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CN105242044A - 猪瘟病毒e2蛋白定量的检测方法 - Google Patents

猪瘟病毒e2蛋白定量的检测方法 Download PDF

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CN105242044A CN201510816326.6A CN201510816326A CN105242044A CN 105242044 A CN105242044 A CN 105242044A CN 201510816326 A CN201510816326 A CN 201510816326A CN 105242044 A CN105242044 A CN 105242044A
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赵毅
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Abstract

本发明属于生物检测方法的改进与研发技术领域，特别是涉及一种猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法，该检测方法包括下述步骤：一、对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及纯化步骤；二、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的优化步骤；三、临界值的确定及检测结果的确定步骤。与常规方法相比，此方法的定量定性过程约2小时，在不影响定量结果的前提下，对人员和仪器设备要求不高，省时省力，为猪瘟病毒E2蛋白定量提供了新的方法。

Description

猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法
技术领域
本发明属于生物检测方法的改进与研发技术领域，特别是涉及一种猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法。
背景技术
目前猪瘟病毒E2蛋白定量的方法有凝胶成像软件分析法和高效液相色谱法。凝胶成像软件分析法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot进行猪瘟病毒E2蛋白的定量和定性分析，耗时较长；高效液相色谱法可快速进行猪瘟病毒E2蛋白的定量，但对仪器设备和操作人员要求较高，且不能进行免疫学分析(定性)；而应用单克隆抗体进行猪瘟病毒E2蛋白的定量定性分析，是基于BCA蛋白定量法的原理，BCA蛋白定量法测定的是样品中的总蛋白量；将单克隆抗体包被于反应板内捕获猪瘟病毒E2蛋白，通过显色定量精确且步骤简单、省时、易于操作。
文献检索披露：猪瘟病毒E2蛋白定量的SOP和相关专利，凝胶成像软件分析法以牛血清白蛋白(BSA)为标准品与待检猪瘟病毒E2蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot分析，经染色、脱色、拍照后，结合Western-blot的目的条带，以BSA建立标准曲线，根据猪瘟病毒E2蛋白的灰度值进行定量；高效液相色谱法以纯化的猪瘟病毒E2蛋白为标准品，建立标准曲线，可对表达的猪瘟病毒E2蛋白进行定量精确，但对设备和操作人员专业水平要求较高，且需通过Western-blot法进行目的蛋白的定性。目前，国内尚无机构和学者应用单克隆抗体捕获猪瘟病毒E2蛋白再结合BCA法进行定量定性分析，本方法步骤简单、省时、易于操作。
发明内容
本发明的目的在于：研制一种猪瘟病毒E2蛋白定量定性的新方法，在不改变定量精确度的前提下，本方法步骤简单、省时、易于操作，为今后猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的生产检验提供技术支持。
本发明的技术方案如下：猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法，该检测方法包括下述步骤：
一、对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及纯化步骤；
二、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的优化步骤；
三、临界值的确定及检测结果的确定步骤。步骤一的具体方法：①将制备单克隆抗体的杂交瘤细胞按常规的培养方式进行培养，培养后的健康细胞离心并调整到1.0×106/ml；②密度调整后的杂交瘤细胞注射到Bacb/c小鼠腹腔内，14天后抽取小鼠腹腔内的腹水；③用饱和硫酸铵进行初步纯化后，用MelonGelIgGSpinPurificationKit进一步纯化；④用BCA试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行定量，定量后备用。步骤二的具体方法：①用包被buffer倍比稀释纯化后的单克隆抗体，浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml，每个稀释度8孔；②将包被板内每孔加入50μl上述稀释后的单克隆抗体；③将包被板置4℃，在潮汐式振荡器上振荡16小时；④弃去板内的液体，每孔加300μlPBST，振荡洗涤5min，重复洗3次；⑤弃去PBST后每孔加入由PBS+1％BSA制备的100μlPBA置37℃，在潮汐式振荡器上振荡2小时，重复上述步骤3次；⑥纯化的猪瘟病毒E2蛋白标准品分别为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml，同时设以PBST为阴性对照的孔，加入上述制备好的包被板内，50μl/孔，置37℃反应1小时；⑦每孔加入200μl的BCA试剂盒中的显色液，置37℃反应30min；⑧用酶标仪在562nm进行读数，计算P/N值；⑨当单克隆抗体浓度3.125μg/ml进行包被时P/N值最大，确定为最佳单抗包被浓度；当猪瘟病毒E2蛋白标准品浓度在6.25～100μg/ml时绘制的标准曲线具有良好的线性关系，R2≥98％，最终确定检测的样本每孔加入50μl即可保证样品检测结果的精确性。步骤三的具体方法：随机抽取20份猪瘟病毒E2重组杆状病毒在昆虫细胞上表达的猪瘟病毒E2蛋白，按上述步骤二的方法检测，计算20份猪瘟病毒E2蛋白的平均OD值(x)和标准差SD，阴阳性临界值＝x+3SD，当待检样本OD值≥x+3SD时，可在99.9％的水平上判定为阳性。
本发明的有益效果：将纯化后特定量的单克隆抗体包被于反应板内，倍比稀释加入纯化并精确定量的猪瘟病毒E2标准品和猪瘟病毒E2蛋白(未纯化细胞表达的上清)，置37℃反应60min，用PBST(PBS+0.02％吐温20)洗6次，每次300μl；每个样品孔内加入200μlBCA试剂盒中的BCA工作液，置37℃反应30min，用酶标仪在562nm进行测定，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。与常规方法相比，此方法的定量定性过程约2小时，在不影响定量结果的前提下，对人员和仪器设备要求不高，省时省力，为猪瘟病毒E2蛋白定量提供了新的方法。
附图说明
下面结合附图对发明作进一步的说明，附图1为单抗法标准曲线，附图2为高效液相色谱法标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对发明作进一步说明。
实施例1、猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法，一、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及纯化：①将制备单克隆抗体的杂交瘤细胞按常规的培养方式进行培养，培养后的健康细胞离心并调整到1.0×106/ml；②密度调整后的杂交瘤细胞注射到Bacb/c小鼠腹腔内，14天后抽取小鼠腹腔内的腹水；③用饱和硫酸铵进行初步纯化后，用MelonGelIgGSpinPurificationKit进一步纯化；④用BCA试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行定量，定量后备用。
二、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的优化：①用包被buffer倍比稀释纯化后的单克隆抗体，浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml，每个稀释度8孔；②将包被板内每孔加入50μl上述稀释后的单克隆抗体；③将包被板置4℃，在潮汐式振荡器上振荡16小时；④弃去板内的液体，每孔加300μlPBST，振荡洗涤5min，重复洗3次。⑤弃去PBST后每孔加入100μlPBA(PBS+1％BSA)置37℃，在潮汐式振荡器上振荡2小时，重复上述步骤3次；⑥纯化的猪瘟病毒E2蛋白标准品分别为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml，同时设以PBST为阴性对照的孔，加入上述制备好的包被板内，50μl/孔，置37℃反应1小时；⑦每孔加入200μl的BCA试剂盒中的显色液，置37℃反应30min；⑧用酶标仪在562nm进行读数，计算P/N值。⑨当单克隆抗体浓度3.125μg/ml进行包被时P/N值最大，确定为最佳单抗包被浓度；当猪瘟病毒E2蛋白标准品浓度在6.25～100μg/ml时绘制的标准曲线具有良好的线性关系，R2≥98％，最终确定检测的样本每孔加入50μl即可保证样品检测结果的精确性结果详见表1～2。
三、临界值的确定：随机抽取20份猪瘟病毒E2重组杆状病毒在昆虫细胞上表达的猪瘟病毒E2蛋白，按上述方法检测，计算20份猪瘟病毒E2蛋白的平均OD值(x)和标准差SD，阴阳性临界值＝x+3SD。当待检样本OD值≥x+3SD时，可在99.9％的水平上判定为阳性。
实施例2、特异性的验证：取在昆虫细胞上表达猪瘟病毒E2蛋白、猪圆环病毒(Ⅱ)、昆虫细胞上表达猪圆环病毒Cap蛋白、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、牛病毒性腹泻病毒的细胞培养物进行检测，结果显示除昆虫细胞上表达猪瘟病毒E2蛋白为阳性，其他均为阴性，证明了包被的单克隆抗体具有良好的特异性。
猪瘟病毒E2蛋白定量精确性验证：随机抽取5份猪瘟病毒E2重组杆状病毒在昆虫细胞上表达的猪瘟病毒E2蛋白按原液、1/2、1/4稀释后进行检测，分别用包被的单克隆抗体和高效液相色谱仪进行检测，对同一样品1/2、1/4稀释检测结果还原到原液进行统计学分析，结果见表3。单抗法标准曲线见附表1和图1，高效液相色谱法标准曲线见附表2和图2。
表3猪瘟病毒E2蛋白定量精确性验证
表1单抗法标准曲线数据
标准品浓度(μg/ml) 6.25 12.5 25 50 100
吸光值 0.085 0.092 0.112 0133 0.188
表2高效液相色谱法标准曲线数据
结果表明：用包被单抗捕获猪瘟病毒E2蛋白进行蛋白定量的结果与高效液相色谱仪定量结果经统计学分析，P＞0.05，差异不显著。本发明可对目的蛋白进行定量和定性分析，不需昂贵的仪器设备，操作步骤简便，可批量的在2小时内完成蛋白定量，与传统的猪瘟病毒E2蛋白定量相比极大的减少了检验成本和时间，具有显著的效果。
本发明中所用的BCA试剂盒购自Thermo公司；MelonGelIgGSpinPurificationKit自Thermo公司；猪瘟病毒E2蛋白标准品由高效液相色谱仪纯化并定量。
本发明通过针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的生产和纯化、单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的优化、临界值的确定、特异性的验证、蛋白定量精确性验证，表明本发明建立的方法具有良好的特异性和定量精确性，不需昂贵的仪器设备，操作步骤简便，可批量的在2小时内完成蛋白定量，与传统的猪瘟病毒E2蛋白定量相比极大的减少了检验成本和时间，具有显著的效果。

Claims (4)

1.猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法，其特征在于，该检测方法包括下述步骤：
一、对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及纯化步骤；
二、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的优化步骤；
三、临界值的确定及检测结果的确定步骤。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤一的具体方法：①将制备单克隆抗体的杂交瘤细胞按常规的培养方式进行培养，培养后的健康细胞离心并调整到1.0×106/ml；②密度调整后的杂交瘤细胞注射到Bacb/c小鼠腹腔内，14天后抽取小鼠腹腔内的腹水；③用饱和硫酸铵进行初步纯化后，用MelonGelIgGSpinPurificationKit进一步纯化；④用BCA试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行定量，定量后备用。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤二的具体方法：①用包被buffer倍比稀释纯化后的单克隆抗体，浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml，每个稀释度8孔；②将包被板内每孔加入50μl上述稀释后的单克隆抗体；③将包被板置4oC，在潮汐式振荡器上振荡16小时；④弃去板内的液体，每孔加300μlPBST，振荡洗涤5min，重复洗3次；⑤弃去PBST后每孔加入由PBS+1%BSA制备的100μlPBA置37oC，在潮汐式振荡器上振荡2小时，重复上述步骤3次；⑥纯化的猪瘟病毒E2蛋白标准品分别为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml，同时设以PBST为阴性对照的孔，加入上述制备好的包被板内，50μl/孔，置37oC反应1小时；⑦每孔加入200μl的BCA试剂盒中的显色液，置37oC反应30min；⑧用酶标仪在562nm进行读数，计算P/N值；⑨当单克隆抗体浓度3.125μg/ml进行包被时P/N值最大，确定为最佳单抗包被浓度；当猪瘟病毒E2蛋白标准品浓度在6.25～100μg/ml时绘制的标准曲线具有良好的线性关系，R2≥98%，最终确定检测的样本每孔加入50μl即可保证样品检测结果的精确性。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤三的具体方法：随机抽取20份猪瘟病毒E2重组杆状病毒在昆虫细胞上表达的猪瘟病毒E2蛋白，按上述步骤二的方法检测，计算20份猪瘟病毒E2蛋白的平均OD值(x)和标准差SD，阴阳性临界值=x+3SD，当待检样本OD值≥x+3SD时，可在99.9%的水平上判定为阳性。
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