩增产物；
然后将上述预处理后PCR扩增产物进行芯片杂交与洗涤；所述芯片杂交为45℃杂交1h；
5)、芯片扫描，获得检测结果。
3.根据权利要求2所述的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，其特征是：
所述步骤5)为：
以每条探针重复点的均值计算信号强度值；若肉眼观察有信号，信号绝对值大于500，信噪比大于3，判为阳性；若信号绝对值小于500，信噪比小于2，判为阴性；如果信号模糊，信噪比介于2和3之间，判为可疑，需重复实验进行验证。
4.根据权利要求2或3所述的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，其特征是：
所述步骤4)中，芯片杂交时所配制的杂交反应液为：6μl预处理后PCR扩增产物，300nM杂交阳性对照1μl与7μl杂交液充分混合；
所述杂交液为：2.5％甲酰胺，2×SSC/4×SSC/6×SSC/8×SSC/10×SSC，0.2％SDS。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20170801 Termination date: 20211202 |