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CN105209629A - 用于水解淀粉的方法 - Google Patents

用于水解淀粉的方法 Download PDF

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CN105209629A
CN105209629A CN201480026850.7A CN201480026850A CN105209629A CN 105209629 A CN105209629 A CN 105209629A CN 201480026850 A CN201480026850 A CN 201480026850A CN 105209629 A CN105209629 A CN 105209629A
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starch
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enzyme
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P·桑德斯
S·E·拉森
S·R·麦克劳克林
C-L·宋
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Novo Nordisk AS
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Abstract

本发明涉及用于将颗粒状淀粉在低于或恰好高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度下酶水解为可溶性淀粉水解物的方法。

Description

用于水解淀粉的方法
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及用于将颗粒状淀粉在低于或恰好高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度下水解为可溶性淀粉水解物的一步方法。
发明背景
已经描述了大量用于将淀粉转化为淀粉水解物(例如麦芽糖、葡萄糖或特制糖浆)的方法，这些淀粉水解物用作甜味剂或者用作其他糖(例如果糖)的前体。还可以将葡萄糖发酵为乙醇或其他发酵产品，例如乳酸、柠檬酸或结晶糖(例如结晶右旋糖)。
淀粉是一种由葡萄糖单位链组成的高分子量聚合物。它通常由约80％支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉是一种分支多糖，其中α-1,4D-葡萄糖残基的直链由α-1,6糖苷键连接。
直链淀粉是一种由D-吡喃葡萄糖单位构成的线性多糖，这些单位通过α-1,4糖苷键连接在一起。在将淀粉转化为可溶性淀粉水解物的情况下，将淀粉解聚。常规的解聚方法由一个糊化步骤和两个连续的工艺步骤(即液化过程和糖化过程)组成。
颗粒状淀粉由在室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热一种水性淀粉浆液时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在此“糊化”过程中，粘度有显著的增加。由于典型工业方法中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被操作。如今主要是通过酶降解而获得粘度的降低。在液化步骤过程中，长链淀粉被α-淀粉酶降解为较小的分支单位和线性单位(麦芽糊精)。液化过程典型地是在约105℃-110℃下进行约5至10分钟，随后在约95℃下进行约1-2小时。然后将温度降至60℃，添加产碳水化合物源的酶(例如葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶或其组合)和任选地脱支酶(例如异淀粉酶或普鲁兰酶)，并且将糖化过程进行约24至72小时。
从以上讨论中清楚的是由于在各个步骤过程中对温度的要求不同，所以常规淀粉转化过程是非常耗能的。因此，希望能够选择在该过程中使用的酶，这样使得可以不在不得不完全糊化淀粉的情况下进行整个过程。此类方法是美国专利号4,591,560、4,727,026和4,009,074以及EP171218的主题。
WO03068976涉及用于将颗粒状淀粉在低于淀粉的初始糊化温度的温度下转化为可溶性淀粉水解物的一步方法。
WO2013/057141和WO2013/057143描述了α-淀粉酶变体及其在例如淀粉加工、发酵产品产生、用于由包含未糊化淀粉的材料产生发酵产品的方法以及用于由包含糊化淀粉的材料产生发酵产品的方法中的用途。这些变体被描述为当在低pH下和/或高温下，特别是在低钙浓度下，并且特别是在至少0.1％淀粉的存在下(例如，在0.9％或1％淀粉的存在下)孵育时具有例如增加的稳定性。
仍需要对用于产生淀粉可溶性水解物的方法进行改进。
发明概述
在一方面，本发明提供了一种用于增加淀粉溶解作用的方法，该方法包括使水性颗粒状淀粉浆液在低于或恰好高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度下经受α-淀粉酶变体，该变体在对应于SEQIDNO:1的以下任何位置的一个或多个位置处包括改变：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450；在存在产碳水化合物源的酶，例如葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶、或其组合的情况下；由此增加该颗粒状淀粉的溶解作用。在一个具体实施例中，在约60℃-70℃的温度下进行该方法。
在一方面，本发明提供了一种用于产生可溶性淀粉水解物的一步方法，该方法包括使水性颗粒状淀粉浆液在低于或恰好高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度下经受一种α-淀粉酶变体的作用，该变体在对应于SEQIDNO:1的以下任何位置的一个或多个位置处包括改变：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450。在一个具体实施例中，在约60℃-70℃的温度下进行该方法。
在一个另外的方面，本发明提供了一种用于产生高果糖淀粉基糖浆(HFSS)的方法，该方法包括通过本发明的前述方面所述的一步方法产生一种可溶性淀粉水解物，并且进一步包括将该可溶性淀粉水解物转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)的步骤。
在一个另外的方面，本发明提供了一种用于产生麦芽糖糖浆的方法，该方法包括通过本发明的前述方面所述的一步方法产生一种可溶性淀粉水解物，并且进一步包括将该可溶性淀粉水解物转化为麦芽糖糖浆的步骤。
附图简要说明
图1示出具有以下氨基酸序列的α-淀粉酶的比对：
SEQIDNO:1是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。
SEQIDNO:2是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
SEQIDNO:3是在应用微生物学杂志(J.Appl.Microbiology)，1997，82:325-334(SWALL:q59222)中描述的芽孢杆菌属α-淀粉酶TS-23。
SEQIDNO:4是在WO2005/001064中描述的黄热芽孢杆菌(Bacillusflavothermus)α-淀粉酶AMY1048。
SEQIDNO:5是在WO04/113511中描述为SEQIDNO:21的芽孢杆菌属α-淀粉酶TS-22。
SEQIDNO:6是解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶。
SEQIDNO:7是在WO95/26397中描述为SEQIDNO1的芽孢杆菌碱性属SP690淀粉酶。
SEQIDNO:8是在WO95/26397中描述为SEQIDNO2的盐敏芽孢杆菌(Bacillushalmapalus)α-淀粉酶。
SEQIDNO:9是在WO00/60060中描述为SEQIDNO4的芽孢杆菌碱性属AA560淀粉酶。
SEQIDNO:10是在WO200210356中描述为SEQIDNO2的芽孢杆菌碱性属A7-7淀粉酶。
SEQIDNO:11是在冢本(Tsukamoto)等人(1988，生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)151:25-33)中描述的芽孢杆菌碱性属SP707淀粉酶。
SEQIDNO:12是在EP1022334中描述为SEQIDNO2的芽孢杆菌碱性属K-38淀粉酶。
SEQIDNO:13是在李(Lee)等人，2006，生物化学杂志(J.Biochem)，139:997-1005中描述的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。
SEQIDNO:14是以前在例如WO2002/010355中披露的变体α-淀粉酶LE399。
发明详细说明
定义
术语“颗粒状淀粉”被理解为生的未煮过的淀粉，即尚未经历糊化的淀粉。淀粉是在植物体内作为不溶于水的微小颗粒而形成。这些颗粒在低于初始糊化温度的温度下被保存为淀粉。当放入冷水中时，这些颗粒可以吸收少量的液体。高达50℃至70℃，膨胀是可逆的，可逆性程度取决于具体的淀粉。在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。
术语“初始糊化温度”被理解为淀粉糊化开始时的最低温度。淀粉在60℃与70℃之间开始糊化，准确温度取决于具体淀粉。初始糊化温度取决于有待加工的淀粉的来源。小麦淀粉的初始糊化温度为约52℃，对于马铃薯淀粉为大约56℃，并且对于玉米淀粉为大约62℃。然而，初始淀粉的品质可以根据植物物种的具体品种以及随生长条件而变化，并且因此应该针对每个单独的淀粉批次确定初始糊化温度。
术语“可溶性淀粉水解物”被理解为本发明的方法的可溶性产物并且可以包括单糖、二糖和寡糖，例如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、环糊精以及这些的任何混合物。优选地，颗粒状淀粉的干固体的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％被转化为可溶性淀粉水解物。
术语“特制糖浆”是本领域公认的术语并且根据DE和碳水化合物谱进行表征(参见由G.G.伯奇(G.G.Birch)和L.F.格林(L.F.Green)编辑的教科书“食品碳水化合物的分子结构与功能(MolecularStructureandFunctionofFoodCarbohydrate)”中的第50+页的文章“新特制葡萄糖糖浆(NewSpecialityGlucoseSyrups)”，应用科学出版社有限公司(AppliedSciencePublishersLTD.)，伦敦)。典型地，特制糖浆的DE范围是从35至45。
α-淀粉酶：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他线性和分支1,4糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可根据在实例中描述的程序例如通过PNP-G7测定来确定。在一方面，本发明的变体具有SEQIDNO:1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在另一方面，本申请的变体具有其亲本的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
葡糖淀粉酶活性：术语“葡糖淀粉酶活性”意指催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性(EC3.2.1.3)。出于本发明的目的，根据下文的“材料与方法”部分所述的程序来确定葡糖淀粉酶活性。Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
β-淀粉酶活性：术语“β-淀粉酶活性”意指催化多糖中的(1->4)-α-D-糖苷键水解以便从链的非还原端除去连续的麦芽糖单位直到分子被降解、或在支链淀粉的情况下直到到达分支点的4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶活性(EC3.2.1.2)。释放的麦芽糖具有β端基异构构型，因此名称为β-淀粉酶。β-淀粉酶是传统地给予外切作用的产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。出于本发明的目的，根据下文的“材料与方法”部分所述的程序来确定β-淀粉酶活性。
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一个片段含有至少300个氨基酸残基、至少350个氨基酸残基、至少400个氨基酸残基、至少450个氨基酸残基、至少470个氨基酸残基或至少480个氨基酸残基。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质上相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质上相关的启动子强的启动子)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以产生由相同的多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。成熟形式的一些α-淀粉酶(例如，一些细菌α-淀粉酶)包括含有用于底物水解的活性位点的催化结构域以及用于结合碳水化合物底物(淀粉)的一个或多个碳水化合物结合模块(CBM)以及任选地将一个或多个CBM与催化结构域连接的多肽，后一类型的区域通常称为“接头”。
亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行变化以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于占据一个位置的氨基酸添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。在一方面，本发明的变体具有SEQIDNO:1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在另一方面，本申请的变体具有其亲本的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。α-淀粉酶活性可通过在实例中描述的PNP-G7测定来确定。
野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物，如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌来表达的α-淀粉酶。
变体命名惯例：出于本发明的目的，将SEQIDNO:1中披露的成熟多肽用来确定另一种α-淀粉酶中的对应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQIDNO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定对应于SEQIDNO:1中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcidsResearch)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSSEMMA。
当其他酶与SEQIDNO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295：613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(NucleicAcidsRes.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。在本申请的实例中，多个突变由空格分开，例如，G205RS411F代表G205R+S411F。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
亲本： 变体：
195 195195a 195b
G G-K-A
多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly，Ala+Arg170Gly，Ala”指示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
用于水解淀粉的方法
在传统葡萄糖加工中，使淀粉浆液经受初次液化和二次液化，包括调节pH和在pH5.5，105℃下蒸汽喷射处理0.1小时，随后在95℃下处理1-2小时。这之后传统地是经30-60小时冷却至60℃并将pH调节至pH4.0-4.5的步骤，用于分开的糖化步骤。因此，传统的方法需要分开的液化和糖化步骤，并且需要能源和化工成本。
相比之下，本发明的淀粉水解方法提供了一种单一的较低温度的方法，由于例如在较低的温度下使用较少的蒸汽并且调节pH使用较少的化学品以及其他益处，该方法可以降低能源和化工成本。此外，本发明的方法消除了对在传统加工中所需的单独的初次和二次液化步骤以及单独的碳柱过滤的需求。
本发明的方法还可以提供高程度的淀粉溶解作用，产生高纯度右旋糖糖浆，并且可以降低水解时间从而整体降低整个加工时间。另外的益处可以包括糖浆中的美拉德(Maillard)产物和蛋白质溶解作用降低。
诸位发明人已经出人意料地发现，针对高温液化方法开发并且在pH4.5至5.5之间具有活性的某些细菌低pH淀粉酶(在此也称为α-淀粉酶变体)在低于或恰好高于淀粉的初始糊化温度的温度(例如，60℃-70℃，如60℃-66℃)下对生淀粉显示出出人意料的高活性，这特别适用于玉米淀粉。在低温下例如在存在产碳水化合物源的酶，如葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶的情况下，通过增加的淀粉溶解作用显示出针对生淀粉的活性。
如在例如WO2013/057141和WO2013/057143(通过引用结合在此)中所披露的，在对应于SEQIDNO:1取代的以下任何位置的一个或多个位置处包括改变的α-淀粉酶变体当在低pH下和/或高温下，特别是在低钙浓度下，并且特别是在至少0.1％淀粉的存在下(例如，在0.9％或1％淀粉的存在下)孵育时显示出增加的稳定性：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450。
这些细菌淀粉酶使得可以在冷煮方法中在例如pH4.5下进行单一步骤或组合的液化-糖化过程。冷煮方法可以代替在105℃下高温喷射，随后在95℃下进行二次液化并且在60℃下进行单独糖化的常规方法。由于在较低的温度下使用较少的蒸汽，从液化至糖化中调节pH使用较少的pH化学品以及因在液化和糖化步骤过程中在高温下产生的美拉德产物和添加的化学品较少而潜在地使用较少的碳柱和离子交换柱，与运行成本相关的成本得到节约。
在一方面，本发明提供了一种用于增加淀粉溶解作用的方法，该方法包括使水性颗粒状淀粉浆液在低于或恰好高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度下经受如在此描述的α-淀粉酶变体；在存在产碳水化合物源的酶，例如葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶或其组合的情况下；由此增加该颗粒状淀粉的溶解作用。
在一个具体方面，该α-淀粉酶变体是以大于约0.05mg酶蛋白/g干固体，例如约0.06mgEP/g干固体、约0.07mgEP/g干固体、约0.08mgEP/g干固体、约0.09mgEP/g干固体、约0.1mgEP/g干固体、约0.11mgEP/g干固体、约0.12mgEP/g干固体、约0.13mgEP/g干固体、约0.14mgEP/g干固体、约0.15mgEP/g干固体、约0.16mgEP/g干固体、约0.17mgEP/g干固体、约0.18mgEP/g干固体、约0.19mgEP/g干固体、约0.20mgEP/g干固体、约0.21mgEP/g干固体、约0.22mgEP/g干固体、约0.23mgEP/g干固体、约0.24mgEP/g干固体、约0.25mgEP/g干固体、约0.26mgEP/g干固体、约0.27mgEP/g干固体、约0.28mgEP/g干固体、约0.29mgEP/g干固体或约0.30mgEP/g干固体的量存在。
在一方面，本发明提供了一种用于产生可溶性淀粉水解物的一步方法，该方法包括使水性颗粒状淀粉浆液在低于或恰好高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度下经受如在此描述的α-淀粉酶变体的作用。
在一个另外的方面，本发明提供了一种用于产生高果糖淀粉基糖浆(HFSS)的方法，该方法包括通过本发明的前述方面所述的方法产生一种可溶性淀粉水解物，并且进一步包括将该可溶性淀粉水解物转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)的步骤。在一些实施例中，可以在水解淀粉的同时产生右旋糖糖浆，即在单一步骤中或在与添加α-淀粉酶变体几乎同时的过程中。
在一个另外的方面，本发明提供了一种用于产生麦芽糖糖浆的方法，该方法包括通过本发明的前述方面所述的方法产生一种可溶性淀粉水解物，并且进一步包括将该可溶性淀粉水解物转化为麦芽糖糖浆的步骤。在一些实施例中，可以在水解淀粉的同时产生麦芽糖糖浆，即在单一步骤中或在与添加α-淀粉酶变体几乎同时的过程中。
例如，麦芽糖糖浆可以通过在温度50℃-60℃和pH5下使用产麦芽糖酶进行糖化而制备自5-20DE部分水解的淀粉底物。使用产麦芽糖酶(例如提取自发芽大麦的β-淀粉酶，或微生物β-淀粉酶或来源于米曲霉的真菌α淀粉酶)产生包含约40-55wt％麦芽糖的水解物。通过使用β-淀粉酶、产麦芽糖酶和脱支酶(例如普鲁兰酶)的组合进行糖化而产生较高水平的麦芽糖(即55-85wt％)。在一些实施例中，还产生了包含中间水平的麦芽糖和右旋糖的60-70DE的高转化糖浆。
有待经受本发明的方法的淀粉浆液可以具有20％-55％干固体颗粒状淀粉，优选25％-40％干固体颗粒状淀粉，更优选30％-35％干固体颗粒状淀粉。
经受本发明的方法之后，颗粒状淀粉的干固体的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或优选99％被转化为可溶性淀粉水解物。
根据本发明的一个实施例，在低于初始糊化温度的温度下进行这些方法。在这个实施例中，进行这些方法的温度是至少30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或优选至少60℃。
在一个实施例中，在低于或恰好高于淀粉的初始糊化温度的温度下进行这些方法。在一个具体实施例中，在约60℃-70℃，例如约60℃-66℃，并且特别是在约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃和/或约66℃的温度下进行该方法。在该淀粉是玉米淀粉时，这些温度范围是特别适用的。如所提及的，本领域技术人员应认识到不同淀粉将具有可以根据植物物种、植物物种的具体品种和/或根据生长条件而变化的初始糊化温度，并且可以相应地调节温度条件。
进行本发明的方法的pH可以是在3.0至7.0，优选从3.5至6.0或更优选从4.0-5.0或优选从4.5-5.5的范围内，例如约4.5。
根据本发明产生的可溶性淀粉水解物的准确组成取决于应用的酶的组合以及加工的颗粒状淀粉的类型。优选地，该可溶性水解物是纯度为至少85％、90％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％的麦芽糖。甚至更优选地，该可溶性淀粉水解物是葡萄糖，并且最优选地，该淀粉水解物的DX(总溶解的干固体的葡萄糖百分比)为至少85％、90％、91.0％、91.5％、92.0％、92.5％、93.0％、93.5％、94.0％、94.5％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5、99.0％或99.5％。然而，同样考虑的是以下方法，其中本发明的方法的产物(可溶性淀粉水解物)是一种特制糖浆，例如包含葡萄糖、麦芽糖(DP2)、DP3和DPn的混合物以用于在制造冰淇淋、糕点、糖果、水果罐头中使用的特制糖浆。
有待在本发明的方法中加工的颗粒状淀粉具体而言可以获得自块茎、根、茎、豆类、谷类或整谷物。更确切地，该颗粒状淀粉可以获得自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。特别考虑的是蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦两者。有待加工的颗粒状淀粉可以是高度精制的淀粉品质，优选地纯度大于90％、95％、97％或99.5％，或者它可以是包含更粗糙的淀粉的材料，包括经研磨的整谷物，包括非淀粉部分(例如胚芽残留物和纤维)。该原材料(如整谷物)经过研磨以便展开结构并且允许进一步加工。根据本发明，以下两种研磨方法是优选的：湿式和干式研磨。在干式研磨中，整个谷粒被研磨并且使用。湿式研磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离并且在应用于使用淀粉水解物产生糖浆的场所时有些例外。干式和湿式研磨两者是本领域中熟知的淀粉加工法并且同样地被考虑用于本发明的方法。可以在超滤系统中进行本发明的方法，在该超滤系统中滞留物在酶、生淀粉和水的存在下被保持于再循环之下并且在该超滤系统中渗透物是可溶性淀粉水解物。同样考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，并且在该反应器中滞留物在酶、生淀粉和水的存在下被保持于再循环之下并且在该反应器中渗透物是可溶性淀粉水解物。还考虑的是在具有微滤膜的连续膜反应器中进行的方法，并且在该反应器中滞留物在酶、生淀粉和水的存在下被保持于再循环之下并且在该反应器中渗透物是可溶性淀粉水解物。
在一些实施例中，使该可溶性淀粉水解物经受转化成为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。优选地使用葡萄糖异构酶并且更优选地通过支持在固相支持体上的固定葡萄糖异构酶实现该转化。考虑的异构酶包括来自诺维信公司(NovozymesA/S)的商品SweetzymeTMIT，来自罗地亚公司(Rhodia)的G-zymeTMIMGI和G-zymeTMG993、KetomaxTM和G-zymeTMG993，来自杰能科国际公司(GenencorInt.)的液体G-zymeTMG993和GenSweetTMIGI。
α-淀粉酶变体
根据本发明有用的α-淀粉酶变体描述于例如WO2013/057141和WO2013/057143(通过引用结合在此)中。
具体而言，α-淀粉酶变体在对应于SEQIDNO:1的以下任何位置的一个或多个位置处包括改变：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450，其中该变体与(i)SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一项的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:1的氨基酸1至483、SEQIDNO:2的氨基酸1至483、SEQIDNO:3的氨基酸1至485、SEQIDNO:4的氨基酸1至482、SEQIDNO:5的氨基酸1至484、SEQIDNO:6的氨基酸1至483、SEQIDNO:7的氨基酸1至485、SEQIDNO:8的氨基酸1至485、SEQIDNO:9的氨基酸1至485、SEQIDNO:10的氨基酸1至485、SEQIDNO:11的氨基酸1至485、SEQIDNO:12的氨基酸1至480、SEQIDNO:13的氨基酸1至483或SEQIDNO:14的氨基酸1至481具有至少60％并且小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
优选地，这些变体是分离的。
在此考虑的α-淀粉酶变体优选地在对应于SEQIDNO:1的以下任何位置的一个或多个位置处包括取代：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450，其中该变体与(i)SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一项的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:1的氨基酸1至483、SEQIDNO:2的氨基酸1至483、SEQIDNO:3的氨基酸1至485、SEQIDNO:4的氨基酸1至482、SEQIDNO:5的氨基酸1至484、SEQIDNO:6的氨基酸1至483、SEQIDNO:7的氨基酸1至485、SEQIDNO:8的氨基酸1至485、SEQIDNO:9的氨基酸1至485、SEQIDNO:10的氨基酸1至485、SEQIDNO:11的氨基酸1至485、SEQIDNO:12的氨基酸1至480、SEQIDNO:13的氨基酸1至483或SEQIDNO:14的氨基酸1至481具有至少60％并且小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
在一个实施例中，该变体包括选自下组的一个或多个改变，该组由以下各项组成：A1AH、A1AF、A1AY、A1AW、A1H、A1F、A1Y、A1W、N2NH、N2N2F、N2NY、N2NW、N2H、N2F、N2Y、N2W、H68F、H68Y、H68W、G71F、G71H、G71Y、G71W、N126F、N126H、N126Y、N126W、H133F、H133Y、H133W、H142F、H142Y、H142W、P144F、P144H、P144Y、P144W、Y156F、Y156H、Y156W、Y158F、Y158H、Y158W、K176L、E185P、I201F、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279Y、F279W、H316F、H316Y、H316W、L318F、L318H、L318Y、L318W、Q360S、D416V、R437F、R437H、R437Y、R437W、H450F、H450Y以及H450W。
在一个优选实施例中，该变体包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W。
在另一个优选实施例中，该变体包括选自下组的两个或更多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W。
在另一个实施例中，该变体包括选自下组的三个或更多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W。在另一个实施例中，该变体包括选自下组的四个或更多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W。
在一个实施例中，该变体包括在对应于位置176的位置处的取代，尤其是取代K176L，并组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的改变，尤其是选自下组的一个或多个改变，该组由以下各项组成：A1AH、A1AW、A1H、A1W、N2NH、N2NW、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W。
在一个优选实施例中，该变体在对应于位置176的位置处包括取代，特别是取代K176L，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的改变，特别是选自下组的一个或多个改变，该组由以下各项组成：A1AH、A1AW、A1H、A1W、N2NH、N2NW、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W，并且该变体与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:1的氨基酸1-483具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。
在一个优选实施例中，该变体在对应于位置176的位置处包括取代，特别是取代K176L，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的改变，特别是选自下组的一个或多个改变，该组由以下各项组成：A1AH、A1AW、A1H、A1W、N2NH、N2NW、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W，并且该变体与(i)SEQIDNO:14的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:14的氨基酸1-481具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。
在一个实施例中，该变体在对应于位置185的位置处包括取代，特别是取代E185P，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W。
在一个优选实施例中，该变体在对应于位置185的位置处包括取代，特别是取代E185P，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W，并且该变体与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:1的氨基酸1-483具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。
在一个优选实施例中，该变体在对应于位置185的位置处包括取代，特别是取代E185P，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W以及H450W，并且该变体与(i)SEQIDNO:14的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:14的氨基酸1-481具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。
在一个实施例中，该变体在对应于位置360的位置处包括取代，特别是取代Q360S，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、D416V、R437W以及H450W。
在一个优选实施例中，该变体在对应于位置360的位置处包括取代，特别是取代Q360S，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、D416V、R437W以及H450W，并且该变体与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:1的氨基酸1-483具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。
在一个优选实施例中，该变体在对应于位置360的位置处包括取代，特别是取代Q360S，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、416、437以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、D416V、R437W以及H450W，并且该变体与(i)SEQIDNO:14的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:14的氨基酸1-481具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。
在一个实施例中，该变体在对应于位置437的位置处包括取代，特别是取代R437W，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V以及H450W。
在一个优选实施例中，该变体在对应于位置437的位置处包括取代，特别是取代R437W，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V以及H450W，并且该变体与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:1的氨基酸1-483具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。
在一个优选实施例中，该变体在对应于位置437的位置处包括取代，特别是取代R437W，组合在对应于位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416以及450中的任何位置的一个或多个位置处的取代，特别是选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：A1H、A1W、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、K176L、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V以及H450W，并且该变体与(i)SEQIDNO:14的成熟多肽，或(ii)SEQIDNO:14的氨基酸1-481具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。
在一个优选实施例中，变体包括选自下组的一组取代，该组由以下各项组成：
A1H+N2W+K176L+E185P，
A1W+N2H+K176L+E185P，
N2H+H68W+H133Y+K176L+E185P，
N2H+H68W+Y156W+K176L+E185P，
N2H+H68W+Y158W+K176L+E185P，
N2H+H68W+K176L+E185P，
N2H+H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D，
N2H+H68W+K176L+E185P+F279W，
N2H+H133Y+K176L+E185P+H316W+R437W，
N2H+H133Y+K176L+E185P+Q360S+R437W，
N2H+H142W+K176L+E185P+H316W+R437W，
N2H+H142W+K176L+E185P+Q360S+R437W，
N2H+P144W+K176L+E185P，
N2H+Y156W+Y158W+K176L+E185P+H316W+R437W，
N2H+Y156W+K176L+E185P+Q360S+R437W，
N2H+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D+H316W，
N2H+K176L+E185P，
N2H+K176L+E185P+H316W，
N2H+K176L+E185P+H316W+L318W+R437W，
N2H+K176L+E185P+H316W+Q360S+R437W，
N2H+K176L+E185P+H316W+R437W，
N2H+K176L+E185P+R437W，
N2H+K176L+E185P+Q360S+R437W，
N2H+K176L+E185P+H316W+Q360S+R437W，
N2H+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H68W+K176L+E185P，
H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H68W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
G71W+K176L+E185P，
N126W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H133Y+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H133Y+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H142W+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H142W+K176L+E185P，
H142W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H142W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
P144W+K176L+E185P，
Y156W+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
Y156W+Y158W+K176L+E185P+H316W+R437W，
Y156W+K176L+E185P+Q360S+R437W，
Y156W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
Y158W+K176L+E185P，
Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D+H316W，
Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+H316L+L318W+Q360S+D416V+R437，
Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+H316W+Q360S+D416V+R437W，
Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
Y158W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
K176L+E185P，
K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
K176L+E185P+I201Y+H205Y+R437W，
K176L+E185P+F279W，
K176L+E185P+H316W，
K176L+E185P+L318W，
K176L+E185P+H450W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+S239Q+Q360S+D416V+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+H316W+Q360S+D416V+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+L318W+Q360S+D416V+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+D416V+R437W，以及
K176L+I201Y+H205Y+Q360S+D416V+R437W。
在另一个优选实施例中，该变体包括选自下组的一组取代，该组由以下各项组成：
A1H+N2W+K176L+E185P，
A1W+N2H+K176L+E185P，
N2H+H68W+H133Y+K176L+E185P，
N2H+H68W+Y156W+K176L+E185P，
N2H+H68W+Y158W+K176L+E185P，
N2H+H68W+K176L+E185P，
N2H+H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D，
N2H+H68W+K176L+E185P+F279W，
N2H+H133Y+K176L+E185P+H316W+R437W，
N2H+H133Y+K176L+E185P+Q360S+R437W，
N2H+H142W+K176L+E185P+H316W+R437W，
N2H+H142W+K176L+E185P+Q360S+R437W，
N2H+P144W+K176L+E185P，
N2H+Y156W+Y158W+K176L+E185P+H316W+R437W，
N2H+Y156W+K176L+E185P+Q360S+R437W，
N2H+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D+H316W，
N2H+K176L+E185P，
N2H+K176L+E185P+H316W，
N2H+K176L+E185P+H316W+L318W+R437W，
N2H+K176L+E185P+H316W+Q360S+R437W，
N2H+K176L+E185P+H316W+R437W，
N2H+K176L+E185P+R437W，
N2H+K176L+E185P+Q360S+R437W，
N2H+K176L+E185P+H316W+Q360S+R437W，
N2H+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H68W+K176L+E185P，
H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H68W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
G71W+K176L+E185P，
N126W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H133Y+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H133Y+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H142W+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H142W+K176L+E185P，
H142W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
H142W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
P144W+K176L+E185P，
Y156W+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
Y156W+Y158W+K176L+E185P+H316W+R437W，
Y156W+K176L+E185P+Q360S+R437W，
Y156W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
Y158W+K176L+E185P，
Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D+H316W，
Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+H316L+L318W+Q360S+D416V+R437W，
Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+H316W+Q360S+D416V+R437W，
Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
Y158W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
K176L+E185P，
K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
K176L+E185P+I201Y+H205Y+R437W，
K176L+E185P+F279W，
K176L+E185P+H316W，
K176L+E185P+L318W，
K176L+E185P+H450W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+S239Q+Q360S+D416V+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+H316W+Q360S+D416V+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+L318W+Q360S+D416V+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+R437W，
K176L+I201Y+H205Y+K213T+D416V+R437W，以及
K176L+I201Y+H205Y+Q360S+D416V+R437W。
在一个优选实施例中，该变体包括选自下组的一组取代，该组由以下各项组成：
T49H+K176L+E185P，
T49G+K176L+E185P，
T49L+S50T+K176L+E185P，
T116G+K176L+E185P，
K176L+E185P，
K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W，
K176L+E185P+L241D，
K176L+E185P+R375V、以及
K176L+E185P+R375G。
在另一个优选实施例中，该变体包括选自下组的一组取代，该组由以下各项组成：
G48A+T49H+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S；
G48A+T49G+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S；
G48A+T49L+S50T+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S；
G48A+T49I+G107A+T116G+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S；
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S；
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201Y+H205Y+A209V+K213T+Q264S+Q360S+D416V+R437W；
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+L241D+A209V+Q264S；
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S+R375V；
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S+R375G；以及
G48A+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S。
在一个实施例中，该变体在位置176和/或185处包括取代。优选地，该取代是176+185，并且更优选是K176L+E185P。
在一个实施例中，该变体在位置176、185、360和/或437中的一个或多个处包括取代。优选地，该取代是176+185+360+437，更优选是K176L+E185P+Q360S+R437W。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQIDNO:1的位置180的位置之前的两个位置处恰好进一步包括缺失。即，对应于SEQIDNO:2的位置181和182的两个氨基酸的缺失。
在另一个实施例中，该变体在对应于SEQIDNO:1的位置177的位置之后且在对应于SEQIDNO:1的位置180的位置之前进一步包括两个氨基酸的缺失。即，SEQIDNO:2的R179-G180-I181-G182肽中的两个氨基酸或SEQIDNO:3至11中任一项的同源氨基酸的缺失。该变体进一步包括一个或多个(例如，若干个)另外的改变，例如一个或多个(例如，若干个)另外的取代。
这些另外的氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-端的或羧基端的延伸，例如氨基端蛋氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)，1979，在蛋白质(TheProteins)，学术出版社，纽约中描述。常见的取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如，德弗斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。
这些变体可以由300至700个，例如350至650个、400至600个、450至500个或470至490个氨基酸组成。
产碳水化合物源的酶
术语“产碳水化合物源的酶”包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。产碳水化合物源的酶能够产生可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能源的碳水化合物，例如，当在用于生产发酵产品(例如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以被直接或间接地转化为所希望的发酵产品，优选乙醇。根据本发明，可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。
葡糖淀粉酶
在一些实施例中，本发明的方法包括添加葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)可以来源于微生物或植物。
在一些实施例中，该葡糖淀粉酶具有淀粉结合结构域。
优选的是栓菌属葡糖淀粉酶，例如来自瓣环栓菌(Trametescingulata)的葡糖淀粉酶(WO2006/069289)，或其变体或片段。
还优选的是粘褶菌属(Gloeophyllum)葡糖淀粉酶，例如来自选自下组的粘褶菌属的葡糖淀粉酶，该组由以下各项组成：冷杉粘褶菌(G.abietinum)、篱边粘褶菌(G.sepiarium)和密粘褶菌(G.trabeum)，并且特别是密粘褶菌(WO2011/068803)，或其变体或片段。还优选的是如披露于例如申请号EP13165995中的粘褶菌属物种的变体，并且特别是具有双取代S95P、A121P的变体。
真菌或细菌来源的示例性葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)3(5):1097-1102)，或其变体，如披露于WO92/00381和WO00/04136中；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.)，1991,55(4):941-949)，或其变体或片段。
其他考虑的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括用于增强热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，1996，蛋白质工程(Prot.Engng.)9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，1995，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，1994，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，1996，生物化学(Biochemistry)35:8698-8704；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，1997，蛋白质工程(ProteinEngng.)10:1199-1204)。此外，克拉克福特(ClarkFord)在1997年10月17日发表了一篇论文，酶工程(ENZYMEENGINEERING)14，北京/中国，10月12-17，97，摘要书页0-61。摘要提出了用于改进热稳定性的泡盛曲霉葡糖淀粉酶的位置G137A、N20C/A27C和S30P的突变。
其他考虑的葡糖淀粉酶包括篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利登记号32,153)、杜邦篮状菌(Talaromycesduponti)、嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属，特别是嗜热解淀粉梭状芽孢杆菌(C.thermoamylolyticum)(EP135138)和嗜热硫化氢梭状芽孢杆菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。优选的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶。还考虑的是商品AMG200L；AMG300L；SANTMSUPER和AMGTME(来自诺维信)；OPTIDEXTM300(来自杰能科国际公司)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM公司)；G-ZYMETMG900(来自酶生物系统公司(EnzymeBio-Systems))；G-ZYMETMG990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。
可以按0.02-2.0AGU/gDS，优选0.1-1.0AGU/gDS(例如0.2AGU/gDS)的量或按本领域技术人员熟知的其他有效量添加葡糖淀粉酶。
β-淀粉酶
在一些实施例中，本发明的方法包括添加β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)。β-淀粉酶是传统地给予外切作用的产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。
β-淀粉酶已经从多种植物和微生物中分离(W.M.福格蒂(W.M.Fogarty)和C.T.凯利(C.T.Kelly)，1979，工业微生物学进展(ProgressinIndustrialMicrobiology)15:112-115)。这些β-淀粉酶表征为具有从40℃至65℃范围内的最适温度并且具有从4.5至7.0范围内的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括来自大麦的β-淀粉酶：来自杰能科国际公司的BBA1500、DBA和OptimaltTMME、OptimaltTMBBA以及来自诺维信公司的NovozymTMWBA。
该β-淀粉酶可以是微生物β-淀粉酶，包括如描述于USPN8,486,682中的来源于弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶。
可以按本领域技术人员熟知的有效量添加β-淀粉酶。推荐的范围是0.05-1BAMU/gDS。
产麦芽糖α-淀粉酶
另一种有待在本发明的方法中用作第一酶的具体酶是产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成处于α-构型的麦芽糖。此外，产麦芽糖α-淀粉酶能够水解麦芽三糖以及环糊精。确切考虑的产麦芽糖α-淀粉酶可以来源于芽孢杆菌属，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，最优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌C599，例如描述于EP120.693中的产麦芽糖α-淀粉酶。这种具体的产麦芽糖α-淀粉酶具有如US6162628中的SEQIDNO:1的氨基酸1-686所示的氨基酸序列。一种优选的产麦芽糖α-淀粉酶具有以下氨基酸序列，其与US6162628中的SEQIDNO:1的氨基酸1-686具有至少70％的一致性，优选至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％的一致性。产麦芽糖α-淀粉酶的最优选的变体包括披露于WO99/43794中的变体。
具有如在US6162628中序列数1的氨基酸1-686所示的氨基酸序列的产麦芽糖α-淀粉酶的水解活性为714。优选地，有待在该方法中应用为第一酶的产麦芽糖α-淀粉酶的水解活性为至少3.5，优选至少4、5、6、7、8、9,10、11、12,13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、100、200、300、400、500、600，或最优选至少700微摩尔/min/mg。
可以按0.01-40.0MANU/gDS，优选从0.02-10MANU/gDS(优选0.05-5.0MANU/gDS)的量或按本领域技术人员熟知的其他有效量添加产麦芽糖α-淀粉酶。考虑的产麦芽糖α-淀粉酶包括(诺维信公司)。
另外的酶
在一些实施例中，本发明任选地包括另外的酶。
环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)
有待在本发明的方法中用作第一酶的具体酶可以是环麦芽糊精葡聚糖转移酶(E.C.2.4.1.19)。环麦芽糊精葡聚糖转移酶(也指环糊精葡聚糖转移酶或环糊精糖基转移酶，在下文称为CGTase)催化将淀粉和类似底物经由分子内转糖基反应转化为环麦芽糊精，由此形成不同尺寸的环麦芽糊精。大多数CGTase具有转糖基活性和淀粉降解活性两者。考虑的CGTase优选地具有微生物来源，并且最优选地具有细菌来源。确切考虑的CGTase包括与如WO02/06508中的SEQIDNO:2的氨基酸1至679所示的序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的CGTase；与披露于生物技术通讯(Biotechnol.Lett.)19:1027-1031的图1中的约根森(Joergensen)等人，1997中的多肽的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的CGTase；以及描述于US5278059和US5545587中的CGTase。优选地，有待在该方法中应用为第一酶的CGTase的水解活性为至少3.5，优选至少4、4.5、5、6、7、8、9,10、11、12,13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，或最优选至少23微摩尔/min/mg。可以按0.01-100.0NU/gDS，优选从0.2-50.0NU/gDS(优选10.0-20.0NU/gDS)的量或按本领域技术人员熟知的其他有效量添加CGTase。考虑的商品是(诺维信公司)。
真菌α-淀粉酶
有待在本发明的方法中用作另外的酶的具体酶是真菌α-淀粉酶(EC3.2.1.1)，例如真菌样α-淀粉酶(fungamyl-likealpha-amylase)。在本披露中，术语“真菌样α-淀粉酶”指示与SEQIDNO:7的氨基酸序列展示出高同源性(即大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性)的α-淀粉酶。可以按0.001-1.0AFAU/gDS，优选从0.002-0.5AFAU/gDS(优选0.02-0.1AFAU/gDS)的量或按本领域技术人员熟知的其他有效量添加真菌α-淀粉酶。
芽孢杆菌属α-淀粉酶
芽孢杆菌属α-淀粉酶(通常也称为“特妙淀粉酶样α-淀粉酶(Termamyl-likealpha-amylase)”)。熟知的特妙淀粉酶样α-淀粉酶包括来源于以下菌株的α-淀粉酶：地衣芽孢杆菌(可作为特妙淀粉酶商购)、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。其他特妙淀粉酶样α-淀粉酶包括来源于芽孢杆菌属菌株NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的α-淀粉酶，所有的这些详细描述于WO95/26397中，以及由冢本(Tsukamoto)等人，1988，生物化学和生物物理研究通讯(BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications)，151:25-31描述的α-淀粉酶。在本发明的上下文中，特妙淀粉酶样α-淀粉酶是如在WO99/19467第3页第18行至第6页第27行中定义的α-淀粉酶。所考虑的变体和杂交体描述于WO96/23874、WO97/41213及WO99/19467中。确切考虑的是具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：I181*+G182*+N193F。可以按本领域技术人员熟知的有效量添加芽孢杆菌属α-淀粉酶。
脱支酶
该方法的另一种具体酶可以是脱支酶，例如异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)或普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶的不能攻击支链淀粉的特性以及通过对于α-极限糊精的有限作用而与普鲁兰酶相区别。可以按本领域技术人员熟知的有效量添加脱支酶。
普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰6-葡聚糖-水解酶)是脱支酶，其由它们在例如支链淀粉(amylopectin)和普鲁兰(pullulan)中水解α-1,6-糖苷键的能力表征。
根据本发明有用的确切考虑的普鲁兰酶包括来自美国专利号4,560,651(特此通过引用结合)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillusamyloderamificans)的普鲁兰酶、WO01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQIDNO:2的普鲁兰酶、WO01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQIDNO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillusderamificans)普鲁兰酶，以及来自WO01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQIDNO:6的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌并且还描述于FEMS微生物学通讯(FEMSMic.Let.)(1994)115，97-106中的普鲁兰酶。
根据本发明的普鲁兰酶可以按有效量添加，该有效量包括从1-100微克/gDS之间，尤其是从10-60微克/gDS的优选范围。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定法描述于下文的“材料与方法”-部分中。
适合的可商购普鲁兰酶产品包括PROMOZYMED、PROMOZYMETMD2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAXL-300以及AMANO8(安能满公司(Amano)，日本)。
在此描述并且要求的本发明不应限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
材料和方法
测量淀粉分解活性(α-淀粉酶活性)的测定
PNP-G7测定：
α-淀粉酶活性通过使用PNP-G7底物的方法来确定。PNP-G7是4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷的缩写，为一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶裂解的嵌段寡糖。裂解之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放游离PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。
试剂：
来自此试剂盒的G7-PNP底物含有22mM4,6-亚乙基-G7-PNP以及52.4mMHEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH7.0。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mMHEPES、87mMNaCl、12.6mMMgCl2、0.075mMCaCl2、>4kU/L的α-葡糖苷酶。
通过将1mlα-葡糖苷酶试剂与0.2mlG7-PNP底物混合来制成底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mMEPPS、0.01％(w/v)TritonX100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))、1mMCaCl2，pH7.0。
程序：
将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来进行测定。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在OD405nm下在5分钟内每20秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。
Phadebas活性测定：
α-淀粉酶活性还可通过使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学(MagleLifeSciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在620nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的稀释缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。在37℃下孵育15分钟。通过添加30μl1MNaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。
淀粉酶样品应稀释以使得620nm下的吸光度在0与2.2之间。
测定：
为了确定残余淀粉酶活性，使用Ultra淀粉酶测定试剂盒(E33651，英杰公司(Invitrogen)，拉霍亚(LaJolla)，加州(CA)，美国(USA))。
底物是一种玉米淀粉衍生物DQTM淀粉，它是用FL染料标记以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。含有大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100微升50mM乙酸钠(pH4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下、黑暗中保持，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加900微升100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mMCaCl2，pH5.5，充分涡旋并且在室温下、黑暗中储存直到准备使用为止。通过以10倍稀释于残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mMCaCl2，pH5.5)中来制备储备底物工作溶液。孵育之后立即将酶在100mM乙酸盐、0.01％(W/v)X100、0.125mMCaCl2，pH5.5中稀释至10-20ng酶蛋白/ml的浓度。
为了测定，在一个黑色384孔微量滴定板中，将25微升底物工作溶液与25微升稀释酶混合10秒。在每个孔中在25℃下于15分钟内每分钟测量荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)并且将Vmax计算作为荧光强度相对于时间的曲线的斜率。曲线应是线性的，并且调整了残余活性测定以使得稀释参考酶溶液在活性测定的线性范围内。
葡糖淀粉酶活性测定(AGU)
可以按葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，由此使存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性反应，形成NADH，在340nm下使用光度计测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
AMG孵育：
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5AGU/mL至4.0AGU/mL
颜色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
β-淀粉酶活性(BAMU)
相对于诺维信β-淀粉酶标准品测量BAMU中的β-淀粉酶活性。β-淀粉酶作用于麦芽六糖(G6)的非还原端以形成麦芽糖(G2)和麦芽四糖(G4)。产生的G4在乳糖氧化酶和O2的存在下比G6反应强烈以形成H2O2。形成的H2O2在过氧化物酶的存在下激活4-氨基安替比林(AA)和N-乙基-N-磺丙基-间甲苯胺(TOPS)的氧化缩合，以形成可以在540nm下定量其吸光度的紫色产物。
α-淀粉酶活性(KNU)
可釆用马铃薯淀粉作为底物来测定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应随后是将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合。最初形成微黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且然后逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
将一个KiloNovoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003MCa2+；和pH5.6下)糊精化5260mg淀粉干物质Merck可溶性淀粉(MerckAmylumsolubile)的酶量。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)的确定
以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准品而确定AFAU。
使用的标准品是AMG300L(来自诺维信公司，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉G1，还披露于博埃尔(Boel)等人(1984)，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)3(5)，第1097-1102页和WO92/00381中)。在室温下存储3周后，此AMG中的中性α-淀粉酶从大约1FAU/mL降至低于0.05FAU/mL。
根据以下描述确定此AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性。在此方法中，1AFAU被定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
碘与淀粉形成蓝色复合物，但不与其降解产物形成蓝色复合物。颜色的强度因此与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法将酶活性确定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减小。
α-淀粉酶
淀粉+碘→糊精+寡糖
40℃，pH2.5
蓝色/紫色t＝23秒脱色
标准条件/反应条件：(/分钟)
麦芽糖淀粉酶活性(MANU)的确定
一个MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位)可以被定义为在10mg麦芽三糖(西格玛M8378)底物/ml的0.1M柠檬酸盐缓沖液(pH5.0)的浓度下，在37℃下持续30分钟，每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需要的酶量。
普鲁兰酶活性(NPUN)的确定
相对于诺维信普鲁兰酶标准品测量NPUN中的内切-普鲁兰酶活性。一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色普鲁兰(redpullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。
将1ml稀释的样品或标准品在40℃下孵育2分钟。添加0.5ml2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸(pH5)并混合。将这些管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml80％乙醇终止。将这些管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm处测量上清液OD并且使用标准品曲线计算活性。
糖谱和溶解的干固体的确定
通过HPLC确定淀粉水解物的糖组成并且将葡萄糖产率随后计算为DX。通过测量折射率而确定淀粉水解物的溶解(可溶性)的干固体的°BRIX(白利糖度)。
材料
α-淀粉酶变体
测试的α-淀粉酶变体是如描述于例如WO2013/057143中的LE399的变体(SEQIDNO:14，先前披露于例如WO2002/010355中)。LE399包括来自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(SEQIDNO:6)的氨基酸1-37以及来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(SEQIDNO:1)的氨基酸40-483，其中具有以下取代G48AT49IG107AH156YA181TN190FI201FA209VQ264S。如下表中列出的每个变体中的取代是与LE399相比的取代。位置编号是根据SEQIDNO:1。
LE399在N-末端中比SEQIDNO:1短两个氨基酸，即在LE399中，没有对应于SEQIDNO:1的位置1和2的氨基酸。表中表示为*2aH的改变是指在LE399的N-末端V之前插入H。SEQIDNO:1中的类似改变是氨基酸N2用H来取代，即N2H(或者，缺失氨基酸A1并组合氨基酸N2用H取代，即A1*N2H)。同样地，表中表示为*2aH*2bW的改变是指在VLE399的N-末端之前插入HW。SEQIDNO:1中的类似改变是取代A1HN2W。
α-淀粉酶变体A：
H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W
α-淀粉酶变体B：
H142W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W
α-淀粉酶变体C：N2H+H133Y+K176L+E185P+Q360S+R437W
α-淀粉酶变体D：
K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W
α-淀粉酶变体E：
K176L+E185P+F201Y+H205Y+K213T+K315M+Q360S+D416V+R437W
葡糖淀粉酶
葡糖淀粉酶A：来自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶(WO2006/069289)。
葡糖淀粉酶B：来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(披露于博埃尔(Boel)等人(1984)，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)3(5),1097-1102中的来源于黑曲霉的葡糖淀粉酶G1，可获得自诺维信公司)。
葡糖淀粉酶C：在申请号EP13165995中披露为具有双取代S95P,A121P的变体的来自密粘褶菌的葡糖淀粉酶。
β-淀粉酶
β-淀粉酶A：OptimaltBBA(可获得自杜邦公司(DuPont))。
β-淀粉酶B：来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶(USPN8,486,682)。
对比性淀粉酶
淀粉酶A：酸性真菌α-淀粉酶(AFAA)，包括微小根毛霉α-淀粉酶催化结构域和黑曲霉葡糖淀粉酶接头以及CBM，在WO2006/069290的表5中披露为V039。
淀粉酶B：酸性真菌α-淀粉酶(AFAA)，包括微小根毛霉α-淀粉酶催化结构域和黑曲霉葡糖淀粉酶接头以及CBM，在WO2013/006756中披露为变体PE96。
实例1
通过在搅拌下向水中添加普通玉米淀粉而制备具有30％干固体(DS)颗粒状淀粉的浆液。用HCl将pH调节至4.5。将颗粒状淀粉浆液分配到100ml蓝帽烧瓶中，其中每个烧瓶中75g。将烧瓶在60℃水浴中在磁搅拌下进行孵育。在零时，将0.05mg/gDSα-淀粉酶变体和0.1mg/gDS葡糖淀粉酶加到烧瓶中。在4、24和48小时之后取出样品，如所指示的。
使用以下方法确定总干固体淀粉。通过添加过量的α-淀粉酶(300KNU/Kg干固体)并且随后将样品在95℃下在油浴中放置45分钟而将淀粉完全水解。在通过0.22微米过滤器过滤之后，通过测量折射率而测量干固体。
在通过0.22微米过滤器过滤之后对样品确定淀粉水解物中的可溶性干固体。通过测量折射率确定可溶性干固体并且通过HPLC确定糖谱。将葡萄糖量计算为％DX。
实例2
在塑料烧瓶中将粉状玉米淀粉与自来水合并，以产生31.5％固体淀粉浆液。使用0.1MHCl溶液将浆液调节至pH为4.5。将此浆液的20mL等分部分添加至30mL耐洁(Nalgene)螺旋盖塑料瓶中并且记录重量。向每个酶处理的瓶给予0.05mg酶蛋白/克的淀粉干物质(mgEP/gDS)剂量的α淀粉酶和0.1mgEP/gDS剂量的葡糖淀粉酶。未加料的两个瓶作为对照。一旦加料，便将瓶放置于两个分别设定为60℃或66℃的烤肉烘箱中。
在不同时间点(T＝4、24和48小时)，从每个瓶中取出2mL等分部分并将其放置于预称重的15mL锥形旋管中，然后对这些旋管再称重。用18μL的1MHCl使每个样品失活。失活后，将样品彻底涡旋。将每个管中的上清液通过0.45μm滤片过滤进微量离心管中，以用于HPLC分析。然后将这些微量离心管在沸水中放置10分钟，以使任何酶活性完全失活。通过将50μL的过滤样品稀释于每个具有950μL的0.005MH2SO4的艾本德(Eppendorf)管中以产生20:1的稀释因子而在小瓶中制备HPLC样品。
一旦已经将上清液从每个样品中取出，便将管用自来水填充至10mL标记处。然后将管如上涡旋和离心，然后倾析。将这个过程用自来水重复第二次，随后用80％乙醇溶液重复第三次和最后一次，以从每个管的固体中除去残余可溶物。将这些管在55℃烘箱中放置最少24小时，之后在105℃烘箱中放置24小时，以完全干燥。在从烘箱中拿出之后，立即将管帽密封，以阻止管内容物吸收水份。然后将管在分析天平上称重，以确定内容物的重量。
通过FIS分析确定溶解作用
如下计算已经被溶解的固体分数：
HPLC分析
HPLC系统具有化学工作站软件的安捷伦(Agilent)1100/1200系列脱气装置，四元泵，自动进样器，柱室w/加热器折射率检测器(RI)
柱伯乐(Bio-Rad)HPX-87H离子排斥柱，300mmx7.8mm，零件号125-0140
伯乐保护柱阳离子H，零件号125-0129，支架零件号125-0131
方法0.005MH2SO4流动相
流速：0.6ml/min
柱温：65℃
RI检测器温度：55℃
该方法使用针对DP4+、DP3、DP2、葡萄糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油以及乙醇(％w/v)的校准标准品对分析物进行定量。使用四点校准(包括来源)进行定量。
对于此实验，没有在处理之间比较有机酸和果糖HPLC结果。
表1.以总干物质的百分比计的可溶性干固体。
*n.d.＝未确定
表2.可溶性水解物的DX。
*n.d.＝未确定
此实例证实测试的α-淀粉酶变体组合葡糖淀粉酶有效地溶解淀粉(在48小时内大于70％)并且给出相当高的％DX(>95％)。
实例3
此对比性实例展示了也与葡糖淀粉酶组合，在60℃下遵循实例1的方案，已知对生淀粉具有活性的酸性真菌α-淀粉酶的较低的淀粉溶解作用。在4小时、24小时以及48或98小时收集样品。结果示于表3和4中。
表3.以总干物质的百分比计的可溶性干固体。
n.d.＝未确定
表4.可溶性水解物的DX。
n.d.＝未确定
此实例证实已知对生淀粉具有活性但不是低pH细菌淀粉酶的酸性真菌α-淀粉酶淀粉酶A和淀粉酶B组合葡糖淀粉酶显示出比实例1的测试的α-淀粉酶变体(这些α-淀粉酶变体是低pH细菌淀粉酶组合葡糖淀粉酶)低的淀粉溶解作用。
实例4
在塑料烧瓶中将粉状玉米淀粉与DI水合并，以产生40.5％固体淀粉浆液。使用0.1MHCl溶液将浆液调节至pH为4.5。将此浆液的10mL等分部分添加至30mL耐洁(Nalgene)螺旋盖塑料瓶中并且记录重量。根据表5，根据其重量向每个瓶中加入α淀粉酶和葡糖淀粉酶。向每个瓶中添加足够的水，以达到30％干固体。瓶1和2未加料并且作为空白处理。一旦加料，便根据表5将瓶放置于两个设定为60℃或66℃的烤肉烘箱中。将空白放置于60℃中，以避免淀粉糊化。
表5.α–淀粉酶(AA)和葡糖淀粉酶(AMG)的加料表。
在24和48小时时间点，从每个烧瓶中取出2mL等分部分并将其放置于预称重的15mL锥形旋管中，然后对这些旋管再称重。用18μL的1MHCl使每个样品失活。失活后，将样品涡旋并在3500rpm下在离心机中放10分钟。将每个管中的上清液通过0.45μm滤片过滤进小微量离心管中，以用于水解物的HPLC分析。然后将这些微量离心管在沸水中放置10分钟，以使任何酶活性完全失活。通过将50μL的过滤样品用950μL的流动相(5mMH2SO4)稀释以产生20:1的稀释因子而在小瓶中制备HPLC样品。根据描述于实例2中的程序分析HPLC样品。还根据描述于实例2中的程序确定淀粉溶解作用。
表6.以总干物质的百分比计的可溶性干固体(重复的平均值)。
*n.d.＝未确定
表7.可溶性水解物的DX(重复的平均值)。
*n.d.＝未确定
此实例证实测试的α-淀粉酶变体组合葡糖淀粉酶有效地溶解淀粉(在48小时内大于70％)并且给出相当高的％DX(>95％)。
实例5
在塑料烧瓶中将粉状玉米淀粉与DI水合并，以产生40.5％固体淀粉浆液。使用0.1MHCl溶液将浆液调节至pH为4.5。将此浆液的10mL等分部分添加至30mL耐洁(Nalgene)螺旋盖塑料瓶中并且记录重量。根据表8，根据其重量向每个瓶中加入α淀粉酶和β淀粉酶。向每个瓶中添加足够的水，以达到30％干固体。瓶21和22未加料并且作为空白处理。一旦加料，便根据表8将瓶放置于两个设定为60℃或66℃的烤肉烘箱中。将空白放置于60℃中，以避免淀粉糊化。
表8.α-淀粉酶和β-淀粉酶的加料表。
在24和48小时时间点，从每个烧瓶中取出2mL等分部分并将其放置于预称重的15mL锥形旋管中，然后对这些旋管再称重。用18μL的1MHCl使每个样品失活。失活后，将样品涡旋并在3500rpm下在离心机中放10分钟。将每个管中的上清液通过0.45μm滤片过滤进小微量离心管中，以用于水解物的HPLC分析。然后将这些微量离心管在沸水中放置10分钟，以使任何酶活性完全失活。通过将50μL的过滤样品用950μL的流动相(5mMH2SO4)稀释以产生20:1的稀释因子而在小瓶中制备HPLC样品。根据描述于实例2中的程序分析HPLC样品。还根据描述于实例2中的程序确定淀粉溶解作用。
表9.以总干物质的百分比计的可溶性干固体(重复的平均值)。
表10.可溶性水解物的DP2％(重复的平均值)。
此实例证实测试的α-淀粉酶变体组合β-淀粉酶有效地溶解淀粉并且甚至可以在66℃的较高温度下有效地发挥作用。

Claims (20)

1.一种用于增加淀粉溶解作用的方法，该方法包括：
a)使水性颗粒状淀粉浆液在低于或恰好高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度下经受α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体在对应于SEQIDNO:1的以下任何位置的一个或多个位置处包括改变：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450；
b)在存在产碳水化合物源的酶，例如葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶、或其组合的情况下；
由此增加该颗粒状淀粉的溶解作用。
2.如权利要求1所述的方法，其中在约60℃-70℃的温度下进行该方法。
3.如权利要求1所述的方法，其中以大于0.05mg酶蛋白/克干固体，例如0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.30mg酶蛋白/克干固体的量添加该α-淀粉酶变体。
4.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶变体在SEQIDNO:1的位置176和/或185，优选位置176和位置183处包括取代，更优选K176L+E185P。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶变体在SEQIDNO:1的位置176、185、360和/或437中的一个或多个，优选位置176+185+360+437处包括取代，更优选K176L+E185P+Q360S+R437W。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法，包括葡糖淀粉酶和β-淀粉酶。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，进一步包括添加选自下组的酶，该组由以下各项组成：环糊精葡聚糖转移酶、真菌α-淀粉酶、芽孢杆菌属α-淀粉酶、大麦β-淀粉酶、异淀粉酶、普鲁兰酶、或其组合。
8.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该淀粉浆液具有20％-55％的干固体颗粒状淀粉，优选25％-40％的干固体颗粒状淀粉，更优选30％-35％的干固体，尤其是33％左右的干固体颗粒状淀粉。
9.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该颗粒状淀粉的干固体的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％被转化为可溶性淀粉水解物。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该温度是至少58℃、59℃，或更优选至少60℃。
11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该pH是在3.0至7.0，优选从3.5至6.0，优选从4.0-5.0，优选4.5-5.5的范围内，更优选4.5。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该可溶性淀粉水解物的DX为至少94.5％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或至少99.5％。
13.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该可溶性淀粉水解物中的主要糖是葡萄糖或麦芽糖。
14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该颗粒状淀粉是获得自块茎、根、茎或整谷物。
15.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该颗粒状淀粉是获得自谷类。
16.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该颗粒状淀粉是获得自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。
17.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该颗粒状淀粉是获得自整谷物的干磨或获得自整谷物的湿磨。
18.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在超滤系统中进行该方法并且在该超滤系统中滞留物在酶、生淀粉和水的存在下被保持于再循环之下并且在该超滤系统中渗透物是该可溶性淀粉水解物。
19.一种用于产生高果糖淀粉基糖浆(HFSS)的方法，其中使如以上权利要求中任一项所述的方法的可溶性淀粉水解物经受转化成为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。
20.一种用于产生麦芽糖糖浆的方法，其中使如以上权利要求中任一项所述的方法的可溶性淀粉水解物经受转化成为麦芽糖糖浆。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110498862A (zh) * 2019-09-03 2019-11-26 陕西奥克药用辅料有限公司 一种可溶性淀粉的制备工艺

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11072786B2 (en) 2014-04-10 2021-07-27 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CA3073278A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Corn Products Development, Inc. Maltose syrups, comestibles comprising the syrup, and process for making the same
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN118201967A (zh) * 2021-10-25 2024-06-14 玉米产品开发公司 使用饱和蒸汽制备的淀粉组合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1813068A (zh) * 2003-06-25 2006-08-02 诺维信公司 淀粉水解的方法
CN1875099A (zh) * 2003-11-21 2006-12-06 金克克国际有限公司 颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法
US20120208251A1 (en) * 2001-05-15 2012-08-16 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4009074A (en) * 1975-03-13 1977-02-22 Cpc International Inc. Preparation of levulose from granular starch
CN102321705A (zh) * 2003-03-10 2012-01-18 诺维信公司 酒精产品生产方法
ES2425351T3 (es) * 2003-06-25 2013-10-14 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos
EP1745122A4 (en) * 2004-01-16 2010-11-03 Novozymes North America Inc PROCESSES FOR PRODUCING FERMENTATION PRODUCT
US20080199927A1 (en) * 2004-05-27 2008-08-21 Nigel Dunn-Coleman Aspergillus Kawachi Acid-Stable Alpha Amylase and Applications in Granular Starch Hydrolysis
BRPI1013388A2 (pt) * 2009-04-01 2019-04-09 Danisco Us Inc composição de limpeza que compreende uma alfa-amilase e uma protease e método de limpeza de um tecido ou superficie dura
EP4253534A3 (en) * 2011-10-17 2024-02-07 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
KR102046075B1 (ko) * 2011-10-17 2019-11-18 노보자임스 에이/에스 알파-아밀라아제 변이체 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120208251A1 (en) * 2001-05-15 2012-08-16 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
CN1813068A (zh) * 2003-06-25 2006-08-02 诺维信公司 淀粉水解的方法
CN1875099A (zh) * 2003-11-21 2006-12-06 金克克国际有限公司 颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110498862A (zh) * 2019-09-03 2019-11-26 陕西奥克药用辅料有限公司 一种可溶性淀粉的制备工艺
CN110498862B (zh) * 2019-09-03 2022-05-27 陕西奥克药用辅料有限公司 一种可溶性淀粉的制备工艺

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