CN105251047B - 电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料及其制备方法和用途。本工艺将微接触印刷术与静电纺丝技术相结合，通过调控纳米纤维基质与微图案印章之间的角度，构建印有不同纳米纤维取向的电纺纳米纤维基质微图案印章支架，其可在无任何生物化学诱导剂作用下，调控干细胞的分化。本发明提供了一种新的在体外能有效促进干细胞分化的微纳米纤维支架材料，为未来功能化多孔微纳米支架的设计及其在组织工程中的应用提供了一种新的设计方向。
Description
技术领域
本发明涉及一种能促进干细胞分化的材料的技术领域，具体是指一种电纺纳米纤维基质微图案印章支架材料及其制备方法，特别涉及基于该电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料促进于人骨髓间充质干细胞分化为神经系细胞的用途。
背景技术
载体支架在组织工程领域占有重要的地位，载体纤维支架是细胞外基质的暂时代替物，能够模拟天然的细胞外基质结构，它的性能决定了细胞的粘附、增殖、分化和胞外基质的正常分泌。
现有的支架材料达不到单独组织生长的，要求细胞伪足具有沿着表面拓扑结构攀附的生长趋势,且还需要添加生物化学诱导因子才能进行分化生长，使用生物化学诱导因子会带来的副作用，如不可控的细胞增长、细胞致癌性及细胞死亡等。
因此有必要对此进行进一步改进。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料，其具有均一多孔的微纳米纤维结构，该支架材料可以作为很好的干细胞粘附、迁移和分化的载体，细胞伪足可沿着纳米纤维基质微图案印章支架材料纤维取向生长，有利于功能化的组织再生。
本发明的第二个目的是提供电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料的制备方法。
本发明的第三个目的是提供电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料的用途。
为实现本发明的第一个发明目的，本发明的技术方案是包括有通过静电纺丝工艺制备的多孔纳米纤维基质、以及通过微接触印刷工艺无缝接触粘附设置于多孔纳米纤维基质上的细胞外基质蛋白图案层，该多孔纳米纤维基质中的纳米纤维的取向相互平行一致。
进一步设置是纳米纤维直径是500±80nm，多孔纳米纤维基质厚度是80微米。
进一步设置是细胞外基质蛋白图案层的形状为条带状，带宽20微米，间隔150微米。
进一步设置是所述的多孔纳米纤维基质的材质为聚L-丙交酯-己内酯（PLCL）聚合物。
为实现本发明的第二个目的，其技术方案是包括以下步骤：
（1）将聚L-丙交酯-己内酯（PLCL）聚合物溶于二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液制得PLCL高聚物溶液，然后将PLCL高聚物溶液用静电纺丝工艺制备均一的多孔纳米纤维基质；
（2）将刻有图案的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章的印章表面在细胞外基质（ECM）蛋白溶液浸润温育至少一小时，再用高压高纯氮气吹干；然后将聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章与多孔纳米纤维基质室温下无缝接触，得到印有纤维连接蛋白条状结构的细胞外基质蛋白图案层的电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料。
进一步设置是聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章上的图案是通过光刻法加工。
进一步设置是步骤（1）中，用静电纺丝工艺的旋转收集器装置的转速是1000-1500rmp，喷嘴与收集器之间的距离是10-15cm，聚合物溶液的流速是0.8-1.2 ml/h，电压12-18kV。
进一步设置是所述的细胞外基质蛋白图案层中的细胞外基质（ECM）蛋白的取向与多孔纳米纤维基质中的纳米纤维的取向相平行或者相交。
实现本发明的第三个发明目的技术方案是在无任何的生物化学诱导因子的存在下，将电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料作为促进人骨髓间充质干细胞分化为神经系细胞的支架材料。
本发明将微接触印刷术与静电纺丝技术相结合，构建静电纺丝纳米纤维基质微图案印章支架材料。静电纺丝技术是利用高压静电场对高分子溶液的击穿作用来制备纳微米纤维材料的方法，其基本原理是在喷射装置和接收装置间施加上万伏的静电场，从纺丝液的锥体端部形成射流，并在电场中被拉伸，最终在接收装置上形成纳米纤维。微接触印刷工艺：先通过光学或电子束光刻得到模板（通常是二氧化硅）。压模材料（通常是PDMS）的化学前体在模板中固化，聚合成型后从模板中脱离，便得到了进行微接触印刷所要求的压模。接着将压模材料与被印刷的墨溶液接触，然后将浸过墨的压模压到待处理的衬底上，将墨转印到衬底上形成所设计图案。
本发明涉及的能促进干人骨髓间充质细胞分化为神经系细胞的电纺纳米纤维基质微图案印章支架材料，其可以在无任何生物化学诱导因子的作用下，只利用材料本身的表面形貌等物理因素促进于人骨髓间充质干细胞分化为神经系细胞，同时还避免了使用生物化学诱导因子所带来的可能出现的副作用，如不可控的细胞增长、细胞致癌性及细胞死亡等。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1显示多孔有序的纳米纤维基质的扫描电子显微镜图（A）及通过调控PDMS印章与多孔有序的纳米纤维基质的角度，可以得到不同取向的电纺纳米纤维基质微图案印章支架（B，C，D），微接触印刷于电纺纳米纤维基质表面的纤维连接蛋白在免疫染色后呈现出0度（B）、45度（C）和90度角（D）取向的微米纳米条状结构；
图2显示多孔纳米纤维基质印章支架可以形成促进神经转录水平上调的生长锥型结构。通过免疫染色结果显示，所有细胞都沿着微接触印刷所形成的微纳条状结构生长。不同的是，0度角（PDMS微印刷印章与有序纳米纤维平行方向）时细胞微丝的生长方向是平行于纳米纤维方向的；45度角（PDMS微印刷印章与有序纳米纤维呈45度角）时，大部分的细胞伪足生长延伸方向沿细胞的两端；90度角（PDMS微印刷印章与有序纳米纤维呈90度角）时，细胞生长方向沿印章的两边延伸；
图3显示了多孔纳米纤维基质印章支架可以促进人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。实时荧光定量PCR（A）和MAP2蛋白免疫染色（B）分析表明，经过14天的细胞培养，45度角时人骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的神经转录水平上调最高。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
步骤一：将PLCL聚合物（70:30）溶于二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液(二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比是4:1)制得PLCL高聚物溶液；然后将PLCL高聚物溶液在静电纺丝机旋转收集器装置的转速是1500rmp，喷嘴与收集器之间的距离是12cm，聚合物溶液的流速是1.0 ml/h，电压17kV，的条件下制得多孔有序的纳米纤维基质。
步骤二：先用光刻法制得PDMS印章，再在室温下将纤维连接蛋白ECM蛋白溶液在PDMS印章表面浸润温育一小时，用高压高纯氮气吹干；然后将PDMS印章与PLCL多孔有序的纳米纤维基质在室温下无缝接触30分钟，得到印有PDMS纤连蛋白条印章的PLCL多孔有序的纳米纤维基质印章支架。而且通过调控PDMS印章与多孔有序的纳米纤维基质的角度，可以得到不同取向的电纺纳米纤维基质微图案印章支架。PDMS印章平行于纳米纤维取向的呈0度角的，与纳米纤维取向呈45度角的，与纳米纤维取向垂直呈90度角的。种植细胞前没有印上纤连蛋白条的区域在37℃下用Pluronic F127(2.5 w/v% in PBS)钝化1小时，再用PBS洗去多余的F127。
步骤三：在MSC培养基中增殖人骨髓间充质干细胞，培养基要2-3天更换一次，然后用PBS和0.05%的胰蛋白酶-EDTA溶液冲洗和分离细胞。收集细胞，将其种植于PLCL多孔纳米纤维印章支架上，在含有L型谷氨酸、10%胎牛血清和1%抗细菌/抗真菌试剂的低葡萄糖培养基中培养种植密度为650个/cm2的人骨髓间充质干细胞，使其覆盖种植于整个印刷和无印刷区域。在37℃下培养30分钟后然后再用新的培养基洗去没有粘附的细胞。
步骤四：通过免疫染色结果显示，0度角（PDMS微印刷印章与有序纳米纤维平行方向）时细胞微丝的生长方向是平行于纳米纤维方向的；45度角（PDMS微印刷印章与有序纳米纤维呈45度角）时，大部分的细胞伪足生长延伸方向沿细胞的两端；90度角（PDMS微印刷印章与有序纳米纤维呈90度角）时，细胞生长方向沿印章的两边延伸。多孔纳米纤维基质印章支架可以形成促进神经转录水平上调的生长锥型结构。qPCR分析表明，经过14天的细胞培养，45度角时人骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的神经转录水平上调最高。
Claims (6)
1.一种电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料，其特征在于：包括有通过静电纺丝工艺制备的多孔纳米纤维基质、以及通过微接触印刷工艺无缝接触粘附设置于多孔纳米纤维基质上的细胞外基质蛋白图案层，该多孔纳米纤维基质中的纳米纤维的取向相互平行一致，纳米纤维直径是500±80nm，多孔纳米纤维基质厚度是80微米，细胞外基质蛋白图案层的形状为条带状，带宽20微米，间隔150微米，所述的多孔纳米纤维基质的材质为聚L-丙交酯-己内酯（PLCL）聚合物。
2.一种制备如权利要求1所述的电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将聚L-丙交酯-己内酯（PLCL）聚合物溶于二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液制得PLCL高聚物溶液，然后将PLCL高聚物溶液用静电纺丝工艺制备均一的多孔纳米纤维基质；
（2）将刻有图案的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章的印章表面在细胞外基质（ECM）蛋白溶液浸润温育至少一小时，再用高压高纯氮气吹干；然后将聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章与多孔纳米纤维基质室温下无缝接触，得到印有纤维连接蛋白条状结构的细胞外基质蛋白图案层的电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料。
3.根据权利要求2所述的一种电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料的制备方法，其特征在于：聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章上的图案是通过光刻法加工。
4.根据权利要求2所述的电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，用静电纺丝工艺的旋转收集器装置的转速是1000-1500rmp，喷嘴与收集器之间的距离是10-15cm，聚合物溶液的流速是0.8-1.2 ml/h，电压12-18kV。
5.根据权利要求2所述的电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料的制备方法，其特征在于：所述的细胞外基质蛋白图案层中的细胞外基质（ECM）蛋白的取向与多孔纳米纤维基质中的纳米纤维的取向相平行或者相交。
6.一种如权利要求1所述的电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料的用途，其特征在于：在无任何的生物化学诱导因子的存在下，将电纺多孔纳米纤维基质微图案印章支架材料作为促进人骨髓间充质干细胞分化为神经系细胞的支架材料。
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