CN105267971A - 一种不含明胶和人血白蛋白的疫苗冻干保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种不含明胶和人血白蛋白的疫苗冻干保护剂。本发明的冻干保护剂其各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖1.5％-10％、右旋糖酐1.5％-3.5％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％，配制保护剂的基质液为199培养液或PBS缓冲溶液或注射用水，并且所述冻干保护剂中不含明胶和人血清白蛋白，所述疫苗半成品是指冻干前的液态疫苗。本发明还提供了该冻干保护剂的用途。该冻干保护剂用于制备冻干疫苗时，可以提高疫苗在冻干过程和储存过程中的稳定性，并大大提高冻干疫苗对人体的安全性，减少了疫苗的不良反应。

Description

一种不含明胶和人血白蛋白的疫苗冻干保护剂

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种不含明胶和人血白蛋白的疫苗保护剂的配方和使用方法。

背景技术

接种疫苗是预防流行性病毒的有效手段，可以降低传染病的发病率和死亡率。随着疫苗的广泛应用和分子生物学和细胞生物学的飞速发展，研究发现，很多接种疫苗后出现的不良反应问题与疫苗产品的保护剂有直接关系，特别是冻干疫苗产品中的冻干保护剂，其中的明胶或明胶衍生物能直接引起使被接种者发生过敏等变态反应。为了减轻或避免在疫苗使用过程中出现的由明胶引起的不良反应，专家建议，使用明胶替代品或直接生产不含明胶的疫苗产品(陈恬，水痘疫苗接种后的明胶过敏性荨麻疹，《国外医学》，1999年(第4期)，182)。

现有疫苗产品多数是参考世界卫生组织所颁发的生物制品规程为标准生产的，标准中没有对保护剂的明胶成分使用量加以限制。日本FDA于1986年批准的疫苗上市许可及美国FDA批准的疫苗上市许可中，均没有把明胶作为生产疫苗的禁用成分。在早期的专利文献中，大多数疫苗保护剂都含有明胶成分。

国家药典委员会在2007年7月17日至7月19日北京会议纪要中明确要求“作为稳定剂成分的明胶注射到人体后可发生过敏反应，生产企业应进行取代明胶成分的相关研究工作，以进一步提高制品的安全性”。

国产明胶内毒素含量偏高，而进口明胶有携带疯牛病病毒的潜在风险，针对这一问题，需研究一系列明胶的替代品来改进传统的配方。近年来由于人血白蛋白来源越来越有限，使得人血白蛋白价格不断飙升，另外其易发生过敏反应及有潜在传染病源的风险，迫使研究者研究一系列人血清白蛋白的替代品来改进传统的配方。

目前现有技术中不含明胶、人血清白蛋白的保护剂虽然降低了对人体的刺激性，但是对疫苗的保护效果并不理想，使得疫苗在冻干过程中和储存过程中的稳定性下降，易发生失效。因此，本领域中急需一种安全有效的无明胶、无人血清白蛋白疫苗冻干保护剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种不含明胶、不含人血白蛋白的新型疫苗冻干保护剂，使内毒素含量下降，不易发生过敏反应，并且仍然能保持较高的稳定性和较长的有效期。

为了达到上述目的，本发明提供一种疫苗冻干保护剂，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖1.5％-10％、右旋糖酐1.5％-3.5％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％，配制保护剂的基质液为199培养液或PBS缓冲溶液或注射用水，并且所述冻干保护剂中不含明胶且不含人血清白蛋白；所述疫苗半成品是指冻干前的液态疫苗。

优选地，本发明的疫苗冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖3％-8％、右旋糖酐2％-3％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％。

更优选地，本发明的疫苗冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖5％、右旋糖酐3％、山梨醇1％、谷氨酸钠1％、L-精氨酸0.2％。

本发明冻干保护剂配方中的右旋糖酐为右旋糖酐70。

所述的199培养液为无酚红199培养基。

本发明提供了上述疫苗冻干保护剂在制备冻干疫苗中的应用。

本发明提供了一种水痘减毒活疫苗冻干苗的制备方法，包括以下步骤：提供水痘减毒活疫苗单次收获液；按比例加入本发明的疫苗冻干保护剂至单次收获液中，并除去细胞碎片，制成水痘减毒活疫苗原液；

将水痘减毒活疫苗原液按疫苗半成品中目标病毒滴度加入适量稀释液配制成疫苗半成品，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖1.5％-10％、右旋糖酐1.5％-3.5％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％；所述稀释液含有与本发明的冻干保护剂相同的成分，且各成分的浓度与本发明冻干保护剂在疫苗半成品中的终浓度一致；所述疫苗半成品为冻干前的液态疫苗；

疫苗半成品在2-8℃条件下，分装，冻干。

在本发明的一个实施例中，水痘减毒活疫苗半成品目标病毒滴度4.8lgPFU/ml。

上述制备方法中，优选地，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖3％-8％、右旋糖酐2％-3％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％，更优选地，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖5％、右旋糖酐3％、山梨醇1-2％、谷氨酸钠1％、L-精氨酸0.2％。

上述制备方法中，冻干的条件为：预冻阶段最低温度-40℃，达到最低温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-20℃，达到最终温度的时间为17小时，真空压力控制在0.18mbar；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空压力控制在0.005mbar，运行8小时。

利用本发明提供的上述制备方法制备得到的一种水痘减毒活疫苗冻干产品也属于本发明的保护范围。

本发明同时提供了一种风疹减毒活疫苗冻干苗的制备方法，包括以下步骤：提供风疹减毒活疫苗原液；按目标病毒滴度加入适量稀释液并加入本发明的冻干保护剂配制成疫苗半成品，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖1.5％-10％、右旋糖酐1.5％-3.5％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％；所述稀释液为风疹减毒活疫苗病毒维持液；所述疫苗半成品为冻干前的液态疫苗；

疫苗半成品在2-8℃条件下，分装，冻干。

在本发明的一个实施例中，风疹减毒活疫苗半成品目标病毒滴度5.0lgCCID₅₀/ml。

上述制备方法中，优选地，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖3％-8％、右旋糖酐2％-3％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％，更优选地，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖5％、右旋糖酐3％、山梨醇1-2％、谷氨酸钠1％、L-精氨酸0.2％。

上述制备方法中，冻干的条件为：预冻阶段最低温度-40℃，达到最低温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-20℃，达到最终温度的时间为17小时，真空压力控制在0.18mbar；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空压力控制在0.005mbar，运行8小时。

利用本发明提供的上述制备方法制备得到的一种风疹减毒活疫苗冻干产品也属于本发明的保护范围。

本发明的冻干保护剂与现有技术的冻干保护剂相比，稳定性结果无显著性差异，但是本发明的冻干保护剂由于不含明胶和人血白蛋白，提高了疫苗的安全性，减少了接种疫苗的不良反应。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1

(1)取水痘减毒活疫苗单次收获液，加入冻干保护剂，除去细胞碎片，即得水痘减毒活疫苗原液。保护剂的基质液为PBS缓冲液，保护剂在水痘减毒活疫苗原液中的终浓度为1.5％蔗糖、3.5％右旋糖酐70、2％山梨醇、0.8％谷氨酸钠、1％L-精氨酸。

(2)将水痘减毒活疫苗原液按4.8lgPFU/ml的目标病毒滴度加入适量稀释液(含1.5％蔗糖、3.5％右旋糖酐70、2％山梨醇、0.8％谷氨酸钠、1％L-精氨酸)配制成疫苗半成品。使疫苗半成品中含有以下终浓度成分1.5％蔗糖、3.5％右旋糖酐70、2％山梨醇、0.8％谷氨酸钠、1％L-精氨酸。

(3)疫苗半成品分装于西林瓶中，进行冻干，即为水痘减毒活疫苗成品。冻干方法为：预冻阶段最低温度-40℃，达到最低温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-20℃，达到最终温度的时间为17小时，真空压力控制在0.18mbar；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空压力控制在0.005mbar，运行8小时。

实施例2

取水痘减毒活疫苗单次收获液，加入保护剂，除去细胞碎片，即得水痘减毒活疫苗原液。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在水痘减毒活疫苗原液中的终浓度为5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸。

将水痘减毒活疫苗原液按4.8lgPFU/ml病毒滴度加入适量稀释液(含5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸)配制成疫苗半成品。使疫苗半成品含有以下终浓度成分：5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸。

疫苗半成品在分装于西林瓶中，参照实施例1的方法冻干，即为水痘减毒活疫苗成品。

实施例3

(1)取水痘减毒活疫苗单次收获液，加入保护剂，除去细胞碎片，即得水痘减毒活疫苗原液。保护剂的基质液为199培养液，保护剂在水痘减毒活疫苗原液中的终浓度为10％蔗糖、1.5％右旋糖酐70、2％山梨醇、1.2％谷氨酸钠、0.5％L-精氨酸。199培养液的生产厂家为GIBCO。

(2)将水痘减毒活疫苗原液按4.8lgPFU/ml病毒滴度加入适量稀释液(含10％蔗糖、1.5％右旋糖酐70、2％山梨醇、1.2％谷氨酸钠、0.5％L-精氨酸)配制成疫苗半成品。使疫苗半成品中含有以下终浓度成分：10％蔗糖、1.5％右旋糖酐70、2％山梨醇、1.2％谷氨酸钠、0.5％L-精氨酸。

(3)疫苗半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的方法冻干，即为水痘减毒活疫苗成品。

实施例4

(1)取水痘减毒活疫苗单次收获液，合并后，加入保护剂，除去细胞碎片，即得水痘减毒活疫苗原液。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在水痘减毒活疫苗原液中的终浓度为5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸。

(2)将水痘减毒活疫苗原液按4.8lgPFU/ml病毒滴度加入适量稀释液(含5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸)和明胶母液配制成疫苗半成品。使疫苗半成品中含有以下终浓度成分：5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸、1％明胶。

(3)半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的冻干方式冻干，即为水痘减毒活疫苗成品。

实施例5

(1)取水痘减毒活疫苗单次收获液，合并后，加入保护剂，除去细胞碎片，即得水痘减毒活疫苗原液。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在水痘减毒活疫苗原液中的终浓度为5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸。

(2)将水痘减毒活疫苗原液按4.8lgPFU/ml病毒滴度加入适量稀释液(含5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸)和人血白蛋白配制成疫苗半成品。使疫苗半成品中含有以下终浓度的成分：5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸、1％人血白蛋白。

(3)半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的冻干方式冻干，即为水痘减毒活疫苗成品。

实施例6

(1)取水痘减毒活疫苗单次收获液，合并后，加入保护剂，除去细胞碎片，即得水痘减毒活疫苗原液。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在水痘减毒活疫苗原液中的终浓度为5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸。

(2)将水痘减毒活疫苗原液按4.8lgPFU/ml病毒滴度加入适量稀释液(含5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸)、人血白蛋白、明胶母液配制成疫苗半成品。使疫苗半成品中含有以下终浓度的成分：5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸、1％人血白蛋白、1％明胶。

(3)半成品分装于西林瓶中，以实施例1的冻干方式进行冻干，即为水痘减毒活疫苗成品。

对以上6个实施例制得的水痘减毒活疫苗成品分别于37℃、4℃放置不同时间，取样进行外观、水分及病毒滴定，质量标准如下：

(1)外观：白色疏松体，复溶后为无色澄明液体，无异物。

(2)水分：依《中华人民共和国药典》三部(附录ⅫD)检查，应不高于3.0％。

病毒滴定：采用蚀斑法进行病毒滴定检测。取疫苗3瓶混合，进行适当稀释，每稀释度病毒液接种人二倍体细胞，置36.5±1℃、5％CO₂培养，经考马斯亮蓝染色后，判定结果，病毒滴度应不低于3.6lgPFU/ml。结果见表1、表2。

表1水痘减毒活疫苗37℃加速稳定性结果

表2水痘减毒活疫苗4℃长期稳定性结果

实施例7

取风疹减毒活疫苗原液按5.0lgCCID₅₀/ml的目标病毒滴度加入适量稀释液，加入冻干保护剂，即得风疹减毒活疫苗半成品。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在风疹减毒活疫苗半成品中的终浓度为1.5％蔗糖、3.5％右旋糖酐70、2％山梨醇、0.8％谷氨酸钠、1％L-精氨酸。

疫苗半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的方法冻干，即为风疹减毒活疫苗成品

实施例8

取风疹减毒活疫苗原液按5.0lgCCID₅₀/ml的目标病毒滴度加入适量稀释液，加入冻干保护剂，即得风疹减毒活疫苗半成品。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在风疹减毒活疫苗半成品中的终浓度为5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸。

疫苗半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的方法冻干，即为风疹减毒活疫苗成品。

实施例9

取风疹减毒活疫苗原液按5.0lgCCID₅₀/ml的目标病毒滴度加入适量稀释液，加入冻干保护剂，即得风疹减毒活疫苗半成品。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在风疹减毒活疫苗半成品中的终浓度为10％蔗糖、1.5％右旋糖酐70、2％山梨醇、1.2％谷氨酸钠、0.5％L-精氨酸。

疫苗半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的方法冻干，即为风疹减毒活疫苗成品。

实施例10

取风疹减毒活疫苗原液按5.0lgCCID₅₀/ml的目标病毒滴度加入适量稀释液，加入冻干保护剂，即得风疹减毒活疫苗半成品。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在风疹减毒活疫苗半成品中的终浓度为5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸、1％明胶。

疫苗半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的方法冻干，即为风疹减毒活疫苗成品。

实施例11

取风疹减毒活疫苗原液按5.0lgCCID₅₀/ml的目标病毒滴度加入适量稀释液，加入冻干保护剂，即得风疹减毒活疫苗半成品。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在风疹减毒活疫苗半成品中的终浓度为5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸、1％人血白蛋白。

疫苗半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的方法冻干，即为风疹减毒活疫苗成品。

实施例12

取风疹减毒活疫苗原液按5.0lgCCID₅₀/ml的目标病毒滴度加入适量稀释液，加入冻干保护剂，即得风疹减毒活疫苗半成品。保护剂的基质液为注射用水，保护剂在风疹减毒活疫苗半成品中的终浓度为5％蔗糖、3％右旋糖酐70、1％山梨醇、1％谷氨酸钠、0.2％L-精氨酸、1％人血白蛋白、1％明胶。

疫苗半成品分装于西林瓶中，参照实施例1的方法冻干，即为风疹减毒活疫苗成品。

对以上实施例7-12制得的风疹减毒活疫苗成品分别于37℃、4℃放置不同时间，取样进行外观、水分及病毒滴定，质量标准如下：

(1)外观：粉色疏松体，复溶后为粉色澄明液体，无异物。

(2)水分：依《中华人民共和国药典》三部(附录ⅫD)检查，应不高于3.0％。

(3)病毒滴定：采用微量细胞病毒法进行病毒滴定检测。取疫苗3瓶混合，进行适当稀释，每稀释度病毒液接种RK-13细胞，置32.0±1℃、5％CO₂培养7天，判定结果，病毒滴度应不低于3.5lgCCID₅₀/ml。结果见表3、表4。

表3风疹减毒活疫苗37℃加速稳定性结果

表4风疹减毒活疫苗4℃长期稳定性结果

对以上12个实施例的保护剂(按照保护剂在半成品中终浓度配制)分别于进行安全性评价，评价标准如下：

(1)细菌内毒素检查：依《中华人民共和国药典》三部(附录ⅫE凝胶限度试验)检查，应不高于50EU/剂。

(2)豚鼠全身主动过敏试验：供试品经皮下注射致敏后再经静脉注射激发，观察豚鼠注射供试品后所产生的全身过敏反应，过敏反应应为阴性。试验结果如下表5：

表5

实施例	细菌内毒素检查	豚鼠全身主动过敏试验
			1	<1.25	阴性
2	<1.25	阴性
			3	<1.25	阴性
4	<25	阴性
			5	<1.25	阳性
6	<25	阳性
			7	<1.25	阴性
8	<1.25	阴性
			9	<1.25	阴性
10	<25	阴性
			11	<1.25	阳性
12	<25	阳性

由以上数据可以看出，本发明的不含明胶和人血白蛋白保护剂与目前常规使用的含明胶和人血白蛋白保护剂相比，稳定性结果无显著性差异，但是本发明的疫苗冻干保护剂提高了疫苗的安全性，减少了疫苗的不良反应。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种疫苗冻干保护剂，其特征在于，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖1.5％-10％、右旋糖酐1.5％-3.5％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％，配制保护剂的基质液为199培养液或PBS缓冲溶液或注射用水，并且所述冻干保护剂中不含明胶且不含人血清白蛋白；所述疫苗半成品是指冻干前的液态疫苗。

2.如权利要求1所述的疫苗冻干保护剂，其特征在于，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖3％-8％、右旋糖酐2％-3％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％。

3.如权利要求1所述的疫苗冻干保护剂，其特征在于，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖5％、右旋糖酐3％、山梨醇1％、谷氨酸钠1％、L-精氨酸0.2％。

4.根据权利要求1所述的疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述的右旋糖酐为右旋糖酐70。

5.根据权利要求1所述的疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述的199培养液为无酚红199培养基。

6.权利要求1-5任一项所述的疫苗冻干保护剂在制备冻干疫苗中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述冻干疫苗为水痘减毒活疫苗冻干苗，包括以下步骤：

提供水痘减毒活疫苗单次收获液；

按比例加入权利要求1-5任一项所述的疫苗冻干保护剂至单次收获液中，并除去细胞碎片，制成水痘减毒活疫苗原液；

将水痘减毒活疫苗原液按疫苗半成品中目标病毒滴度加入适量稀释液配制成疫苗半成品，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖1.5％-10％、右旋糖酐1.5％-3.5％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％；所述稀释液含有与本发明的冻干保护剂相同的成分，且各成分的浓度与本发明冻干保护剂在疫苗半成品中的终浓度一致；所述疫苗半成品为冻干前的液态疫苗；所述目标病毒滴度为4.8lgPFU/ml；

疫苗半成品在2-8℃条件下，分装，冻干。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述冻干疫苗为风疹减毒活疫苗冻干苗，包括以下步骤：

按照病毒滴度病毒滴度为5.0lgCCID₅₀/ml加入适量稀释液至风疹病毒原液并按比例加入权利要求1-5任一项所述的疫苗冻干保护剂配制成疫苗半成品，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖1.5％-10％、右旋糖酐1.5％-3.5％、山梨醇1％-2％、谷氨酸钠0.8％-1.2％、L-精氨酸0.2％-1％；所述稀释液为风疹减毒活疫苗病毒维持液；所述疫苗半成品为冻干前的液态疫苗；

疫苗半成品在2-8℃条件下，分装，冻干。

9.根据权利要求6-8任一所述的应用，冻干的条件为：预冻阶段最低温度-40℃，达到最低温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-20℃，达到最终温度的时间为17小时，真空压力控制在0.18mbar；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空压力控制在0.005mbar，运行8小时。

10.权利要求6-9任一所述的应用制备得到的疫苗冻干产品，所述疫苗为水痘减毒活疫苗或风疹减毒活疫苗。